KR100647346B1

KR100647346B1 - 약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법

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Publication number: KR100647346B1
Application number: KR1020050096248A
Authority: KR
Inventors: 김윤숙; 박용곤; 석호문; 최인욱; 조형용
Original assignee: 한국식품연구원; 재단법인 전라북도생물산업진흥원; 정읍시; 칠보농업협동조합
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2006-11-23

Abstract

본 발명은 증자된 생지황의 페이스트, 인삼분말, 백복령분말 및 꿀을 포함하고, 약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 경옥고의 제조방법은 최종 중량에 대하여, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 혼합하여 혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 혼합물을 밀봉하고, 중탕가열하며, 상온에 방치하여 냉각시킨 다음, 밀봉된 상태로 다시 중탕가열하는 공정을 포함한다. 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고는 종래의 경옥고 보다 항산화활성과 항암활성이 우수하므로, 자양강장, 허약체질개선 및 암예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

경옥고, 생지황, 증자된 생지황 페이스트

Description

약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법{Kyoung-ok-ko with Improved Pharmacological Activity and Process for Preparing the Same}

도 1a는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.

도 1b는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 ABTS 음이온 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.

도 1c는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 히드록시라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.

도 2는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 항암활성을 비교한 그래프이다.

본 발명은 약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 증자된 생지황 페이스트, 인삼분말, 백복령분말 및 꿀을 포함하고, 약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

지황(地黃)은 종래로부터 한약재로 사용되어 온 현삼과에 속하는 다년생 초본으로, 한방에서는 뿌리부분의 근엽과 잔뿌리를 제거하고 흙을 깨끗이 제거한 것을 생지황(Rehmannia Radix crudus), 생지황을 말린 것을 건지황(Rehmannia Radix), 생지황을 황주 또는 맥주와 혼합하고 구증구폭(九蒸九暴)한 것을 숙지황(Rehmannia Radix preparata)이라 분류하여, 서로 다른 증상에 사용하고 있다.

지황의 약리성분으로는 β-시토스테롤(β-sitosterol), 스티그마스테롤(stigmasterol) 등의 피토스테롤류; 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose) 등의 당류; 리신, 히스티딘, 티로신 등의 아미노산류; 카탈폴(catalpol), 디히드로카탈폴(dihydrocatalpol), 멜리토시드(mellitoside), 아큐빈(acubin), 레오누리드(leonuride), 레만니오시드(rehmanniosides) 등의 이리도이드 글리코시드(iridoid glycoside)류; 만니톨(mannitol), 키세오리올(chyseoriol) 등의 당알콜류; 및, 기타 무기염류 등이 보고되어 있다.

지금까지 연구에 의하면, 생지황의 열수추출물은 혈당강하, 강심, 혈압상승작용 등을 나타내고, 당뇨가 유발된 쥐의 혈당치를 저하시키며, 제초제에 대해 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있다(참조: Lee, Youn Su and W. J. Manning, Phytopathology, 81(10):1216-1221, 1991). 또한, 생지황의 성분 중에서 레만니오시드 D(rehmanniosides D)가 당뇨가 유발된 쥐의 혈당치를 저하시킬 수 있고, 만니톨은 방사능에 대한 세포보호효과를 나타내며, 만니톨의 유도체(1,6-bis-(2- chloro-diethyl)-desoxy-D-mannitol)는 항종양 작용을 나타낸다고 보고되었다(참조: Oshio Haraju et al., Phytopathology, 80(1):121-125. 1990). 아울러, 지황의 열수추출물이 혈중 염증의 발생에 관여하는 사이토카인의 함량을 저하시키고, 자궁내막염 유발원인균에 대하여 항균활성을 나타낸다고 보고되었다(참조: Hiroshige et al., Proceedings of Invited Lectures on Recent Research Trend of Plant Pathology-Abstract, pp 33-34. 1998)

이러한 약리효과를 갖는 지황은 보혈 강장의 효과를 가져 빈혈, 허약, 당뇨병, 자궁출혈, 토혈 등의 치료를 목적으로 하는 경옥고, 자감초탕, 도적산 등의 여러 가지 한방처방약이나 생약 배합제제에 많이 이용되고 있으며, 그중 대표적인 것이 경옥고이다.

