KR100620959B1 - 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 표지 및 이의용도 - Google Patents

형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 표지 및 이의용도 Download PDF

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윤경병
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서강대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 형광물질을 내포하는 제올라이트를 포함하는 형광표지, 이의 제조 방법 그리고 이를 사용하는 분석방법 및 키트를 제공한다. 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트 형광표지는 우수한 검출한도 및 강력한 형광세기를 제공하며, 넓은 농도 범위를 검출할 수 있으므로, 다양한 생물학적, 화학적 물질의 정성 또는 정량분석, 질병 진단용으로 사용될 수 있다.
형광물질, 제올라이트, 형광표지, 정성, 정량, 질병 진단

Description

형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 표지 및 이의 용도{Probe Comprising Fluorophore-Incorporated Zeolites and its Use}
도 1은 본 발명의 형광물질을 내포하는 제올라이트를 생물학적 물질의 정량분석시 표지물질로 이용한 예의 대표도로서, A는 항원-항체에 대한 것이고, B는 DNA 올리고머 대한 것이다.
도 2은 실시예 15에서 제시한 것과 같이 도 1에서 형성된 제올라이트 표지에 빛을 조사 (λ=460 nm)할 경우 발광되는 것을 나타내며, 또한, 제올라이트 세공내부에 형광물질인 헤미시아닌이 정렬되어 내포된 것을 나타낸다.
도 3은 실시예 4,5,7 및 8에서 제시한 것과 같이 형광물질을 내포하는 제올라이트의 표면 및 유리 기질 상에 연결화합물을 이용하여 항체 혹은 DNA 올리고뉴클레오티드를 고정하는 방법을 나타낸다.
도 4는 실시예 12에서 형성된 제올라이트 층에 대한 SEM 이미지로 A는 제올라이트 A (Na+ 형태, ~1.7 x 1.7 x 1.7 ㎛3), B는 제올라이트 Y (~0.15 ㎛), C는 실리카라이트 (~1.0 x 0.7 x 0.3 ㎛3)이다.
도 5는 항체를 피펫팅할 연결화합물 포함 유리 기질 (A), 마이크로 피펫을 이용하여 1 ㎕ 부피로 항체를 피펫팅하고, 같은 위치에 각각 다른 농도의 항원을 피펫팅한 유리 기질의 사진 (B), 그리고, 마지막 단계로 항체가 코팅된 헤미시아닌이 내포된 제올라이트를 반응시킨 후, 마이크로어레이 레이저 스캐너(ScanArray Lite/Express, PerkinElmer)로 얻은 이미지 (C)를 나타낸다.
도 6은 9x9 ㎟ 크기의 유리 기질의 한쪽 면에 항원-항체 (DNP-n-DNP - Ig E) 결합에 의해 형광물질을 내포한 제올라이트 층을 형성시키고, 365 nm UV 램프를 조사하여 발생하는 형광을 보여주는 디지털 카메라 이미지이다; 100%는 DNP-n-DNP 10 pmol (4.9 ng, 100 ㎕ 물) 반응시킨 것으로 상기 양에 대해 각각 80. 60, 40, 20, 5%을 반응시켰다.
도 7의 왼쪽 사진은 헤미시아닌 크리스탈, 그리고 물 400 ㎕에 헤미시아닌 내포된 제올라이트 (HC@SL), 이와 동량의 헤미시아닌, 그 5배 및 10배 양의 헤미시아닌을 첨가한 것에 365 nm UV 램프를 조사하였을 때 발생하는 형광에 대한 디지털 카메라 이미지로서 헤미시아닌이 제올라이트에 내포된 경우 (HC@SL)에 현저하게 큰 형광세기를 보임을 알 수 있으며, 오른쪽 그래프는 HC@SL 및 이와 동량의 헤미시아닌이 물에 있을 때의 형광세기를 형광계를 이용하여 측정한 결과를 나타내며, HC@SL의 경우 형광세기가 46,374 배 크다는 것을 알 수 있다.
도 8은 헤미시아닌 (HC2) 농도 변화에 따른 형광세기를 나타낸 그래프이다; (A)는 각각 물, 디메틸설폭사이드, 에탄올 용매 하에서의 HC2의 양에 대한 형광세기(λmax=580 nm)를 나타내며, (B)는 HC2를 내포한 실리카라이트(SL)를 항원-항체 결합에 의해 유리 기질 상에 단층으로 형성시켰을 때, 유리 기질 상에 붙은 제올라이트 양에 따른 형광세기를 그래프를 나타낸다. (B)에서는 형광 세기가 HC2-SL의 함량과 선형 관계가 있음을 알 수 있다 ( X 좌표 최고치인 81.5 ㎍은 유리 9x9 mm2 위에 형성된 한층의 실리카타이트 SL) 양을 기준으로 한 것이다).
도 9는 세 종류의 다른 농도의 헤미시아닌을 포함한 제올라이트를 유리 기질 상에 항원-항체 결합으로 단층으로 형성시켰을 때 유리 기질 상에 붙은 제올라이트 양에 대한 형광세기를 그래프이다; 유리 9x9 ㎟ 상에 형성된 단층의 제올라이트의 평균 질량 81.5 ㎍ 안에 헤미시아닌이 각각 0.561, 0.368, 0.211 ㎍씩 들어있음을 UV 정량을 통해 확인하였다.
도 10은 항원의 농도를 변화시키며, 항원-항체 (DNP-n-DNP - Ig E) 결합에 의해 3x3 mm2 유리 기질 상에 헤미시아닌을 포함한 제올라이트를 단층으로 형성시키고, 그 형광세기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 항원의 농도와 형광세기는 선형관계를 보여주었다. 낮은 농도의 항원 반응시의 결과를 확인하기 위하여 3x3 mm2 면적의 유리 기질을 사용하였으며, 더 낮은 농도의 항원 용액에서의 반응결과는 측정하는 형광계(計)의 기기상의 문제로 인하여 측정이 불가능하다. 농도최고점은 물 100 ㎕ 내의 194 펨토몰 (femtomole)이고 최저점은 물 100 ㎕ 내의 5 펨토물이다.
도 11은 매우 낮은 농도의 항원을 사용하여, 항원-항체 결합에 의해 헤미시아닌이 내포된 제올라이트를 단층 형태로 유리 기질 위에 형성시킨 후, SEM (x 500) 및 형광 현미경(x 40)을 사용하여 얻은 이미지이다. 형광 빛이 강해서 SEM 상에서 500배의 배율에서 관찰한 이미지를 형광현미경에서는 40배의 배율에서도 비슷한 크기로 관찰이 가능하다.
도 12는 DNP-n-DNP 및 이의 항체를 사용하여 도 5에 개시된 방법으로 제조된 각 점들을 형광현미경으로 분석 (4배 렌즈)하여 반응한 DNP-n-DNP의 개수와 형광세기에 로그를 취해 그래프로 나타낸 것이다; DNP-n-DNP의 개수는 200, 800, 8000 및 80000 개에 해당하며 개수가 증가함에 따라 형광세기의 변화되는 양상을 관찰할 수 있다. 대략 105개 정도의 개수까지는 선형적으로 증가함을 보이며 이를 통해 매우 낮은 농도에서는 항원과 제올라이트가 1:1 결합을 한다고 예상할 수 있다.
도 13은 미오글로빈 및 이의 항체를 사용하여 도 5에 개시된 방법으로 제조된 각 점들을 형광현미경으로 분석 (4배 렌즈)하여 반응한 미오글로빈의 개수와 형광세기에 로그를 취해 그래프로 나타낸 것이다. 미오글로빈의 개수는 200, 800, 8000, 80000 개에 해당하며 개수가 증가함에 따라 형광세기의 변화되는 양상을 관찰할 수 있다. 대략 천개 정도의 개수까지는 선형적으로 증가함을 보이며 이를 통해 매우 낮은 농도에서는 항원과 제올라이트가 1:1 결합을 한다고 예상할 수 있다.
도 14는 40 머 올리고뉴클레오티드의 농도에 따라 각 20 머 올리고뉴클레오티디의 혼성화에 의해 도 5에 개시된 방법으로 제조된 각 점들을 형광현미경으로 분석 (2.5배 렌즈)하여 반응한 미오글로빈의 개수와 형광세기에 로그를 취해 그래 프로 나타낸 것이다. 40 머 올리고뉴클레오티는 개수는 200, 800, 8000, 80000 개에 해당하며 개수가 증가함에 따라 형광세기의 변화되는 양상을 관찰할 수 있다. 대략 천개 정도의 개수까지는 선형적으로 증가함을 보이며 이를 통해 매우 낮은 농도에서는 40 mer 올리고뉴클레오티드와 제올라이트가 1:1 결합을 한다고 예상할 수 있다.
도 15는 미오글로빈 및 이의 항체를 사용하여 도 5에 개시된 방법으로 제조된 각 점들을 형광현미경으로 관찰 (4배렌즈, Ex:480 nm, Em:560/80 nm)한 이미지이며 각각 반응한 미오글로빈의 개수는 200, 800 및 80000 개이다.
도 16은 매우 낮은 농도의 각 항원 (DNP-n-DNP 또는 미오글로빈) 또는 DNA 가닥에 대해서 실험적으로 반응한 개수와 형광현미경 이미지에서 측정한 제올라이트 개수를 비교한 결과이다. 0 에 해당하는 것이 비교 실험으로 항원이 없을 때를 나타내며 항원 200 개 개수까지 비교하였다.
