KR100663687B1

KR100663687B1 - 항체 발현 세포의 분리 방법

Info

Publication number: KR100663687B1
Application number: KR1020047001203A
Authority: KR
Inventors: 라처앤디; 싱라빈더
Original assignee: 론자 그룹 아게
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2007-01-02
Also published as: CN1296710C; JP4202251B2; CN1545621A; US20040219611A1; DE60204699D1; ATE298090T1; JP2005526950A; GB0118337D0; WO2003012449A3; ES2243757T3; KR20040021660A; PT1415158E; DE60204699T2; CA2454088A1; WO2003012449A2; EP1415158A2; EP1415158B1

Abstract

단백질 A 또는 단백질 G 를 세포 표면에 부착시켜서, 분비된 가용성 항체를 포획하는 단계를 포함하는, 고수준의 항체 생성 세포를 분리하는 방법. 통상적인 방법에 의해 포획된 항체를 형광 염색한 후, FACS 분석하면 소량의 고 생산자 단일 세포가 분리된다.

Description

항체 발현 세포의 분리 방법 {METHOD FOR SELECTING ANTIBODY EXPRESSING CELLS}

본 발명은 생물공학적 제조 분야에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 항체 생성 세포 분리 및 세포 주 (cell line) 안정성 평가 방법을 고안하는 것이다.

항체 생성 세포 대 항체 비(non)-생성 세포의 분리, 특히 고 생성 세포 주의 분리는 임의의 생물공정 (bioprocess) 의 발생 (development) 에서 중요한 제 1 단계이다. 동물 세포로부터의 단백질 생성에 있어서, 전형적으로는 한계 희석 클로닝 (cloning) 의 반복에 의해, 이같이 분리된 세포 주를 단리시킨 후, 생성물을 분석한다. 이 전형적인 공정은 시간 소비적이고, 비용이 많이 든다. 클론성 (clonality) 달성의 이론적 확실성을 개선시키기 위하여, 2 회의 클로닝 반복이 요구된다. 고 생산자보다 보통 더 높은 성장 속도를 가지는 저 생산성 변형체에 의해, 고 생산자의 과잉성장을 피하기 위하여 클론성은 중요하다. 전체로, 전형적인 공정은 완료되는데 8 개월이 넘게 걸릴 수 있다. 또한, 실제적인 연구는 사실상 선별 (screen) 되는 세포의 수를 제한할 수 있으므로, 소수의 고-생산 세포 클론의 검출을 단지 운의 문제로 치부할 수도 있다.

발생 공정 도중의 세포 주 안정성 평가는 또한 분석용 클로닝을 요구할 수 있고, 이것은 6 내지 7 주가 걸릴 수 있다. 또한, 분석용 클로닝은 유세포 분 석 (flow cytometry) 으로 가능한 수천개의 분석에 비하여, 200-300 클론의 평가를 포함하고, 이것은 따라서, 비-생성 모집단 (population) 의 크기에 대하여, 더욱 상세하고 정확한 묘사를 제공한다. 이전에 보고된 분비 분석은 뚜렷한 하위-모집단 (sub-population) 을 분해 (resolution) 하고, 따라서 정량하기에 감도가 불충분하였다.

유세포 분석 (FC) 은 또한 매우 다수의 세포의 생산성을 검사하고, 적합한 단일 세포를 단리시키는 것을 가능하게 하였다. FC 는 세포를 형광발색단 (fluorophor) 으로 표지할 것을 요하고, 이들의 형광은 FC 에서 정량화되며, 원하는 특성과 서로 관련되어야 한다. 그러나, 세포 주의 표면 상에 막-결합된 것으로 나타난 항체의 양은 가용성 항체에 있어서 이의 분비 속도와 그리 관련되어 있지는 않다 (Meilhoc 등, Application of flow cytometric measurement of surface IgG in kinetic analysis of monoclonal antibody synthesis and secretion by murine hybridoma cell-line in low serum and serum-free media, Hybridoma 9, 67-175). 따라서, 나타난 항체를 검출 항체로 간단하게 염색하는 것은 고도로 생산성인 클론을 단리하는데 효과적인 것으로 입증되지 않았다. 2 가지의 기본적으로 상이한 접근법을 선택하여 이 문제를 극복하고, 분비된 항체의 고 생산자 세포를 직접 분리하였다.

제 1 방법에서, 단일 세포 및 수반되는 분비된 항체를 겔 방울에 캡슐화한다. 이어서, 전체 방울을 표지하고, FC 를 이용하여 분류한다. 이 접근법은 사용자에게 불편하고, 겔 방울을 단일 세포로 확실히 채우기 위하여, 생성된 겔 방울의 약 5% 만이 세포를 포함하는 반면, 분석된 겔 입자의 약 95% 가 셀이 없다는 단점이 있다. 또한, 캡슐화/탈캡슐화는 재조합 단백질, 가장 현저하게는 골수종 (myeloma) NS0 세포의 발현에 흔히 사용되는 일부 세포 유형의 생존력을 감소시킬 수 있다.

