KR100693796B1

KR100693796B1 - 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체

Info

Publication number: KR100693796B1
Application number: KR1020017012929A
Authority: KR
Inventors: 엠. 스티븐 피버; 데이비드 에프. 실버
Original assignee: 헬스 리서치 인코포레이티드
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-24
Publication date: 2007-03-12
Also published as: US6620779B2; BR0010082A; KR20020000557A; AU4486300A; ZA200108012B; US6426094B2; NZ514521A; IL146012A0; BG106057A; PL350918A1; NO20015227L; JP2002542296A; HUP0200840A2; WO2000064455A1; BG64940B1; CN1188137C; US20020198153A1; NO20015227D0; CN1352561A; EP1212068A4

Abstract

본 발명의 목적은 항종양제의 효과를 증강시키는 방법을 제공하는 것인데, 상기 방법은 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체를 투여하는 것을 포함하며, 상기 적혈구용적 증강제는 상기 항종양제를 투여하기 전에 또는 항종양제와 동시에 투여할 수도 있다.

Description

항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체{COMBINATION OF THE ANTI-TUMOR AGENT AND THE HEMATOCRIT ELEVATOR}

본 발명은 암의 치료분야에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 화학요법을 사용하는 동안에 적혈구용적(hematocrit)을 증가시켜서 고형 종양을 치료하기 위한 화학요법제의 효능을 증강시키는 것에 관한 것이다.

항종양제

암치료에 있어서 많은 발전이 있어 왔다 하더라도, 고형 종양은 여전히 치료하기 어렵다. 결과적으로, 종래 요법들이 일반적으로 효과가 없었기 때문에, 많은 환자들에 의해서 종양이 발전된 형태로 거듭나고 있다. 따라서, 항암작용을 위해서 새로운 형태의 항암제들이 검토되고 있고, 최근에는 백금 배위화합물(Rosenberg et al., 1969, Nature, 222: 385-386)에 상당한 관심이 집중되고 있다. 구조적으로 이러한 화합물은 백금의 중심원자에 의해서 형성되어, 시스나 트랜스 관계에 있는 염소원자나 암모니아기의 다양한 배열로 둘러싸인 복합체로서, 상기 백금계 복합제제 화학요법은 변종된 난소암을 앓는 환자들에게 있어서 제1선의 후-외과적 요법이 되고 있다(American Cancer Society, 1995, Facts and figures). 세포독성 백금 배위화합물로는, 악성 변종을 치료하는데 유용한 시스플라틴(시스-디아민 디클로로 백금) 및 카르보플라틴(1,1-시클로부탄디카르복실디아민 백금-(II))이 있다. 암세포에 대한 세포독성 효과를 나타내는 것으로 알려진 기타 백금 화합물로는, 1,4- 및 1,2-디아미노시클로헥산 백금(IV) 복합체(미국특허 제5,434,256)가 있다.

이러한 백금화합물이 악성종양에 대하여 효과적이라고 하더라도, 치료과정 동안에 종양내성도 또한 증가되고 있으므로, 이들의 유용성에도 한계가 있다. 백금의 특정 항암 메커니즘의 대부분이 아직 충분히 밝혀져 있지 않기 때문에, 백금의 세포독성에 대한 상세한 메커니즘적인 정보없이, 시스플라틴에 대한 암내성의 문제를 극복하고, 백금 및 기타 항종양제의 효능을 증강시키기는 어려웠다.

고형 종양은 충분하게 산소처리된 세포 및 저산소성 세포군 모두를 함유한다. 저산소증은 일반적으로 혈액으로부터 가장 떨어진 세포에서 발생하는데, 이러한 세포는 천천히 증식하지만, 또한 항종양제에 대하여 비교적 내성이 있다. 예를 들어, 상기 데이터로부터 시스플라틴의 세포독성 효과가 산소화된 세포에서보다 저산소성 종양세포에서 더 큰 내성을 나타낸다는 것을 알 수 있다(Herman et al., 1988, Cancer Research, 48: 2342-2347; Melvic et al., 1988, Radiat. Res., 114: 489-499; Grau et al., 1988, Radiother. oncol., 13: 301-309). 따라서, 항암제에 대한 내성을 나타내는 종양에 의한 하나의 메커니즘은 상대적으로 저산소인 상태에서 비롯되는 것일 수도 있다.