본 발명은 형광물질을 내포하는 제올라이트를 포함하는 형광표지, 이의 제조 방법, 상기 형광표지를 사용하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
작은 분자로부터 거대 분자에 이르는 다양한 종류의 물질을 검출하기 위하여, 형광 을 내는 분자들, 3H- 또는 125I- 등을 함유하는 방사성 화합물들, 또는 효소들이 표지 (probe)로서 광범위하게 이용되어져 왔다. 상기 표지를 사용하는 측정법으로는 사용된 표지물질의 종류에 따라 각각 형광면역측정법 (fluoroimmunoassay, FIA), 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)등이 있다.
방사면역측정법의 경우, 방사성 화합물들의 짧은 반감기, 인체에 유해한 특성 및 고가의 장비가 필요하다는 점에서 그 사용빈도가 점차적으로 감소되고 있다. 또한, 효소결합면역측정법의 경우도 나름대로 장점을 가지고 있지만 긴 배양 시간으로 말미암아 분석 시간이 길고, 여러 세척 단계를 거쳐야하는 단점들로 인하여 마이크로어레이 (microarray)를 이용한 고속 분석에는 적합하지 못하다.
이러한 관점에서 보면 형광면역측정법은 다른 두 방법보다 많은 장점이 있다.
형광면역측정법에서, 형광을 내는 다양한 작은 분자들이 표지물질로서 사용되어져 왔으며 최근에는 코아 (core)에 CdSe가 있고 쉘 (shell)에 ZnS가 있는 코아쉘(core-shell)형 형광나노입자1, Eu2O3 또는 Tb2O3가 도핑된 실리카 또는 알루미나 나노입자2, Eu3+ 착물이 내포된 고분자 나노입자3 등 다양한 나노 입자들이 형광표지 물질로서 주목을 받고 있다. 형광면역 측정법의 검출한도는 측정하고자 하는 분자의 분자량에 따라 크게 다르다. 분자량 70,000인 α-페토단백질 (α-fetoprotein)과 같은 고분자의 경우에 검출한도는 100 ㎕ 속에 녹아있는 3,4 x 104 개의 분자(57.1 fmol), 즉 5.7 x 10-16 M (57 fM) 정도이다. 그러나, 분자량 348 인 모르핀 (Morphine)과 같은 작은 분자의 경우 검출한도는 100 ㎕ 속에 녹아있는 약 8x1010 개의 분자(0.14 pmol), 즉 1.4 x 10-9 M(1.4 nM) 정도이다. 그리고, 분자량 17,800인 마이오글로빈 (myoglobin)의 검출한도는 100 ㎕ 속에 녹아있는 2.4 x 109개(0.4 pmol), 즉 4 x 10-11 M(40 pM) 정도이다.
형광면역측정법에도 단점이 있다. 이를테면 기존의 형광표지물질들은 형광세기가 그리 크지 않기 때문에 결과적으로 방사면역측정법 또는 효소결합면역측정법에 비해 검출한도가 낮은 편이다. 뿐만 아니라 기존의 분자나 나노 입자 상태의 형광물질들은 장시간 빛을 받으면 분해되어 형광세기가 감소하는 광표백 (photobleach) 특성이 있어서 장시간 빛을 쪼이며 지속적으로 분석할 수 없는 단점이 있다. 또한, 형광물질의 농도가 증가하면 형광세기가 오히려 감소하는 특성 때문에 검출 한계 농도의 폭이 좁은 단점이 있다.
따라서, 형광면역 측정법의 단점을 개선하기 위한 핵심적인 기술적 과제는 형광세기가 크고 광표백 효과가 일어나지 않으며 넓은 농도 범위의 화합물을 검출할 수 있는 새로운 개념의 수퍼 형광표지 물질을 개발하는 것이다.
한편, 제올라이트는 결정성 알루미노실리케이트 (crystalline aluminosilicate)를 총칭하며, 골격을 이루는 알루미노실리케이트는 알루미늄이 있 는 자리마다 음전하를 띄고 있기 때문에 전하 상쇄를 위한 양이온들이 세공 (pore)속에 존재하며 세공내의 나머지 공간은 보통 물 분자 들로 채워져 있다. 제올라이트가 갖는 3차원적인 세공의 구조, 모양, 크기는 제올라이트의 종류에 따라 다르나 세공의 지름이 보통 분자 크기에 해당한다. 따라서, 제올라이트는 종류에 따라 세공 속으로 받아들이는 분자에 대한 크기 선택성 (size selectivity) 또는 형상 선택성 (shape selectivity)을 갖기 때문에 분자체 (molecular sieve)라고도 불린다.
제올라이트 유사분자체들 (zeotype molecular sieves)도 넓은 의미에서 제올라이트라 칭하며 이들은 제올라이트 골격 구조를 이루는 원소들인 실리콘 (Si)과 알루미늄(Al) 대신에 여러 가지 다른 원소로 실리콘이나 알루미늄의 일부 또는 전체를 대체시킨 물질들이다. 예를 들면, 알루미늄을 완전히 제거시킨 다공성 실리카 (silicalite)와, 실리콘을 인 (P)으로 대체시킨 알포 (AlPO4-4)계 분자체, 그리고 이러한 제올라이트 및 유사분자체의 골격에 Ti, Mn, Co, Fe, Zn 등 다양한 금속 원소를 일부 치환시켜 얻은 유사분자체들이 알려져 있다.
이러한 제올라이트들은 원유의 크래킹 촉매, 흡착제, 탈수제, 기체 정화제, 세제첨가제, 토양개량제 등 실생활과 산업계에서 매우 광범위하게 사용되고 있으며, 특히 중금속이나 방사성 동위원소, 산업 폐수 속에 들어있는 각종 이온성 색소를 제거하기 위한 이온교환제 등으로 유용하게 사용되고 있다.
또한, 제올라이트는 분자크기의 나노세공을 가짐으로 인하여 첨단 신소재로 서의 가능성이 주목받고 있다.4 예를 들어, 3차원적 메모리소재5, 빛에너지의 집결장치6-8, 전극 보조물질9 또는 반도체 양자점 및 양자선10, 분자 회로11, 감광장치12, 발광체13, 비선형 광학물질14, 레이저 발광소자15 들의 담체 (host) 같은 첨단 신소재로서의 응용가능성이 주목받고 있다.
이러한 제올라이트 내에 형광분자를 내포시킬 경우 많은 양의 형광분자가 내포되어도 형광세기가 줄지 않고 오히려 크게 증가하는 현상을 보일 뿐만 아니라 장시간 빛을 쪼여도 형광세기가 감소하지 않는 현상을 보인다.
한편, 미세한 제올라이트 결정들을 여러 가지 연결화합물을 이용하여 기질에 단층 또는 다층으로 부착시키는 방법이 개발되어 왔다16-18 (대한민국특허 제 0335966호; PCT/KR2000/01002).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 발명자들은 기존의 형광표지들이 가지는 단점을 극복하고자 예의 연구 노력한 결과, 제올라이트에 형광물질을 내포시켜 형광표지로 사용하는 경우 형광세기가 크고 광표백 효과가 일어나지 않으며 넓은 농도 범위의 목적화합물을 검출할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형광표지를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 사용하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광표지를 포함하는 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 제공한다.
본 발명자들은 형광분자를 내포시킨 제올라이트 미세결정을 형광표지로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 형광표지가 종래의 형광표지들이 가진 단점을 극복하고, 다양한 화합물 예를 들어, 항원, 항체, 단백 질, 핵산, 효소 등의 정성 또는 정량분석에서 유용하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
기존의 형광표지물질들은 형광세기가 그리 크지 않기 때문에 결과적으로 방사 표지 또는 효소 표지를 사용하는 측정법에 비해 검출한도가 낮은 편이다. 뿐만 아니라 기존의 분자나 나노 입자 상태의 형광물질들은 장시간 빛을 받으면 분해되어 형광세기가 감소하는 광표백 (photobleach) 특성이 있어서 장시간 빛을 조사하면 지속적으로 분석할 수 없는 단점이 있다. 또한, 형광물질의 농도가 증가하면 형광세기가 오히려 감소하는 특성 때문에 검출 한계 농도의 폭이 좁은 단점이 있다.
이에 비하여, 형광 분자를 내포시킨 제올라이트 미세결정은 높은 세기의 형광 빛을 발산할 뿐 만 아니라 또한 발산되는 빛의 세기는 넓은 범위에서 제올라이트 세공 속에 들어있는 형광물질의 양에 비례해서 선형적으로 증가한다. 더욱이, 형광물질이 내포된 제올라이트의 형광세기는 모든 농도범위에서 그 양에 따라 선형적으로 증가하는 경향을 보인다.
따라서, 본 발명의 형광분자를 내포한 제올라이트 미세결정을 형광표지로서 사용하면, 매우 낮은 농도의 목적화합물을 검출할 수 있고, 넓은 농도 범위를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 형광분자를 포함한 제올라이트을 포함하는 형광표지는 분석에 필요한 소요시간이 짧으므로, 분석시간을 단축할 수 있고, 재현성 또한 탁월하다.
