PL230756B1 - Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona w postaci 2- cyjan o-N-( 2,5-dibromofenylo)- 3-hydroksy-2- butenamidu do zastosowania jako lek oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku do terapii nowotworu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zestaw farmaceutyczny charakteryzujący się tym, że zawiera erytropoetynę oraz inhibitor kinazy Brutona, zarówno w tym samym lub odrębnym opakowaniu i/lub instrukcję stosowania. Dodatkowo przedmiotem zgłoszenia jest także erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do zastosowania jako lek. Ponadto, przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie erytropoetyny oraz inhibitora kinazy Brutona do wytwarzania leku do terapii nowotworu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) do zastosowania jako lek oraz zastosowanie erytropoetyny oraz inhibitora kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), do wytwarzania leku do terapii nowotworu, zwłaszcza raka jelita grubego. W niniejszym zgłoszeniu ujawniono również zestaw farmaceutyczny, zawierający erytropoetynę oraz inhibitor kinazy Brutona.

Rak jelita grubego stanowi istotny problem zarówno w aspekcie medycznym, jak też społecznym. Co więcej, dynamika wzrostu zachorowań na ten nowotwór w Polsce jest wyższa, niż w innych krajach Europy. Istnieje zatem konieczność intensyfikacji badań w zakresie zarówno wczesnej diagnostyki, jak też samej terapii tego schorzenia.

Pacjenci z rakiem jelita grubego stanowią stosunkowo heterogenną grupę chorych, w związku z tym trudno jest wskazać jedyny skuteczny schemat leczenia.

Istnieją określone standardy postępowania z chorym onkologicznym, w tym przypadku podstawowym elementem terapii jest leczenie chirurgiczne. Ma ono na celu uzyskanie wolnych od nacieku nowotworowego tkanek jelita.

Jako niezbędne leczenie uzupełniające do wcześniejszej interwencji chirurgicznej wprowadza się chemioterapię. Opiera się ona głównie na fluoropirymidynie, 5-fluorouracylu/kwasie foliowym, kapecytabinie oraz okaliplatynie. W zależności od stopnia zaawansowania nowotworu oraz stanu klinicznego pacjenta stosowany jest odpowiedni schemat terapii. Według obecnie obowiązujących wytycznych celem leczenia przeciwnowotworowego jest aktywna terapia prowadząca do eradykacji z organizmu komórek nowotworowych oraz zapewnienie choremu optymalnej jakości życia. Należy jednak podkreślić, iż stosowane obecnie schematy terapeutyczne, są zdecydowanie niezadawalające.

Związane jest to między innymi z tym, iż progresja zmian nowotworowych prowadzi do wyczerpania rezerw kompensacyjnych organizmu, przez co pojawia się szereg objawów utrudniających, czy wręcz uniemożliwiających funkcjonowanie chorego w społeczeństwie.

Obok choroby podstawowej - niekontrolowanego rozrostu, poważny problem kliniczny stanowi niedokrwistość. Występuje ona u około 60-90% pacjentów onkologicznych, a niemal 30% jest to niedokrwistość ciężka lub wręcz zagrażająca życiu. Stopień jej nasilenia zależy od rodzaju histopatologicznego nowotworu, stopnia zaawansowania klinicznego, czasu trwania choroby, obecności powikłań oraz metod i intensywności stosowanej terapii.

W przypadku zmian nowotworowych jelita grubego do głównych przyczyn występowania niedokrwistości należą przede wszystkim przewlekle krwawienia, upośledzony pasaż jelitowy oraz zaburzenia wchłaniania.

Według pacjentów onkologicznych największym problemem oprócz dolegliwości bólowych, które prawidłowo leczone są kontrolowane, jest przewlekłe wyczerpanie, dramatycznie obniża ono komfort życia, a co ważniejsze zmniejsza również skuteczność prowadzonej terapii (Alexiusdottir KK, Molier PH, Snaebjornsson P, Jonasson L, Olafsdottir EJ, Bjórnsson ES, Tryggvadottir L, Jonasson JG. Association of symptoms of colon cancer patients with tumor location and TNM tumor stage. Scand J Gastroenterol.2012 ; 47 : 795-801). Opublikowane w 2004 roku wyniki badania obserwacyjnego ECAS (European Cancer Anemia Survay) jednoznacznie dowiodły istnienia ścisłego związku pomiędzy stężeniem hemoglobiny, a stanem sprawności pacjenta.

Stosowane do tej pory leczenie niedokrwistości w przebiegu chorób nowotworowych polega głównie na podawaniu koncentratu krwinek czerwonych, suplementacji rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny (rhEpo).

Erytropoetyna jest glikoproteiną wytwarzaną głównie przez komórki śródmiąższowe nerek (80-90%). Stopień niedotlenienia oraz niedokrwistość to główne czynniki determinujące wielkość syntezy erytropoetyny (Noguchi CT, Wang L, Rogers HM, Teng R, Jia Y. Survival and proliferative roles of erythropoietin beyond the erythroid lineage. Expert Rev Mol Med. 2008 Dec 1 ; 10 : e36).

Gen EPO znajduje się na 7 chromosomie, złożony jest z pięciu eksonów i czterech intronów. Produktem transkrypcji tego genu jest łańcuch składający się pierwotnie ze 193 aminokwasów. Podczas translacji następuje odcięcie 27 hydrofobowych aminokwasów, powstaje wówczas łańcuch zawierający 166 aminokwasy. W wyniku przemian potranslacyjnych od C-końca odszepiana jest reszta argininy, a tym samym ostatecznie powstaje łańcuch osiągający długość 165 aminokwasów o masie cząsteczkowej około 30-34 kD (w zależności od zawartości węglowodanów).

PL 230 756 Β1

Na polskim rynku farmaceutycznym oprócz erytropoetyny β zarejestrowana jest również erytropoetyna a oraz darbepoetyna a. Erytropoetyna a i erytropoetyna β są analogami ludzkiej erytropoetyny uzyskanymi za pomocą metod inżynierii genetycznej z użyciem klonów komórek jajnika chomika chińskiego. Trzeci związek - darbepoetyna a - jest rekombinowaną i zmodyfikowaną pochodną ludzkiej erytropoetyny. Modyfikacja ta polega na dodatkowej glikozylacji, i charakteryzuje ją około 3-krotnie dłuższy czas półtrwania w porównaniu z preparatami erytropoetyny a i β.

Erytropoetyna β jest wysoce oczyszczoną glikoproteiną o identycznej sekwencji aminokwasów i węglowodanów jak erytropoetyna izolowana z moczu chorych na niedokrwistość, tj. erytropoetyna endogenna. Związek ten posiada 4 łańcuchy węglowodanowe, w przeciwieństwie do erytropoetyna a (3 łańcuchy węglowodanowe) oraz darbepoetyny a (5 łańcuchów węglowodanowych). Erytropoetyna β aktywuje receptor dla erytropoetyny słabiej niż erytropoetyna a, lecz silniej niż darbepoetyna a. Działanie jej charakteryzuje się niższą aktywnością w warunkach in vitro, wyższą natomiast aktywnością in vivo oraz wydłużonym okresem półtrwania w porównaniu do erytropoetyny a.

Badania farmakokinetyczne przeprowadzone u zdrowych ochotników oraz pacjentów z mocznicą wykazały, że okres półtrwania podanej dożylnie erytropoetyny β (preparat NeoRecormon) wynosi 4 do 12 godzin, zaś jej objętość dystrybucji równa jest 1 do 2 krotnej objętości osocza. Analogiczne wyniki uzyskano w doświadczeniach na szczurach z mocznicą i zdrowych. Po podskórnym podaniu erytropoetyny β pacjentom z mocznicą, przedłużone wchłanianie prowadzi do powstania plateau stężenia w surowicy, a maksymalne stężenie osiągane jest średnio po 12-28 godzinach. Okres półtrwania w fazie eliminacji po podaniu podskórnym jest dłuższy niż po podaniu dożylnym i wynosi średnio 13-28 godzin. Biodostępność erytropoetyny β podanej podskórnie wynosi 23-42% w porównaniu do podania dożylnego.

Erytropoetyna działa za pośrednictwem specyficznego receptora EpoR, indukując jego homodimeryzację prowadzi do aktywacji (poprzez wzajemną fosforylację) dwóch kinaz tyrozynowych JAK2. Dochodzi wówczas do fosforylacji samego receptora, jak również ośmiu reszt tyrozynowych zlokalizowanych w cytoplazmatycznej domenie receptora. W dalszej drodze wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału biorą udział kinazy MAP (aktywacja różnicowania i proliferacji), czynniki transkrypcyjne STAT5 (hamowanie apoptozy), kinaza białkowa C (nasilenie proliferacji) i inne.