신장 독성, 내이신경독성 및 신독성과 같은 일반적으로 관찰된 일부 부작용으로 말미암아, 백금화합물의 효능에도 한계가 있다. 빈혈 또한 백금요법의 일반적인 부작용이다. 빈혈은 특히 하기 시스플라틴 요법에서는 흔한 것으로서, 심지어 환자들은 종종 수혈받기도 한다. 하기 시스플라틴 요법에서 빈혈이 발생하는 원인은 복합적이지만, 에리트로포이에틴 수치가 감소되는 것으로 보아서 에리트로포이에틴 결핍이 주원인인 것으로 사료된다. 하기 시스플라틴 요법이나 기타 화학요법을 적용한 재조합 인간 에리트로포이에틴은 상기 요법과 연관된 빈혈을 역전시키는데 효과적인 것으로 보고되고 있다(Abels 1992, Seminars in Oncology, 19: 29-35).

적혈구조혈 조절자

세기의 시작과 함께, 적혈구생성을 조절하는 호르몬의 생성 및 적혈구세포의 생성이 제일 먼저 제안되었다. 그 후, 적혈구생성(EPO)을 체액조절하기 위한 데이터가 증가되고 있다. 이것으로, 에리트로포이에틴(EPO)의 정제 및 그것의 아미노산서열을 측정할 수 있으며, 궁극적으로는 인간 EPO 유전자의 클로닝도 가능하게 되었다(Jacobs et al., 1985, Nature, 313: 806-810; Lin, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 7580-7584; Lin, 미국특허 제 4,403,008). 재조합 EPO의 정제는 Lai 등에게 허여된 미국특허 제4,667,016에 기재되어 있다.

EPO는 순환되는 적혈구 세포의 정도를 조절하는데 필수적인 호르몬이다. 자연적으로 발생하는 EPO는, 태아인 경우에는 간에서 생성되며 성인인 경우에는 신장에서 주로 생성된다. 유전공학기술에 의해서 제조된 재조합 에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴을 코딩하는 유전자로 형질전환된 숙주세포로부터의 단백질생성물의 발현과 연관되어 있다. 많은 세포표면과 분비 단백질과 마찬가지로, EPO는 글리코실화되어 있다. 글리코실화는 일반적으로 N-연결된 올리고사카라이드가 아스파라긴 잔기에 부착되어 있는 것과, O-연결된 올리고사카라이드가 세린이나 트레오닌 잔기에 부착된 것의 2가지 유형이 있다. 인간의 뇨에서 배출된 에리트로포이에틴은 3개의 N-연결 및 1개의 O-연결된 올리고사카라이드 사슬을 함유하는데, 이 사슬은 글리코프로테인의 전체중량에 대하여 대략 40%를 함유한다. 다양한 글리코실화 정도에 대응하는 에리트로포이에틴의 상이한 동형체가 기재되어 있다(Elliott et al., 1995, EP 0640619A1).

에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴 수용체에 결합하여 효과를 발휘한다. 상기 EPO 수용체의 활성으로 증식, 분화의 자극 및 아포토시스의 발현과 같은 다수의 생물학적 효과들이 나타난다(Liboi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1990, 11351). 또한, EPO 수용체는 EPO 돌연변이체 및 아날로그, 펩티드, 및 항체와 같은 작용물질에 의해서 활성화될 수 있다. EPO에 추가하여, 에리트로포이에틴과 같은 활성을 갖는 기타화합물 또한 검증되어 오고 있는데, 예를 들어 신장세포암으로부터 확인된 분자는 적혈구조혈에 대해서 EPO-와 같은 효과를 보유하고 있는 것으로 알려져 왔지만, EPO와는 면역학적인 차이가 있다(Sytkowski et al, 1979). 적혈구조혈의 기타 자극제로는 전이금속의 수용성 염이 있다(Brugnara et al., 미국특허 제 5,369,014).

백금요법이, 발달된 고형 종양에 있어서 보다 효과적이라 하더라도, 적혈구 용적 또는 헤모글로빈과 화학요법제의 항종양 효과 사이의 임상적인 상호연관성이 아직 평가되지 않아서, 적혈구 용적을 증강시키는 제제가 항암제에 대한 종양의 감도를 증가시키는지 아닌지는 측정할 수 없다. 비통상적인 항암제의 사용이 증가하는 것을 고려하면, 이러한 제제에 대한 항종양 반응을 증강시키는 것이 여전히 필요하다.