상술한 바와 같이, 본 발명과 관련되어 사용되는 용어, "제올라이트"는 유사분자체를 포함하는 광의의 제올라이트를 의미한다. 본 발명에 적합한 제올라이트는 0.2 에서 100 nm 의 세공 크기를 갖는 규칙적으로 배열된 기하학적 구조를 보이는 세공 배열과 세공 형태를 갖는 다공성의 활성물질이다. Si, Al, Ga, B, P, O, S 등의 주족원소 그리고 Ti, V, Zr, Mn, Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn 등의 여러 가지 전이금속 등이 골격을 구성하는 원자가 될 수 있으며, 이들의 상대적인 혼합비는 다양하게 변할 수 있다. 이때 제올라이트, 유사분자체 및 메조다공성 물질의 골격이 음전하를 띄게 될 경우 전하상쇄를 위해 존재하는 양이온은 이온교환을 통해 다른 양이온으로 바뀌거나 병속의 배 (ship-in-a-bottle) 기법에 의해 세공 내에서의 합성을 통해 새로이 내포될 수 있는데 양이온의 종류에 상관없이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제올라이트는 다음에서 선택된다:
(A)천연 제올라이트; (B)MFI 구조를 갖는 제올라이트 및 유사분자체 (ZSM-5, 실리카라이트-1,TS-1 그리고 전이금속이 부분적으로 치환된 메탈로-실리카라이트-1 등); (C)MEL 구조를 갖는 제올라이트 및 유사분자체 (ZSM-11, 실리카라이트-2, TS-2 그리고 전이금속이 부분적으로 치환된 메탈로-실리카라이트-2 등); (D)제올라이트 A, X, Y, L, 베타, 모르데나이트, 페리에라이트, ETS-4, ETS-10; (E)메조다공성 실리카 (MCM 계열, SBA 계열, MSU 계열, KIT 계열); (F)기타 수열합성을 통해 생성되는 제올라이트 및 메조다공성 실리카를 포함하는 유사분자체; (G)유기-무기 복합 메조세공 구조체 및 층상물질; (H)금속이온과 리간드가 3차원적으로 결합하여 규칙적인 나노세공을 형성하는 유기 제올라이트, 유기금속 제올라이트 또는 배위화합물 제올라이트라 불리는 나노다공성 물질들; (I)점토 등 무기 층상물질.
본 발명에서 제올라이트에 내포시키는 데 사용되는 형광물질은 제올라이트에 결합될 수 있는 어떠한 형광물질도 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직한 형광물질은 다음에서 선택된다:
(a) 광발광 (photoluminescent)시 일중항 (singlet) 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 및 양자선(quantum wire);(b) 광발광 (photoluminescent)시 삼중항 (triplet) 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 또는 양자선; 및 (c) 광발광시 원래 일중항 여기상태에서 발광하는 물질이지만 인접한 분자나 중금속 이온에 의해 삼중항 여기 상태로 전이하여 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 및 양자선.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 형광물질의 예는 다음과 같다:
(ⅰ) 헤미시아닌 (hemicyanine: 4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-docosyl- pyridinium bromide) 계열 화합물; (ⅱ) 메로시아닌(merocyanine; 1-docosyl-4-(4- hydroxystyryl)pyridinium bromide) 계열 화합물; (ⅲ) 니트로스틸벤 (4-heptadecylamido-4'-nitrostilbene) 계열 화합물; (ⅳ) 디스퍼스 오렌지 3 (Disperse Orange 3; 4-(4-nitrophenylazo)aniline) 계열 화합물; (ⅴ) 디스퍼스 오렌지13 (Disperse Orange 13; 4-[4-(phenylazo)-1- naphthylazo]phenol) 계열 화합물; (ⅵ) 디스퍼스 오렌지 25 (Disperse Orange 25; 3-[N-ethyl-4-(4- nitrophenylazo)phenylamino]propionitrile) 계열 화합물; (ⅶ) 디스퍼스 레드 1 (Disperse Red 1; 2-[N-ethyl-4-(4-nitrophenylazo)- phenylamino]ethanol) 계열 화합물; (ⅷ) 디스퍼스 레드 13 (DisperseRed13;2-[4-(2-chloro-4-nitrophenylazo) -N-ethylphenylamino]ethanol 계열 화합물; (ⅸ) 디스퍼스 옐로우 7 (Disperse Yellow 7; 4-[4-(phenylazo)phenylazo]- o-cresol) 계열 화합물; (ⅹ) 메틸 니트로아닐린 (Methyl nitroaniline: MNA), N-(4-니트로페닐)-L-프로리놀 (N-(4-nitrophenyl)-L-prolinol: NPP), (-)-2-α-메틸벤질아미노-5-니트로피리딘 ((-)-2-α-methylbenzylamino-5-nitropyridine: MBA-NP), 3-메틸-4-메톡시-4'-니트로스틸벤 (3-methyl-4-methoxy-4'-nitrostilbene: MMONS), 2-(N-프로리놀)-5-니트로피리딘 (2-(N-prolinol)-5-nitropyridine: PNP), 3-메틸-4-니트로피리딘-1-옥사이드 (3-methyl-4-nitropyridine -1-oxide: POM) 등의 유기화합물.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 형광물질의 예는 다음과 같다:
5,5'-디페닐-2,2'-파라-페닐렌비스옥사졸(5,5'-diphenyl-2,2'-p- phenylenebis(oxazole); POPOP),9-플로레논(9-fluorenone), 메틸바이올로젠(MV2+), 옥소닌(oxonine), 파이로닌 (pyronine), 타이로닌 (thionine), 다이페닐헥사트리엔 (diphenylhexatriene: DPH), 로다민 (rhodamine) 계열 화합물, FITC (fluorescein isothiocyanate) 계열 화합물, APC (allophycocyanin), 사이아닌 염료 (cyanine dye), PE (phycoerythrobilin), PerCP (peridinin chlorophyll protein).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 형광물질의 예는 다음과 같다:
금, 은 등의 금속 입자 또는 이를 포함하는 나노쉘 (nanoshell), 나노디스크 (nanodisk), 멀티포드 (multipod), 삼각 나노프리즘 (triangular nanoprism) 및 분지된 구조 (branched structure), 주기율표상에서 원자번호 58-71에 해당하는 란탄족 (lanthanide) 또는 희토류 (rare earth metal) 원소들 (Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu) 및 이들이 도핑된 실리카나 알루미나 나노입자, CdSe, ZnS를 포함하는 코아쉘 (core-shell)형 형광나노입자, Eu2O3 또는 Tb2O3가 도핑된 실리카 또는 알루미나 나노입자, Eu3+ 착물이 내포된 고분자 나노입자, 플로레세인디아세테이트(fluoresceindiacetate: FDA).
본 발명에 따르면, 본 발명은 상기한 형광물질이외에도 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 형광염료로서 유기 형광염료의 한 종류인 헤미시아닌 (hemicyanine: 4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-docosylpyridinium bromide) 계열중 n = 1, R3 = 2 인 물질(HC2)을 합성해서 사용한다: R1R2N-C6H4-(CH=CH)n-C6H4N-R3 Br.
Figure 112005035652718-pat00001
헤미시아닌계의 분자가 실리카라이트 제올라이트의 채널 속에 일정한 배향으로 들어가 정렬되고 2차 비선형광학 성질을 띠는 제올라이트-비선형광학 분자 복합체가 생성된다는 사실은 본 연구소에서 개발한 바 있다19 (대한민국특허출원 제 2003-91229호; PCT/KR2004/003310).
본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 표지 (probe)는 본 발명이 범위에 포함된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 형광표지는 다음을 포함한다: (a) 형광물질을 내포한 제올라이트; (b) 상기 제올라이트에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물; 및 (C) 상기 제 2 결합 부위에 결합하는 미끼 화합물.
본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트를 표지로 사용하여 목적화합물을 검출하기 위하여, 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 연결된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트를 미끼화합물과 연결시키기 위하여 연결화합물을 사용한다.
하지만, 연견화합물이 반드시 필요한 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "목적화합물"은 본 발명의 형광표지를 사용하여 검출하고자 하는 분석 대상 화합물을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 목적화합물은 어떠한 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 물질 예를 들어, 항원, 항체, 효소, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 생물체 내에 존재하는 대사산물 및 화학적으로 합성된 약제를 포함하는 화학물질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 항체는 전체 또는 일부, 이를테면 Fab 부분 또는 힌지 (hinge) 부위만을 선택적으로 잘라낸 부분 (half-immunoglobulin fragment) 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 핵산 분자는, 2-200개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 혹은 c-DNA 모두를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "미끼화합물"은 본 발명의 형광표지를 사용하여 목적화합물을 특이적으로 검출하기 위하여, 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트에 연결하여 사용하는 화합물을 의미한다.
본 발명에서 미끼화합물은 목적화합물에 특이적으로 결합될 수 있는 화합물로서, 다른 화합물과 비교하여 분석하고자 목적화합물에 보다 높은 친화성 (affinity)을 갖는 화합물이다.