제 2 접근법에서, 분비된 항체는 세포 표면 상에 인공적으로 생성된 친화성 부위 또는 수용체에 의해 유지되어, FC 에 의해 연속적으로, 분비된 항체의 수를 평가한다. Holmes 등 (J. of Immunol. methods, 230 (1999), 141-147) 은 실온에서 원형질 (plasma) 막 단백질의 비오티닐화 (biotinylation) 를 포함하는 분석을 기술한다. 비오틴은 일차적으로는 아비딘 및 이차적으로는 비오티닐화 포획 항체의 결합을 추가로 촉진시킨다. 포획 항체는 NSO 세포 주로부터 분비된 항체를 인식하고, 이것을 세포 표면에 붙인다. 이어서, 제 3 의 형광 표지된 검출 항체로 포획되어 있는 분비된 항체와 세포를 배양시킴으로써, FC 에 의해, 소수의 고 생산자 세포 클론의 형광 검출 및 세포 분류를 달성한다. 배양 배지에 젤라틴과 같은 점도제를 첨가하면, 각각의 클론 사이의 누화 (cross-talk) (즉, 생산자 세포로부터 분비된 항체의 비- 또는 저-생산자 세포로의 확산 및 결합) 가 방지된다.

공인된 방법의 주요한 단점은, 이것이 높고 낮은 수준의 생산자 세포를 구별하고, 소수의 고 생산자 세포를 정확히 분류하는데 대하여, 비교적 낮은 감도를 제공한다는 것이다. 공인된 방법을 사용함으로써, 제공된 세포 주로부터 분비된 키메라 (chimeric) 항체의, 포획 항체를 통한 세포 표면에의 결합을 검출하는 것이 불가능했다. 또한, 포획 항체는 필연적으로, 태아 혈청을 포함할 수 있는 포유류 세포 배양액으로부터 유래하였고, 종종 시판되는 항체 제제로서의 소 혈청 알부민으로 안정화될 것이다. 따라서, 포획 항체를 사용하면 클론성 세포 배양액의 바이러스성 또는 BSE 오염의 위험이 수반된다.

본 발명의 목적은 세포 클론 풀 (pool) 로부터 적합한 항체를 발현시키는 단일 세포를 효과적으로 검출 및 분리하는 또다른 방법을 고안하는 것이다. 이 목적은 독립항 1 에 따른 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 가능한 구현예를 도면에 나타낸다. 이는 하기의 도면에 나타나 있다:

도 1 a: 분비된 항체 분석용 포획 및 검출 원리의 개략도 및 b: 포획 항체 및 단백질 A 의 결합 용량 비교

도 2 본 발명의 분비 분석으로부터의 샘플의 형광 세포분석 (fluorescent cytometry: FC) 분석

도 3 분비된 항체의 포획에 대한 단백질 A 대 항-인간 IgG 항체의 효과를 비교하는 분비 분석으로부터의 샘플의 형광 세포분석 (FC) 분석

제 1 항체를 분비하는 세포를 분리하기 위한 본 발명에 따른 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) 세포의 세포 표면에 아비딘을 연결시키는 단계

b) 단백질 G 또는 단백질 A 로부터의 하나 이상의 관능성 항체 결합 영역을 포함하는 비오티닐화 폴리펩티드와 세포를 배양시키는 단계

c) 형광으로 표지되고, 제 1 항체 상의 에피토프를 인식하고 결합하는 제 2 항체와 세포를 배양하고, 배양 후, 결합되지 않은 제 2 항체를 씻어내는 단계

d) 바람직하게는, 편의상, 형광 분석 유세포 분석 (FC) 을 이용하여, 상당량의 제 2 항체와 결합한, 형광 표지된 세포를 분리하는 단계. FC 는 형광으로 표지된 세포를 동시에 분류시킨다.

항체를 분비하는 생산자 세포는 예를 들어, 하이브리도마 (hybridoma), 골수종 또는 CHO 세포와 같이, 항체를 분비하는데 사용되는 임의의 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 생산자 세포는 골수종 세포 주이고, 가장 바람직하게는, 이것은 NSO 세포 주이다.