본 발명은 항종양제의 효능을 증강시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 상기 방법에는 증가된 적혈구용적의 조건하에서 그러한 치료가 필요한 개인에게 항종양제를 투여하는 것이 포함되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체를 투여함으로써 고형 종양을 치료하는 방법을 제공하는 것으로서, 바람직한 실시예에서 상기 적혈구용적 증강제는 항종양제 이전에 투여된다.

본 발명의 다른 목적은 항종양 백금화합물 및 에리트로포이에틴이나 그와 유사한 화합물을 투여함으로써 고형 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시스플라틴 및 에리트로포이에틴의 조합체를 투여함으로써 난소종양의 치료방법을 제공하는 것이다.

명세서와 청구항에 사용된 "말로나토 백금 배위화합물(류)"은, 치환되거나 치환되지 않아도 좋은 두자리 말로나토의 두자리 리간드를 함유하는 백금(II) 및 백금(IV)의 시스 및 트랜스 이성질체를 의미한다. 상기 백금(II)은 공간적으로 평면배열되는 배위화합물을 형성하는 반면, 상기 백금(IV)은 공간적으로 8면체 배열되는 배위화합물을 형성한다. 상기 화합물은 참고로 여기에 기재된 Cleary et al에게 허여된 미국특허 제 4,140,707호 및 제 4,657,927호에 기재되어 있다.

"항종양제" 및 "항암제"란 용어는 명세서 및 청구항에서 교환가능하게 사용 되는데, 이것은 암세포 또는 암세포의 성장을 억제, 완화 또는 저지하는데 효과적이거나 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 화합물이나 조성물을 말한다. 항종양제의 "화학요법적으로 효과적인 양"이라고 하는 것은 명세서 및 청구항에서 암세포의 성장을 억제, 완화 또는 저지하는데 개별적으로 충분한 양 또는 암세포에 대한 세포독성 효과를 발현하는데 충분하게 투여된 양을 말한다.

또한, "항종양 효과" 또는 "항종양 활성"이라는 것은 명세서와 청구항에서, 암세포의 성장을 억제, 완화 또는 저지하거나, 세포독성 효과를 발현하는 것을 의미한다. 종양크기가 감소되는 것으로, 항종양효과를 측정할 수 있다.

"에리트로포이에틴" 또는 "EPO"는 명세서와 청구항에서, 화학적 분리 및 정제기술에 의해서 전체적으로 또는 부분적으로 얻어지거나 분리된 에리트로포이에틴; 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻어진, 인간 에리트로포이에틴을 포함한 모든 형태의 에리트로포이에틴을 의미한다. 이 용어는 또한 EPO를 코딩하는 유전자를 포함하는 외인성 유전물질로 형질전환하거나, EPO를 코딩하는 유전자를 포함하는 외인성 유전물질을 함유하는 형질전환된 제1 또는 제2 세포를 각 개체에 이식하는 것에 의해서, 개체의 세포에 의해서 생성된 에리트로포이에틴을 의미하기도 한다. 상기 생성물 또는 형질전환된 세포의 생성기술 및 운반기술이 미국특허 제 5,773,761에 참고적으로 기재되어 있다.

"에리트로포이에틴과 유사한" 분자 또는 물질은 명세서나 청구항에서 화학적분리 및 정제기술에 의해서 또는 재조합 기술에 의해서 얻어진, 임의의 분자로서, 에리트로포이에틴 수용체를 활성화시키거나, 또는, 이와 달리, 적혈구생성을 자극하는 것과 같이 에리트로포이에틴의 기작을 모방할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 이러한 정의는 전체 EPO 분자의 길이보다 더 짧아도 좋고, 또 상기 EPO 수용체를 활성화시킬 수 있는, 자연적인 또는 재조합 EPO 분절; 손상되지 않은 EPO 분자내에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열을 부분적으로 함유하는 용융된 분자; 여기에 참고로 기재된 Okasinski에게 허여된 미국특허 제 5,888,772에 기재된 것과 같은 아날로그로서, 그것의 아미노산서열은 적혈구생성을 자극하는 생물학적인 활성을 갖는 자연발생적인 EPO와 완전히 동일하지 않지만 거의 유사하며; EPO의 구조가 1개 이상의 치환기나 원자군을 첨가함으로써 개질(또는 결실)된 EPO 유도체; 예를 들어 참고로 여기에 기재되어 있는 Strickland에 의해서 기재된 미국특허 제 5,856,298과 같이 EPO의 다양한 글리코실화 상태를 포함하는 EPO의 동형체; 참고로 여기에 기재되어 있는 Eliott et al에게 허여된 유럽특허(EP 0640619B1)에 기재되어 있는 것과 같이 부가적인 글리코실화 자리나 재배열된 글리코실화 자리를 함유하는 재조합하여 얻은 EPO의 동형체; 참고로 여기에 기재되어 있는 Wrighton et al에게 허여된 미국특허 5,773,569 및 Wilson et al에게 허여된 미국특허 제 5,835,382에 기재되어 있는 것과 같은 펩티드류로서, 이것은 상기 EPO 수용체와 결합하여 활성화하거나 EPO 작용물질과 같이 행동하며; 참고로 여기에 기재된 Sytkowski et al에게 허여된 미국특허 제 5,614,184에 기재되어 있는 것과 같은, 돌연변이화한 분비가능한 EPO 단백질로서, 이것은 변환된 생물학적 활성을 보유하고 있다. 또한, 이러한 정의에 포함되는 것으로 참고로 여기에 기재된 Elliott et al에게 허여된 미국특허 제 5,885,574에 기재되어 있는 것과 같은 필사적(agonistic) 항체 또는 그것의 분절이 있는데, 이것은 에리트로포이에틴 수용체를 활성화시키거나, 또는 이와 달리 EPO의 작용을 모방한다. 상기 모든 에리트로포이에틴과 유사한 물질의 공통적인 작용은 EPO의 1개 이상의 작용을 모방하는 능력을 갖는다는 것이다.