Erytropoetyna jest powszechnie stosowanym w leczeniu niedokrwistości czynnikiem wzrostu odpowiedzialnym za utrzymanie odpowiedniej liczby erytrocytów w układzie krążenia, zapewniając w ten sposób prawidłowe utlenowanie tkanek. Lek ten promuje przeżycie, proliferacje i różnicowanie progenitorów erytropoezy, wykazuje działanie proangiogenne i antyapoptotyczne.

Badania ostatnich lat wskazują, iż stosowanie erytropoetyny w leczeniu niedokrwistości u pacjentów ze zmianami rozrostowymi poza korzystnym wpływem na parametry hematologiczne, może być obarczone poważnym działaniem niepożądanym, jakim jest promowanie procesu nowotworowego. Działanie to wiąże się między innymi z ekspresją erytropoetyny i jej receptora na niektórych tkankach nowotworowych. Ich obecność wykazano w raku gruczołu piersiowego, szyjki i trzonu macicy, żołądka oraz jelita grubego. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, iż w obszarach nowotworu objętych niedotlenieniem obserwuje się szczególnie nasiloną ekspresję Epo i EpoR (Acs G, Acs P, Beckwith SM, Pitts RL, Clements E, Wong K, Verma A. Erythropoietin and erythropoietin receptor expression in human cancer. Cancer Res. 2001 ;61:3561-5, Jelkmann W, Bohlius J, Hallek M, Sytkowski AJ: The erythropoietin receptor in normal and cancer tissues. Crit Rev Oncol Hematol, 2008, 67, 39-61., Jelkmann W, Bohlius J, Hallek M, Sytkowski AJ: The erythropoietin receptor in normal and cancer tissues. Crit Rev Oncol Hematol, 2008, 67, 39-61). Stosowanie erytropoetyny daje, zatem możliwość dodatkowej aktywacji receptora dla erytropoetyny. Takie działanie może prowadzić do progresji choroby nowotworowej oraz skrócenia życia chorych poddawanych terapii erytropoetyną. Potwierdzają to badania przeprowadzone przez Leyland-Jones i wsp., w których wykazano, iż stosowanie rEpo alfa u pacjentek z rakiem gruczołu piersiowego z przerzutami było przyczyną wzrostu śmiertelności tej grupy chorych z powodu progresji choroby oraz incydentów zakrzepowych (Leyland-Jones B, Semiglazov V, Pawlicki M, Pieńkowski T, Tjulandin S, Manikhas G, Makhson A, Roth A, Dodwell D, Baselga J, Biakhov M, Valuckas K, Voznyi E, Liu X, Vercammen E. Maintaining normal hemoglobin levels with epoetin alfa in mainly nonanemic patients with metastatic breast cancer receiving first-line chemotherapy: a survival study. J Clin Oncol. 2005 Sep 1; 23(25):5960-72). Udowodniono także, iż terapia erytropoetyną β u pacjentów z nowotworami głowy i szyi leczonych radioterapią, zmniejszała przeżycie chorych oraz nasilała progresję guza (Henke M, Laszig R, Riibe C, Schafer U, Haase KD, Schilcher B, Mose S, Beer KT, Burger U, Dougherty C, Frommhold H. Erythropoietin to treat head and neck cancer patients with

PL 230 756 Β1 anaemia undergoing radiotherapy: randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2003 Oct 18;362 (9392) :1255-60). Wyniki trzech niezależnych badań klinicznych fazy III oraz dwie metaanalizy przeprowadzone odpowiednio na 10 tys. oraz blisko 14 tys. pacjentach onkologicznych dodatkowo potwierdziły niekorzystny wpływ terapii erytropoetyną na przeżycie chorych poddawanych terapii tym lekiem.

W badaniach in vitro na komórkach czerniaka z nokautem genu EPOR wykazano osłabioną fosforylację kinazy ERK w odpowiedzi na erytropoetynę, zmniejszoną proliferację komórek oraz silniejszy efekt chemioterapeutyczny cisplatyny (Kumar SM, Zhang G, Bastian BC, Arcasoy MO, Karande P, Pushparajan A, Acs G, Xu X. Erythropoietin receptor contributes to melanoma celi survival in vivo. Oncogene. 2012;31:1649-60). Badania te sugerują, iż erytropoetyną oraz jej receptor mogą zwiększać żywotność niedocenionych komórek w guzach litych, a przez to promować selekcję komórek z obniżonym potencjałem apoptotycznym oraz opornością na chemioterapię i w konsekwencji nasilać rozwój procesu nowotworowego.

W innym badaniu in vitro na komórkach ludzkiego płaskonabłonkowego raka głowy i szyi obserwowano aktywację szlaku kinazy tyrozynowej z grupy JAK oraz czynnika transkrypcyjnego NF-kB i STAT w odpowiedzi na erytropoetynę, czego efektem było hamowanie procesu apoptozy (Lai S.Y., Childs E.E., Xi S. i wsp. Erythropoietin-mediated activation of JAK-STAT signaling contributes to cellular invasion in head and neck squamous celi carcinoma. Oncogene 2005; 24: 4442-4449). Skutkowało to wzrostem oporności na leki przeciwnowotworowe, promieniowanie jonizujące jak również wzmożoną proliferacją, nasiloną migracją i naciekaniem zmienionych nowotworowo komórek.

2-cyjano-N(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (dalej jako LFM-A13) (Wzór 1) jest niskocząsteczkowym aktywnym metabolitem leflunomidu, zaprojektowanym i uzyskanym dzięki technikom modelowania komputerowego.

Br

Wzór 1

LFM-A13 jest pierwszym inhibitorem kinazy tyrozynowej Brutona (BTK), kluczowej cząsteczki sygnałowej kompleksu receptorów na powierzchni komórek B (US 6,221,900B1). BTK należy do rodziny kinaz Tec, bardzo licznej grupy, niezwiązanych bezpośrednio z receptorem, cytoplazmatycznych kinaz tyrozynowych. Odgrywa ona istotną rolę w dojrzewaniu komórek układu odpornościowego, jest kluczowym elementem wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego dojrzewających limfocytów B. Poza limfocytami B, BTK obecna jest także w monocytach, makrofagach, neutrofilach, komórkach tucznych oraz megakariocytach, gdzie bierze udział w aktywacji szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za procesy związane z dojrzewaniem i żywotnością komórek, produkcją cytokin i degranulacją komórek. Kinaza Brutona odgrywa ważną rolę w rozwoju nowotworów wywodzących się z komórek B, aktywując szlaki antyapoptyczne (US 6,221,900B1). Jej zwiększoną ekspresję wykazano także w komórkach raka prostaty, gdzie wysoki poziom tej kinazy dodatnio korelował ze stopniem zaawansowania tego nowotworu (Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Yang JC, Changou C, Ma AH, Mazloom A, Chintapalli S, Xiao K, Xiao W, Kumaresan P, Sanchez E, Yeh CT, Evans CP, Patterson R, Lam KS, Kung HJ. Targeting Btk/Etk of prostatę cancercells by a novel dual inhibitor. Celi Death Dis. 2014 Sep 4;5:el409). Blokowanie aktywności BTK poprzez stosowanie wprowadzonych już do lecznictwa (ibrutynib, sorafenib), bądź obecnie intensywnie badanych (GDC0834, CGI-560, CGI-1746) licznych inhibitorów tej kinazy skutecznie hamuje proces nowotworowy. Należy wyraźnie podkreślić, że inhibitory BTK znalazły dotychczas zastosowanie w chorobach rozrostowych układu krwiotwórczego. Brak jest natomiast jakichkolwiek danych dotyczących jego wpływu na komórki raka jelita grubego. LFM-A13 jest intensywnie badany w aspekcie leczenia białaczek limfocytarnych wywodzących się z komórek prekursorowych B. Związek ten promuje proces apoptozy, działa antyproliferacyjnie oraz zwiększa wrażliwość komórek nowotworowych na działania chemioterapeutyków. Posiada jednocześnie wysoki profil bezpieczeństwa, gdyż stosowane w badaniach in vivo wysokie dawki LFM-A13 (20-100 mg/kg i.v.) nie wywołują nefrotoksyczności, hepatotoksyczności, czy zmian z obrazie krwi (Uckun FM, Zheng Y, Cetkovic-Cvrlje M, Vassilev A,

PL 230 756 Β1

Lisowski E, Waurzyniak B, Chen H, Carpenter R, Chen CL. In vivo pharmacokinetic features, toxicity profile, and chemosensitizing activity of alpha-cyjano-beta-hydroxy-beta-methyl-N-(2,5-dibromophenyl)propenamide (LFM-A13), a novel antileukemic agent targeting Bruton's tyrosine kinase. Clin Cancer Res. 2002 May ; 8 (5) : 1224-33). Wstępne dane dotyczące wysokiej selektywności tego związku, nie znalazły potwierdzenia w kolejnych badaniach, gdzie zaobserwowano, iż LFM-A13 hamuje także kinazę fosfatydyloinozytolu (P13K) oraz indukowaną erytropoetyną fosforylację receptora EpoR. Udowodniono, że związek ten blokuje związane z receptorem EpoR kinazy janusowe JAK2 (JAK2), przerywając w ten sposób wewnątrzkomórkowy szlak przekaźnictwa sygnału (van den Akker E, van Dijk TB, Schmidt U, Felida L, Beug H, Lówenberg B, von Lindern M. The Btk inhibitor LFM-A13 is a potent inhibitor of Jak2 kinase activity. Biol Chem. 2004 May;385(5) : 409-13).

Mimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ostatnich latach w chemioterapii, opracowanie skutecznej terapii przeciwnowotworowej stanowi poważne wyzwanie dla współczesnej onkologii. Stosowane obecnie w terapii raka jelita grubego leki cytostatyczne wywołują liczne efekty działania niepożądane, które ograniczają ich skuteczność terapeutyczną, dramatycznie obniżają jakość życia pacjentów. Poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych, łączących aktywność przeciwnowotworową z jednoczesną poprawą parametrów hematologicznych stanowi szczególnie pilne zadanie dla badaczy, lekarzy oraz przemysłu farmaceutycznego.

Przedmiotem wynalazku jest erytropoetyną oraz inhibitor kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), do zastosowania jako lek.

Korzystnie erytropoetyną jest wybrana z grupy obejmującej erytropoetynę a, erytropoetynę β oraz darbepoetynę a, w szczególności erytropoetynę β.

Korzystnie erytropoetyną oraz inhibitor kinazy Brutona według wynalazku są stosowane w terapii nowotworu.

Korzystnie nowotwór charakteryzuje się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona.

Korzystnie nowotwór charakteryzujący się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona obejmuje raka jelita grubego i/lub inne guzy lite w szczególności wybrane z grupy obejmującej guzy zarodkowe, mięsaki, raki, chłoniaki, guzy kości i nerwowopochodne.

Korzystnie nowotwór charakteryzujący się szczególnie wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona jest wybrany z grupy obejmującej hormonozależny nowotwór piersi u kobiet, hormonozależny nowotwór prostaty oraz nowotwór gruczołowy płuc.

Korzystnie erytropoetyną i inhibitor kinazy Brutona są podawane równocześnie, oddzielnie lub sekwencyjnie.

Korzystnie erytropoetyną jest podawana podskórnie lub dożylnie, korzystnie podskórnie, a inhibitor kinazy Brutona jest podawany dootrzewnowo.

Korzystnie terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β jest podawana 3 razy w tygodniu, a terapeutycznie skuteczna ilość inhibitora kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), jest podawana 2 razy dziennie.

Korzystnie terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny β podawana 3 razy w tygodniu wynosi 600 IU/kg na podanie, a terapeutycznie skuteczna ilość 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) podawana 2 razy dziennie wynosi 10 mg/kg na podanie.

Korzystnie dodatkowo stosuje się skuteczną ilość co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmującej cytostatyki, korzystnie fluorouracyl, fluoropirymidynę, i/lub inhibitory kinaz, korzystnie ibrutynib, sorafenib, AZD0530, GDC 0834, CGI-560, CGI-1746.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie erytropoetyny β oraz inhibitora kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), do wytwarzania leku do terapii nowotworu.

Korzystnie erytropoetyną jest wybrana z grupy obejmującej erytropoetynę a, erytropoetynę β oraz darbepoetynę a, w szczególności erytropoetynę β.

Korzystnie nowotwór charakteryzuje się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona.

Korzystnie nowotwór charakteryzujący się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona obejmuje raka jelita grubego, i/lub inne guzy lite, w szczególności wybrane z grupy obejmującej guzy zarodkowe, mięsaki, raki, chłoniaki, guzy kości i nerwowopochodne.

Korzystnie nowotwór charakteryzujący się szczególnie wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona jest wybrany z grupy obejmującej hormonozależny nowotwór piersi u kobiet, hormonozależny nowotwór prostaty oraz nowotwór gruczołowy płuc.

PL 230 756 Β1

Korzystnie erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β i inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), są podawane równocześnie, oddzielnie lub sekwencyjnie.

Korzystnie erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β, jest podawana podskórnie lub dożylnie, korzystnie podskórnie, a inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), jest podawany dootrzewnowo.

Korzystnie terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β jest podawana 3 razy w tygodniu, a terapeutycznie skuteczna ilość inhibitora kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), jest podawana 2 razy dziennie.

Korzystnie terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny β podawana 3 razy w tygodniu wynosi 600 lU/kg na podanie, a terapeutycznie skuteczna ilość 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) podawana 2 razy dziennie wynosi 10 mg/kg na podanie.

Korzystnie erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β oraz inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), są stosowane w połączeniu z co najmniej jednym związkiem wybranym z grupy obejmującej cytostatyki, korzystnie fluorouracyl, fluoropirymidynę, i/lub inhibitory kinaz, korzystnie ibrutynib, sorafenib, AZD0530, GDC0834, CGI-560, CGI-1746.

W niniejszym zgłoszeniu ujawnia się również zestaw farmaceutyczny charakteryzujący się tym, że zawiera erytropoetynę oraz inhibitor kinazy Brutona zarówno w tym samym lub odrębnym opakowaniu i/lub instrukcję stosowania.

Korzystnie ujawnia się, iż erytropoetyna jest wybrana z grupy obejmującej erytropoetynę a, erytropoetynę β oraz darbepoetynę a, w szczególności erytropoetynę β i/lub inhibitor kinazy Brutona oznacza w szczególności 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13).

Korzystnie ujawnia się, iż erytropoetyna i inhibitor kinazy Brutona, są dostosowane do podawania równoczesnego, oddzielnego lub sekwencyjnego.

Korzystnie ujawnia się, iż erytropoetyna jest dostosowana do podawania podskórnego lub dożylnego, korzystnie podskórnego, a inhibitor kinazy Brutona jest dostosowany do podawania dootrzewnowego.

Korzystnie ujawnia się, iż zestaw zawiera skuteczną terapeutycznie ilość erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β, do podawania 3 razy w tygodniu, oraz skuteczną terapeutycznie ilość inhibitora kinazy Brutona, w szczególności 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFMA13), do podawania 2 razy dziennie.

Korzystnie ujawnia się, iż terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny β do podawania 3 razy w tygodniu wynosi korzystnie 600 lU/kg na podanie, a terapeutycznie skuteczna ilość 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) do podawania 2 razy dziennie wynosi 10 mg/kg na podanie.

Korzystnie ujawnia się, iż zestaw dodatkowo zawiera co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej cytostatyki, korzystnie fluorouracyl, fluoropirymidynę, i/lub inhibitory kinaz, korzystnie ibrutynib, sorafenib, AZD0530, GDC0834, CGI-560, CGI-1746.

Niniejszy wynalazek zatem dotyczy użyteczności erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β oraz inhibitora kinazy Brutona, w postaci LFM-A13, w terapii zwłaszcza nowotworu w szczególności raka jelita grubego, a także ich zastosowania do wytwarzania leku do terapii nowotworu.

Erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β wraz z inhibitorem kinazy Brutona, w postaci LFM-A13, może być podawana równocześnie, oddzielnie lub sekwencyjnie.

Roztwór zawierający erytropoetynę może być podawany podskórnie lub dożylnie. Korzystną i najczęściej stosowaną drogą podania jest wstrzyknięcie podskórne, gdyż podanie dożylne wykonuje się u pacjentów hemodializowanych przez przetokę tętniczo-żylną pod koniec dializy. Należy również zaznaczyć, iż okres półtrwania w fazie eliminacji po podaniu podskórnym jest dłuższy niż po podaniu dożylnym i wynosi średnio 13-28 godzin.

LFM-A13 jest związkiem trudno rozpuszczalnym w wodzie, dlatego też uzyskana zawiesina nie może podawana być drogą dożylną. Dostępne dane literaturowe wskazują, iż wstrzyknięcie dootrzewnowe jest najczęściej stosowaną drogą podania LFM-A13.

Korzystnie erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β jest poddawana podskórnie 3 razy w tygodniu a inhibitor kinazy Brutona, w postaci LFM-A13 jest podawany dootrzewnowo 2 razy na dobę, najkorzystniej erytropoetyna β jest podawana 3 razy w tygodniu w dawce 600 lU/kg a LFM-A13 jest oddawany dootrzewnowo 2 razy na dobę w dawce 10 mg/kg.