결과적으로, 항체는 임의의 자연 발생적, 또는 설계된 항체, 또는 더욱 최근에 공지된, 낙타 및 라마의 단일 중사슬 항체를 포함하는, 키메라, 또는 1가 또는 2특이적 항체와 같은 항체 단편일 수 있다 (Trends Biochem. Scien. (2001), 26, 230). 바람직하게는, 본 발명에 따른 이같은 항체는 항상 다양한 부류의 면역글로불린 (Ig) (IgG, IgA, IgE, IgM) 의 자연 발생적 Fc 부분에서와 비교하여 박테리아성 단백질 G 또는 단백질 A 의 고친화성 결합용 결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 IgG 의 Fc 부분을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 IgG 이거나, 적어도 IgG 의 하나 이상의 중사슬을 포함한다.

본 발명에 따른 아비딘은 통상적인 조류 아비딘 (대략, 67 kD) 또는, 예를 들어, 스트렙토마이세스 (streptomyces) 종으로부터의 스트렙트아비딘 (Streptavidin) (60 kD) 과 같은 이의 임의의 기타 관능성, 즉, 비오틴-결합 동족체 또는 이같은 자연 발생적 아미딘의 화학적 또는 유전학적으로 설계된 임의의 변형체이다. 이같이 설계된 변형체의 예는 탄수화물이 없고, 6-7 사이에 pI 를 가지고, 추가로, 세포 표면 수용체에 대하여 비-특이적 결합을 매개할 수 있는 스트렙트아비딘을 포함하는 트리펩티드 RYD 영역을 포함하지 않도록 설계된 탈글리코실화된 (deglycosylated) 아비딘인 뉴트라비딘 (Neutravidin) (Pierce, Rockford/IL) 이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 아비딘은 조류 아비딘, 탈글리코실화 조류 아비딘 또는 뉴트라비딘이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 아비딘은 뉴트라비딘이다. 이같은 뉴트라비딘은 비오틴 결합에 있어서 최대의 용량을 나타내고, 그 용량은 대략 14 ㎍ 비오틴/단백질 ㎎ 의 범위이다.

상기 아비딘은 예를 들어 가교에 의해 세포 표면에 연결될 수 있다. 옥시란, 알데히드, 숙신 이미드, 또는 N-[N-4-아지도-테트라플루오로벤조일)비오시티닐옥시]숙신이미드, SAND (술포숙신이미디닐 2-[m-아지도-o-니트로벤즈아미도]-에틸-1,3-디티오프로피오네이트) 와 같은 광-반응성 화합물과 같은 반응성 기를 포함하는, 업계에 잘 공지되어 있는 통상적인 2관능성 가교 시약을 사용할 수 있다. 가교는 지질의 반응성 기 (예를 들어, 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 의 히드록시관능), 또는 더욱 적당하게는, 막 단백질 표면 상에 나타난 반응성 기로 일어난다는 것은 말할 필요도 없다.

바람직한 구현예에서, 아비딘은 비오틴 표식을 수반하는 1관능성 가교 시약을 이용하여, 세포 표면에 비오틴 부분을 공유적으로 연결시킨 후, 세포 표면 상에 비-공유적으로 부착된다. 아비딘은 세포 표면 상의 비오틴 부분을 인식하고 결합한다. 가장 바람직하게는, 이같은 비오티닐화는 10℃ 미만, 가장 바람직하게는 약 4℃ 이하의 온도에서 수행된다. 이 온도에서, 비오티닐화의 효능은 경시적으로 증가한다. 편의상, 세포 표면의 비오티닐화에 있어서의 반응 시간은 30-60 분의 범위이다.

세포 표면 상의 비오틴 표식을 이용하여, 아비딘을 세포 표면에 포획시키는 경우, 50 ㎍/㎖ 이상의 아비딘, 더욱 바람직하게는 100 ㎍/㎖ 이상의 아비딘을 포함하는 용액에서 세포를 배양시키는 것이 더욱 바람직하다 ('아비딘' 이라는 용어는 본 발명에 따른 아비딘을 가리킴). 아비딘 분자는 보통 약 4 개의 비오틴용 결합 부위를 가진다. 비오틴 표식을 세포 표면 코팅에 사용하고, 세포 표면 상에 공유적으로 연결된 과량의 비오틴 표식 내에서 연속적으로 아비딘을 배양시키는 경우, 하나의 비오틴 표식은, 추가로 약 3 개의, 비오틴 표식에 대한 결합 부위가 개방되어 있는 하나의 아비딘 분자에 결합할 것이다.