본 발명에서 미끼화합물은 연결화합물에 결합시키기 위하여 공지된 방법으로 미끼화합물의 관능기를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 핵산 말단에 아민기 치환).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 미끼화합물은 분석하고자 하는 목적화합물을 고려하여 선택되며, 목적화합물과 특이적으로 결합할 수 있는 것이라며, 어떠한 화합물일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 물질 예를 들어, 항원, 항체, 효소, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 생물체 내에 존재하는 대사산물 및 화학적으로 합성된 약제를 포함하는 화학물질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 항체는 전체 또는 일부, 이를테면 Fab 부분 또는 힌지 (hinge) 부위만을 선택적으로 잘라낸 부분 (half-immunoglobulin fragment) 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 핵산 분자는, 2-200개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 혹은 c-DNA 모두를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "연결화합물"은 본 발명의 형광물질을 내포하는 제올라 이트와 미끼화합물을 연결시키기 위하여 사용하는 화합물을 의미한다.
본 발명에서 "연결화합물"은 제올라이트에 결합하는 관능기 (제 1 결합 부위) 및 분석하고자 하는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 결합하는 관능기 (제 2 결합 부위)를 가지는 화합물로서 상기 관능기를 통하여 제올라이트와 미끼화합물을 연결시킬 수 있다.
제올라이트 표면에 결합을 할 수 있는 관능기란, 예를 들어, 표면 히드록실기를 갖는 제올라이트에 대해서는 예컨대, 히드록실기와 반응하여 결합할 수 있는 할로실릴기 [-SiX3-nAn (n=0-2) X= 할로겐 원소, A=알킬, 수소, 알콕시, 아릴기], 알콕시실릴기 (예: -Si(OCH3)3), 이소시아나토기 (-N=C=O) 등을 의미한다.
미끼화합물에 결합하는 관능기에는 예를 들어, NH2, -CHO 기등이 있다.
물론 재료 표면의 성질 (관능성, functionality)에 따라 그와 화학적인 결합을 할 수 있는 적절한 관능기를 선택할 수 있으며, 이러한 관능기들은 당업자에 의해 적절히 선택할 수 있으며, 하나 이상의 연결화합물이 연결되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 연결화합물은 바람직하게는 화학식 1-6의 화합물을 포함한다:
화학식 1
R3Si-L-X
화학식 2
Z
화학식 3
Y-L-Y
화학식 4
R3Si-L-Y
화학식 5
HS-L-X
화학식 6
HS-L-Y
상기 식에서, R은 할로겐족 원소, C1-C4 알콕시 또는 알킬기를 나타내고; L은 치환 또는 비치환된 C1-C17 알킬, 아르알킬 또는 아릴기를 나타내고, 이들은 하나 이상의 산소, 질소, 황 원자를 포함할 수 있으며; X는 할로겐과 같은 이탈기를 나타내며, 단 3 개의 R 중 적어도 하나는 할로겐 또는 알콕시기이고; Y는 히드록실기, 티올기, 아민기, 암모늄기, 술폰기 및 이의 염, 카르복실산 및 이의 염, 산무수물, 에폭시기, 알데하이드기, 에스테르기, 아크릴기, 이소시아네이트기(-NCO), 당류(saccharides) 잔기, 이중결합, 삼중결합, 디엔(diene), 디인(diyne), 숙신이미드기(succinimide), 말레이미드기(maleinimide) 알킬 포스핀, 알킬 아신로 이루어진 군으로 선택되는 유기 관능기, 및 리간드 교환을 할 수 있는 배위 화합물이며; Z는 단백질 A (Protein A, 64 KDa)나 단백질 G(Protein G, 30 KDa) 등의 캡처 리간드를 나타내고, 단, 상기 반응성 기능기는 연결화합물 분자의 양 말단이 아닌 중간에 위치할 수 있다.).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 목적화합물 및 미끼화합물을 다양하게 조합될 수 있으며, 가장 대표적인 예는 항원-항체, 단일가닥 핵산-이와 상보적인 단일가닥 핵산, 기질-효소 및 단백질 결합 화합물 (바이오틴)-단백질 등이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지는 시료에 존재하는 목적화합물의 정성 또는 정량에 사용되거나, 질병의 진단에 사용된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 형광물질을 제올라이트와 반응시켜 형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계; (b) 상기 형광물질을 내포하는 제올라이트에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적 화합물에 친화성을 갖는 미끼 화합물에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물과, 상기 (a)에서 얻어진 형광물질을 내포하는 제올라이트를 반응시켜 연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b)에서 얻어진 연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 목적 화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물과 반응시켜 미끼화합물-연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기에서 연결화합물을 사용하지 않는 경우에는 (b)단계를 생략할 수 있다.
본 발명은 상술한 형광물질을 내포하는 제올라이트, 연결화합물 및 미끼화합물을 사용하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 화합물 사이의 결합은 이온결합, 공유결합, 배위결합 및 금속결합에 의하여 이루어질 수 있으면, 화합물 사이의 반응 조건은 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다 (예를 들어, 반응온도, 압력 및 반응시간 조정, 촉매의 사용).
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라 제올라이트 세공 내에 형광물질을 내포시키는 과정을 설명하면 다음과 같다:
제올라이트 입자를 합성 당시 사용된 유기 주형 물질이 잔존하는 경우에는 적당한 온도에서 산소를 공급하면서 소성시킨다. 형광물질 (e.g. HC2)을 적당한 용매 (e.g. 메탄올)에 용해시키고 여기에 제올라이트를 20℃-100℃ 에서 하루 정도 담가둔다. 원심분리 시켜서 여분의 용액을 제거하고 동일 용매로 세척하고, 세척액에서 더 이상 형광분자가 나오지 않을 때까지 세척한다. 건조시켜 형광물질이 내포된 제올라이트를 얻는다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 형광 물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 사용하는 분석 방법을 제공한다:
(a) 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 목적화합물과 반응시키는 단계; 및 (b) 내포된 형광물질이 가지는 고유한 여기 파장을 조사하고 방출되는 발광 빛의 세기를 검출하는 단계.
본 발명은 상술한 형광물질을 내포하는 제올라이트, 연결화합물 및 미끼화합물을 사용하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지는 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 서던 블롯팅 (Southern blotting) 또는 노던 블롯팅 (Northern blotting)에서 정성 또는 정량 분석을 위하여 사용된다.
본 발명에 따르면, 웨스턴 블롯팅에서 전기영동으로 분리된 여러 단백질 중 정성 혹은 정량을 목적으로 하는 특정 단백질에 대해 1차 또는 2차 항체로써 상기 단백질에 대해 특이 결합을 갖는 항체가 처리된 형광물질이 내포된 제올라이트를 표지물질로 사용한다.
본 발명에 따르면, 서던 블롯팅 (Southern blotting) 또는 노던 블롯팅 (Northern blotting)에서 검출하고자하는 DNA나 RNA 등의 핵산에 대해 상보적으로 반응하는 핵산가닥이 처리된 형광물질이 내포된 제올라이트를 표지물질로서 사용한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 형광표지는 고정된 목적화합물 또는 고정되지 않은 목적화합물에 처리할 수 있으며, 형광표지된 목적화합물이 차후적으로 고정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예 따르면, 본 방법은 상기 목적화합물과의 반응 전 또는 후에 추가적으로 다음의 단계를 포함하는 목적화합물을 고정용 기질 상에 고정시키는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다:
(ⅰ) 고정용 기질에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물′에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물′과 고정용 기질을 반응시켜 연결화합물′-기질을 제조하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 (ⅰ)에서 얻어진 연결화합물′-기질을 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물′과 반응시켜 미끼화합물′-연결화합물′-기질을 제조하는 단계.
본 발명에서 고정용 기질은 목적화합물을 고정하기 위하여 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 연결된다.
본 발명에서 고정용 기질을 미끼화합물′과 연결시키기 위하여 연결화합물′을 사용한다.
하지만, 연결화합물′이 반드시 필요한 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "미끼화합물′ " 및 용어 "연결화합물′ "은 형광물질을 내포한 제올라이트 대신에 고정용 기질에 사용된다는 것을 제외하고는 상기에서 언 급한 용어 "미끼화합물" 및 용어 "연결화합물"에 관한 내용을 그대로 인용한다.
본 발명에 따르면, 고정용 기질은 바람직하게는 표면에 히드록실기를 가지는 기질 (예를 유리) 또는 메르캅토기와 반응할 수 있는 금속, 주사슬 또는 측사슬에 반응성 관능기를 갖는 중합체로부터 선택된다.
보다 바람직하게는 기질은 다음에서 선택된다:
(A) 실리콘, 알루미늄, 티탄, 주석, 인듐 등 각종 금속 및 비금속 원소들이 단독 또는 복합적으로 포함되어 있는 산화물로서, 이를테면 석영, 운모, 유리, ITO 유리 (인듐주석산화물이 증착된 유리), F-도핑된 주석산화물 (F-SnO2) 등 각종 전도성 유리, 실리카, 다공성 실리카, 알루미나, 다공성 알루미나, 이산화티탄, 다공성 이산화티탄, 실리콘 웨이퍼 등 표면에 히드록실기를 가지는 모든 물질;
(B) 금, 은, 동, 백금과 같이 티올기 또는 아민기와 잘 결합하는 금속;
(C) 표면에 다양한 작용기를 가지는 중합체, 예를 들면 PVC, 메리필드 펩타이드 수지 (Merrifield peptide resin)와 같은 중합체;
(D) 셀레늄화아연(ZnSe), 비소화갈륨(GaAs) 및 인화인듐(InP) 등 반도체; 및
(E) 셀룰로오스, 녹말 (아밀로오스 및 아밀로펙틴), 리그닌 등 표면에 히드록실기를 가지는 천연 고분자 등으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 복합체.