적혈구용적 증강제의 "화학요법적으로 효과적인" 양이라는 것은, 적혈구의 생성을 증가시켜서 상기 적혈구용적의 정상적인 상한을 증가시키기에 충분한 자연적으로 발생되거나 재조합하여 생성된 EPO 또는 EPO 유사물질의 양을 의미한다. 예를 들어, 물질의 중량 kg당 15-1,500 단위, 바람직하게는 50-300단위의 범위에 있는 양이, 여기에 참고로 기재된 미국특허 제 5,013,718에서 화학요법적으로 효과적인 것으로 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 적혈구용적을 증가시킴으로써 특정 항종양제의 효과를 증강시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 그러한 치료가 필요한 환자에게항종양제와 적혈구용적을 증가시키는 제제의 조합체를 투여하는 과정을 포함한다.

본 발명의 방법은 인간의 암종양, 특히 백금화합물로 치료가능한 고형 종양과 같은 포유동물의 암종양의 치료에 유용하다.

여기에 한정되지는 않지만, 그러한 종양으로는 선암, 흑색종, 림프종, 육종 및 폐, 유방, 난소, 머리 및/또는 목, 전립선, 경추, 자궁내막, 결장직장, 위, 간, 난관, 식도, 소장, 췌장, 신장, 부신, 질, 외음, 뇌 및 고환종양이 있다.

본 발명의 방법에 대해서, 상기 적혈구용적을 증가시키는 제제와 함께 1개 이상의 항종양제가 같이 투여된다. 상기 항종양제 및 적혈구용적 증강제는 동시에 또는 연속적으로 투여하여도 좋지만, 항종양제를 투여하기 전에 적혈구용적 증강제 를 투여하는 것이 바람직하다. 항종양제로는, 상기 백금 배위화합물과 같은 백금함유 화합물이 있다. 본 발명의 백금 배위화합물로는 백금(II) 및 백금(IV)화합물이 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

암세포에 세포독성 효과를 보유하는 것으로 알려진 백금화합물의 2가지 예로는, 시스플라틴과 카르보플라틴이 있다. 이러한 2개의 화합물은 구조중에 (OOC)₂-C 결합이 있기 때문에 "말로나토"라고 하는 화합물군의 일종이다. 시스플라틴은 황색빛이 도는 백색분말로서, 이것은 수평면상에 염소와 암모니아기를 함유한다. 카르보플라틴은 순백 내지 순백이 아닌 결정질 분말이다. 시스플라틴과 같이, 카르보플라틴은 소세포 폐암, 판상세포 암 및 고환암과 같은 인간에게 발병되는 다양한 암을 치료하는데 사용되어 오고 있다(미국 Pharmacists, September, 1989, 62-63페이지 참조). 특정한 이론을 적용하지 않더라도, 상기 백금 배위화합물이 DNA의 상보성 스트랜드를 가교결합함으로써 DNA 합성을 방해하여 항종양 활성을 나타낸다는 것은 정설화되어 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 백금화합물은 시스플라틴이다.