경옥고는 생지황 압착액, 인삼분말, 백복령분말 및 꿀을 혼합하고, 이를 2회에 거쳐 증자하여 제조되는, 반고형 상태의 한약으로서, 동의보감에는 경옥고의 효능에 대하여 「진정(鎭靜), 보수(補髓), 조진(調眞), 양생(養生), 반노(返老), 환동(還童)하며, 백손(百損)을 보(補)하고 백병(百病)을 제거하며 만신(萬神)이 모두 족하며, 오장을 영일(盈溢)하며 백발이 검어지고, 낙치(落齒)가 다시 나며 분마(奔馬)처럼 달린다」라고 기재되어 있고, 방약합편에는 「정(精)을 채우고 수(髓)를 보하여, 모발을 검게 하고 치아를 나게 하고 만신(萬神)이 구족(俱足)하여 백병(百病)을 제거한다」라고 기록되어 있으며, 민간에서도 이를 자양강장 및 허약체질개선 보약으로 널리 사용해왔다.

최근에 천연물을 이용한 건강보조식품에 대한 관심이 증폭되면서, 기능성이 강화된 경옥고 또는 종래의 경옥고를 이용한 건강식품을 개발하려는 노력이 꾸준히 진행되어 왔다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제 28639호에는 반고형 죽상태의 종래 경옥고에 물을 넣고 가열하여, 경옥고 용액을 수득한 다음, 이에 한천, 설탕, 팟앙금, 올리고당 등을 가하고, 가열하여 제조된 양갱형 또는 젤리형 경옥고 및 그의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 354962호에는 경옥고에 물을 혼합하여 가열 후 압착 여과시켜 경옥고 용액을 추출한 경옥고 용액을 동결시켜 진공동결건조기로 건조하고, 동결건조된 경옥고 분말에 포도당, 인삼향 및 젖산을 포함하는 경옥고 즉석차 및 그 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제 1994-6595호에는 인삼농축엑기스, 숙지황추출물, 백복령추출 및 벌꿀을 포함하며 여기에 물을 가하고 균질화시키고 멸균시켜서 제조된 경옥고 액제 및 그의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제 2001-79241호에는 생지황, 인삼, 백복령 이외의 대추, 맥문동, 녹용, 구기자 등을 포함하는 기능성이 향상된 경옥고 및 그의 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 제조된 경옥고 또는 경옥고를 이용한 건강식품은 경옥고의 근본적인 기능성을 증진시킨 것이 아니라, 경옥고의 기호성을 증진시키거나 또는 경옥고에 공지된 건강보조성분을 단순히 혼합한 형태에 불과하여, 전통적인 경옥고의 본래의 약리활성을 증진시키지 못할 뿐만 아니라, 오히려 경옥고 본래의 약효가 감소되는 효과를 초래할 수도 있다는 우려가 제기되어 왔다.

만일, 경옥고의 본래의 약리활성을 증진시킬 수 있다면, 새로운 형태의 건강보조식품으로서 활용될 수 있을 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과 가 보고되지 않고 있는 실정이다.

따라서, 약리활성이 증진된 경옥고를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 약리활성이 증진된 경옥고를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고를 제조할 경우, 경옥고에 함유된 약리성분의 함량이 증가할 뿐만 아니라, 경옥고의 약리활성이 증대됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 약리활성이 증진된 경옥고의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조되어, 약리활성이 증진된 경옥고를 제공하는 것이다.