PL 230 756 Β1

Jak ujawniono zestaw zawierający erytropoetynę, w szczególności erytropoetynę β oraz inhibitor kinazy Brutona, w szczególności LFM-A13, może być stosowany łącznie z innymi inhibitorami kinaz, przykładowo takimi jak wprowadzone już do lecznictwa ibrutynib i sorafenib, bądź będącymi na etapie badań AZD0530, GDC0834, CGI-560 czy CGI-1746, a także fluorouracylem, czy fluoropirymidyną, klasycznymi cytostatykami rekomendowanymi w leczeniu raka jelita grubego. Takie połączenia skutkują wyższą skutecznością terapii (efekt hipperaddycyjny), przy relatywnie słabiej zaznaczonych działaniach niepożądanych.

Jak ujawniono zestaw zawierający erytropoetynę, w szczególności erytropoetynę β oraz inhibitor kinazy Brutona, w szczególności LFM-A13, jest użyteczny w terapii raka jelita grubego oraz innych guzów litych.

Termin „guzy lite odnosi się do złośliwych zmian nowotworowych o litej strukturze histologicznej i ogniskowym rozroście. Należą do nich między innymi: guzy zarodkowe, mięsaki, raki, chłoniaki, guzy kości i nerwowopochodne. W szczególności przedmiotowy wynalazek jest skuteczny względem nowotworów charakteryzujących się szczególnie wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona, takich jak hormonozależny nowotwór piersi u kobiet, hormonozależny nowotwór prostaty oraz nowotwór gruczołowy płuc.

Ujawnione zastosowanie erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β wraz z inhibitorem kinazy Brutona, w szczególności LFM-A13 nie tylko istotne spowalnia tempo wzrostu komórek nowotworowych, ale także nieoczekiwanie prowadzi do całkowitej regresji niskozaawansowanych zmian nowotworowych.

Za różnice w odpowiedzi guzów na leczenie istotną rolę odgrywa faza cyklu podziałowego, w jakiej znajdują się komórki nowotworowe. Wykazano, że w guzach litych liczba komórek nowotworowych w fazie GO (faza spoczynkowa) jest znacznie większa niż w komórkach prawidłowych (Gasińska A., Biesaga A. Nowe spojrzenie na proliferację nowotworów. NOWOTWORY Journal of Oncology. 2010; 228-235). Ich liczba sięga nawet 98% w linii 769-P, będącej gruczolakorakiem nerki. Komórki rakowe w stanie „uśpienia (faza GO) są bardzo często oporne na działanie cytostatyków. Niniejsi Twórcy zauważyli, iż wprowadzenie ich w kolejne etapy cyklu komórkowego (faza S, M) może skutkować wyższą podatnością na leczenie. W badaniach prowadzonych na ludzkich komórkach gruczolakoraka nerki (769-P, 768-0) oraz komórkach podstawnokomórkowego raka skóry (Caki-1) udowodniono, iż erytropoetyna będąca czynnikiem wzrostu powoduje wejście komórek nowotworowych z fazy GO w cykl podziałowy poprzez fazę G1 do S (Miyake M, Goodison S, Lawton A, Zhang G, Gomes-Giacoia E, Rosser CJ. Erythropoietin is a JAK2 and ERK1/2 effectorthat can promote renal tumorcell proliferation under hypoxic conditions. J Hematol Oncol. 2013 Sep 3;6:65).

Nieoczekiwanie zauważono, iż częściowo zaktywowane po podaniu erytropoetyny szlaki wewnątrzkomórkowe ulegają następnie zahamowaniu na skutek podania LFM-A13, co z kolei prowadzi do ograniczenia proliferacji komórek nowotworowych. Połączenie czynnika wzrostu, jakim jest erytropoetyna β, z LFM-A13 skutecznie hamuje wzrost masy guza u myszy z indukowanym nowotworem linii DLD-1 i Ht-29. W przypadku guzów o niewielkiej objętości terapia skojarzona skutkuje nieoczekiwanym całkowitym zanikiem zmian rozrostowych.

Twórcy zauważyli, iż erytropoetyna istotnie nasila przeciwnowotworową aktywność LFM-A13, prawdopodobnie na drodze fosforylacji wewnątrzkomórkowych szlaków, które jedynie w formie aktywnej stanowią punkt uchwytu działania LFM-A13.

Połączenie to jest także skuteczne w badaniach in vitro, gdzie łączne podanie erytropoetyny β z LFM-A13 skutkuje zahamowaniem proliferacji, zmniejszeniem liczby komórek, ograniczeniem przyczepności do podłoża, jak również upośledzeniem podziałów komórkowych obu badanych linii komórkowych. Wyniki przeprowadzonych badań jednoznacznie wskazują, iż przedmiotowy wynalazek w tym zwłaszcza ujawnione zastosowanie ujawnionego zestawu - wykazuje wysoką skuteczność wobec komórek raka jelita grubego.

Oprócz wspomnianego powyżej efektu cytostatycznego skojarzonej terapii przedmiotowy wynalazek koryguje rozwijającą się u badanych zwierząt niedokrwistość, prowadząc tym samym do poprawy parametrów hematologicznych.

Kolejnym, bardzo cenną zaletą przedmiotowego wynalazku jest redukcja działań niepożądanych, jakie obserwuje się w czasie klasycznej terapii. Co prawda, monoterapia LFM-A-13 może wywoływać powikłania hematologiczne, w tym krwawienia, jednak jednoczesne podawanie erytropoetyny znamiennie redukuje to działanie niepożądane.

PL 230 756 Β1

Przedmiotowe rozwiązanie charakteryzuje się zatem nie tylko wysoką aktywnością przeciwnowotworową, ale także istotnie wpływa na poprawę jakości życia pacjentów.

Wdrożenie prezentowanej terapii opartej na kojarzeniu efektów wywołanych erytropoetyną oraz LFM-A13 stwarza realne szanse eradykacji komórek nowotworowych w tym w szczególności komórek raka jelita grubego przy stosunkowo słabo zaznaczonych działaniach niepożądanych.

Krótki opis figur

Fig. 1. Przedstawia wpływ erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ) (A), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) (B) oraz ich łącznego podania (C) na proliferację komórek DLD-1 po 72 godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 2. Przedstawia wpływ erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 ILI) (A), LFM-A13 (1, 10, 100 pM) (B) oraz ich łącznego podania (C) na proliferację komórek Ht-29 po 72 godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 3. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1,10,100 μΜ) oraz ich łącznego podania na liczbę komórek DLD-1 po 24 (A), 48 (B) oraz 72 (C) godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 4. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1,10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na liczbę komórek Ht-29 po 24 (A), 48 (B) oraz 72 (C) godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 5. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na żywotność komórek DLD-1 po 24 (A), 48 (B) oraz 72 (C) godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 6. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na żywotność komórek Ht-29 po 24 (A), 48 (B) oraz 72 (C) godz. inkubacji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 7. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek DLD-1 po 24 godz. inkubacji.

Fig. 8. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek Ht-29 po 24 godz. inkubacji.

Fig. 9. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek DLD-1 po 48 godz. inkubacji.

Fig. 10. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek Ht-29 po 48 godz. inkubacji.

Fig. 11. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek DLD-1 po 72 godz. inkubacji.

Fig. 12. Przedstawia wpływ wybranych stężeń erytropoetyny β (Epo 1, 10, 100 UJ), LFM-A13 (1, 10, 100 μΜ) oraz ich łącznego podania na morfologię komórek Ht-29 po 72 godz. inkubacji.

Fig. 13. Przedstawia dynamikę przyrostu guza jelita grubego u myszy Fox indukowanego linią DLD-1 oraz Ht-29. 0 - początek obserwacji, gdy guz ma ok. 5x5 mm, 1 - po pierwszym tygodniu, 2 - po drugim tygodniu, 3 - po trzecim tygodniu, 4 - po czwartym tygodniu. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10,

Objętość guza (V) obliczano wg metody opracowanej przez Feldman i wsp. (Feldman JP, Goldwasser R, Mark S, Schwartz J, Orion I. A Mathematical Model For Tumor Volume Evaluation Using Two-Dimensions. JAQM 2009, 4, 455-462) za pomocą poniższego wzoru:

zr 1

V - - /(długość xszerokości

Fig. 14. Przedstawia wpływ skojarzonego działania LFM-A13 (10 mg/kg m.c.) oraz erytropoetyny β (Epo, 600 lU/kg m.c.) na objętość guza u myszy z indukowanym rakiem jelita grubego linią DLD-1 (A) oraz Ht-29 (B). 0 - przed podawaniem substancji, 1 - po pierwszym tygodniu podawania substancji, 2 - po drugim tygodniu podawania substancji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10.