본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 기질은 웰플레이트 (well plates) 또는 평면 등의 다양한 형태로 가공된다.
본 발명에서 형광물질에 조사되는 광 소스는 플리쉬 램프 (flash lamp), 모듈화 램프 (modulated lamp), 전기발광 장치 (elcetroluminescent device), 광-방출-다이오드 (light-emitting diode), 다이오드 레이저 (diode laser), 및 증폭 모듈화 레이저 (amplitude modulated laser)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 형광의 검출을 위하여 통상적인 형광계 또는 형광현미경, 사진기 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 검출된 결과는 목적화합물의 정성 또는 정량 분석을 위해 사용되거나 질병의 진단을 위해 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 분석 방법은 목적화합물의 정성 또는 정량 분석 방법 및 질병의 진단을 위한 분석 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 포함하는 분석용 키트를 제공한다.
본 발명은 상술한 형광물질을 내포하는 제올라이트, 연결화합물 및 미끼화합물을 사용하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 시료에 존재하는 미량의 특정 목적화합물의 정성 또는 정량에 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 질병의 진단에 사용된다.
본 발명에 따른 특정 목적화합물의 분석결과에 따르면, 본 발명의 검출한도는 분자량 17,800 D인 마이오글로빈과 분자량 490인 DNP-n-DNP (1,8-Dinitrobenzylnonane)의 경우, 모두 분자량과 상관없이 1 ㎕ 속에 녹아있는 50개 (0.05 zmol 또는 50 ymol), 즉, 8 x 10-17 M (0.08 fM 또는 80 aM)이다. 이러한 검출한도는 종래의 형광물질을 사용하여 얻은 분자량 70,000인 α-펩토단백질의 검출한도 (3.4 x 104 개) 보다 680배가 높으며 기존의 마이오글로빈 검출한도(2.4 x 109 개)보다 48만배 높고 분자량 348 인 몰핀 (morphine, 8 x 1010 개)과 비교하면 16억배 높다.
병의 진단을 목적으로 마이오글로빈의 농도를 정량할 경우 현재 검출한도가 높은 방사면역측정법이 사용되고 있으며, (주)녹십자에서는 일본 다이이치 (Daiichi) 사에서 판매되는 키트를 사용하고 있는데 이 경우 검출 한도가 25 ㎕ 속에 녹아있는 8.4 x 10-9개 (0.01 fmol), 즉 5.6 x 10-10 M(0.56 nM) 이다. 본 발명은 다이이치 사의 방법에 비해서도 검출한도가 107 농도 배 높아서 극미량의 마이오글로빈의 정량분석이 가능하다.
본 발명에서, 40 머인 DNA 올리고핵산의 경우 검출한도도 1 ㎕ 속에 녹아있 는 약 50가닥으로 나타나서 기존 방법에 의한 검출한도보다 수백배 이상 증가한다. 즉, 40 머인 DNA 올리고핵산의 경우 검출한도는 0.05 zmol 또는 50 ymol, 즉, 8 x 10-17 M(0.08 fM 또는 80 aM)이다.
본 발명의 검출농도 범위는 1 ㎕를 사용할 경우 비례곡선을 이용하면 최소 8 x 10-17 M(0.05 zmol 또는 50 ymol)에서 1 x 10-7 M (0.1 pmol 또는 100 fmol)이다.
본 발명에서 각각 항체, 항원, DNA 올리고핵산이 부착된 제올라이트 미세결정들은 PBS 완충용액에 3개월 이상 냉장 보관한 뒤 사용하여도 활성이 저하되지 않으며 일단 기질위에 부착된 제올라이트 미세결정들은 1년 이상 상온에서 보관하여도 형광세기가 줄어들지 않는다.
따라서, 형광물질을 내포한 제올라이트 미세 결정들은 높은 검출한도를 제공할 뿐만 아니라 장기간 보관이 용이하여 보관상에도 많은 장점을 제공한다.
본 방법의 최소 소요시간은 이미 항체가 부착된 유리판을 사용할 경우 최소 1시간 30분이 소요되어 정량분석에 소요되는 시간도 짧다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라 본 발명의 형광표지를 사용하여 정성 또는 정량 분석에 사용하는 과정을 설명하면 다음과 같다:
1) 형광물질을 내포한 제올라이트의 표면에 연결화합물을 형성하여 미끼화합물을 고정시켜 형광표지를 제조하는 단계:
형광물질을 내포한 제올라이트을 증류된 용매 (e.g. 톨루엔, 헥산 벤젠, 사 염화탄소, 알코올)에 분산시키고 연결화합물 (e.g. 3-아미노프로필트리메톡시실란)를 주입하여 반응시킨다. 원심분리 방법으로 용매 (e.g. 톨루엔, 에탄올 및 메탄올)로 세척하고, 용매를 제거하였다. 연결화합물의 관능기를 변경시키기 위하여 추가적으로 연결화합물 (e.g. 테레프탈디카복시알데히드)을 반응시킬 수 있다. 상기 과정에 얻은 연결화합물-제올라이트를 미끼화합물 (e.g. IgE, IgG, 또는 단일가닥 DNA)을 포함하는 완충액에 넣고 반응시킨다. 완충액 및 증류수로 세척하여 미반응 미끼화합물을 제거한다.
2) 기질의 표면에 연결화합물을 형성하여 항체를 고정시키는 단계:
기질 (예를 들어, 유리)을 증류된 용매 (e.g. 톨루엔, 헥산 벤젠, 사염화탄소, 알코올)에 넣고 연결화합물 (e.g. 3-아미노프로필트리메톡시실란)를 주입하여 반응시킨다. 용매 (e.g. 톨루엔, 에탄올 및 메탄올)로 세척하고, 용매를 제거한다. 연결화합물의 관능기를 변경시키기 위하여 추가적으로 연결화합물 (e.g. 테레프탈디카복시알데히드)을 반응시킬 수 있다. 상기 과정에 의하여 얻은 연결화합물로 코팅된 기질 위에 피펫으로 미끼화합물 (e.g. IgE, IgG, 또는 단일가닥 DNA)을 일정 간격으로 스팟한다. 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 반응시킨다. 미끼화합물이 코팅된 기질은 완충액으로 세척하고 용매를 제거한다.
3) 미끼화합물을 고정시킨 기질 위에 각 농도에 해당하는 목적화합물을 반응시키는 방법:
상기 2)에서 제조된 미끼화합물이 고정된 기질 위에 각 농도에 해당하는 목적화합물 (미끼화합물이 예를 들어, IgE, IgG, 또는 단일가닥 DNA인 경우 상기 화 합물과 특이적으로 결합하는 항원 또는 상보적인 단일가닥 DNA) 완충액를 상기 미끼화합물이 고정된 위치에 정확하게 스팟한다. 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 반응시킨다. 목적화합물이 결합된 기질은 완충액으로 세척한다. 목적화합물이 단백질인 경우 특이적 반응 이외의 반응을 최소화시키기 위하여, BSA 등을 포함하는 완충액에 담가 블로킹한다. 기질판을 완충액으로 세척하고 용매를 제거한다.
4) 목적화합물이 고정된 기질 상에 형질물질을 내포한 제올라이트 형광 표지를 반응시키는 단계
상기 1)에서 제조한 형광표지를 완충액에 균일하게 분산시키고 일정 시간 후에 침전하지 않은 상층만을 일부 취한다. 이것을 상기 3)에서 제조한 기질 상의 목적화합물이 고정된 지점에 일정 량을 스팟한다. 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 반응시킨다. 반응 후 기질을 완충액 및 증류수로 세척한다.
5): 반응이 끝난 후 물리적으로 흡착된 제올라이트를 제거하는 단계
형광표지 및 목적화합물 간의 결합이 항원-항체, 혹은 DNA 상보 결합과 같은 특이적 결합이 아닌 물리적 흡착에 의해 기질 표면에 붙는 것을 방지하기 위하여 완충액에서 약한 초음파를 일정 시간 처리한다.
6) 형광분석
형광계 (fluorimeter) 또는 형광 현미경 등을 이용하여, 형광세기를 분석한다.
본 발명의 발명자들은 형광 분자를 내포시킨 제올라이트 미세결정은 높은 세기의 형광 빛을 발산할 뿐 만 아니라 또한 발산되는 빛의 세기는 넓은 범위에서 제올라이트 세공 속에 들어있는 형광물질의 양에 비례해서 선형적으로 증가한다는 것을 확인하였으며, 더욱이, 형광물질이 내포된 제올라이트의 형광세기는 모든 농도범위에서 그 양에 따라 선형적으로 증가하는 경향을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 형광물질을 내포한 제올라이트 미세 결정들은 부착된 항체, 항원, DNA 올리고 핵산 등을 이용하여 상보적인 항원, 항체, DNA 올리고 핵산이 부착된 기질위에 단층막으로 부착될 수 있다.
본 발명은 위에서 기술한 획기적인 실험 결과와 기존의 생물학적 정량법을 조합하여 미지의 항원, 항체, 단백질, 핵산, 효소 등 미량 화합물을 정성 또는 정량 할 수 있는 새로운 방법을 제공한다.
(1) 본 발명에 따른 형광물질이 내포된 제올라이트를 생물학적 정량에 대한 표지물질로 이용한 시스템에서는 샌드위치 형태로 분석가능한 모든 생체물질에 대해 대략 젭토몰 (zepto mole, 수십개 분자)의 검출한도를 가진다.