본 발명의 경옥고의 제조방법은 최종 중량에 대하여, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 혼합하여 혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 혼합물을 용기에 담아 밀봉하고, 90 내지 110℃에서 60 내지 80시간 동안 중탕 가열하며, 상온에 방치하여 냉각시킨 다음, 밀봉된 상태로 다시 90 내지 110℃에서 12 내지 36시간 동안 중탕 가열하고, 상온에서 냉각시키는 공정을 포함한다. 이때, 증자된 생지황 페이스트의 제조방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 생지황을 90 내지 110℃, 5 내지 15기압의 조건에서 10 내지 30분간 증자하고, 이를 마쇄하는 방법을 사용함이 바람직하며, 마쇄방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 제트 밀, 콜로이드 밀 등을 사용하여 마쇄함이 바람직하다. 아울러, 기호성을 증진시키기 위하여, 전기 경옥고의 제조시 감초분말을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명자들은 약리활성이 증진된 경옥고를 개발하기 위하여, 경옥고의 주성분인 인삼, 백복령 및 생지황을 다양한 방법으로 가공한 결과, 생지황의 가공방법에 따라, 경옥고의 항산화 활성이 변화됨을 확인하였다. 즉, 종래의 경옥고의 제조시에는 생지황의 압착액을 사용하였으나, 생지황의 압착액, 생지황의 페이스트 및 증자된 생지황의 페이스트를 사용하여 각각의 경옥고를 생산하고, 각 경옥고에 함유된 약리성분인 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량과 생지황에서 유래된 카탈폴(catalpol)의 함량을 측정한 결과, 증자된 생지황의 페이스트를 포함하는 경옥고에 함유된 약리성분의 함량이 가장 높음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 상기 제조된 각 경옥고의 항산화활성 및 항암활성을 비교한 결과, 증자된 생지황의 페이스트를 포함하는 경옥고가 가장 높은 항산화활성과 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.

한편, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 포함하는 경옥고는 가장 우수한 약리활성 및 관능특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

경옥고의 투여방법

본 발명의 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고는, 종래의 경옥고와 동일한 경구투여 방법으로 투여될 수 있으며, 환자의 상태에 따라, 물에 현탁시켜서 경구투여할 수도 있다.

경옥고의 유효량

본 발명의 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 0.5 내지 1.0g을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

경옥고의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견(beagle)을 대상으로 본 발명의 경옥고를 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 10g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않았는 바, 본 발명의 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고는 kg당 20g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고는 종래의 경옥고 보다 항산화활성과 항암활성이 우수하므로, 자양강장, 허약체질개선 및 암예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 제조

실시예 1-1: 다양한 방법으로 가공된 생지황 가공물의 수득

선별 및 수세된 생지황을 다음과 같이 가공하였다. 즉, 쵸퍼(chopper, Hobart, USA)를 이용하여 생지황 480g을 마쇄하고, 이를 유압프레스에 적용하여 수득한 생지황 압착액(실험군 1). 쵸퍼를 이용하여 생지황 480g을 마쇄하고, 이를 콜로이드 밀(colloid mill, Masscolloider, Masuko, Japan)에 적용하여 수득한 생지황 페이스트(실험군 2) 및 생지황 480g을 100℃, 10기압에서 20분동안 증자하고, 쵸퍼를 이용하여 증자된 생지황을 마쇄한 다음, 이를 콜로이드 밀에 적용하여 수득한 증자된 생지황 페이스트(실험군 3)를 각각 수득하였다.

실시예 1-2: 생지황 가공물을 이용한 경옥고의 제조

전기 실시예 1-1에서 수득한 각각의 생지황 가공물(실험군 1 내지 3), 인삼분말 45g, 백복령분말 90g 및 꿀 300g을 혼합하고, 50rpm으로 5분간 혼합한 다음, 500rpm으로 다시 5분간 혼합하였으며, 이를 가열용 도기에 넣고, 수분의 증발을 방지하기 위해 기름종이로 입구를 잘 막은 후, 다시 면포로 밀봉하였으며, 98℃에서 72시간동안 중탕가열하였다. 이어, 24시간동안 상온에서 방치하여 냉각한 다음, 다시 동일한 조건으로 중탕가열하여, 각각의 경옥고(실험군 11 내지 13)를 제조하였다.