Fig. 15. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na objętość guza u myszy z indukowanym rakiem jelita grubego linią DLD-1 (A) oraz Ht-29 (B). 0 - przed podawaniem substancji, 1 - po pierwszym tygodniu podawania substancji, 2 - po drugim tygodniu podawania substancji. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 4-5.

Fig. 16. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 lU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na liczbę białych krwinek u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią

PL 230 756 Β1

DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 17. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β(Ερο, 600 lU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na erytrocytów u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 18. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na stężenie hemoglobiny u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 19. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 lU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na wartość hematokrytu u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 20. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na objętość krwinki czerwonej u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 21. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na średnią masę hemoglobiny w erytrocycie u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 22. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na średnie stężenie hemoglobiny w erytrocycie u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 23. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na liczbę płytek u myszy Fox z guzem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 (A) Ht-29 (B) po dwóch tygodniach podawania związków. Wyniki przedstawiono, jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Fig. 24. Przedstawia wpływ LFM-A13 (10 mg/kg m.c.), erytropoetyny β (Epo, 600 IU/kg m.c.) oraz ich łącznego podania na masę myszy z indukowanym rakiem jelita grubego linią DLD-1 (A) oraz Ht-29 (B). Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± SD, n = 10-12.

Poniżej przedstawiono przykłady realizacji przedmiotowego wynalazku, przy czym niniejszy wynalazek nie jest do nich ograniczony.

Przykłady wykonania

Stosowane związki są komercyjnie dostępne. Erytropoetyna β (w przykładach jako Epo) została nabyta w firmie Rochejako preparat NeoRecormon, natomiast LFM-A13 został nabyty w firmie Tocris.

Substancje pomocnicze wykorzystane w produkcji przemysłowej preparatu handlowego pod nazwą NeoRecormon są niezbędne w procesie wytwarzania postaci leku oraz warunkują jego stabilność podczas przechowywania preparatu. Do substancji pomocniczych obecnych w preparacie NeoRecormon należą :

Mocznik - jego rolą jest zwiększenie wchłaniania/uwalniania substancji leczniczej dzięki czemu możliwe jest osiągnięcie korzystniejszych rezultatów leczenia przy obniżeniu dawki leku dostarczanej do organizmu.

Sodu chlorek, Sodu diwodorofosforan dwuwodny, Disodu fosforan dwunastowodny - są to substancje osmotycznie czynne i buforujące zapewniające utrzymanie stałych, ustalonych przez producenta warunków przechowywania preparatu w gotowej postaci leczniczej.

Polisorbat 20 - jest to niejonowa, hydrofilowa substancja pomocnicza, której rolą jest umożliwienie wprowadzenia do roztworu wodnego substancji słabo lub bardzo słabo się w nim rozpuszczających poprzez utworzenie emulsji O/W.

Wapnia chlorek dwuwodny-jest to regulator kwasowości i stabilizator, dodatkowo pełniący funkcję zabezpieczającą przez nadmiernym uwodnieniem substancji czynnej.

Glicyna, L-leucyna, L-izoleucyna, L-treonina, L-kwas glutaminowy, L-fenyloalanina - są to aminokwasy niezbędne do zachowania odpowiednich właściwości izoelektrycznych polipeptydu jakim jest erytropoetyna, a także pełnią funkcję buforującą roztworu preparatu.

PL 230 756 Β1

Woda do wstrzykiwać - jest niezbędna do rozpuszczenia substancji czynnej i substancji pomocniczych i przeprowadzenia ich w postać roztworu.

Alkohol benzylowy - pełni rolę substancji konserwującej, której użycie jest niezbędne w celu zachowania jałowości i apirogenności roztworu wprowadzanego do organizmu żywego.

A. Badania in vitro.

W pierwszym etapie badań przeprowadzono eksperymenty in vitro z wykorzystaniem dwóch linii raka jelita grubego DLD-1 oraz Ht-29 (użyte w badaniach linie DLD-1 oraz Ht-29 pochodziły z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych i były to linie ciągłe, należy jednak zaznaczyć, iż pod względem histopatologicznych odpowiadają one komórkom nowotworowym raka jelita grubego izolowanym od pacjentów onkologicznych). Obie linie zaliczane są do linii adhezyjnych, szybkorosnących. Linia DLD-1 posiada gen i białko EpoR oraz pod względem histologicznym najbardziej przypomina pierwotnego guza, natomiast linia Ht-29 stanowi negatywną kontrolę genu EpoR. Linia komórek DLD-1 została wyizolowana z tkanki nabłonkowej gruczolakoraka jelita grubego (stadium C w skali Dukesa) dorosłego mężczyzny. Wykazuje ona obecność onkogenu myc, myb, ras, fos, sis i p53 oraz brak onkogenu abl, ros i src. Linia Ht-29 została wyizolowana z gruczolakoraka jelita grubego 44-letniej kobiety. W hodowlach in vitro wykazuje morfologię typową dla komórek nabłonkowych, ale mimo to nie różnicuje się do form tworzących rąbek szczoteczkowy. Ogromną część populacji komórek Ht-29 stanowią komórki kubkowe, a przez to linia ta tworzy duże ilości śluzu jelitowego. W komórkach linii Ht-29 wykazano obecność onkogenu myc, myb, ras, myb, fos, sis i p53 oraz brak onkogenu abl, ros i src.

Linię DLD-1 oraz Ht-29 zakupiono w Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ATCC). Linię DLD-1 hodowano w pożywce RPM11640 (ATCC), natomiast linię Ht-29 w pożywce McCoy's 5A (ATCC) zawierającej 10% FBS (ATCC) i po 50 ^tg/ml penicyliny i streptomycyny (ATCC). Komórki hodowano na płytkach „Falcon (Becton Dickinson, USA) o średnicy 100 mm w inkubatorze (Heraeus), w atmosferze 5% CO2, przy wilgotności 95%, w temperaturze 37°C. Pożywkę zmieniano co 2-3 doby. Gdy komórki osiągały 70-80% konfluencji były przepłukiwane PBS, trypsynizowane za pomocą buforu fosforanowego zawierającego 0,25% trypsyny i przenoszone na nowe płytki. Do badań użyto komórek między 8 a 14 pasażem.

Przykład 1. Wpływ erytopoetyny β na proliferację komórek raka jelita grubego linii DLD-1 i Ht-29.

Oceny tej dokonano przy pomocy metody MTT według Mosmann (Plumb J. A., Milroy R. , Kaye S. B.: Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res., 1989, 49: 4435-4440) polegającej na pomiarze aktywności o ksyd o redukcyjnej mitochondriów żywych komórek poprzez redukcję żółtego rozpuszczalnego w wodzie bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowego (MTT) do fioletowego nierozpuszczalnego w wodzie formazanu. Badanie to wykonano po 72 godzinach od momentu dodania do podłoża hodowlanego erytropoetyny. Komórki linii DLD-1 oraz Ht-29 umieszczono na płytki 24-dołkowe w ilości 1 X 100 000/studzienkę i inkubowano przez okres 48 godzin do uzyskania pełnej konfluencji. Pożywkę zmieniono na świeżą zawierającą Epo w stężeniu 0 (kontrola), 1,10 i 100 lU/ml. Po 72-godzinnej inkubacji z Epo pożywkę usunięto, a komórki przepłukano PBS. Następnie do komórek dodano po 1 ml roztworu MTT w PBS (5 mg/ml) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po dokładnym usunięciu roztworu MTT, do komórek dodano po 1 ml DMSO w celu wywołania lizy i rozpuszczenia kryształów formazanu oraz po 10 μΙ buforu Sorensena (0,1 mol/l glicyny, 0,1 mol/l NaCI doprowadzony do pH 10,5 roztworem 0,1 N NaOH). Absorbancję mierzono wobec DMSO jako próby zerowej przy długości fali λ=570 nm, za pomocą czytnika mikropłytek UVM 340 (Asys, Niemcy) wyposażonego w oprogramowanie MikroWin 2000. Wyniki przedstawiono w procentach wartości próby kontrolnej (kontrola = 100%).

Siedemdziesięciodwugodzinna inkubacja komórek nowotworowych linii DLD-1 z Epo w stężeniu 100 lU/ml wykazała istotne statystycznie zahamowanie proliferacji wobec komórek inkubowanych z Epo 1 lU/ml (p<0,05) (Fig. 1 A). Z kolei 72-godzinna inkubacja komórek nowotworowych linii Ht-29 z Epo w stężeniu 10 lU/ml oraz 100 lU/ml wykazała istotne statystycznie zahamowanie proliferacji w porównaniu do grupy kontrolnej (odpowiednio p<0,05 i p<0,001). Inkubacja komórek z Epo 10 lU/ml spowodowała istotne statystycznie zahamowanie proliferacji w porównaniu do proliferacji komórek poddanych działaniu Epo 1 lU/ml (p<0,01). Zaobserwowano również istotne statystycznie zahamowanie proliferacji komórek inkubowanych z Epo 100 lU/ml wobec komórek poddanych działaniu Epo w stężeniu 10 lU/ml (p<0,001) oraz 1 lU/ml (p<0,001) (Fig. 2A).