(2) 본 발명에 따라 제조한 시스템은 기존의 유기분자를 이용한 시스템의 검출한도에 비해 106 배 농도만큼 증가한 경우로 질병의 조기 검진이나 특정물질의 생체 매커니즘 규명의 연구 등의 강력한 수단이 될 것이다.
(3) 본 발명에 의거해 제조한 형광분자를 내포하는 제올라이트 유사체들은 인체에 유해한 방사성 물질들을 대신해 생체조건 안과 밖에서(in vivo, in vitro) 다양한 응용가능성을 가진다.
(3) 형광 분자의 종류와 제올라이트 및 유사분자체의 종류및 크기를 변화시켜 각기 다른 물질에 적용할 수 있으며 형광세기를 극대화 시킬 수 있다.
(4) 구입이 용이하고 가격이 낮은 형광분자들이 많고 제올라이트 및 유사분자체도 극미량이 사용되므로 생산원가가 낮으며 이렇게 제조된 물질의 안정성이 매우 크고 제조 방법의 재현성이 매우 높은 점을 이용해 대량화 및 대중화가 용이하다.
(5) 생체물질뿐만 아니라 현존하는 샌드위치 형태의 다양한 분석법 (마약류, 다양한 환경 오염물질등)에 응용이 가능하다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
본 발명을 더욱 효과적으로 설명하기 위하여 다음과 같이 실시예들을 기술하였다.
실험재료
테트라프로필암모늄 히드록사이드 (TPA+OH-), 4-[4-(디메틸아미노)스티릴]피리딘, 1-브로모에탄, 1.8-디아미노옥탄, 소듐카보네이트, 2,4-디니트로플로로벤젠, 3-아미노프로필트리메톡시실란 (AP-TES), 테레프탈디카복시알데히드(TPDA)는 알드리치에서 구입하였다. 항-DNP 면역글로불린 항체E (IgE, monclonal, clone no. SPE-7), 항-미오글로빈 면역글로불린 항체G (IgG, clone no. MG-1), 인간 심장으로부터 추출한 미오글로빈 (Lot.113k1311), PBS 완충액 (pH = 7.4, 0.01M 인산 완충 염수; 0.138M NaCl; 0.0027M KCl, 25℃), BSA 포함 PBS (pH = 7.4, 1% W/V 우혈청알부민; 0.01M 인산 완충 염수; 0.138M NaCl; 0.0027M KCl, 25℃)은 시그마에서 구입하였다.
올리고뉴클레오티드 및 이의 아민치환체들은 바이오니아에서 구입하였다. 슬라이드글라스 (2.5 x 7.5 ㎠)는 마리엔펠드 (Marienfeld)에서 구입하였고, 용융실리카판 (fused silica plates)은 CVI 레이저 사에서 구입하여 ~18x18 ㎜로 잘라서 사용하였다.
실시예 1: 제올라이트 A, Y, 실리카라이트의 합성
제올라이트 A (Na+ 형태, ~1.7 x 1.7 x 1.7 ㎛3) 및 실리카라이트(~1.0 x 0.7 x 0.3 ㎛3)는 각각 TMA+와 TPA+를 주형으로 하여 문헌대로 합성하였다.21
제올라이트 Y (~0.15 ㎛)는 겔조성 AIP:TEOS:TMAOH:NaOH:H2O = 1:1.7:2.5:0.07:360에서 합성하였다. 우선, 이차증류수 115 ㎖에 녹아있는 TMA+OH- (45.5 g, 25 wt%)용액에서 AIP (10.2 g)를 수화(hydrolyze)시켰다. 상기 용액에 TEOS (18 g)를 첨가하고 교반하면서 두시간 동안 수화시켰다. 10 ㎖의 이차증류수에 0.14 g NaOH를 용해한 용액을 첨가하고, 12시간 동안 교반하면서 에이징 (aging)시킨다. 100℃ 오븐에서 10일 동안 결정화시켰다. 합성된 Y 결정들을 세척 및 침전과정을 반복하면서 정제하였다. TMA+와 TPA+는 사용 전에 550℃에서 12 시간 소성시켜 제거하였다.
실시예 2: 헤미시아닌 (hemicyanine: 4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-ethyl- pyridinium bromide ; HC2) 화합물의 제조
4-[4-(디메틸아미노)스티릴]피리딘 (1 mol) 및 1-브로모에탄 (1.2 mol)을 아세토니트릴 용액 (25 ㎖)에서 24 시간동안 환류시켰다. 무색의 용액이 흑적색이 되며, 반응이 끝난 용액을 상온으로 냉각시킨 후 아세토니트릴을 제거하였다. 여기에 에틸아세테이트를 첨가하여 생성물인 HC2를 제외한 나머지는 여과하여 제거하였다. 걸러진 고체를 메탄올 및 디메틸에테르를 이용해 재결정하여 순수한 HC2를 얻었으며, 1H NMR로 확인한다.
실시예 3: 제올라이트 입자의 세공 내에 형광물질을 내포시키는 방법
제올라이트 또는 유사분자체 입자는 합성 당시 사용된 유기 주형 (organic template) 물질이 잔존하는 경우에는 적당한 온도에서 산소를 공급하면서 소성시켰다. 형광물질인 HC2 분자를 메탄올에 용해시키고 여기에 주형분자가 제거된 다양한 형태의 제올라이트를 60℃에서 하루 정도 담가두었다. 원심분리 시켜서 여분의 용액을 제거하고 동일 용매로 세척하였으며, 분광학적 기기로 측정하여, 세척액에서 더 이상 형광분자가 나오지 않을 때까지 세척하였다. 상온에서 진공으로 건조시켜 HC2 분자가 일정한 배향으로 내포된 제올라이트를 얻었다. 형광측정을 위해 실시 예에서 사용한 제올라이트는 실리카라이트이며 크기는 ~1.0 x 0.7 x 0.3 ㎛3이다.
실시예 4: 형광물질을 내포한 제올라이트의 표면에 연결화합물을 형성하여 항체(IgE, IgG)를 고정시키는 방법
HC2를 내포한 제올라이트 20 ㎎을 증류된 톨루엔에 분산시키고 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.1 ㎖를 주입하여 한 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 원심분리 방법으로 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하여, 상온 진공 상태에서 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여, 아미노기로 코팅된 제올라이트 20 ㎎을 증류된 톨루엔에 분산시키고 테레프탈디카복시알데히드 0.1 ㎎을 넣어 세 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉가시킨 후 원심분리 방법으로 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하여, 상온 진공 상태에서 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 벤즈알데히드 코팅된 제올라이트 결정 (10 ㎎)을 항체 (IgE 또는 IgG 0.2 μM, 2 ㎖) PBS 완충액 (pH=7.4) 용액에 넣고 두 시간동안 상온에서 흔들면서 반응시켰다. 항체가 코팅된 제올라이트 결정들은 PBS 완충액 및 증류수로 수회 세척하여 미반응 항체를 제거하였다.
실시예 5: 형광물질을 내포한 제올라이트의 표면에 연결화합물을 형성하여 단일가닥 올리고머 DNA (single-stranded oligomer DNA)를 고정시키는 방법
HC2를 내포한 제올라이트 20 ㎖을 증류된 톨루엔에 분산시키고 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.1 ㎖을 주입하여 한 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 원심분리 방법으로 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하여 상온 진공 상태에서 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 아미노기로 코팅된 제올라이트 20 ㎖을 증류된 톨루엔에 분산시키고 테레프탈디카복시알데히드 0.1 ㎖을 넣어 세 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 원심분리 방법으로 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하여 상온 진공 상태에서 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 벤즈알데히드 코팅된 제올라이트 결정 (10 ㎎)을 단일가닥 DNA (5'-NH2-catagttatcACTTGAGGGGGGTGCGAGAA-3', 20 머, 0.3 μM, 2 ㎖) PBS 완충액 (0.3 M NaCl, pH=7.4, 10 mM 포스페이트) 용액에 넣고 두 시간동안 상온에서 흔들면서 반응시켰다. 단일가닥 DNA가 코팅된 제올라이트 결정들은 PBS 완충 용액 및 증류수로 여러 번 세척하여 미반응 단일가닥 DNA를 제거한다.
실시예 6: 기질의 전처리
유리 (2.5 x 7.5 ㎠) 등의 기질은 황산 및 과산화수소를 7:3으로 혼합한 피란하 (piranha) 용액이나, 과황산암모늄 ((NH4)2S2O8) 및 황산 용액에 한 시간 이상 담가 두었다. 기질을 회수하여 증류수로 잘 세척하고, 증류수에 넣어서 보관하며, 사용하기 전에 질소를 이용하여 건조시켰다.
실시예 7: 기질의 표면에 연결화합물을 형성하여 항체를 고정시키는 방법
전 처리된 유리 다섯 장을 증류된 톨루엔 용액 (150 ㎖)에 넣고 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.2 ㎖을 주입하여 한 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하고 질소로 여분의 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 아미노기로 코팅된 유리를 증류된 톨루엔 (150 ㎖)에 넣고 테레프탈디카복시알데히드 0.2 ㎎을 넣어 세 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하고 질소로 여분의 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 벤즈알데히드로 코팅된 유리 위에 교정 (calibration)한 마이크로 피펫(eppendorf, 0.1-2.5 ㎕)으로 항체 (IgE 또는 IgG 3 μM, 1 ㎖) PBS 완충액 (pH=7.4)을 1 ㎕씩 일정 간격으로 스팟 (spotting)하였다 (모눈종이 이용, 전체 4 x 14 = 56개의 점). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응시켰다. 항체가 코팅된 유리는 PBS 완충액으로 수회 세척하고 질소를 이용해 용매를 제거하였다.