실시예 2: 경옥고에 함유된 약리성분의 함량

전기 실시예 1-2에서 제조한 각각의 경옥고에 함유된 약리성분인 총 폴리페놀 화합물, 플라보노이드 및 생지황에서 유래된 카탈폴의 함량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다(참조: 표 1)

먼저, 폴리페놀 화합물의 함량은 폴린시약을 이용하여 측정하였다: 즉, 전기 실험군 11 내지 13의 각 경옥고 1g을 물 10㎖에 희석한 희석액 0.125㎖와 증류수 0.5㎖을 혼합하고, 폴린시약(Folin-Ciocalteu reagent, Sigma Chem. Co., USA) 0.125㎖을 가하여 6분간 반응시킨 후, 1.25㎖의 7%(w/v) 탄산나트륨 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어, 3㎖의 증류수를 가하여 희석시키고, 90분간 발색시킨 다음, 760nm에서 흡광도를 측정하고, 표준 정량곡선을 이용하여, 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하였다(단위: mg/시료100g).

다음으로, 플라보노이드의 함량은 질산나트륨법을 이용하여 측정하였다: 즉, 전기 실험군 11 내지 13의 각 경옥고 1g을 물 10㎖에 희석한 희석액 0.125㎖와 1.25㎖의 증류수를 혼합하고, 다시 5%(w/v)의 질산나트륨 용액 0.075㎖을 첨가한 후, 5분간 정치하였다. 이어, 0.15㎖의 10%(w/v) 염화알루미늄 용액을 가하여 6분간 반응시키고, 1N NaOH 0.5㎖과 증류수 0.275㎖을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 510nm에서 흡광도를 측정하고, 표준 정량곡선을 이용하여, 플라보노이드의 함량을 측정하였다(단위: mg/시료100g).

끝으로, 카탈폴의 함량은 HPLC를 이용하여 측정하였다: 즉, 전기 실험군 11 내지 13의 각 경옥고 6g에 물 150㎖을 가하고, 초음파 마쇄기(sonicator, ultrasonic cleaner, Brensonic, USA)를 이용하여 60분 동안 10분 간격으로 초음파 를 처리한 다음, 여과 및 미세여과를 순차적으로 수행하여, HPLC분석용 검액을 수득하였다. 이어, 전기 검액 20㎕를 HPLC 시스템(고정상: μBondapak C18 column (10㎛, 3.9×300 ㎜, 125Å), 이동상: 1.5%(v/v) acetonitrile, 용매속도: 1.0㎖/min, 검출기: UV-detector)에 적용하고, 파장 210nm에서 검출하고, 표준 정량곡선을 이용하여, 플라보노이드의 함량을 측정하였다(단위: mg/시료100g).

다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고에 함유된 약리성분의 함량(단위: mg/시료100g)

실험군	총 폴리페놀 화합물 함량	플라보노이드 함량	카탈폴 함량
실험군 11	106.90 ± 4.94	47.81 ± 0.52	0.783
실험군 12	139.12 ± 3.25	79.41 ± 0.76	0.926
실험군 13	177.40 ± 2.60	109.07 ± 1.24	1.025

상기 표 1에서 보듯이, 전체적으로 생지황 압착액을 포함하는 경옥고(실험군 11) 보다는 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12)가 약리성분을 높은 함량으로 함유하고, 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12) 보다는 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)가 약리성분을 높은 함량으로 함유함을 알 수 있었다. 따라서, 경옥고의 제조시, 약리성분의 함량의 측면에서는 증자된 생지황 페이스트를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 3: 경옥고의 약리활성의 비교

전기 실시예 1-2에서 제조한 각 경옥고의 약리활성을 항산화 활성 및 항암활성의 측면에서 비교하였다. 특히, 항상화 활성은, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 음이온 라디칼 소거능 및 히드록시라디칼 소거능의 측면에서 비교하였다.

실시예 3-1: 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 비교

실험군 11 내지 13의 경옥고를 증류수에 희석하여, 0, 5, 10, 50 및 100㎍/㎖의 농도를 갖는 시료를 준비하였다. 이어, 전기 각 시료 1.0㎖에 0.1mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 0.2㎖을 넣고 10초간 혼합하여, 20분간 반응시킨 후, 525nm에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 환산하여 DPPH 라디칼 소거능을 산출하였다(참조: 도 1a).

