JPH1067678A - 肝疾患治療用医薬組成物 - Google Patents
肝疾患治療用医薬組成物Info
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- JPH1067678A JPH1067678A JP9158745A JP15874597A JPH1067678A JP H1067678 A JPH1067678 A JP H1067678A JP 9158745 A JP9158745 A JP 9158745A JP 15874597 A JP15874597 A JP 15874597A JP H1067678 A JPH1067678 A JP H1067678A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 エリスロポエチンを有効成分とする、肝
疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少させ、該哺乳動
物の肝機能を改善するための肝疾患治療用医薬組成物。 【効果】 本発明のエリスロポエチンを有効成分とする
医薬組成物によれば、肝疾患哺乳動物の肝内の過剰の鉄
イオンを減少させることができるので、過剰鉄イオンに
よる慢性肝炎や肝癌、肝硬変等の治療に有効である。更
に、該医薬組成物の投与と瀉血療法を併用すれば、瀉血
に伴う患者の貧血を防止すると共に、肝細胞からの過剰
の鉄イオンの排泄を促進させることができる。また、Ｉ
ＦＮ療法が効果を示さないＣ型慢性肝炎患者に対し、本
発明の医薬組成物を投与して肝機能を改善した後、公知
のＩＦＮ療法を行うことにより該肝炎の治療効果を期待
することができる。
疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少させ、該哺乳動
物の肝機能を改善するための肝疾患治療用医薬組成物。 【効果】 本発明のエリスロポエチンを有効成分とする
医薬組成物によれば、肝疾患哺乳動物の肝内の過剰の鉄
イオンを減少させることができるので、過剰鉄イオンに
よる慢性肝炎や肝癌、肝硬変等の治療に有効である。更
に、該医薬組成物の投与と瀉血療法を併用すれば、瀉血
に伴う患者の貧血を防止すると共に、肝細胞からの過剰
の鉄イオンの排泄を促進させることができる。また、Ｉ
ＦＮ療法が効果を示さないＣ型慢性肝炎患者に対し、本
発明の医薬組成物を投与して肝機能を改善した後、公知
のＩＦＮ療法を行うことにより該肝炎の治療効果を期待
することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エリスロポエチン
を有効成分とする肝疾患治療用医薬組成物に関する。詳
しくは、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などの肝疾患と密接な
関係があるといわれている肝内の過剰の鉄イオンを、好
ましくは瀉血療法を併用して肝細胞から取り出し、低下
させることにより、肝機能を改善するための肝疾患治療
用医薬組成物に関する。
を有効成分とする肝疾患治療用医薬組成物に関する。詳
しくは、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などの肝疾患と密接な
関係があるといわれている肝内の過剰の鉄イオンを、好
ましくは瀉血療法を併用して肝細胞から取り出し、低下
させることにより、肝機能を改善するための肝疾患治療
用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】慢性肝炎は、肝硬変、肝癌に移行する重篤
な肝疾患であり、大部分はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
の感染によって引き起こされる。現在、Ｃ型慢性肝炎に
対してインターフェロン（ＩＦＮ）療法が行われている
が、重篤な副作用が知られているにも関わらず４〜６ヶ
月間の長期投与が必要であり、しかも、治療効果も限ら
れているのが実状である。例えば、ＩＦＮ療法の効果と
ＨＣＶの性状に関する研究から、ＩＦＮ療法が著効を示
すのは遺伝子型がIII 型を示すウイルス（日本では１〜
２割）であり、日本で７割以上を占めるII型ウイルスに
は20〜30％の反応性しか期待できないことが報告されて
いる〔飯野ら、最新医学、99、2225（1993）〕。そのた
め、ＩＦＮ療法が効果を示さない患者に対する新たな治
療法の開発が望まれている。
な肝疾患であり、大部分はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
の感染によって引き起こされる。現在、Ｃ型慢性肝炎に
対してインターフェロン（ＩＦＮ）療法が行われている
が、重篤な副作用が知られているにも関わらず４〜６ヶ
月間の長期投与が必要であり、しかも、治療効果も限ら
れているのが実状である。例えば、ＩＦＮ療法の効果と
ＨＣＶの性状に関する研究から、ＩＦＮ療法が著効を示
すのは遺伝子型がIII 型を示すウイルス（日本では１〜
２割）であり、日本で７割以上を占めるII型ウイルスに