세포 표면에 공유적으로 연결되고, 아비딘을 세포 표면에 비-공유적으로 부착시키는 기능을 하는 비오틴 부분을, 스페이서 (spacer) 부분, 예를 들어, 10 Å 이상, 더욱 바람직하게는 20 Å 이상, 가장 바람직하게는 30 Å 이상 늘어나는 선형 알킬 사슬을 이용하여 세포 표면에 연결시키는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 다음 단계에서, 하나 이상의 항체 결합 영역을 포함하는 비오티닐화 폴리펩티드는 아비딘 표식 세포와 배양시키고, 이제 세포 표면에 연결되어 있는 아비딘에 결합된다. 본 발명에 따른 항체 결합 영역은 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 항원-결합 또는 상보성 결정 부분으로부터 유도되지 않는다. 이는 비-면역글로불린-유도 항체 결합 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어 단백질 A (Surolia, A. 등, 1982, Protein A: Nature's universal, antibody, TIBS 7, 74-76; Langone, J., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Adv. in Immunology, 32: p. 156-241), 단백질 G 또는 단백질 L 일 수 있다. 단백질 L 은 Peptostreptococcus 종으로부터의 것이고, 항체의 항원-결합 부위로 방해되지 않으면서 kappa 경사슬 상호작용을 통한 특이한 결합능을 가지므로 (Kastern, W. 등, 1992, Structure of protein L and identification of a repeated immunoglobulin light-chain binding domain, J. Biol. chem. 267, 12820-12825), 단일 사슬 가변 단편 (ScFv) 및 Fab 단편에 대해서만큼 모든 부류의 Ig 에도 결합한다.

본 발명에 따르면, 이같은 항체-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드를 사용하면 본 발명에 따른 분비 분석에서 감도가 강화되어 저 또는 비-생산자로부터 고 생산자 세포 클론이 충분히 구별된다. 본 발명에 따른 분비 분석은 또한 용이하고 빠른 세포 주 안정성 평가를 가능하게 한다. 세포 주 발생 공정 동안의 세포 주 안정성 평가는 전형적으로 적어도 200-300 클론의 분석용 클로닝을 요하고, 이는 6 내지 7 주 걸릴 수 있다. 유세포 분석과 관련하여, 본 출원의 주제인 분석은 수천개의 세포 중 저 또는 비-생산성 하위-모집단을 분해하고 정량하기에 충분히 민감하여, 단지 5 시간 만에 세포 주 안정성에 대한 정보를 제공한다.

바람직하게는, 항체 결합 영역은 단백질 A 또는 단백질 G 로부터의 것이다. Staphylococcus 종의 단백질 A 및 Streptococcus 종의 단백질 G 는 구체적으로 항체의 Fc 부분에 결합하는, 잘 공지되어 있는 단백질 성분이다 (Boyle, M., Bacterial Immunoglobulin-Binding proteins, Academic Press, San Diego 1990). 이들은 거의 임의의 동물 종 또는 하위부류의 IgG 의 친화성 정제용 생물공학에서 폭넓게 응용된다. Staphylococcal 단백질 A 는, Deisenhofer 등 (1981, Biochemistry 20; 2361-2370) 및 Sauer-Eriksson 등 (1995, Structure 3, 265-278) 에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 인간 IgG-Fc 잔기 252-254, 433-435 및 311 에서의 경우를 포함하여, streptococcal 단백질 G 와 마찬가지로 IgG 의 Fc 단편 상의 유사 부위에 결합한다.

또한, WO 00/7428 에는 IgG 의 Fab 단편에 결합하지만, 실질적으로는 IgG 의 Fc 단편에 결합하지 않는 박테리아성 단백질 G 의 B1 영역 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체가 기술되어 있다. 이 B1 영역을 사용하는 것은 본 발명의 또다른 바람직한 구현예이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 항체 영역을 단리된 영역으로 또는 기타 폴리펩티드 부분과의 융합 단백질로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, G, L, 또는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 인공적으로 설계된, 이의 여전히 관능성인 변형체의 수 개의 항체 결합 영역을 융합시키는 것이 또한 가능하다. 각 각 결실을 수반하거나 절단된, 예를 들어, 단백질 A, G, L 등의 변형체를 사용하는 것 또한 가능하다.

바람직하게는, 폴리펩티드는 글리코실화 부위를 포함하지 않거나, 단지 1-2 개의 글리코실화 부위를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 임의의 탄수화물이 없다.

바람직하게는, 4 개 이상의 항체 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 분자량이 약 42 kD 인 완전 (intact) 단백질 A 를 본 발명에 사용한다. 이같은 완전 단백질 A 는 IgG 의 Fc 부분에 대하여 4-5 개의 고 친화성 결합 부위를 가진다. 비오틴 부분에 대한 아비딘의 다가성과 관련하여, 이는 결합되어 있는 분비된 항체의 양을 상당히 증폭시키므로 신호를 증폭시킨다.