상기 항종양제는 특수요법에 적당한 통상적인 경로에 의해서 약학적으로 허용되는 캐리어를 통하여 환자에게 투여된다. 예를 들어, 상기 항종양제는 정맥내, 복강내, 피하, 근육내의 경로에 의해서, 또는 효과적인 형태로 혈관내에 직접 주입하여 운반되어도 좋다. 또한, 상기 항종양제는 참고로 여기에 기재된 미국특허 제 5,620,703에 기재된 대로 세포내 지방입자로 캡슐화하여 투여하여도 좋다. 본 발명의 항종양제의 효과적인 용량은 항종양 효과를 갖는다고 공지된 정도로서, 상기 용 량은 당업자에게 공지되어 있거나, 경험적으로 측정할 수 있는 양이다. 예를 들어, 다수 화학요법의 투약원리는 일반적으로 외과의의 데스크 레퍼런스(desk reference)를 일반적으로 참고하여 실시한다. 백금화합물의 투약량은 대략 1-200mg/kg/투약량이고, 이러한 화합물은 3-5일의 기간에 걸쳐서 단독으로 주사하거나 복합적으로 주사하는데, 이러한 사이클은 필요에 따라 반복할 수도 있다. 하루치료량을 1회의 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 시스플라틴의 투약량은 일반적으로 25-300mg/㎡이고, 보다 바람직한 범위는 50-100mg/㎡이다. 충분한 수화력을 유지하기 위해서, 일반적인 식염수를 하기 시스플라틴을 주입하기 전에 투여한다.

본 발명의 적혈구용적 증강제로는, 그 제제로 처치한 각 적혈구세포의 수를 증가시키는 제제라면 어느 것이어도 좋은데, 예를 들어 본 발명의 방법에 유용한 적혈구용적 증강제로는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 에리트로포이에틴 및 에리트로포이에틴 유사물질이 있다. 상기 적혈구용적 증강제는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 적혈구용적을 증가시키기 위해서 유용하게 사용되며 당업자에게 공지되어 있는 투약량으로 정맥, 복강내 또는 피하경로를 통한 종래방법으로 투여할 수도 있다. EPO를 플라즈마 상태로 그것의 반감기가 약 5시간인 복합투여로 투여하여도 좋다. 또한, 개체의 세포에 EPO를 주입하는데 트랜스펙션 기술을 사용할 수도 있으며, 유사한 투여경로를 EPO유사물질에 대해서도 사용할 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 주당 3차례정도로 정맥이나 피하를 통하여 50-100단위/kg 체중을 투여한다.

상기 치료효과는 종양을 평가함으로써 측정할 수 있는데, 촉진가능한 종양은 종래방법으로 측정할 수 있다. CT 스캔, MRI 스캔, 초음파검사와 같은 화상기술들도 종양의 크기를 측정하여 평가하는데 사용할 수 있다. 또한, 여기에 한정되는 것은 아니나, 전립선암용 PSA, 난소암용 CA-125, 유방암용 CA-15-3과 같은 특정 암 마아커를 종양평가를 위해서 정량화할 수 있다. 감응을 평가하는데 표준기준을 사용할 수 있는데, 예를 들어 암치료의 결과를 보고하는 WHO 핸드북(WHO Offset Pubrication, 1979)에 기재되어 있는 기준을 따라도 좋다. 따라서, 완전히 감응된 것, 부분적으로 감응된 것 또는 전혀 감응되지 않은 것으로서 종양을 분류할 수도 있다. 시스플라틴 및 EPO의 치료사이클은 허용가능할 정도로 감응되거나, 허용될 수 없는 독성효과가 관찰될 때까지 연속하여도 좋다.

도1은 난소종양 증가에 대한 시스플라틴 및 에리트로포이에틴의 투여효과를 시간의 함수로 표시한 도면이다.

도2는 적혈구용적의 퍼센트변화에 대한 시스플라틴, 에리트로포이에틴의 투여효과를 시간의 함수로 표시한 도면이다.

실시예1

본 실시예는 EPO를 사용하여 적혈구용적을 전처리, 증강 및 유지시킨 SCID 쥐에 그래프트한 인간세포에 대한 시스플라틴 감도효과를 나타내는 것이다. 이러한 실시예를 설명하기 위해서, 인간 난소암을 보유하고 있는 면역력이 결핍된 SICD에서 실험을 실시하였다. 이러한 쥐는 당업자에 의해서 잠재적인 화학요법제의 항종 양 효과를 증명하기 위한 적합한 동물모델로 여겨지고 있다.