は20〜30％の反応性しか期待できないことが報告されて
いる〔飯野ら、最新医学、99、2225（1993）〕。そのた
め、ＩＦＮ療法が効果を示さない患者に対する新たな治
療法の開発が望まれている。
【０００３】本発明者らは、慢性肝炎を基盤として発生
するヒト肝癌のモデル動物（ＬＥＣラット）を用いて肝
障害発症機構を研究したところ、ＬＥＣラットを銅、鉄
などの金属イオンを含む普通飼料で飼育した場合、急激
な肝銅濃度上昇および肝鉄濃度上昇を引き起こし、高い
割合で劇症肝炎を発症するのに対し、鉄欠乏食で飼育し
た場合には、肝銅濃度は普通飼料飼育と同様に急増する
ものの、肝鉄濃度の上昇は軽微であり、劇症肝炎の発症
は認められないことを見い出した。これらのことから、
直接的に肝障害を引き起こす主要因子は、肝内に異常増
加した鉄イオンであるという知見を得た〔小船ら、第53
回日本癌学会総会要旨集、第91頁、1994年〕。実際、瀉
血により鉄イオンを除去することによってＣ型慢性活動
性肝炎が鎮静化する可能性〔瀧川ら、第27回日本肝臓学
会西部会要旨集、Vol. 33 、Supple (2)、第49頁、1992
年〕や、瀉血によりＩＦＮ不応答性が応答性に変わる可
能性〔林ら、医学と薬学、29、1487（1993）〕も報告さ
れている。しかしながら、急激な瀉血は肝鉄濃度減少に
有効であるものの、患者に貧血状態をもたらし、全身症
状の悪化により継続的な治療を困難にする。また、患者
が過度の貧血に陥らないようコントロールしながら瀉血
を行う場合には、十分な治療効果を得るまでに１〜２年
もの長期間を必要とするが、慢性肝炎は多くが肝硬変、
肝癌に移行することから、できるだけ速やかに肝機能を
改善させる治療法の開発が強く要望されている。
するヒト肝癌のモデル動物（ＬＥＣラット）を用いて肝
障害発症機構を研究したところ、ＬＥＣラットを銅、鉄
などの金属イオンを含む普通飼料で飼育した場合、急激
な肝銅濃度上昇および肝鉄濃度上昇を引き起こし、高い
割合で劇症肝炎を発症するのに対し、鉄欠乏食で飼育し
た場合には、肝銅濃度は普通飼料飼育と同様に急増する
ものの、肝鉄濃度の上昇は軽微であり、劇症肝炎の発症
は認められないことを見い出した。これらのことから、
直接的に肝障害を引き起こす主要因子は、肝内に異常増
加した鉄イオンであるという知見を得た〔小船ら、第53
回日本癌学会総会要旨集、第91頁、1994年〕。実際、瀉
血により鉄イオンを除去することによってＣ型慢性活動
性肝炎が鎮静化する可能性〔瀧川ら、第27回日本肝臓学
会西部会要旨集、Vol. 33 、Supple (2)、第49頁、1992
年〕や、瀉血によりＩＦＮ不応答性が応答性に変わる可
能性〔林ら、医学と薬学、29、1487（1993）〕も報告さ
れている。しかしながら、急激な瀉血は肝鉄濃度減少に
有効であるものの、患者に貧血状態をもたらし、全身症
状の悪化により継続的な治療を困難にする。また、患者
が過度の貧血に陥らないようコントロールしながら瀉血
を行う場合には、十分な治療効果を得るまでに１〜２年
もの長期間を必要とするが、慢性肝炎は多くが肝硬変、
肝癌に移行することから、できるだけ速やかに肝機能を
改善させる治療法の開発が強く要望されている。
【０００４】また、癌マーカーの抗原の一つがトランス
フェリンレセプターであること [Trowbridge, I.S. and
Omary, M.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3039
-3043, (1981)]、さらに、本発明者らの一部により、活
発に分裂増殖している癌細胞にトランスフェリンレセプ
ターが豊富に存在すること、トランスフェリンレセプタ
ーが、細胞増殖能や癌の悪性度を反映するマーカーであ
ることが報告されている [J. Jpn. Cancer Ther. 21
(3), 641〜646, Apr. (1986)] ことから、癌細胞が活発
に増殖するために多くの鉄イオンを要求していることも
示唆される。
フェリンレセプターであること [Trowbridge, I.S. and
Omary, M.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3039
-3043, (1981)]、さらに、本発明者らの一部により、活
発に分裂増殖している癌細胞にトランスフェリンレセプ
ターが豊富に存在すること、トランスフェリンレセプタ
ーが、細胞増殖能や癌の悪性度を反映するマーカーであ
ることが報告されている [J. Jpn. Cancer Ther. 21
(3), 641〜646, Apr. (1986)] ことから、癌細胞が活発
に増殖するために多くの鉄イオンを要求していることも
示唆される。
【０００５】一方、腎機能障害からくる慢性貧血改善の
ための輸血により誘発される血色素症の治療のために、
貧血性の血液透析患者にエリスロポエチンを投与し、瀉
血によって貯蔵鉄や血清鉄を減少させることが提案され
ている（特公平６−９２３１６）。しかしながら、肝疾
患患者、特に、慢性肝炎患者や肝癌患者の肝機能が改善
されるかどうかについては何ら記載されていない。