폴리펩티드의 비오티닐화는 세포 표면의 비오티닐화에 대하여 상기 기술한 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 비오틴 부분을 티라민에 공액시키는 것 또한 통상적으로 가능하고, 폴리펩티드에 대한 이것의 공유 연결은 과산화수소의 존재 하에 과산화수소효소에 의해 발생된, 산소가 없는 라디칼에 의해 촉진된다.

폴리펩티드가 단백질 A 또는 단백질 G 의 하나 이상의 항체 결합 영역을 수반하는 폴리펩티드-아비딘 공액물을 직접 사용하는 것은 또한 가능하고, 이는 본 발명의 추가의 목적이다. 폴리펩티드 및 단백질 부분 각각의 가교는 생화학 분야에 잘 공지되어 있고, 다수의 시약으로 달성할 수 있다 (Fasold 등, bifunctional reagents for the crosslinking of proteins, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1971), 10: 795-801). 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테 르를 사용하는, 아미노산 리신의 아미노기로의 커플링은 업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 구현예 및 정의 또한 이 목적에 적합하다.

바람직하게는, 스페이서 암 (arm) 은 길이가 15 Å 이상, 더욱 바람직하게는 22 Å 이상, 가장 바람직하게는 30 Å 이상인 스페이서 부분을 사용하여, 비오틴 부분을 폴리펩티드에 연결시킨다. 적합한 스페이서 암은 예를 들어, 선형 알킬 부분일 수 있다. 이같이 확장된 스페이서 암은 수 개의 비오티닐화 분자를 하나의 아비딘 착물에 결합시키는 경우, 입체 장애를 감소시킨다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 항체 결합 영역이, 폴리펩티드 또는 단백질에 공유적으로 연결된 3 개 이상의 비오틴 부분, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질 당 각각 6 개 이상의 비오틴 부분, 가장 바람직하게는 6-10 개의 비오틴 분자를 수반하는 것이 또한 바람직하다. 폴리펩티드의 비오티닐화의 정도는 폴리펩티드 내의 반응성 기 (예를 들어, 리신의 아미노기, 시스테인의 술히드릴기) 의 수 및 비오티닐화시 폴리펩티드에 대한 비오티닐화 시약의 비율에 의해 쉽게 좌우된다.

본 발명에 따른 제 2 의 검출 항체는, 구체적으로, 세포 클론에 의한 이의 발현이 본 발명의 방법에 의해 검사되는, 분비된 제 1 항체에 결합하는 임의의 통상적인, 형광 표지된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 본 발명의 범주 내에서, '검출 항체' 는 또한, 예를 들어, Elisa 기술과 같은 연관된 기술에 통상적으로 사용되는, 제 1 및 제 2 검출 항체의 임의의 적합한 조합을 포함하는 것으로 해석될 수 있고, 단지 후자만 형광 표지된다. 동등하게, 제 1 의 분비된 항체에 의해 인식되는 형광 표지된 항원을 검출에 사용할 수 있다. 편의상, 본 발명의 단계 b 및 단계 c 사이에, 세포 배양액 배지에서 단기간 동안 삽입 배양시켜 세포 표면 상에 인공적으로 생성된 항체 결합 부위를 분비된 항체로 포화시킨다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 비오티닐화 폴리펩티드와 세포를 배양시키는 동안 또는 배양 직후, 증점제 (viscosity increasing agent) 를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킨다. 이 방법은 인공적으로 배지의 점도를 증가시킴으로써 세포 사이의 교차-배양을 방지한다. 이같은 작용제는, 예를 들어, 메틸 셀룰로스, PEG, 전분, 말 (algae), 박테리아 또는 식물로부터의 다당류, 또는 젤라틴일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 10% (w/w) 이상의 농도의 젤라틴을 사용한다.

추가로, 특히 바람직한 추가의 구현예에서, 비오티닐화 폴리펩티드와 세포를 배양시키는 동안 또는 배양 직후, 및 본 발명의 방법에 따라 형광 표지된 항체 또는 항원으로 세포를 염색시키기 전에, 비-비오티닐화 단백질 A, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 또다른 비-포획 길항 항체 결합 영역을, 0.5 ㎍/㎖ 이상의 농도, 더욱 바람직하게는 4 ㎍/㎖ 이상의 농도, 가장 바람직하게는 8 ㎍/㎖ 이상의 농도로 포함하는 배지에서 세포를 배양시킨다. 편의상, 이같은 비-포획 길항 단백질 A 등을 상기 기술한 바와 같은 증점제와 조합하여 사용하여, 세포 사이의 가교-배양을 방지한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 형광 표지된 항체 또는 항원으로 세포를 염색하기 전 및 분비된 항체를 세포 표면 상에 고정된 비오티닐화 폴리펩티드에 결합시킨 후, 제 3 의 차단 항체를 세포에, 예를 들어, 0.5 이상 내지 5 ㎎/㎖ 의 농도로 첨가한다. 이같은 제 3 의 차단 항체는 비오티닐화 폴리펩티드의 잔류 항체 결합 부위에 결합할 수 있지만, 검출에 사용되는 제 2 의 형광 표지된 항원 또는 항체에 의해 각각 인식되고 결합되지는 않는다. 이 방법은 추가로 클론 사이의 후기 교차-배양을 제거하는데 기여하므로, 본 발명의 분석의 감도 및 분석에 의한 구별을 개선시킨다. 이같은 방법을 기타 제안된 방법, 예를 들어, 증점제 및/또는 길항 비-비오티닐화 단백질 A 등과 임의의 방식으로 조합하여, 분석의 구별 및 따라서 감도를 공동으로 강화시킬 수 있다는 것은 말할 필요도 없다.