도 1a는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프로서, (●)은 생지황 압착액을 포함하는 경옥고(실험군 11)를 나타내고, (■)은 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12)을 나타내며, (▲)은 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)를 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)가 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 경옥고의 ABTS 음이온 라디칼 소거능 비교

먼저, 7mM ABTS(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))용액(containing of 2.45mM potassium persulfate)이 734nm에서 0.7±0.02의 흡광도를 나타내도록 5mM PBS에 희석하였다. 한편, 실험군 11 내지 13의 경옥고를 증류수에 희석하여, 0, 1, 2, 5 및 10㎎/㎖의 농도를 갖는 시료 10㎕와 전기 희석된 990㎕의 ABTS 용액을 혼합하고, 10분동안 반응시킨 다음, 734nm에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 환산하여 항산화제(VCEAC, vitamin C equivalent antioxidant capacity)의 농도를 산출하였다(참조: 도 1b), 전기 산출된 VCEAC의 농도가 높을 수록 ABTS 음이온 라디칼 소거능이 우수하다고 판단되었다.

도 1b는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 ABTS 음이온 라디칼 소거능을 비교한 그래프로서, (●)은 생지황 압착액을 포함하는 경옥고(실험군 11)를 나타내고, (■)은 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12)를 나타내며, (▲)은 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)를 나타낸다. 도 1b에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)가 가장 우수한 ABTS 음이온 라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 경옥고의 히드록시라디칼 소거능 비교

반응용액(10mM FeSO₄ _·7H₂O 및 10mM EDTA) 0.15㎖, 전기 실시예 3-2에서 준비된 각 경옥고의 시료 0.075㎖, 10mM 2-deoxyribose 용액 0.15㎖, 0.02M 인산나트륨 완충용액(pH 7.4) 0.3㎖ 및 증류수 0.525㎖을 혼합한 다음, 10㎖의 H₂O₂ 용액 0.15㎖를 가하여 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 이어, 2.8%(v/v) TCA(trichloroacetic acid) 0.75㎖과 1.0%(w/v) TBA(thiobarbituric acid)/50mM NaOH 0.75㎖을 가하고, 10분간 가열한 다음, 얼음물에서 냉각시켜 반응을 종결하였으며, 520nm에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 환산하여 히드록시라디칼 소거능을 산출하였다(참조: 도 1c).

도 1c는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 히드록시라디칼 소거능을 비교한 그래프로서, (●)은 생지황 압착액을 포함하는 경옥고(실험군 11)를 나타내고, (■)은 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12)을 나타내며, (▲)은 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)를 나타낸다. 도 1c에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)가 가장 우수한 히드록시라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 경옥고의 항암활성의 비교

먼저, 국립암센터(경기도 고양시 일산동구 마두 1동 809번지 소재)로부터 분양받은 암 세포주인 HepG2를 암세포 배양용 DMEM 배지(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin(10,000 U/㎖))에서 37℃ 및 5%(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다.

한편, 실험군 11 내지 13의 경옥고를 증류수에 희석하여, 0, 1, 5, 10, 50 및 100㎎/㎖의 농도를 갖는 시료를 준비하였다.

전기 배양된 세포를 96웰 플레이트에 2.5 × 10⁴세포/웰 로 분주하고, 4시간 동안 배양한 다음, 배약액을 전기 준비된 각 시료를 포함하는 암세포 배양용 DMEM 배지로 교환하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어, MTT용액(Sigma Chem. Co., USA)을 가하여, 2시간동안 추가로 배양하고, 배양액을 제거한 다음, 150㎕의 DMSO를 가하고 540nm에서 흡광도를 측정하여, 암 세포주의 세포수를 측정하고, 이의 변화를 확인함으로써, 암세포주의 증식정도를 비교하였다(참조: 도 2).

도 2는 다양한 방법으로 가공된 생지황을 포함하는 경옥고의 항암활성을 비교한 그래프로서, (●)은 생지황 압착액을 포함하는 경옥고(실험군 11)를 나타내고, (■)은 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 12)을 나타내며, (▲)은 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 포함하는 경옥고(실험군 13)가 가장 우수한 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: 생지황 증자페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 성분분석

전기 실시예 2 및 3에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고가 가장 높은 함량으로 약리성분을 함유하고, 가장 우수한 약리활성을 나타냄을 확인하였으므로, 이의 수분함량, 환원당함량 및 당도를 분석하였다.