ための輸血により誘発される血色素症の治療のために、
貧血性の血液透析患者にエリスロポエチンを投与し、瀉
血によって貯蔵鉄や血清鉄を減少させることが提案され
ている（特公平６−９２３１６）。しかしながら、肝疾
患患者、特に、慢性肝炎患者や肝癌患者の肝機能が改善
されるかどうかについては何ら記載されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、肝鉄代謝と
エリスロポエチンとの関係について明らかにするととも
に、エリスロポエチンを有効成分として含有する肝疾患
治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
エリスロポエチンとの関係について明らかにするととも
に、エリスロポエチンを有効成分として含有する肝疾患
治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、エリスロポエチン
が何らかの特異的受容体を介して肝細胞から直接鉄の放
出を亢進し、肝内の過剰の鉄イオンを低下させることに
よって、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などの肝疾患患者の肝
機能を改善する作用を有することを初めて見い出した。
また、エリスロポエチン投与と瀉血療法とを併用するこ
とによって、患者に過度の貧血を強いることなく、安全
でしかも短期間で肝機能を改善することができること、
さらには、癌化した肝細胞の増殖をエリスロポエチンに
よって抑制することができることを知得し、本発明を完
成するに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、エリスロポエチン
が何らかの特異的受容体を介して肝細胞から直接鉄の放
出を亢進し、肝内の過剰の鉄イオンを低下させることに
よって、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などの肝疾患患者の肝
機能を改善する作用を有することを初めて見い出した。
また、エリスロポエチン投与と瀉血療法とを併用するこ
とによって、患者に過度の貧血を強いることなく、安全
でしかも短期間で肝機能を改善することができること、
さらには、癌化した肝細胞の増殖をエリスロポエチンに
よって抑制することができることを知得し、本発明を完
成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、エリスロポエチンを有効
成分とする、肝疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少
させ、該哺乳動物の肝機能を改善するための肝疾患治療
用医薬組成物である。以下、本発明を詳細に説明する。
成分とする、肝疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少
させ、該哺乳動物の肝機能を改善するための肝疾患治療
用医薬組成物である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の医薬組成物の有効成分で
あるエリスロポエチンは、赤芽球系前駆細胞を赤血球に
分化させる作用を有する分子量（見掛け）約36,000ダル
トンの糖蛋白質であり、ヒト尿などから精製される天然
エリスロポエチン、遺伝子工学的手法によって得られる
組換えエリスロポエチンおよびその改変体など公知の種
々のものが使用できる（特公平１−４４３１７、特公平
２−１７１５６など）。
あるエリスロポエチンは、赤芽球系前駆細胞を赤血球に
分化させる作用を有する分子量（見掛け）約36,000ダル
トンの糖蛋白質であり、ヒト尿などから精製される天然
エリスロポエチン、遺伝子工学的手法によって得られる
組換えエリスロポエチンおよびその改変体など公知の種
々のものが使用できる（特公平１−４４３１７、特公平
２−１７１５６など）。
【００１０】上記のエリスロポエチンを医薬組成物とす
る場合は、単独で生理的食塩水等に溶解してもよいが、
通常は、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、マ
ンニトール、ソルビトール等の糖などと共に生理的食塩
水に溶解する。特に、0.01〜0.1 重量％のヒト血清アル
ブミンおよび 1〜1.5 重量％のＤ−マンニトールと共に
生理的食塩水に溶解したものが好適である。上記の生理
食塩水中には、医薬上許容可能な安定化剤、ｐＨ、浸透
圧などの調整剤を適宜添加してもよい。
る場合は、単独で生理的食塩水等に溶解してもよいが、
通常は、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、マ
ンニトール、ソルビトール等の糖などと共に生理的食塩
水に溶解する。特に、0.01〜0.1 重量％のヒト血清アル
ブミンおよび 1〜1.5 重量％のＤ−マンニトールと共に
生理的食塩水に溶解したものが好適である。上記の生理
食塩水中には、医薬上許容可能な安定化剤、ｐＨ、浸透
圧などの調整剤を適宜添加してもよい。
【００１１】本発明の医薬組成物は投与量は、症状の程