모든 실험에서, 표준 염색된-세포 계수 기술에 의해 분석한 바와 같이 생존력이 95% 를 초과하는, 배치식 배양액의 기하급수적 성장 상으로부터 세포를 취하였다.

1. 비교 실험

NSO 골수종 세포 주로부터 유도된 세포 주 6A1(100)3 (Lonza Biologics 로부터 수득) 를 사용하였다. 이는 유방 종양 항원 TAG73 에 특이적인 인간 키메라 IgG 항체 cB72.3 을 분비하는 GS-트랜스펙션된 세포 주 (Bebbington, C. 등, 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase (GS) gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175) 였다. 간행물 Holmes 등 (동일한 인용문) 에 기술되어 있는 바와 같이 정확하게 세포를 처리하였다. 결과는 실망스러웠고, 재현성이 없으며, 분비 세포들 및 비처리 음성 대조군 세포 주 (NSO 세포 주 ECACC No. 85110503) 사이의 형광에서의 상당한 차이가 관찰되지 않았다. 비-생성 GS 트랜스펙션된 골수종 세포 주 및 세포에 외부에서 첨가한 인간 IgG 로 실험을 반복하였고, 다시, 평균 형광에서는 뚜렷한 차이가 없었다.

2. 분비 분석

2.1 분비된 항체의 포획

분비된 항체의 포획 및 검출의 원리를 도 1 에 도식적으로 묘사하였다. 키메라 항체 cB72.3 을 분비하는 세포 주 6A1(100)3 을 다시 실험 모델로서 선택하였다. 분비 매트릭스를 하기와 같이 해석하였다. 10⁷ 6A1(100)3 세포를 25 ㎖ 의 pH 8 PBS 로 세척하고, 생리학적 표준 PBS (pH 8) 중 1㎖ 의 1 ㎎/㎖ NHS-LC-비오틴 (카탈로그 번호 21336, 숙신이미딜-6-(비오틴아미도) 헥사노에이트; Pierce, Rockford, IL/U.S.A.) 에 재현탁시켰다. 4℃ 에서 40 분 동안 배양한 후, 세포를 PBS (pH 7) 로 2 회 세척하고, 1 ㎖ PBS (pH 7) 에 재현탁시켰다. 128 ㎕ 의 1 ㎎/㎖ neutravidin^TM (Pierce, UK) 용액을 첨가하고, 세포를 실온에서 15 분 동안 배양한 후, 추가로 50 ㎖ 의 PBS (pH 7) 로 세척하였다. 1 ㎖ 의 pH 7 PBS 에 재현탁시킨 후, 비-비오티닐화 단백질 A 를 1 ㎍/㎖ 의 최종 농도로 첨가하였다: 혼합물을 실온에서 5 분 동안 배양하였다. 다음으로, 52 ㎕ 의 1 ㎎/㎖ 비오티닐화 단백질 A (Pierce, Rockford, IL/U.S.A.; 단백질 당 6-10 개의 비오틴 표식을 수반함) 용액을 첨가하고, 추가로 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 배양시킨 비오티닐화 단백질 A 의 농도는 아직 포화되지는 않았다. 독립적인 실험에 의해, 120 ㎍/㎖ 농도의 비오티닐화 단백질 A 에서도, 결합은 포화에 접근하지 않았다는 것이 확인되었다 (데이타는 나타내지 않았음).

이어서, 양성 대조군으로서 사용하는 샘플을 적당한 부피의 정제 cB72.3 IgG 와 투약하여 6.6 ㎍/㎖ 의 농도를 제공하였다.

음성 대조군으로서 사용하는 샘플은 비오틴/아비딘/포획 단백질 A 친화성 매트릭스가 없는 세포로 이루어졌다. 이들 샘플은 분비 배지에서의 배양으로 출발하는 모든 기타 샘플로서 설계하였다.