Przykład 2. Wpływ LFM-A13 na proliferację komórek raka jelita grubego linii DLD-1 i Ht-29.

PL 230 756 Β1

Komórki linii DLD-1 oraz Ht-29 inkubowano z LFM-A13 w stężeniu 0 (kontrola), 1,10 oraz 100 μΜ przez 72 godziny. Nie stwierdzono istotnego statystycznie wpływu LFM-A13 na proliferację komórek linii DLD-1 (Fig. 1B). Zaobserwowano natomiast istotne statystycznie hamowanie proliferacji komórek linii Ht-29 po inkubacji z LFM-A13 w stężeniu 1 μΜ (p<0,05), 10 μΜ (p<0,001) oraz 100 μΜ (p<0,001) w porównaniu do kontroli. Stwierdzono również istotne statystycznie zahamowanie proliferacji komórek inkubowanych z LFM-A13 w stężeniu 100 μΜ w porównaniu do komórek poddanych działaniu LFM-A13 w stężeniu 1 μΜ (p<0,001) oraz 10 lU/ml (p<0,001) (Fig. 2B).

Przykład 3. Wpływ łącznego podania erytropotyny β i LFM- A13 na proliferację komórek raka jelita grubego linii DLD-1 oraz Ht-29.

Po 72 godzinach inkubacji komórek linii DLD-1 z jednocześnie podanymi Epo oraz LFM-A13 stwierdzono istotne statystycznie zahamowanie proliferacji komórek w porównaniu do kontroli (p<0,01) oraz LFM-A13 (p<0,001). Badanie to wykazało potencjalizujący efekt łącznego podania Epo oraz LFM-A13 w porównaniu do każdego z tych związków osobno (Fig. 1C). Podobne wyniki uzyskano w linii Ht-29, gdzie jednoczesna inkubacja komórek Ht-29 z Epo oraz LFM-A13 spowodowała istotne statystycznie hamowanie proliferacji komórek w porównaniu do kontroli (p<0,001), Epo (p<0,001), jak również LFM-A13 (p<0,001). Przeprowadzone doświadczenia jednoznacznie wskazują, iż łączne podania Epo oraz LFM-A13, skuteczniej hamuje proliferację komórek obu badanych linii raka jelita grubego w porównaniu do efektu wywieranego przez te związki stosowane osobno (Fig. 2C).

Przykład 4. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na liczbę komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 24 godzinnej inkubacji.

Liczbę komórek oceniano przy użyciu aparatu NucleoCounter® firmy ChemoMetec, który wykrywa i przechwycą sygnały emitowane przez jodek propidyny - Propidium lodide (Pl) - wnikający do DNA jądra komórkowego. Podanie Epo w stężeniu 10 oraz 100 UJ spowodowało istotny statystycznie wzrost liczby komórek DLD-1 w porównaniu do kontroli (p<0,001, p<0,001). LFM-A13 w stężeniu 100 μΜ obniżył liczbę komórek w porównaniu do kontroli (p<0,05). W toku eksperymentu wykazano, iż łączne podanie erytropoetyny β oraz LFM-A13 (Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zmniejszało istotnie statystycznie liczbę komórek w porównaniu do kontroli (p<0,05, p<0,05) oraz komórek poddanych działaniu samej Epo 100 (odpowiednio p<0,001, p<0,001). Istotne statystycznie obniżenie liczby komórek wykazano także po inkubacji z Epo 100 + LFM-A13 30 w porównaniu do efektu wywieranego przez sam LFM-A13 30 (p<0,01) (Fig. 3A).

Po 24 godzinnej inkubacji komórek linii Ht-29 z Epo w stężeniu 100 UJ zanotowano niespodziewany spadek liczby komórek w porównaniu do kontroli (p<0,001). Podobny efekt obserwowano po podaniu LFM-A13 w stężeniu 30 i 100 μΜ w odniesieniu do kontroli (odpowiednio p<0,01, p<0,01). Analogicznie jak w przypadku linii DLD-1 wykazano, że łączne podanie erytropoetyny β oraz LFM-A13 (Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zmniejszało istotnie statystycznie liczbę komórek Ht-29 w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,001) oraz komórek poddanych działaniu samej Epo 100 (odpowiednio p<0,01, p<0,001). Zaobserwowano także znaczny spadek liczby komórek inkubowanych z Epo 100 + LFM-A13 30 oraz Epo 100 + LFM-A13 100 w porównaniu do komórek poddanych działaniu samego LFM-A13 w stężeniu 30 i 100 μΜ (odpowiednio p<0,001; p<0,001) (Fig. 4A).

Przykład 5. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na liczbę komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 48 godzinnej inkubacji.

Podanie Epo w stężeniu 10 UJ spowodowało istotny statystycznie wzrost liczby komórek DLD-1 wobec kontroli (p<0,001). LFM-A13 w stężeniu 100 μΜ obniżył liczbę komórek w porównaniu do kontroli (p<0,05). Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, iż łączne podanie erytropoetyny β oraz LFM- A13 (Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zmniejszało istotnie statystycznie liczbę komórek w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,01, p<0,001) oraz komórek poddanych działaniu samej Epo 100 (odpowiednio p<0,001, p<0,001). Istotne statystycznie obniżenie liczby komórek wykazano także po inkubacji z Epo 100 + LFM-A13 30 w porównaniu do efektu wywieranego przez sam LFM-A13 100 (p<0,001) (Fig. 3B).

Po 48 godzinnej inkubacji komórek linii Ht-29 z Epo w stężeniu 10 i 100 UJ, LFM-A13 30 i 100 μΜ, a także po ich łącznym podaniu (Epo 10 + LFM-A13 30; Epo 10 + LFM-A13 100; Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zaobserwowano istotny statystycznie spadek liczby komórek w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001) (Fig. 4B). Ponadto stwierdzono znaczne obniżenie liczby komórek inkubowanych z Epo 10 + LFM-A13 100 w wobec komórek poddanych działaniu samego LFM-A13 100 (p<0,01).

PL 230 756 Β1

Przykład 6. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na liczbę komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 72 godzinnej inkubacji.

Po 72 godzinnej inkubacji komórek linii DLD-1 z Epo w stężeniu 10 i 100 IU, LFM-A13 30 i 100 μΜ, a także po ich łącznym podaniu (Epo 10 + LFM-A13 30; Epo 10 + LFM-A13 100; Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zaobserwowano istotny statystycznie spadek liczby komórek wobec kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001). Zaobserwowano także znaczny spadek liczby komórek inkubowanych z Epo 100 + LFM-A13 30 oraz Epo 100 + LFM-A13 100 w porównaniu do komórek poddanych działaniu samego LFM-A13 w stężeniu 30 i 100 μΜ (odpowiednio p<0,001; p<0,001 (Fig. 3C).

Podobny efekt uzyskano po 72 godzinnej inkubacji komórek linii Ht-29 z Epo w stężeniu 10 i 100 IU, LFM-A13 100 μΜ, a także po ich łącznym podaniu (Epo 10 + LFM-A13 30; Epo 10 + LFM-A13 100; Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) wobec kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001). Łączne podanie erytropoetyny β oraz LFM-A13 (Epo 100 + LFM-A13 30; Epo 100 + LFM-A13 100) zmniejszało istotnie statystycznie liczbę komórek w porównaniu do samej Epo 100 (odpowiednio p<0,05, p<0,01) . Podobny efekt obserwowano po podaniu Epo 100 + LFM- A13 30 w odniesieniu do komórek inkubowanych z samym LFM-A13 30 μΜ (p<0,001) oraz Epo 100 + LFM-A13 100 wobec komórek poddanych działaniu LFM-A13 100 μΜ (p<0,05) (Fig. 4C).

Przykład 7. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na żywotność komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 24 godzinnej inkubacji.

Po 24 godzinnej inkubacji komórek linii DLD-1 (Fig. 5A) oraz Ht-29 (Fig. 6A) nie obserwowano zmian w żywotności komórek po podaniu badanych związków.

Przykład 8. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na żywotność komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 48 godzinnej inkubacji.

Po 48 godzinnej inkubacji komórek linii DLD-1 (Fig. 5B) oraz Ht-29 (Fig. 6B) nie obserwowano zmian w żywotności komórek po podaniu badanych związków.

Przykład 9. Wpływ wybranych stężeń erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz ich łącznego podania na żywotność komórek linii DLD-1 i Ht-29 po 72 godzinnej inkubacji.