度、治療対象となる哺乳動物の年齢、体重等により異な
るが、有効成分であるエリスロポエチン治療上有効量、
例えば、組換えエリスロポエチンであれば10〜10,000ユ
ニット／kg体重の範囲が例示される。また、下記の瀉血
療法を併用する場合は、10〜2,000 ユニット／kg体重の
範囲で投与する。
度、治療対象となる哺乳動物の年齢、体重等により異な
るが、有効成分であるエリスロポエチン治療上有効量、
例えば、組換えエリスロポエチンであれば10〜10,000ユ
ニット／kg体重の範囲が例示される。また、下記の瀉血
療法を併用する場合は、10〜2,000 ユニット／kg体重の
範囲で投与する。
【００１２】本発明においては、エリスロポエチンの投
与により赤血球の産生が促進されるので、瀉血療法など
の除血方法を併用して過剰の赤血球を除去するのが好ま
しい。瀉血療法としては、例えば、肝炎、肝癌、肝硬変
などの患者に対し、約200 ml／回程度の瀉血を行った後
に、本発明の医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
かかる方法により、瀉血に伴う患者の貧血を防止すると
共に、肝細胞からの過剰の鉄イオンの排泄を促進させる
ことができる。
与により赤血球の産生が促進されるので、瀉血療法など
の除血方法を併用して過剰の赤血球を除去するのが好ま
しい。瀉血療法としては、例えば、肝炎、肝癌、肝硬変
などの患者に対し、約200 ml／回程度の瀉血を行った後
に、本発明の医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
かかる方法により、瀉血に伴う患者の貧血を防止すると
共に、肝細胞からの過剰の鉄イオンの排泄を促進させる
ことができる。
【００１３】本発明の医薬組成物により治療されうる疾
患は、肝細胞の過剰鉄イオンに起因すると考えられる肝
疾患、例えば、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などが挙げられ
る。慢性肝炎は、その多くはＣ型肝炎ウイルスの感染に
よるものであり、Ｃ型慢性肝炎やＣ型劇症肝炎などが挙
げられる。
患は、肝細胞の過剰鉄イオンに起因すると考えられる肝
疾患、例えば、慢性肝炎や肝癌、肝硬変などが挙げられ
る。慢性肝炎は、その多くはＣ型肝炎ウイルスの感染に
よるものであり、Ｃ型慢性肝炎やＣ型劇症肝炎などが挙
げられる。
【００１４】
【実施例】以下に試験例、実施例を挙げてさらに具体的
に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 〔試験例１〕 肝細胞に対するエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）結合能の測定 Indogen 法 [Franker, P.J. and Speck, J.C.Jr., Bioc
hem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978)]に従
い作製した125 Ｉ−ＥＰＯおよび125 Ｉ−ＥＰＯを0.05
N 塩酸存在下で80℃、60分間処理することによって得ら
れた125 Ｉ−アシアロＥＰＯを用いて、肝実質細胞表面
への結合能を測定した。なお、結合能の測定は、公知の
方法 [Higuchi, M. et al., J. Biol. Chem., 267, 770
3-7709 (1992)]に準じて行った。
に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 〔試験例１〕 肝細胞に対するエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）結合能の測定 Indogen 法 [Franker, P.J. and Speck, J.C.Jr., Bioc
hem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978)]に従
い作製した125 Ｉ−ＥＰＯおよび125 Ｉ−ＥＰＯを0.05
N 塩酸存在下で80℃、60分間処理することによって得ら
れた125 Ｉ−アシアロＥＰＯを用いて、肝実質細胞表面
への結合能を測定した。なお、結合能の測定は、公知の
方法 [Higuchi, M. et al., J. Biol. Chem., 267, 770
3-7709 (1992)]に準じて行った。
【００１５】先ず、コラゲナーゼ潅流法によって得たマ
ウス肝実質細胞（ＡＭＬＣ）画分に対して0.5nM の125I
−アシアロＥＰＯを添加し、125I−アシアロＥＰＯの肝
実質細胞画分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰ
Ｏ、およびアシアロα１−acid−glycoproteinの阻害効
果を測定した。その結果を図１に示す。図１より、125I
−アシアロＥＰＯは肝実質細胞画分に結合することが分
かった。また、アシアロＥＰＯおよびアシアロα１−ac
id−glycoproteinがほぼ同程度に125I−アシアロＥＰＯ