80마리의 CB 17-SCID/SCID 쥐(타코닉 랩)를 사용하는데, 이 동물을 불임상태 및 빛을 제어한 조건하에서 두었다. 재발단계 IIIC에 있는 환자로부터 취한 3기 종양의 일부로서, 난소에 있는 유두모양의 심하게 진전된 정도의 선암을 이식하고 나서, 당업자에게 잘 공지되어 있는 과정으로 SCID 쥐에서 증식시켰다. 간단히 말하자면, 이종이식편을 배양하여, 종양을 이식하기 전에 5차례 이상 실험동물에 이송하였다. 6주령의 40마리의 실험쥐에서, 상기 인간 이종이식된 종양의 2-3mm 조각을 봉합결찰하여, 참고로 여기에 기재되어 있는 Sakakibara et al.(1996, Can. J. Sci. Amer., 2: 291-300)에 기재된 방법으로 고나달 지방 패드(GFP)에 이식하였다. 상기 GFP 종양 이종이식편은 복부검사에 의해서 촉진이 가능할 정도로 큰 크기로 복강내에서 배양되었다. 각 쥐를 흉골에서 장골 가슴정도까지 뻗은 중심선을 따라서 절개함으로써 연속적으로 개복하였다. 종양에 밀착된 부분을 용해시키고, GFP 페디칼(pedical)을 자극하지 않으면서 상기 종양을 복강내 구멍을 통하여 들어내고 나서, 버니어 캘리퍼스를 사용하여 3차원적으로 종양을 측정하였다. 그런 다음, 상기 종양을 원래 복강내 제위치에 복귀시키고, 복부의 단층을 봉합하였다. 3일이 경과한 후에, 치료 프로토콜이 개시되었다. 쥐를 4개의 치료군중의 어느 하나에 무작위적으로 배치하였다. 복강내에 시스플라틴 또는 인산완충 식염수(PBS)을 주입한 첫날을 0일(제로데이)로 정의하고, I군의 동물(대조군)에게는 -15~+6일동안에는 주당 3차례 100㎕의 PBS를 주입하고, 0일째에는 300㎕의 PBS를 피하로 주입하였다. II군의 쥐(EPO군)에게는 -15~+6일동안에는 주당 3차례 PBS 100㎕에 20단위의 투약 량으로 그리고 0날째에는 PBS ip 300㎕의 투약량으로 EPO를 피하로 주입하였다. III군(시스플라틴군)의 쥐에게는 0일째에는 300㎕의 PBS에 5mg/kg의 투약량으로 그리고 -15~+6일째에는 주당 3차례 PBS 100㎕를 피하로 주사하였다. IV군(EPO + 시스플라틴군)의 쥐에게는 -15~+6일 동안에는 II군과 동일하게 ip 시스플라틴을 주사하고, 0일째에는 III군에서와 마찬가지로 ip 시스플라틴을 주사한 다음, 8일까지 쥐를 관찰하였다.

-15, -7, 0, +7일에 각 군으로부터 무작위적으로 선택된 3마리의 쥐로부터 채혈하여 자동화된 적혈구용적을 얻었다. 각각 1회씩만 취혈하였다. 7일째에, 쥐를 죽여서 부검하였다. 종양을 절제하고, 버니어 캘리퍼스로 3차원적으로 측정하였다. 종양용적을 하기 식으로 계산하였다.

(폭) ×(길이) ×(높이) = 종양용적

또한, 종양성장율을 하기 식으로 계산하였다.

[(부검한 종양용적/처음의 종양용적)-1] ×100 = 종양성장율(%)

처음 개복시에 종양의 크기는 대략 3차원적으로 2cm ×1.5cm ×1cm이었고, 각 치료군에서도 마찬가지였다. 시스플라틴으로 치료하고 치료하지 않은 군에서 종양성장율에 현저한 차이가 확인되었다. 시스플라틴으로만 처치한 쥐의 종양의 크기와 EPO와 시스플라틴을 함께 처치한 쥐의 종양의 크기 사이에서, EPO에 의한 시스플라틴의 효과의 향상을 시사하는 차이(P=0.07)가 확인된 반면, 상기 대조군과 상기 EPO군에서는 어떠한 차이도 확인되지 않았다.