Po 72 godzinnej inkubacji komórek linii DLD-1 zaobserwowano spadek żywotności komórek poddanych działaniu Epo 100, jak również Epo 100 + LFM-A13 100 w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,05, p<0,01. Istotne zmniejszenie żywotności wykazano w komórkach inkubowanych z Epo 100 + LFM-A13 100 wobec komórek poddanych działaniu samego LFM-A13 100 (P<0,001) (Fig. 5C).

W linii Ht-29 72 godzinna inkubacja z LFM-A13 100, Epo 10 + LFM-A13 100, Epo 100 + LFM-A13 30, Epo 100 + LFM-A13 100 spowodowała wyraźny spadek żywotności komórek wobec kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,001, p<0,001, p<0,001). Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, iż łączne podanie erytropoetyny β oraz LFM-A13 (Epo 10 + LFM-A13 100) zmniejszało istotnie statystycznie żywotność komórek w porównaniu do komórek poddanych działaniu samej Epo 10 (p<0,001). Podobne obniżenie żywotności stwierdzono po inkubacji komórek Ht-29 z Epo 100 + LFM-A13 30 oraz Epo 100 + LFM-A13 100 wobec komórek poddanych działaniu samej Epo 100. Ponadto LFM-A13 w stężeniu 100 pM podany łącznie z Epo 10 (Epo 10 + LFM-A13 100) oraz Epo 100 (Epo 100 + LFM-A13 100) zmniejszył żywotność w porównaniu do komórek inkubowanych z samym LFM-A13 100 (odpowiednio p<0,001, p<0,001) (Fig. 6C).

Przykład 10. Obserwacje morfologiczne komórek DLD-1 oraz Ht-29.

W celu oceny wpływu erytropoetyny beta, LFM-A13 oraz obu tych związków jednocześnie stosowanych na zmiany morfologiczne DLD-1 oraz Ht-29, komórki zostały rozsiane na płytki 24-oczkowe. Po 48-godzinnej inkubacji podłoże zmieniono na świeże zawierające wybrane stężenia badanych związków. Po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji obraz komórek zarejestrowano w 200-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu kontrastowo-fazowego Nikon Eclipse TS 100 (Nikon, Japonia) z kamerą Nikon DS-Fi1c wyposażonego w oprogramowanie NIS-Elements F. Doświadczenie przeprowadzono na konfluentnych komórkach linii DLD-1 oraz Ht-29 inkubowanych w podłożu z 10% surowicą i różnymi stężeniami badanych związków przez 24, 48 i 72 godziny. Pod wpływem erytropoetyny β oraz LFM-A13 nastąpiło zmniejszenie gęstości komórek linii DLD-1 oraz Ht-29 w hodowli, przyczepności do podłoża, jak również upośledzenie podziałów komórkowych. Zmiany te były najbardziej zauważalne w komórkach inkubowanych z badanymi związkami przez 72 godzinny. Zdjęcia komórek przedstawiono na Fig. 7 i 8 (odpowiednio inkubacja 24 godz. linia DLD-1 i Ht-29), Fig. 9 i 10 (inkubacja 48 godz. linia DLD-1 i Ht-29, odpowiednio) oraz Fig. 11 i 12 (inkubacja 72 godz. linia DLD-1 i Ht-29, odpowiednio).

PL 230 756 Β1

B. Badania in vivo.

Drugi etap badań został przeprowadzony z wykorzystaniem zwierząt (samice myszy Cby.CgFoxn1 nu/J) (Jackson Laboratory, USA). Szczep ten wykazuje defekt nabłonka grasicy (bezgrasiczność) oraz cebulek włosowych (homozygotyczne samice) i jest powszechnie stosowany do badań nad substancjami modulującymi rozrost nowotworu. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi doświadczeń na zwierzętach oraz protokołem zatwierdzonym przez Lokalną Komisję Etyczną (uchwała NR 31/2013). Badania przeprowadzone w warunkach in vivo zostały wykonane w Centrum Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Jest to nowoczesna jednostka, która zapewnia wysoki standard hodowli w statusie SPF za barierą hodowlaną. Zwierzęta przebywają w nadciśnieniu, optymalnej temperaturze 22°C, wilgotności powietrza 55%, 15 wymian na godzinę (prędkość nie przekracza 0.3 m/s) i cyklu dnia świetlnego 12/12. Pomieszczenia, w których znajdują się zwierzęta są całodobowo monitorowane, a okresowej kontroli podlegają zarówno zwierzęta (zgodnie z zaleceniami FELASA) jak i pomieszczenia, w których się one znajdują. Centrum Medycyny Doświadczalnej posiada Certyfikat Zgodności z Zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP).

W badaniach wstępnych myszy zostały podzielone na dwie grupy. Myszom z grupy pierwszej na stronie grzbietowej podskórnie wstrzyknięto 50 μΙ zawiesiny zawierającej sto milionów komórek DLD-1 w PBS, natomiast myszom z grupy drugiej 50 μΙ zawiesiny zawierającej sto milionów komórek Ht-29 w PBS zgodnie z metodyką opisaną przez Shinohara i wsp. Linia Ht-29 jest negatywną kontrolą EpoR, zaś linia DLD-1 pozytywną kontrolą EpoR.

Po pierwszym tygodniu, gdy guz osiągnął średnicę ok. 5 mm, tj. według danych literaturowych wielkość odpowiednią do przeprowadzania dalszych etapów badań, rozpoczęto podskórne podawanie erytopoetyny β w dawce 600 lU/kg, tj. dawce terapeutycznej stosowanej u ludzi trzy razy w tygodniu. Moment podawania erytropoetyny β oraz LFM-A13 oznaczono jako czas 0. Zwierzęta otrzymywały dwa razy dziennie dootrzewnowo LFM-A13 w dawce 10 mg/kg. Okres podawania związków wynosił 2 tygodnie. Grupę kontrolną stanowiły zwierzęta otrzymujące podskórnie 50 μΙ PBS oraz dootrzewnowo 50 μΙ 10% roztworu etanolu w PBS. Przed podaniem związków (czas 0) oraz po 5 pierwszym (czas 1) oraz drugim tygodniu (czas 2) podawania substancji oceniano wielkość guza w trzech wymiarach przy pomocy elekronicznej suwmiarki. Objętość guza wyrażano w mm3 zgodnie obliczeniami, które zostały opisane przez Feldman i wsp. [Feldman JP, Goldwasser R, Mark S, Schwartz J, Orion I. A Mathematical Model ForTumorVolume Evaluation Using Two-Dimensions. JAQM 2009, 4, 455-462],

Na początku eksperymentu in vivo zbadano dynamikę rozwoju guza u myszy ostrzykniętych linią DLD-1 oraz Ht-29. Stwierdzono zdecydowanie większe przyrosty guza w grupie Ht-29 już od drugiego tygodnia obserwacji. Różnica ta utrzymywała się przez cały okres doświadczenia, tj. 4 tygodnie (Fig. 13).

W grupie zwierząt z rakiem jelita grubego indukowanym linią DLD-1 zaobserwowano istotne statystycznie zahamowanie rozwoju guza u zwierząt otrzymujących LFM-A13 + Epo zarówno po pierwszym i drugim tygodniu trwania eksperymentu w porównaniu do grupy kontrolnej (Fig. 14A). Podobnie, u zwierząt z guzem jelita grubego indukowanym linią Ht-29 stwierdzono istotne statystycznie zmniejszenie objętości guza w grupie zwierząt otrzymujących oba związki jednocześnie (Fig. 14B).

Uzyskanie pozytywnych wyników skłoniło do powtórzenia i rozbudowania dalszych etapów badań w opisanym powyżej modelu zwierzęcym. Ponownie wyindukowano guz przy pomocy linii DLD-1 oraz Ht-29, po czym randomizowano zwierzęta do 4 grup w obrębie każdej linii. W ten sposób uzyskano następujące grupy: kon, LFM-A13, Epo oraz LFM-A13 + Epo. Zwierzęta otrzymywały badane związki wg wcześniejszego schematu. Pomiar wielkości guza prowadzono przed rozpoczęciem podawania związków oraz po pierwszym i drugim tygodniu trwania eksperymentu.

U zwierząt ostrzykniętych linią DLD-1 w pierwszym oraz drugim tygodniu zaobserwowano istotne zahamowanie rozwoju guza w grupie otrzymującej LFM-A13 + Epo w porównaniu do grupy kontrolnej (Fig. 15A). Z kolei u zwierząt ostrzykniętych linią Ht-29 zahamowanie rozwoju guza zanotowano jedynie w grupie otrzymującej sam LFM-A13 w drugim tygodniu podania w porównaniu do kontroli (Fig. 15B).