結合を阻害するが、ＥＰＯは顕著な結合阻害効果を示さ
ないことが分かった。この結果は、125I−アシアロＥＰ
Ｏの肝実質細胞画分への結合がＥＰＯレセプターを介す
るものではなく、アシアロ糖蛋白質レセプターへの結合
であることを示している。
ウス肝実質細胞（ＡＭＬＣ）画分に対して0.5nM の125I
−アシアロＥＰＯを添加し、125I−アシアロＥＰＯの肝
実質細胞画分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰ
Ｏ、およびアシアロα１−acid−glycoproteinの阻害効
果を測定した。その結果を図１に示す。図１より、125I
−アシアロＥＰＯは肝実質細胞画分に結合することが分
かった。また、アシアロＥＰＯおよびアシアロα１−ac
id−glycoproteinがほぼ同程度に125I−アシアロＥＰＯ
結合を阻害するが、ＥＰＯは顕著な結合阻害効果を示さ
ないことが分かった。この結果は、125I−アシアロＥＰ
Ｏの肝実質細胞画分への結合がＥＰＯレセプターを介す
るものではなく、アシアロ糖蛋白質レセプターへの結合
であることを示している。
【００１６】一方、125I−ＥＰＯ（0.5nM)の肝実質細胞
画分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯおよびア
シアロα１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した
結果、図２に示すように、ＥＰＯが最も強い阻害効果を
示し、アシアロＥＰＯおよびアシアロα１−acid−glyc
oproteinの阻害効果は部分的なものであった。
画分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯおよびア
シアロα１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した
結果、図２に示すように、ＥＰＯが最も強い阻害効果を
示し、アシアロＥＰＯおよびアシアロα１−acid−glyc
oproteinの阻害効果は部分的なものであった。
【００１７】以上の結果から、ＥＰＯは肝実質細胞画分
に含まれるシアリダーゼ活性によって一部はアシアロ化
されたアシアロ糖蛋白質レセプターに結合するものの、
アシアロ糖蛋白質レセプターとは異なるＥＰＯ特異的レ
セプターが存在することが示された。
に含まれるシアリダーゼ活性によって一部はアシアロ化
されたアシアロ糖蛋白質レセプターに結合するものの、
アシアロ糖蛋白質レセプターとは異なるＥＰＯ特異的レ
セプターが存在することが示された。
【００１８】〔試験例２〕 ヒト肝癌細胞株におけるＥ
ＰＯレセプターの発現 ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）におけるＥＰＯレセ
プターｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって測定し
た。ＨｅｐＧ２細胞よりJ. E. Badley et al., Bio Tec
hniques, Vol.6, No.2, 114-116 (1988)に記載された方
法に従って調製したｍＲＮＡからｄ（Ｔ）12−18（Phar
macia Biotech 社製）をプライマーとして使用した逆転
写反応でｃＤＮＡを作製した。
ＰＯレセプターの発現 ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）におけるＥＰＯレセ
プターｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって測定し
た。ＨｅｐＧ２細胞よりJ. E. Badley et al., Bio Tec
hniques, Vol.6, No.2, 114-116 (1988)に記載された方
法に従って調製したｍＲＮＡからｄ（Ｔ）12−18（Phar
macia Biotech 社製）をプライマーとして使用した逆転
写反応でｃＤＮＡを作製した。
【００１９】次いで、下記のプライマーを用い、Y. Nak
amura et al., Science Vol. 257,21, p.1138-1141 (19
92)に記載された方法に従ってＰＣＲを行った。 センス ：ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＣＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＣＡ アンチセンス：ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＴＡ 得られたＰＣＲ産物（ＥＰＯ−Ｒ Ｅｘｏｎ ４−８）
を1.5%アガロースゲル電気泳動で解析した結果、図３に
示すように、完全長ＥＰＯレセプターｍＲＮＡである約
608bp のバンドが検出され、ＨｅｐＧ２細胞には正常な
機能を有するＥＰＯレセプターが発現していることが示
唆された。
amura et al., Science Vol. 257,21, p.1138-1141 (19