실시예 8: 기질의 표면에 연결화합물을 형성하여 단일가닥 올리고머 DNA (single-stranded oligomer DNA)를 고정시키는 방법
전 처리된 유리 다섯 장을 증류된 톨루엔 용액 (150 ㎖)에 넣고 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.2 ㎖을 주입하여 한 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하고 질소로 여분의 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 아미노기로 코팅된 유리를 증류된 톨루엔 (150 ㎖)에 넣고 테레프탈디카복시알데히드 0.2 ㎎을 넣어 세 시간 동안 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 톨루엔, 에탄올, 메탄올 순으로 세척하고 질소로 여분의 용매를 제거하였다. 상기 과정에 의하여 벤즈알데히드 코팅된 유리 위에 교정(calibration)한 마이크로 피펫 (eppendorf, 0.1-2.5 ㅅL)으로 단일가닥 DNA (5'-GCTGCGTTGCGTCCTTTCCTcatagttatc-NH2-3', 20 머, 0.3 μM, 2 ㎖) PBS 완충액 (pH=7.4)을 1 ㎕씩 일정 간격으로 스팟 (spotting)하였다 (모눈종이 이용, 전체 4 x 14 = 56개의 점). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응시켰다. 단일가닥 DNA 코팅된 유리는 PBS 완충액으로 수회 세척하여 미반응 올리고머 DNA를 제거하고 질소를 이용해 용매를 제거하였다.
실시예 9: 1,9-디니트로벤질노난 (1,8-Dinitrobenzylnonane
DNP-n-DNP, Mw=490.49)의 제조
1,9-디아미노노난 (1.0 g, 6 mmol) 및 소듐카보네이트 (Na2CO3, 1.3 g, 13 mmol)를 15 ㎖ 물에 첨가하고, 디아민을 용해시키기 위해서 물중탕 하여 50℃ 까지 온도를 올렸다. 2,4-디니트로플로로벤젠 (2.4g, 13 mmol)을 넣고 빠른 속도로 교반시켰다. 50 ㎖의 물을 더 첨가하고 온도를 60℃로 올려서 20분간 방치한 뒤 상온으로 냉각시켰다. 생성된 노란 침전물을 여과해 내고, 묽은 소듐카보네이트 용액 및 묽은 염산의 순으로 세척하였다. 결과물을 80℃ 오븐에서 30분 동안 건조시키고 밀봉건조용기 (desiccator)에 보관하였다. 결과물은 1H NMR로 확인하였다.
Figure 112005035652718-pat00002
실시예 10: 항체 (IgE 또는 IgG)를 고정시킨 기질 위에 각 농도에 해당하는 항원분자 (DNP-n-DNP 또는 마이오글로빈)를 반응시키는 방법
실시예 7의 항체 (IgE 또는 IgG)가 고정된 유리 위에 각 농도(4 x 10-17 ~ 1 x 10-7 M)에 해당하는 항원 (DNP-n-DNP 또는 마이오글로빈)의 PBS 완충액 1 ㎕를 상기 항체가 고정된 위치에 정확하게 스팟하였다 (모눈종이 이용). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응시켰다. 항원이 결합된 유리는 PBS 완충액으로 수회 세척하였다. 특이적 반응 이외의 반응을 최소화시키기 위하 여, BSA 포함 PBS 완충액 (pH=7.4, 1% W/V 우혈청알부민)에 담가서 한시간 가량 흔들어주어 블로킹 (blocking)시켰다. 블로킹된 유리판은 PBS 완충액으로 수회 세척하고 질소로 용매를 제거하였다.
실시예 11: 단일가닥 DNA를 고정시킨 기질 위에 각 농도에 해당하는 상보적인 단일가닥 DNA (40 머)를 반응시키는 방법
실시예 8의 단일가닥 DNA (5'-GCTGCGTTGCGTCCTTTCCTcatagttatc-NH2-3')가 고정된 유리 위에 각 농도 (4 x 10-17 ~ 1 x 10-7 M)에 해당하는 상보적 단일가닥 DNA (5'-AGGAAAGGACGCAACGCAGC TTCTCGCACCCCCCTCAAGT-3')의 PBS 완충액 1 ㎕를 상기 단일가닥 DNA가 고정된 위치에 정확하게 스팟하였다 (모눈종이 이용). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응시켰다. 상보적인 단일가닥 DNA가 결합된 유리는 PBS 완충액으로 수회 세척하였다.
실시예 12: 항원이 고정된 기질위에 항체가 고정된 HC2를 내포한 제올라이트 층을 형성시키는 방법
실시예 4의 항체가 고정된 제올라이트 5 ㎎을 PBS 완충액 (pH = 7.4) 1 ㎖에 균일하게 분산시키고 10분 후에 침전하지 않은 상층 0.5 ㎖ 만을 취하였다. 이것을 실시예 10의 기질 상의 항원이 고정된 지점에 1 ㎕씩 일정 간격으로 스팟하였다 (모눈종이 이용). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응 시켰다. 반응 후 기질을 PBS 완충액 및 이차 증류수로 수회 세척하였다.
실시예 13: 40 머 올리고머가 고정된 기질위에 HC2를 포함하는 20 머 올리고머가 고정된 제올라이트 층을 형성시키는 방법
실시예 5의 20 머 올리고머 DNA (5'-NH2-catagttatcACTTGAGGGGGGTGCGAGAA-3')가 고정된 제올라이트 5 ㎖을 PBS 완충액 (0.3M NaCl, pH=7.4, 10 mM 포스페이트) 1 ㎖에 균일하게 분산시키고 10분 후에, 침전되지 않은 상층 0.5 ㎖ 만을 취하였다. 이것을 실시예 11의 기질 상의 40 머 올리고머가 고정된 지점에 1 ㎕씩 일정 간격으로 스팟하였다 (모눈종이 이용). 습기가 일정하게 유지되는 용기 안에서 상온으로 한 시간 반응시켰다. 반응한 기질은 PBS 완충액 및 이차 증류수로 수회 세척하였다.
실시예 13: 반응이 끝난 후 물리적으로 흡착된 제올라이트를 제거하는 방법
항원-항체, 혹은 DNA 상보 결합과 같은 특이 결합이 아닌 물리적 흡착에 의해 유리표면에 붙어있는 제올라이트의 대부분을 제거하기 위하여 PBS 완충액 (pH=7.4)에서 약한 세기의 초음파(155 W, 28 KHz)를 2-3 분 정도 처리하여 제거하였다 (초음파기 사용).
실시예 15: 형광계 (fluorimeter) 또는 형광 현미경을 이용한 형광세기 분석
상기 실시예에 따라 제조된 시료들은 형광계 (PTI;Photon Technology International LPS-220) 또는 형광 현미경 (Zeiss, Axioskop2, Ex:480 ㎚, Em:560/80 ㎚)을 이용하여 측정하였고, 형광 이미지는 Axiovision Rel.4.3 프로그램을 이용해 분석하였다.
실시예 15: 주사형 전자 현미경 (scanning electron microscope, SEM) 분석
상기 실시예에 따라 제조된 시료 위에 약 15 ㎚ 두께로 백금/팔라듐 코팅을 하고 주사형 전자 현미경 (Hitachi S-4300)을 이용하여 SEM 이미지를 얻었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예 일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 형광물질을 내포하는 제올라이트를 포함하는 형광표지, 이의 제조 방법 및 이를 사용한 분석방법을 제공한다. 본 발명의 형광물질을 내포한 제올라이트 형광표지는 우수한 검출한도 및 강력한 형광세기를 제공하며, 넓은 농도 범위를 검출할 있으므로, 다양한 생물학적 화학적 물질의 정성 또는 정량분석, 질병의 진단에 사용될 수 있다.
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21. (a) Zhu, G.; Qui, S.; Yu, J.; Sakamoto, Y.; Xiao, F.; Xu, R.; Terasaki,O. Synthesis and characterization of high-quality zeolite LTA and FAU single nanocrystals. In Chem. Mater. 10, 1483 (1998) (b) U.S.Patent3702886, 1972. (c) U.S. Patent 4061724, 1977.