완전 분비 분석에 사용하는 모든 샘플을 하기의 절차에 노출시켰다: 세포를 10 ㎖ 의 분비 배지 (10% 젤라틴이 풍부한 NSO 6A1(100)-3 세포 주의 배양액에 있어서, Holmes, P. 등, Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors, J. of Immunological methods, 230(1999), 141-147 에 기술된 바와 같은 세포 배양액 배지) 에 재현탁시켰다. 이 배지는 또한 8 ㎍/㎖ 의 비-비오티닐화 단백질 A (Sigma, UK) 를 포함하여 생산자 세포로부터 확산되는 항체를 포획하여, 이것이 비-생산자 세포에 결합하는 것을 방지한다. 4℃ 에서 15 분 동안 분비 배지 내에서 세포를 배양하였다.

2.2 형광 표지

1/500 로 최종 희석시킨 마우스 항-인간 kappa 경사슬 FITC 공액물 (Sigma, UK) 을 사용하여, 결합되어 있는 분비된 항체를 검출하였다. 2.1 하에 기술된 바와 같이 처리한 세포를 25 ㎖ PBS (pH 7) 로 1 회 세척하고, 320 ㎕ 의 1 ㎎/㎖ 쥐 IgG 차단 항체 (Sigma, UK) 를 첨가하고, 세포 펠렛과 혼합하고 5 분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 25 ㎖ 의 PBS (pH 7) 로 수 초의 시간 동안 세척하고, 1 ㎖ 의 PBS 에 재현탁시켰다. 5 ㎕ 의 마우스 항-인간 Kappa 경사슬 FITC 검출 항체 (Sigma, UK) 를 첨가하고, 세포를 15 분 동안 배양하였다. 25 ㎖ PBS 로 추가로 세척한 후, 유세포 분석에 의해 분석하기 위하여 세포를 1 ㎖ PBS 에 재현탁시켰다.

2.3 유세포 분석

이전 단락에서 기술한 바와 같이 염색시킨 후, 각각 488 ㎚ 및 515 ㎚ 의 여기 (excitation) 및 검출 파장으로, Coulter Epics Elite flow 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하였다. 갇힌 (gated) 가변 모집단을 확인하기 위하여 측면 비산 (scatter) 대 전면 비산 대수를 사용하였고, 이 모집단에 대하여 형광의 수준 (따라서, 결합된 항체의 양) 을 측정하였다. (A) 음성 대조군 (즉, 친화성 매트릭스 없음), (B) 친화성 매트릭스에 의해 포획되어 있는 분비된 항체가 있는 세포 및 (C) 친화성 매트릭스에 의해 포획된, 외부적으로 첨가된 정제 IgG 로 배양된 양성 대조군 세포에 대한 분포를 세포 수 대 형광 강도로서 도 2 에 모두 나타내었다. 분비 세포 B 는 음성 대조군 A 에 비하여 평균 형광이 50 배 증가한 19.3 의 평균 형광을 나타내었다. 양성 대조군 C 는 평균 59.5 를 나타내었고, 따라서, 음성 대조군에 대하여 125 배 증가하였다. 도 2 에 따른 평균 형광의 수치를 표 1 에 제공하였다.

샘플	평균 형광 [임의 단위]
A: 음성 대조군	0.4
B: 분비 세포	19.3
C: 양성 대조군 (+ 외인성 IgG)	59.5

3.비교예

세포 표면에서 분비된 항체의 비오티닐화 포획 항체 결합의 효능을 비오티닐화 단백질 A 의 것과 비교하였다. 비교 실험에서, 모든 샘플에 대하여, 배양을 위하여 분비 배지 대신에 임의의 증점제가 없는 PBS 를 사용하는 것을 제외하고, 단락 2 에 기술된 바와 같이 정확하게 분비 분석을 수행하였다. 이전의 단락에 기술된 바와 같은 표준 음성 대조군 (A), 양성 대조군 (C) 및 cB72.3 분비 세포 (D) 와는 별개로, 비오티닐화 단백질 A 를, 세포 표면에 고정되어 있는 비오티닐화 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 포획 항체 (Sigma, UK) 로, 50 ㎍/㎖ 로 15 분 동안 배양시킴으로써 치환시켜 하나의 추가의 샘플 (B) 을 제조하였고, 이 농도는 포화에 가까웠으며 이전의 실험에 사용한 단백질 A 의 양과 견줄만 하였다. 샘플 (B) 를 연속적으로 외인성으로 첨가한 인간 IgG 와 배양시키고, 상기 양성 대조군에 대하여 기술한 바와 같이 추가로 설계하였다. 모든 샘플에 대한 분포를 도 3 에, 도 2 에 사용한 바와 같이 유세포 분석 형광 분석 후 세포 수 대 형광 강도로서 나타내었다 (도 3: A: 음성 대조군, B: 포획 항체, C: 양성 대조군, 단백질 A, D: 분비된 cB72.3, 단백질 A). 도 3 에 제공된 분포에 따른 평균 형광의 수치를 표 2 에 나열하였다. 인간 IgG 모델 생성물이 있는 포획 항체 (샘플 B) 를 사용하면, 음성 대조군 세포에 비하여, 평균 형광이 5 배 증가하였다. 그러 나, 단백질 A 를 사용한 경우 (샘플 C), 평균 형광은 80 배 증가하였고, 따라서, 단백질 A 가 포획 항체보다 더욱 효과적이라는 것이 입증되었다. 상기 기술을 사용하여, 분비된 cB72.3 을 포획하고 검출하는 경우, 단백질 A 는 또한 고도로 효과적이었고, 음성 대조군에 비하여 평균 형광이 대략 55 배 증가하였다.