92)に記載された方法に従ってＰＣＲを行った。 センス ：ＴＧＡ ＧＡＣ ＡＣＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＣＡ アンチセンス：ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＴＡ 得られたＰＣＲ産物（ＥＰＯ−Ｒ Ｅｘｏｎ ４−８）
を1.5%アガロースゲル電気泳動で解析した結果、図３に
示すように、完全長ＥＰＯレセプターｍＲＮＡである約
608bp のバンドが検出され、ＨｅｐＧ２細胞には正常な
機能を有するＥＰＯレセプターが発現していることが示
唆された。
【００２０】〔試験例３〕 ＥＰＯによる肝細胞からの
鉄放出作用 ＨｅｐＧ２細胞を24well cell culture cluster で培養
した（２×105 cell/well 、10％FCS を含むMEM 、５％
CO2 、37℃）。次いで、59ＦｅＣｌ3 を90,000ｃｐｍ添
加し、37℃で24時間培養した。
鉄放出作用 ＨｅｐＧ２細胞を24well cell culture cluster で培養
した（２×105 cell/well 、10％FCS を含むMEM 、５％
CO2 、37℃）。次いで、59ＦｅＣｌ3 を90,000ｃｐｍ添
加し、37℃で24時間培養した。
【００２１】培養終了後、ＦＣＳフリーＭＥＭで細胞を
３回洗浄し、所定量のＥＰＯ（０、０．２、２ｕｎｉｔ
／ｍｌ）及び／又はアポトランスフェリン（Ｔｆ）
（０、１００μｇ／ｍｌ）を添加して、肝細胞から培地
中に放出される59Ｆｅの量を測定した。その結果を図４
に示した。図４から、添加したＥＰＯ濃度に依存してＨ
ｅｐＧ２細胞からの59Ｆｅ放出量は増加することが分か
った。また、アポトランスフェリンの添加によってＥＰ
Ｏの59Ｆｅ放出作用が増加することがわかった。
３回洗浄し、所定量のＥＰＯ（０、０．２、２ｕｎｉｔ
／ｍｌ）及び／又はアポトランスフェリン（Ｔｆ）
（０、１００μｇ／ｍｌ）を添加して、肝細胞から培地
中に放出される59Ｆｅの量を測定した。その結果を図４
に示した。図４から、添加したＥＰＯ濃度に依存してＨ
ｅｐＧ２細胞からの59Ｆｅ放出量は増加することが分か
った。また、アポトランスフェリンの添加によってＥＰ
Ｏの59Ｆｅ放出作用が増加することがわかった。
【００２２】以上の結果は、ＥＰＯが直接肝細胞に働き
かけて細胞内の鉄を放出させることを示しており、肝細
胞に発現しているレセプターを介して、鉄放出を促すシ
グナルを伝えていると考えられる。また、鉄放出の経路
には少なくともトランスフェリンが関与していることが
示された。
かけて細胞内の鉄を放出させることを示しており、肝細
胞に発現しているレセプターを介して、鉄放出を促すシ
グナルを伝えていると考えられる。また、鉄放出の経路
には少なくともトランスフェリンが関与していることが
示された。
【００２３】〔試験例４〕 ＥＰＯによるヒト肝癌細胞
株の増殖抑制効果 ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞およびＨｕＨ７細
胞をそれぞれ２．５％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地およびＲ
ＰＭＩ培地に懸濁し、細胞数１×104 cell/well(96 wel
l dish）となるように調整し、５％CO2 の条件下、37℃
で３日間培養を行った。その際、ＥＰＯは０〜20ユニッ
ト／mlの範囲で培養初日より添加した。培養終了後、細
胞数をＭＴＴ法で測定し、ヒト肝癌細胞株の増殖に対す
るＥＰＯの作用を調べた。その結果を図５および図６に
示した。両図から、ＥＰＯがＨｅｐＧ２細胞およびＨｕ
Ｈ７細胞に対して明らかな増殖抑制効果を示しているこ
とがわかる。
株の増殖抑制効果 ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞およびＨｕＨ７細
胞をそれぞれ２．５％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地およびＲ
ＰＭＩ培地に懸濁し、細胞数１×104 cell/well(96 wel
l dish）となるように調整し、５％CO2 の条件下、37℃
で３日間培養を行った。その際、ＥＰＯは０〜20ユニッ
ト／mlの範囲で培養初日より添加した。培養終了後、細
胞数をＭＴＴ法で測定し、ヒト肝癌細胞株の増殖に対す
るＥＰＯの作用を調べた。その結果を図５および図６に
示した。両図から、ＥＰＯがＨｅｐＧ２細胞およびＨｕ
Ｈ７細胞に対して明らかな増殖抑制効果を示しているこ
とがわかる。
【００２４】〔試験例５〕インターフェロンに対して不
応性であったＣ型慢性肝炎患者で、かつ、過去６ヶ月間
の血清ＧＴＰ活性が正常域より高いレベルで推移してい
る患者に、１回の瀉血量が200ml で週１回12週間の瀉血
を行い、毎回の瀉血後に24,000IUのＥＰＯを皮下投与し
た。初回瀉血後より毎週血清ＧＰＴ活性、ヘモグロビン
濃度を測定し、また、隔週で血清フェリチン値を測定し
た。その結果を瀉血量と共に表１に示した。