Claims (20)

  1. 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표지는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    (a) 형광물질을 내포한 제올라이트;
    (b) 상기 제올라이트에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물; 및
    (C) 상기 제 2 결합 부위에 결합하는 미끼화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광물질은 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    (a) 광발광 (photoluminescent)시 일중항 (singlet) 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 및 양자선(quantum wire);
    (b) 광발광 (photoluminescent)시 삼중항 (triplet) 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 또는 양자선; 및
    (c) 광발광시 원래 일중항 여기상태에서 발광하는 물질이지만 인접한 분자나 중금속 이온에 의해 삼중항 여기 상태로 전이하여 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 및 양자선.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광물질은 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    (ⅰ) 헤미시아닌 (hemicyanine: 4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-docosyl- pyridinium bromide) 계열 화합물; (ⅱ) 메로시아닌(merocyanine; 1-docosyl-4-(4-hydroxystyryl)pyridinium bromide) 계열 화합물; (ⅲ) 니트로스틸벤 (4-heptadecylamido-4'-nitrostilbene) 계열 화합물; (ⅳ) 디스퍼스 오렌지 3 (Disperse Orange 3; 4-(4-nitrophenylazo)aniline) 계열 화합물; (ⅴ) 디스퍼스 오렌지13 (Disperse Orange 13; 4-[4-(phenylazo)-1- naphthylazo]phenol) 계열 화합물; (ⅵ) 디스퍼스 오렌지 25 (Disperse Orange 25; 3-[N-ethyl-4-(4- nitrophenylazo)phenylamino]propionitrile) 계열 화합물; (ⅶ) 디스퍼스 레드 1 (Disperse Red 1; 2-[N-ethyl-4-(4-nitrophenylazo)- phenylamino]ethanol) 계열 화합물; (ⅷ) 디스퍼스 레드 13 (DisperseRed13;2-[4-(2-chloro-4-nitrophenylazo) -N-ethylphenylamino]ethanol 계열 화합물; (ⅸ) 디스퍼스 옐로우 7 (Disperse Yellow 7; 4-[4-(phenylazo)phenylazo]- o-cresol) 계열 화합물; (ⅹ) 메틸 니트로아닐린 (Methyl nitroaniline: MNA), N-(4-니트로페닐)-L-프로리놀 (N-(4-nitrophenyl)-L-prolinol: NPP), (-)-2-α-메틸벤질아미노-5-니트로피리딘 ((-)-2-α-methylbenzylamino-5-nitropyridine: MBA-NP), 3-메틸-4-메톡시-4'-니트로스틸벤 (3-methyl-4-methoxy-4'-nitrostilbene: MMONS), 2-(N-프로리놀)-5-니트로피리딘 (2-(N-prolinol)-5-nitropyridine: PNP), 및 3-메틸-4-니트로피리딘-1-옥사이드 (3-methyl-4-nitropyridine -1-oxide: POM).
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광물질은 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    5,5'-디페닐-2,2'-파라-페닐렌비스옥사졸(5,5'-diphenyl-2,2'-p- phenylenebis(oxazole); POPOP), 9-플로레논(9-fluorenone), 메틸바이올로젠(MV2+), 옥소닌 (oxonine), 파이로닌 (pyronine), 타이로닌 (thionine), 다이페닐헥사트리엔 (diphenylhexatriene: DPH), 로다민 (rhodamine) 계열 화합물, FITC (fluorescein isothiocyanate) 계열 화합물, APC (allophycocyanin), 사이아닌 염료 (cyanine dye), PE (phycoerythrobilin) 및 PerCP (peridinin chlorophyll protein).
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광물질은 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    금속 입자 또는 이를 포함하는 나노쉘 (nanoshell), 나노디스크 (nanodisk), 멀티포드 (multipod), 삼각 나노프리즘 (triangular nanoprism) 및 분지된 구조 (branched structure), 주기율표상에서 원자번호 58-71에 해당하는 란탄족 (lanthanide) 또는 희토류 (rare earth metal) 원소들 (Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu) 및 이들이 도핑된 실리카나 알루미나 나노입자, CdSe, ZnS를 포함하는 코아쉘 (core-shell)형 형광나노입자, Eu2O3 또는 Tb2O3가 도핑된 실리카 또는 알루미나 나노입자, Eu3+ 착물이 내포된 고분자 나노입자, 및 플로레세인디아세테이트 (fluoresceindiacetate: FDA).
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제올라이트는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    (A) 천연 제올라이트;
    (B) MFI 구조를 갖는 제올라이트 및 유사분자체 (ZSM-5, 실리카라이트-1, TS-1 및 전이금속이 부분적으로 치환된 그리고 메탈로-실리카라이트-1);
    (C) MEL 구조를 갖는 제올라이트 및 유사분자체 (ZSM-11, 실리카라이트-2, TS-2 및 전이금속이 부분적으로 치환된 메탈로-실리카라이트-2);
    (D) 제올라이트 A, X, Y, L, 베타, 모르데나이트, 페리에라이트, ETS-4 및 ETS-10;
    (E) 메조다공성 실리카 (MCM 계열, SBA 계열, MSU 계열 및 KIT 계열);
    (F) 수열합성을 통해 생성되는 제올라이트 및 메조다공성 실리카를 포함하는 유사분자체;
    (G)유기-무기 복합 메조세공 구조체 및 층상물질;
    (H)금속이온과 리간드가 3차원적으로 결합하여 규칙적인 나노세공을 형성하는 유기 제올라이트, 유기금속 제올라이트 및 배위화합물 제올라이트라 불리는 나노다공성 물질; 및
    (I) 무기 층상물질.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 목적화합물은 항원, 항체, 효소, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 생물체 내에 존재하는 대사산물 및 화학적으로 합성된 약제인 것을 특징으로 하는 형광표지.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 미끼화합물은 항원, 항체, 효소, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 생물체 내에 존재하는 대사산물 및 화학적으로 합성된 약제 인 것을 특징으로 하는 형광표지.
  10. 제 2 항에 있어서, 상기 연결화합물은 다음으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형광표지:
    화학식 1
    R3Si-L-X
    화학식 2
    Z
    화학식 3
    Y-L-Y
    화학식 4
    R3Si-L-Y
    화학식 5
    HS-L-X
    화학식 6
    HS-L-Y
    상기 식에서, R은 할로겐족 원소, C1-C4 알콕시 또는 알킬기를 나타내고; L은 치환 또는 비치환된 C1-C17 알킬, 아르알킬 또는 아릴기를 나타내고, 이들은 하 나 이상의 산소, 질소, 황 원자를 포함할 수 있으며; X는 할로겐과 같은 이탈기를 나타내며, 단 3 개의 R 중 적어도 하나는 할로겐 또는 알콕시기이고; Y는 히드록실기, 티올기, 아민기, 암모늄기, 술폰기 및 이의 염, 카르복실산 및 이의 염, 산무수물, 에폭시기, 알데하이드기, 에스테르기, 아크릴기, 이소시아네이트기(-NCO), 당류(saccharides) 잔기, 이중결합, 삼중결합, 디엔(diene), 디인(diyne), 숙신이미드기(succinimide), 말레이미드기(maleinimide) 알킬 포스핀, 알킬 아신로 이루어진 군으로 선택되는 유기 관능기, 및 리간드 교환을 할 수 있는 배위 화합물이며; Z는 단백질 A (Protein A, 64 KDa)나 단백질 G(Protein G, 30 KDa) 등의 캡처 리간드를 나타내고, 단, 상기 반응성 기능기는 연결화합물 분자의 양 말단이 아닌 중간에 위치할 수 있다).
  11. 다음의 단계를 포함하는 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지의 제조방법:
    (a) 형광물질을 제올라이트와 반응시켜 형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계;
    (b) 상기 형광물질을 내포하는 제올라이트에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적 화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물과, 상기 (a)에서 얻어진 형광물질을 내포하는 제올라이트를 반응시켜 연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)에서 얻어진 연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 목적 화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물과 반응시켜 미끼화합물-연결화합물-형광물질을 내포하는 제올라이트를 제조하는 단계.
  12. 다음의 단계를 포함하는 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 사용하는 분석 방법:
    (a) 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 목적화합물과 반응시키는 단계; 및
    (b) 내포된 형광물질이 가지는 고유한 여기 파장을 조사하고 방출되는 발광 빛의 세기를 검출하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 형광표지를 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 서던 블롯팅 (Southern blotting) 또는 노던 블롯팅 (Northern blotting)에서 사용하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 방법은 목적화합물과의 반응 전 또는 후에 추가적으로 목적화합물을 고정용 기질 상에 고정시키는 다음의 단계를 포함하는 것을 특 징으로 하는 분석 방법:
    (ⅰ) 고정용 기질에 결합하는 제 1 결합 부위 및 분석하고자 하는 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물′에 결합하는 제 2 결합 부위를 갖는 연결화합물′과 고정용 기질을 반응시켜 연결화합물′-기질을 제조하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 (ⅰ)에서 얻어진 연결화합물′-기질을 목적화합물에 친화성을 갖는 미끼화합물′과 반응시켜 미끼화합물′-연결화합물′-기질을 제조하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 기질은 표면에 히드록시기를 가지는 기질, 메르캅토기와 반응할 수 있는 금속, 주사슬 또는 측사슬에 반응성 관능기를 갖는 중합체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 기질은 다음으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석 방법:
    (A) 실리콘, 알루미늄, 티탄, 주석, 인듐을 포함하는 금속 및 비금속 원소가 단독 또는 복합적으로 포함되어 있는 산화물;
    (B) 티올기 또는 아민기와 결합하는 금속;
    (C) 표면에 연결화합물′과 반응하는 작용기를 가지는 중합체;
    (D) 반도체; 및
    (E) 표면에 히드록실기를 가지는 천연 고분자;
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 웰플레이트 또는 평면의 형태로 가공된 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  18. 형광물질을 내포한 제올라이트를 포함하는 형광표지를 포함하는 분석용 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 키트는 목적화합물의 정성 또는 정량용인 것을 특징으로 하는 분석용 키트.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 키트는 질병 진단용인 것을 특징으로 하는 분석용 키트.
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