실시예 4-1: 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 수분함량

수분정량 수기에 바다모래(sea sand)와 짧은 유리막대를 넣어 미리 105℃로 유지된 오븐(Lab line Instrument. Inc., USA)에 넣어 항량에 도달하면, 시료 약 2g을 수기에 담아 유리막대로 시료와 바다모래가 골고루 섞이도록 한 다음, 오븐에 넣어 항량에 도달할 때의 무게를 측정하여 수분함량을 측정하였다.

그 결과, 생지황 증자페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 수분함량은 42.70±0.25(%)임을 알 수 있었다.

실시예 4-2: 생지황 증자페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 환원당함량

경옥고 10g과 증류수 100㎖를 혼합하고, 30분간 교반하여, 경옥고의 당을 충분히 용해시킨 다음, 감압 여과하여 시료를 수득하였다. 이어, 전기 시료 1㎖와 DNS 시약 1㎖를 혼합하고, 5분간 가열하여 반응시킨 후, 상온에 10분 정도 방냉하여 발색시켰다. 그런 다음, 반응액에 증류수 5㎖를 넣어 희석하고, 분광광도계(UV-spectrophotometer, Beckman, USA)를 이용하여 500㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도를 환산하여 환원당 함량을 산출하였다. 이때, DNS 시약은 2N NaOH용액 100㎖와 디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid) 5g을 혼합하고, 가열한 다음, 150g의 로첼(Rochelle)염을 넣고 500㎖가 되도록 증류수를 첨가하여 제조하였다.

그 결과, 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 환원당함량은 33.3±1.01(%)임을 알 수 있었다.

실시예 4-3: 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 당도

경옥고 10g과 증류수 100㎖를 혼합한 경옥고 희석액을 당도계(digital reflectometer, Atago, Japan)에 적용하여 당도를 측정한 결과, 생지활 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 당도는 37°Brix임을 알 수 있었다.

실시예 5: 경옥고에 포함된 각 성분의 함량비 결정

상기 실시예 전기 실시예 2 및 3에서 보듯이, 증자된 생지황 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고가 가장 높은 함량으로 약리성분을 함유하고, 가장 우수한 약리활성을 나타냄을 확인하였으므로, 최적의 약리활성을 나타낼 수 있는 경옥고의 각 성분인 증자된 생지황 페이스트, 인삼분말, 백복령분말 및 꿀의 함량비를 결정하였다.

실시예 5-1: 증자된 생지황 페이스트의 함량비 결정

증자된 생지황 페이스트(sjp), 인삼분말(gp), 백복령분말(bp), 꿀(h) 및 감초분말(kp)을 하기의 표 2a에 개시된 함량비로 혼합하고, 50rpm으로 5분간 혼합한 다음, 500rpm으로 다시 5분간 혼합하였으며, 이를 가열용 도기에 넣고, 수분의 증발을 방지하기 위해 기름종이로 입구를 잘 막은 후, 다시 면포로 밀봉하였으며, 98℃에서 72시간동안 중탕가열하였다. 이어, 24시간동안 상온에서 방치하여 냉각한 다음, 다시 동일한 조건으로 중탕가열하여, 각각의 경옥고(실험군 21 내지 28)를 제조하였다(참조: 표 2a).

경옥고에 포함된 각 성분의 함량비(단위: %(w/w))

실험군	sjp	kp	gp	bp	h
실험군 21 실험군 22 실험군 23 실험군 24 실험군 25 실험군 26 실험군 27 실험군 28	10 20 30 40 50 60 70 80	71 61 51 41 31 21 11 1	4 4 4 4 4 4 4 4	5 5 5 5 5 5 5 5	10 10 10 10 10 10 10 10

이어, 상기 제조된 각 경옥고(실험군 21 내지 28)를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법을 사용하여, 각 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 비교하였다(참조: 표 2b).