応性であったＣ型慢性肝炎患者で、かつ、過去６ヶ月間
の血清ＧＴＰ活性が正常域より高いレベルで推移してい
る患者に、１回の瀉血量が200ml で週１回12週間の瀉血
を行い、毎回の瀉血後に24,000IUのＥＰＯを皮下投与し
た。初回瀉血後より毎週血清ＧＰＴ活性、ヘモグロビン
濃度を測定し、また、隔週で血清フェリチン値を測定し
た。その結果を瀉血量と共に表１に示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１から明らかなように、瀉血療法開始２
週間後から血清フェリチン値の顕著な低下が認められ、
その後の活動期における肝炎の指標である血清ＧＰＴ活
性は低下した。瀉血療法開始９週間後からは正常範囲に
まで低下し、その後維持した。また、ヘモグロビン濃度
は、試験期間中ＥＰＯ投与によりほぼ11.0g/dlを維持し
た。ＥＰＯの投与により瀉血量は12週間で2400ml採取で
き、また、貧血症状を来たすことなく過剰の鉄を除去す
ることができた。
週間後から血清フェリチン値の顕著な低下が認められ、
その後の活動期における肝炎の指標である血清ＧＰＴ活
性は低下した。瀉血療法開始９週間後からは正常範囲に
まで低下し、その後維持した。また、ヘモグロビン濃度
は、試験期間中ＥＰＯ投与によりほぼ11.0g/dlを維持し
た。ＥＰＯの投与により瀉血量は12週間で2400ml採取で
き、また、貧血症状を来たすことなく過剰の鉄を除去す
ることができた。
【００２７】〔実施例１〕（静注用組成物の製造） 注射用蒸留水１００ｍｌ中に、エリスロポエチン１ｍ
ｇ、Ｄ−マンニトール５０ｍｇおよびヒト血清アルブミ
ン５０ｍｇを無菌的に溶解した後、１ｍｌずつバイアル
に分注し、凍結乾燥して密封した。使用する際に生理的
食塩水に溶解して静注用組成物とする。
ｇ、Ｄ−マンニトール５０ｍｇおよびヒト血清アルブミ
ン５０ｍｇを無菌的に溶解した後、１ｍｌずつバイアル
に分注し、凍結乾燥して密封した。使用する際に生理的
食塩水に溶解して静注用組成物とする。
【００２８】
【発明の効果】本発明のエリスロポエチンを有効成分と
する医薬組成物によれば、肝疾患哺乳動物の肝内の過剰
の鉄イオンを減少させることができるので、過剰鉄イオ
ンによる慢性肝炎や肝癌、肝硬変等の治療に有効であ
る。更に、該医薬組成物の投与と瀉血療法を併用すれ
ば、瀉血に伴う患者の貧血を防止すると共に、肝細胞か
らの過剰の鉄イオンの排泄を促進させることができる。
する医薬組成物によれば、肝疾患哺乳動物の肝内の過剰
の鉄イオンを減少させることができるので、過剰鉄イオ
ンによる慢性肝炎や肝癌、肝硬変等の治療に有効であ
る。更に、該医薬組成物の投与と瀉血療法を併用すれ
ば、瀉血に伴う患者の貧血を防止すると共に、肝細胞か
らの過剰の鉄イオンの排泄を促進させることができる。
【００２９】また、ＩＦＮ療法が効果を示さないＣ型慢
性肝炎患者に対し、本発明の医薬組成物を投与して肝機
能を改善した後、公知のＩＦＮ療法を行うことにより該
肝炎の治療効果を期待することができる。
性肝炎患者に対し、本発明の医薬組成物を投与して肝機
能を改善した後、公知のＩＦＮ療法を行うことにより該
肝炎の治療効果を期待することができる。
【図１】125I−アシアロＥＰＯの肝実質細胞（AMLC) 画
分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯ、およびア
シアロα１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した
図である。
分への結合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯ、およびア
シアロα１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した
図である。
【図２】125I−ＥＰＯの肝実質細胞画分（AMLC) への結
合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯ、およびアシアロα
１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した図であ
る。
合に対するアシアロＥＰＯ、ＥＰＯ、およびアシアロα
１−acid−glycoproteinの阻害効果を測定した図であ
る。
【図３】ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）に発現した
ＥＰＯレセプターｍＲＮＡのＰＣＲ産物のアガロースゲ
ル電気泳動写真を示す。
ＥＰＯレセプターｍＲＮＡのＰＣＲ産物のアガロースゲ
ル電気泳動写真を示す。
【図４】ＥＰＯによるヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細
胞）からの鉄放出作用を示す。
胞）からの鉄放出作用を示す。
【図５】ＥＰＯによるヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２細
胞）に対する増殖抑制効果を示す。
胞）に対する増殖抑制効果を示す。