본 실시예의 또 다른 실험예에서, 치료시 시스플라틴을 2회 투여하였다. 또 한, 6주령의 40마리의 실험용 쥐에게 인간 난소암 이종이식편 2mm 조각을 이식하였다. 치료군을 이식한 후, 3일 뒤에 무작위적으로 할당하였다. I군의 동물(대조군)에게는 -15~+13일동안에는 주당 3차례 100㎕의 PBS를 주입하고, 0 및 7일째에는 300㎕의 PBS를 피하로 주입하였다. II군의 쥐(EPO군)에게는 -15~+13일동안에 주당 3차례 PBS 100㎕에 20단위의 투약량으로, 그리고 0 및 7일째에는 PBS ip 300㎕의 투약량으로 EPO를 피하로 주입하였다. III군(시스플라틴군)의 쥐에게는 0 및 7일째에는 PBS 300㎕에 5mg/kg의 투약량으로 그리고 -15~+13일째에는 주당 3차례로 PBS 100㎕를 피하로 주사하였다. IV군(EPO + 시스플라틴군)의 쥐에게는 -15~+13일 동안에 II군과 동일하게 주당 3차례로 EPO를 피하로 주사하고, 0 및 7일째에는 III군에서와 마찬가지로 ip 시스플라틴을 주사한 다음, +15일까지 쥐를 관찰하였다.

-15, -7, 0, +7, +14일에 상기한 대로 자동화 적혈구용적을 얻었다. 초기 적혈구용적에 대한 적혈구용적의 변화를 시간에 따라 기록하였다. 종양의 작은 마디를 0일부터 시작하여 버니어 캘리퍼스를 사용하여 2차원적으로 연속적으로 측정하였다. 0일째에는, 각 군에서 그 종양의 크기는 대략 4mm ×5mm로 성장하였다. 종양용적은 하기 식을 사용하여, 0, +1, +3, +5, +7, +9, +11, +13, +15일에 하기 식을 사용하여 계산하였다.

(길이) ×(폭) ² /2 = 종양용적

0일과 비교하여 각 인덱스 일자에 대해 종양성장율(%)을 계산하고, 시간에 따라 표시하였다.

통계적인 분석으로는, 다량의 GPF 종양시험에서 총괄적인 종양성장을 평가하기 위한 스튜던트 T 테스트가 있다. 보다 적은 피하종양군에서 진전된 성장곡선 및 시간에 따른 적혈구용적의 변화를 나타내는 곡선을 평방편차분석으로 분석하였다. P값이 0.05 미만인 것이 중요하게 여겨진다.

시스플라틴을 일주일에 2회 투여하는 경우, EPO + 시스플라틴군과 시스플라틴군(도1)에서 현저한 차이가 확인되었다(p＜0.05). 시스플라틴군과 비교해서, 상기 EPO + 시스플라틴군에서 종양의 감소가 보다 현저해지는 것이 증명된 피하종양에 대하여 종양 성장곡선을 표시하였다. 또한, 대조군과 EPO군 사이에서는 별 차이가 관찰되지 않았다.

주당 적혈구용적과, 소형 피하종양이 있는 쥐에 대해서 시간에 따른 적혈구용적의 변화를 표1 및 도2에 각각 표시한다. 다량의 GFP 종양을 보유하고 있는 쥐로부터 취한 적혈구용적은 유사하다(데이터가 표시되어 있지 않음). EPO를 투여하면, 그것의 초기값에 비해서 적혈구용적이 25-35% 증가하게 되며, 대조군과 비교해서 볼때 매우 상이하였다(p ＜ 0.01). EPO를 병용하지 않은 시스플라틴을 사용하면 적혈구용적이 20% 감소하였다. 대조군에서 종양을 보유하고 있는 쥐는 시간에 따라 적혈구용적이 2% 감소하였다(도2).

시간	적혈구용적
시간	대조	EPO	시스플라틴	EPO + 시스플라틴
-2주	39.5 ±0.1	39.5 ±0.2	39.8 ±0.2	39.6 ±0.2
-1주	39.7 ±0.3	44.9 ±0.2	39.8 ±0.2	45.1 ±0.3
0주	39.8 ±0.3	48.9 ±0.3	39.8 ±0.3	48.9 ±0.2
+1주	40.8 ±0.2	49.3 ±0.3	40.7 ±0.1	52.7 ±0.3
+2주	38.6 ±0.3	53.6 ±0.4	33.1 ±0.3	50.9 ±0.3

이러한 데이터로부터, 시스플라틴만으로 쥐를 치료하는 것에 비해서 EPO와 시스플라틴을 사용하면 종양억제효과가 훨씬 크다는 것을 알 수 있다.