증자된 생지황 페이스트의 함량에 따른 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 변화

실험군	DPPH 라디칼 소거능(%)
실험군 21 실험군 22 실험군 23 실험군 24 실험군 25 실험군 26 실험군 27 실험군 28	58 60 67 83 86 88 88 88

상기 표 2b에서 보듯이, 경옥고에 포함된 증자된 생지황 페이스트의 함량이 증가할 수록 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능도 증가함을 알 수 있었다. 아울러, 경옥고에 포함된 증자된 생지황 페이스트의 함량이 40%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 급격히 증가되었고, 생지황 페이스트의 함량이 60%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 더이상 증가되지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고의 제조시에는, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5-2: 인삼분말의 함량비 결정

증자된 생지황 페이스트, 인삼분말, 백복령분말, 꿀 및 감초분말을 하기의 표 2c에 개시된 함량비로 혼합하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 각각의 경옥고(실험군 31 내지 40)를 제조하였다(참조: 표 2c).

경옥고에 포함된 각 성분의 함량비(단위: %(w/w))

실험군	sjp	kp	gp	bp	h
실험군 31 실험군 32 실험군 33 실험군 34 실험군 35 실험군 36 실험군 37 실험군 38 실험군 39 실험군 40	40 40 40 40 40 40 40 40 40 40	24 23 22 21 20 19 18 17 16 15	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5	30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

이어, 상기 제조된 각 경옥고를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법을 사용하여, 각 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 비교하였다(참조: 표 2d).

인삼분말의 함량에 따른 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 변화

실험군	DPPH 라디칼 소거능(%)
실험군 31 실험군 32 실험군 33 실험군 34 실험군 35 실험군 36 실험군 37 실험군 38 실험군 39 실험군 40	68 70 77 89 90 92 93 94 94 94

상기 표 2d에서 보듯이, 경옥고에 포함된 증자된 인삼분말의 함량이 증가할 수록 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능도 증가함을 알 수 있었다. 아울러, 경옥고에 포함된 증자된 인삼분말의 함량이 4%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 급격히 증가되었고, 인삼분말의 함량이 8%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 더이상 증가되지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고의 제조시에는, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말을 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5-3: 백복령분말의 함량비 결정

증자된 생지황 페이스트, 인삼분말, 백복령분말, 꿀 및 감초분말을 하기의 표 2e에 개시된 함량비로 혼합하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 각각의 경옥고(실험군 41 내지 50)를 제조하였다(참조: 표 2e).

경옥고에 포함된 각 성분의 함량비(단위: %(w/w))

실험군	sjp	kp	gp	bp	h
실험군 41 실험군 42 실험군 43 실험군 44 실험군 45 실험군 46 실험군 47 실험군 48 실험군 49 실험군 50	40 40 40 40 40 40 40 40 40 40	21 19 17 15 13 11 9 7 5 3	8 8 8 8 8 8 8 8 8 8	1 3 5 7 9 11 13 15 17 19	30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

이어, 상기 제조된 각 경옥고를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법을 사용하여, 각 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 비교하였다(참조: 표 2f).

백복령분말의 함량에 따른 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 변화

실험군	DPPH 라디칼 소거능(%)
실험군 41 실험군 42 실험군 43 실험군 44 실험군 45 실험군 46 실험군 47 실험군 48 실험군 49 실험군 50	68 70 88 89 91 92 93 94 94 94

상기 표 2f에서 보듯이, 경옥고에 포함된 증자된 백복령분말의 함량이 증가할 수록 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능도 증가함을 알 수 있었다. 아울러, 경옥고에 포함된 증자된 백복령분말의 함량이 5%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 급격히 증가되었고, 백복령분말의 함량이 15%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 더이상 증가되지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고의 제조시에는, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말을 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5-4: 꿀의 함량비 결정

증자된 생지황 페이스트, 인삼분말, 백복령분말, 꿀 및 감초분말을 하기의 표 2g에 개시된 함량비로 혼합하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 각각의 경옥고(실험군 51 내지 55)를 제조하였다(참조: 표 2g).

경옥고에 포함된 각 성분의 함량비(단위: %(w/w))

실험군	sjp	kp	gp	bp	h
실험군 51 실험군 52 실험군 53 실험군 54 실험군 55	40 40 40 40 40	41 31 21 11 1	4 4 4 4 4	5 5 5 5 5	10 20 30 40 50

이어, 상기 제조된 각 경옥고를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법을 사용하여, 각 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 비교하였다(참조: 표 2h).