【図６】ＥＰＯによるヒト肝癌細胞株（ＨｕＨＧ７細
胞）に対する増殖抑制効果を示す。
胞）に対する増殖抑制効果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年６月２３日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
Claims (6)
- 【請求項１】 エリスロポエチンを有効成分とする、肝
疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少させ、該哺乳動
物の肝機能を改善するための肝疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項２】 エリスロポエチンを有効成分とする、肝
疾患哺乳動物の肝内過剰鉄イオンを減少させ、該哺乳動
物の肝機能を改善するための肝疾患治療用医薬組成物で
あって、該医薬組成物の投与と瀉血療法を併用すること
を特徴とする肝疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項３】 肝疾患が、慢性肝炎である請求項１又は
２記載の肝疾患治療用医薬組成物。 - 【請求項４】 慢性肝炎がＣ型肝炎ウイルスの感染によ
るものである請求項３記載の医薬組成物。 - 【請求項５】 慢性肝炎がＣ型慢性肝炎またはＣ型激症
肝炎である請求項３記載の医薬組成物。 - 【請求項６】 肝疾患が、肝癌または肝硬変である請求
項１又は２記載の肝疾患治療用医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9158745A JPH1067678A (ja) | 1996-06-20 | 1997-06-16 | 肝疾患治療用医薬組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16032096 | 1996-06-20 | ||
| JP8-160320 | 1996-06-20 | ||
| JP9158745A JPH1067678A (ja) | 1996-06-20 | 1997-06-16 | 肝疾患治療用医薬組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1067678A true JPH1067678A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=26485768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9158745A Pending JPH1067678A (ja) | 1996-06-20 | 1997-06-16 | 肝疾患治療用医薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1067678A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002542296A (ja) * | 1999-04-27 | 2002-12-10 | ヘルス リサーチ インコーポレイテッド | 抗腫瘍剤の効力を増大させる方法 |
| JP2005533800A (ja) * | 2002-06-20 | 2005-11-10 | バイオメトス ホールディング ゲーエムベーハー | 増殖因子を用いて、および生物学的マトリクスあるいは支持構造を用いて細胞を増殖および分化する方法およびデバイス |
| JP2009085647A (ja) * | 2007-09-28 | 2009-04-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ｈｃｖ患者における瀉血治療の効果の判定方法及び判定キット |
-
1997
- 1997-06-16 JP JP9158745A patent/JPH1067678A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002542296A (ja) * | 1999-04-27 | 2002-12-10 | ヘルス リサーチ インコーポレイテッド | 抗腫瘍剤の効力を増大させる方法 |
| JP2005533800A (ja) * | 2002-06-20 | 2005-11-10 | バイオメトス ホールディング ゲーエムベーハー | 増殖因子を用いて、および生物学的マトリクスあるいは支持構造を用いて細胞を増殖および分化する方法およびデバイス |
| JP2009085647A (ja) * | 2007-09-28 | 2009-04-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ｈｃｖ患者における瀉血治療の効果の判定方法及び判定キット |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040416 |
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