시스플라틴군에서의 쥐와 비교해서, 상기 EPO + 시스플라틴군에서의 쥐의 적혈구용적이 25-35% 증가하였다.

실시예2

본 실시예는 증가하는 적혈구용적이 항종양제의 독성과 연관된 치사율을 감소시킨다는 것을 증명하고 있다. 이러한 실시예를 설명하기 위해서, 다양한 치료를 받은 실시예1의 쥐의 행동상태를 평가하였다. 실험쥐에서 치사율 및 이환율과 관련된 5가지 객관적인 기준을 사용하여 쥐의 행동상태의 추이를 0, +7, +14일에 대해서 평가하였다. 상기 5가지 기준이라는 것은, (1)구겨진 털, (2)허약함/무기력, (3)대조동물의 평균중량에 비해서 20중량% 이상의 감량, (4)후만의 구부린 자세, 및 (5) 사망이다.

0일째에는 모든 쥐의 행동상태는 각 치료군에서 정상적인 건강한 쥐와 같았다(모든 스코어가 0임). 표2에 표시한 대로, +7일까지 시스플라틴에서의 치사율 신호가 표시되어 있다(표2). 대조군 및 EPO군에서 모든 쥐의 행동상태 스코어는 0으로 유지되어 있다. 상기 시스플라틴군에서의 10마리쥐중에서, 모두가 털이 구겨지고, 허약함/무기력의 징후를 보이며, 그 중 6마리가 +7일째의 대조군과 비교하여 20중량%의 감량이 있었다. 상기 EPO + 시스플라틴군에서는, 모든 쥐의 털이 구겨져 있는 상태이고, 7마리가 허약함/무기력 징후를 나타내었다. +14일째에는, 시스플라 틴군에서의 쥐의 행동상태가 더욱더 감퇴하여 이 중 4마리가 죽고, 3마리의 쥐가 후만이 구부러지는 증상을 나타내는 것에 비해서, 상기 EPO + 시스플라틴군에서는 단 1의 치사율이 관찰되고, 또 다른 1마리가 후만의 구부러짐 증상을 나타내었다(표2).

쥐 번호	대조	EPO	시스플라틴	EPO + 시스플라틴
1	0	0	+++++	++
2	0	0	+++	+++
3	0	0	++++	+++
4	0	0	+++++	++
5	0	0	+++++	+++
6	0	0	+++	++++
7	0	0	++++	++
8	0	0	+++	++
9	0	0	++++	+++++
10	0	0	+++++	+++
합계	0	0	43+	29+

따라서, 상기 EPO + 시스플라틴으로 치료한 쥐에 비해서, 시스플라틴으로 치료한 동물에서 치사율이 보다 높았다. 또한, EPO로 치료한 쥐는 보다 나은 행동상태를 유지하며, 시스플라틴과 비교해서 치사율이 보다 적었다. 굳이 어떤 이론을 적용하여 설명하지 않더라도, 상기 EPO + 시스플라틴군에서 얻어진 증강된 항종양효과는 허용가능한 행동상태라고 하기 보다는, 증가된 적혈구용적에 기인한 것이라고 추정된다.

본 발명을 지금까지 상세하게 기재하였지만, 상기 실시예들은 단지 설명을 목적으로 하는 것을 염두해 두어야하며, 당업자에게는 자명한 본 발명의 실시예의 기타 변형은 첨부된 청구범위의 범주내에서 행해질 수 있다.

본 발명은 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체를 투여함으로써 고형 종양을 치료하는 방법, 항종양 백금화합물 및 에리트로포이에틴이나 그와 유사한 화합물을 투여함으로써 고형 종양을 치료하는 방법, 및 보다 상세하게는, 시스플라틴 및 에리트로포이에틴의 조합체를 투여함으로써 난소종양을 치료하는 방법을 제공한다.

Claims

(a)화학요법적으로 유효량의 항종양제 및 (b)적혈구용적 증강제로 구성되는 조합체로서, 상승적인 항종양 효과를 보유하고, 상기 항종양제는 시스플라틴 또는카르보플라틴이며 상기 적혈구용적 증강제는 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유사물질인 것을 특징으로 하는 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체.
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제1항에 있어서, 상기 시스플라틴은 25mg/㎡~300mg/㎡의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체.
제11항에 있어서, 상기 시스플라틴은 50mg/㎡~100mg/㎡의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 항종양제 및 적혈구용적 증강제의 조합체.
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