꿀의 함량에 따른 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능 변화

실험군	DPPH 라디칼 소거능(%)
실험군 51 실험군 52 실험군 53 실험군 54 실험군 55	85 87 93 95 95

상기 표 2h에서 보듯이, 경옥고에 포함된 꿀의 함량이 증가할 수록 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능도 증가함을 알 수 있었다. 아울러, 경옥고에 포함된 꿀의 함량이 30%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 급격히 증가되었고, 꿀의 함량이 40%(w/w) 이상인 경우에는 경옥고의 DPPH 라디칼 소거능이 더이상 증가되지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고의 제조시에는, 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

상기 실시예 5-1 내지 5-4의 결과를 종합하면, 최종 중량에 대하여, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 포함하는 경옥고가 가장 우수한 약리활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 6: 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고의 관능검사 결과

전문 패널요원 30명을 대상으로 하여 전기 실시예 1-2에 개시된 종래의 경옥고(실험군 11) 및 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고(실험군 15)의 관능평가를 7점 측정법(1점: 가장 나쁘다, 2점: 나쁘다. 3점: 조금 나쁘다. 4점: 보통이다. 5점: 조금 좋다. 6점: 좋다. 7점: 가장 좋다)으로 수행하였다(참조: 표 3).

경옥고의 관능검사 결과

경옥고			실험군 11	실험군 15
강도	맛	단맛	5.47±1.44	5.41±1.32
		신맛	5.59±1.28	5.56±1.36
		쓴맛	5.72±1.22	5.97±1.09
		떫은맛	5.03±1.94	5.34±1.60
	향	단향	5.41±1.23	5.88±1.20
		신향	4.84±1.33	4.94±1.08
		약재향	5.34＋1.64	5.78±1.14
		고소한향	4.72＋1.75	5.19±1.59
		가열취	4.78＋1.60	4.44±0.95
	조직감	응집성	6.21±1.78	6.44±1.35
	조직감	거침성	3.09±0.86	3.81±1.60
기호도	맛		5.81±1.22	6.00±1.41
	향		5.75±1.00	6.06±1.48
	조직감		6.88±1.20	6.53±1.31
종합적기호도			6.38±1.31	6.33±1.36

상기 표 3에서 보듯이, 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고(실험군 15)는 종래의 경옥고(실험군 11)에 비하여, 대등한 수준의 관능적 특성을 나타냄을 알 수 있었다.

따라서, 상기 실시예 2, 3 및 6의 결과를 종합하면, 본 발명의 생지황 증자 페이스트를 이용하여 제조된 경옥고는 종래의 경옥고보다 우수한 약리활성을 나타내면서도, 대등한 수준의 관능적 특성을 나타냄을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 증자된 생지황의 페이스트, 인삼분말, 백복령 분말 및 꿀을 포함하고, 약리활성이 증진된 경옥고 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 약리활성이 증진된 경옥고는 종래의 경옥고 보다 항산화활성과 항암활성이 우수하므로, 자양강장, 허약체질개선 및 암예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

(ⅰ) 최종 중량에 대하여, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 혼합하여 혼합물을 수득하는 공정; 및,

(ⅱ) 전기 혼합물을 용기에 담아 밀봉하고, 90 내지 110℃에서 60 내지 80시간 동안 중탕 가열하며, 상온에 방치하여 냉각시킨 다음, 밀봉된 상태로 다시 90 내지 110℃에서 12 내지 36시간 동안 중탕 가열하고, 상온에서 냉각시키는 공정을 포함하는, 경옥고의 제조방법.
제 1항에 있어서,

증자된 생지황 페이스트는 생지황을 90 내지 110℃ 및 5 내지 15기압의 조건하에서 10 내지 30분간 증자하고, 이를 제트 밀 또는 콜로이드 밀에 적용하여 수득하는 것을 특징으로 하는

경옥고의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조되어, 최종 중량에 대하여, 40 내지 60%(w/w)의 증자된 생지황 페이스트, 4 내지 8%(w/w)의 인삼분말, 5 내지 15%(w/w)의 백복령분말 및 30 내지 40%(w/w)의 꿀을 포함하는 경옥고.