Holmes 등 (동일한 인용문) 에 기술된 바와 같이 정확하게 제조된 샘플은 음성 대조군에 비하여 어떠한 증가도 나타내지 않았다 (데이타는 나타내지 않았음).

샘플	평균 형광 [임의 단위]
A: 음성 대조군	0.6
B: 포획 항체 + 외인성 IgG	2.8
C: 포획 단백질 A + 외인성 IgG	46.3
D: 포획 단백질 A + 분비된 cB72.3	32.9

실험 B 대 C, D 의 데이터를 비교하면, 포획 항체를 단백질 A 로 치환하면 검출 감도 및 결합 용량 각각이 급격하게 개선된다는 것이 명백하였다. 이론적으로, 단백질 A 는 포획 항체에 비하여 2 개의 결합 부위를 과량 (총: 4) 으로 가지므로, 결합되어 있는 분비된 항체의 양을 2 배로 할 수 있다 (이론적인 2 배 강도 강화). 이 예상은 이론적 최대치를 구성하며, 이는 고 친화성 결합 항체가 단백질 A 의 결합 친화성을 약 한 단위 초과할 수 있기 때문이다. 반대로, 놀랍게도, 알 수 없는 이유로, 크게는 약 15-20 배인 단백질 A 대 포획 항체에 의해 실제로 관찰되는 강도 강화는 이론적으로 예상하는 값을 초과하였다.

도 1 b 는 외인성으로 첨가된 IgG 의 포획 항체 결합 Fc 부분 대 이같은 외인성 IgG 에 결합하는 단백질 A 에 대한 결합 용량의 비교를 나타내었다. 배양에 사용한 포획 항체 및 단백질 A 의 양 모두를 각각 2 배로 하여 확실히 포화 결 합시키는 것을 제외하고, 이 단락의 현재 부분에 기술한 바와 같이 샘플을 본질적으로 제조하였다. 한정된 부피의 세포 펠렛에 정제된 IgG 를 첨가하여, 배양 동안 외인성 IgG 의 정확한 소정의 농도를 확보하였다.

Claims

하기의 단계를 포함하는, 제 1 항체를 분비하는 세포의 분리 방법:

a) 세포의 세포 표면에 아비딘 (avidin) 을 연결시키는 단계

b) 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 또는 이들의 관능성 변형체의 하나 이상의 관능성 항체 결합 영역을 포함하는 비오티닐화 (biotinylated) 폴리펩티드와 세포를 배양시키는 단계

c) 형광으로 표지되고, 제 1 항체 상의 에피토프 (epitope) 를 인식하고 결합하는 제 2 항체와 세포를 배양시키는 단계

d) 제 2 항체에 결합한, 형광 표지된 세포를 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 비오티닐화 폴리펩티드가 단백질 G 또는 단백질 A 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포 표면의 공유 비오티닐화를 수행한 후, 아비딘을 세포 표면에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 비오티닐화 폴리펩티드와의 배양 도중 또는 직후에, 증점 제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시키는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계에서 형광 분석 유세포 분석 (fluorescent analysis flow cytometry) 을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 비오티닐화가 4℃ 내지 10℃ 의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 항체 선별 분비 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 세포가 하이브리도마, 골수종 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 박테리아성 단백질 G 또는 A의 고친화성 결합용 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG 또는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아비딘이 뉴트라비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 비오틴 부분이 15 Å 이상의 길이를 갖는 스페이서 부분에 의해 폴리펩티드에 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 15 항에 있어서, 비오티닐화 폴리펩티드가 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 3 개 이상의 비오틴 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 비오티닐화 폴리펩티드가 6 내지 10 개의 비오틴 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.