Analiza parametrów hematologicznych po dwutygodniowej terapii wykazała istotny statystycznie wzrost liczby RBC u zwierząt z rakiem Ht-29 otrzymujących Epo, jak również LFM-A13 + Epo w porównaniu do kontroli oraz wzrost liczby RBC w grupie otrzymującej LFM-A13 + Epo w porównaniu do grupy ostrzykiwanej samym LFM-A13 (Fig. 17B). Zaobserwowano także istotny wzrost stężenia HGB oraz HCT u myszy z wyindukowanym guzem linią Ht-29 wobec grupy kontrolnej (odpowiednio p<0,05 oraz p<0,05), a także w porównaniu do grupy otrzymującej sam LFM-A13 (odpowiednio p<0,01, p<0,001).

PL 230 756 Β1

Należy podkreślić, iż poprawę tych parametrów (HGB, HOT) obserwowano także u zwierząt otrzymujących samo Epo w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,01, p<0,001) (Fig. 18B, 19B). W przypadku myszy ostrzykniętych linią DLD-1 nie stwierdzono zmian w stężeniu HGB oraz HOT, co związane było z brakiem rozwoju niedokrwistości we wszystkich badanych grupach (Fig. 18A, 19A). U zwierząt z wyindukowanym nowotworem linią DLD-1 oraz Ht-29 obserwowano wzrost wartości MCV po leczeniu Epo w porównaniu do kontroli (odpowiednio p<0,001, p<0,01). Parametr ten uległ zwiększeniu także w grupach zwierząt otrzymujących LFM-A13 + Epo wobec myszy ostrzykiwanych samym LFM-A13 (w grupie DLD-1 p<0,001, w grupie Ht-29 p<0,01), jak również w porównaniu do zwierząt kontrolnych z wyindukowanym nowotworem linią Ht-29 (p<0,001) (Fig. 20A, 20B). U myszy DLD-1 dodanie LFM-A13 do Epo spowodowało spadek wartości MCV w porównaniu do grupy otrzymującej samą Epo (p<0,05) (Fig. 20A). Wartość parametru MCHC uległa istotnemu obniżeniu w grupie zwierząt Ht-29 otrzymujących LFM-A13 + Epo w porównaniu do kontroli (p<0,01) oraz LFM-A13 (p<0,05). Zastosowanie samej Epo również obniżyło wartość MCHC (p<0,001) (Fig. 22B). Nie stwierdzono natomiast zmian tego parametru u myszy ostrzykniętych linią DLD-1 (Fig. 22A). Nie odnotowano żadnych zmian w parametrach WBC (Fig. 16A, 16B), MCH (Fig. 21 A, 21B), PLT (Fig. 23A, 23B) u myszy z wyindukowanym guzem linią DLD-1 oraz Ht-29.

Oprócz parametrów hematologicznych monitorowano masę ciała zwierząt. Myszy u których utkanie nowotworowe stanowiły komórki Ht-29 zaobserwowano przyrost masy ciała jedynie w grupie, która przez 2 tygodnie otrzymywała samą Epo (p<0,05) (Fig. 24B). Z kolei, u zwierząt z nowotworem DLD-1 nie zarejestrowano istotnych zmian masy ciała w żadnej z analizowanych grup (Fig. 24A).

Analiza statystyczna

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Dla cech zgodnych z rozkładem normalnym, ocenianych testem Shapiro-Wilka, przy porównaniach między dwiema grupami stosowano test t- Studenta a dla cech niezgodnych z tym rozkładem stosowano test U Manna-Whitneya. Przy porównaniach większej liczby grup niż dwie stosowano odpowiednio analizę wariancji z testem post hoc Benferroniego lub test Kruskala-Wallisa. Analizując w grupach pomiary w odstępach czasowych wykorzystano odpowiednio test t- Studenta dla par lub test Wilcoxona dla par. W obliczeniach przyjęto poziom istotności p < 0,05 jako znamienny statystycznie. Obliczenia wykonano wykorzystując pakiet statystyczny SPSS.

Claims (21)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), do zastosowania jako lek.
2. 2. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że erytropoetyna jest wybrana z grupy obejmującej erytropoetynę a, erytropoetynę β oraz darbepoetynę a w szczególności erytropoetynę β.
3. 3. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że są stosowane w terapii nowotworu.
4. 4. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-3, znamienna tym, że nowotwór charakteryzuje się wysoką aktywnością kinazy tyrozyn owej Brutona.
5. 5. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-4, znamienna tym, że nowotwór charakteryzujący się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona obejmuje raka jelita grubego i/lub inne guzy lite w szczególności wybrane z grupy obejmującej guzy zarodkowe, mięsaki, raki, chłoniaki, guzy kości i nerwowopochodne.
6. 6. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-5, znamienne tym, że nowotwór charakteryzujący się szczególnie wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona jest wybrany z grupy obejmującej hormonozależny nowotwór piersi u kobiet, hormonozależny nowotwór prostaty oraz nowotwór gruczołowy płuc.
7. 7. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrzeżeń 1-6, znamienna tym, że erytropoetyna i inhibitor kinazy Brutona są podawane równocześnie, oddzielnie lub sekwencyjnie.
8. 8. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-7, znamienna tym, że erytropoetyna jest podawana podskórnie lub dożylnie, korzystnie podskórnie, a inhibitor kinazy Brutona jest podawany dootrzewnowo.

   PL 230 756 Β1
9. 9. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-8, znamienna tym, że terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β jest podawana 3 razy w tygodniu, a terapeutycznie skuteczna ilość inhibitora kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), jest podawana 2 razy dziennie.
10. 10. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-9, znamienna tym, że terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny β podawana 3 razy w tygodniu wynosi 600 IU/kg na podanie, a terapeutycznie skuteczna ilość 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) podawana 2 razy dziennie wynosi 10 mg/kg na podanie.
11. 11. Erytropoetyna oraz inhibitor kinazy Brutona do stosowania według jednego z poprzednich zastrz. 1-10, znamienna tym, że dodatkowo stosuje się skuteczną ilość co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmującej cytostatyki, korzystnie fluorouracyl, fluoropirymidynę, i/lub inhibitory kinaz, korzystnie ibrutynib, sorafenib, AZD0530, GDC0834, CGI-560, CGI1746.
12. 12. Zastosowanie erytropoetyny β oraz inhibitora kinazy Brutona w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), do wytwarzania leku do terapii nowotworu.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że erytropoetyna jest wybrana z grupy obejmującej erytropoetynę a, erytropoetynę β oraz darbepoetynę a, w szczególności erytropoetynę β.
14. 14. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-13, znamienne tym, że nowotwór charakteryzuje się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona.
15. 15. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-14, znamienne tym, że nowotwór charakteryzujący się wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona obejmuje raka jelita grubego, i/lub inne guzy lite, w szczególności wybrane z grupy obejmującej guzy zarodkowe, mięsaki, raki, chłoniaki, guzy kości i nerwowopochodne.
16. 16. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-15, znamienne tym, że nowotwór charakteryzujący się szczególnie wysoką aktywnością kinazy tyrozynowej Brutona jest wybrany z grupy obejmującej hormonozależny nowotwór piersi u kobiet, hormonozależny nowotwór prostaty oraz nowotwór gruczołowy płuc.
17. 17. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-16, znamienne tym, że erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β i inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), są podawane równocześnie, oddzielnie lub sekwencyjnie.
18. 18. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-17, znamienne tym, że erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β, jest podawana podskórnie lub dożylnie, korzystnie podskórnie, a inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), jest podawany dootrzewnowo.
19. 19. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-18, znamienne tym, że terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny, w szczególności erytropoetyny β jest podawana 3 razy w tygodniu, a terapeutycznie skuteczna ilość inhibitora kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13), jest podawana 2 razy dziennie.
20. 20. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-19, znamienne tym, że terapeutycznie skuteczna ilość erytropoetyny 3 podawana 3 razy w tygodniu wynosi 600 lU/kg na podanie, a terapeutycznie skuteczna ilość 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamidu (LFM-A13) podawana 2 razy dziennie wynosi 10 mg/kg na podanie.
21. 21. Zastosowanie według jednego z poprzednich zastrz. 12-20, znamienne tym, że erytropoetyna, w szczególności erytropoetyna β oraz inhibitor kinazy Brutona, w postaci 2-cyjano-N-(2,5-dibromofenylo)-3-hydroksy-2-butenamid (LFM-A13), są stosowane w połączeniu z co najmniej jednym związkiem wybranym z grupy obejmującej cytostatyki, korzystnie fluorouracyl, fluoropirymidynę, i/lub inhibitory kinaz, korzystnie ibrutynib, sorafenib, AZD0530, GDC0834, CGI-560, CGI-1746.