KR20170120483A - 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 생체분자를 표지하는 것이 가능한 신규한 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 생체분자를 표지하는 것이 가능한 신규한 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
형광성 염료는 DNA 및 RNA를 비롯한 핵산 및 핵산을 수반하는 다양한 생물학적 샘플의 검출에 사용되어 왔다. 이에 따라, 핵산에 특이적으로 결합 또는 인터컬레이션되어 우수한 형광성을 나타내는 복합체를 형성하는 형광성 핵산 염료에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔다.
핵산에 특이적으로 결합 또는 인터컬레이션되는 염료는 순수 용액, 세포 추출물, 전기영동 겔, 마이크로어레이 칩, 생세포 또는 고정 세포, 사멸 세포 및 환경 샘플 등에 사용될 수 있으며, 각종 샘플 내 DNA 및 RNA의 존재 및 양을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이러한 형광 염료는 게놈 연구 및 의료 진단에 사용되는 대표적인 방법인 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
이 때, 일반적인 end-point PCR의 경우 샘플 핵산의 양에 비례한 정량적인 PCR이 불가능하기 때문에, 증폭 사이클마다 실시간으로 변화하는 형광값을 측정하여 핵산의 양에 대한 정량적 분석이 가능한 실시간 정량적 PCR (real-time PCR 또는 qPCR)이 주로 사용되고 있다.
이러한 qPCR은 PCR 결과물로부터 형광 신호를 측정하여 정량적인 분석을 하게되는데, 형광 신호를 측정하기 위해 방식으로는 형광 프로브(probe)를 이용한 검출법과 인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 검출법 등이 주로 알려져 있다.
형광 프로브를 이용한 검출법은 형광성 염료와 퀀처 염료의 복합체로 표지화된 프로브(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 사용한다. 형광성 염료와 퀀처 염료의 복합체로 표지화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열과 혼성화될 경우, 형광 염료가 복합체로부터 절단되어 분리됨에 따라 형광 신호를 발생시키게 된다.
상술한 형광 프로브를 이용한 검출법은 표적 서열에 대한 선택성과 특이성이 높다는 이점이 있으나, 설계가 복잡하고 다량으로 사용되기에 고가라는 단점이 존재한다.
인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 검출법은 형광성 핵산 염료(dye) 또는 착색제(stain)로서 지칭되는 DNA-결합 형광성 염료에 기초한다. 형광성 핵산 염료는 비교적 간단한 분자로 구성되기 때문에 설계 및 제조가 용이하여 상대적으로 저렴하다는 이점이 있다.
그러나, qPCR에 사용되기 위해서는 몇가지 기준들을 충족시켜야 하기 때문에 일반적으로 알려진 형광성 핵산 염료들이 모두 qPCR에 사용될 수 있는 것은 아니다.
예를 들어, qPCR에 사용되는 형광성 핵산 염료는 저장 및 PCR 중 충분한 안정성을 가져야 하며, PCR에 사용되는 완충액의 pH 범위에 대한 내성을 가져야 한다.
또한, 형광성 핵산 염료는 핵산이 존재하지 않을 경우, 형광 신호를 발생시키지 않거나 아주 미약한 형광 신호만을 발생시켜야 하며, 핵산이 존재할 경우 상대적으로 강한 형광 신호를 발생시켜야 한다.
종래 핵산의 표지에 가장 많이 사용되는 염료로는 브로민화 에티듐(ethidium bromide)이 있다.
[브로민화 에티듐]
브로민화 에티듐은 예를 들어 전기영동이 완료된 겔을 염색하기 위해 사용(사후-염색)되며, 전기영동 전 겔의 제조시 미리 첨가하여 전기영동과 함께 염색이 이루어지기 위해 사용(사전-염색)된다. 또한, 브로민화 에티듐은 400 nm 이하의 UV 광을 발생시키며, DNA와 결합할 시 약 620 nm의 발광 스펙트럼을 가지기 때문에 DNA의 존재 및 위치를 시각적으로 용이하게 확인할 수 있다는 이점이 있다.
상술한 브로민화 에티듐의 이점에도 불구하고 브로민화 에티듐은 돌연변이 원(mutagen) 및 발암물질(carcinogen)에 해당하기 때문에 사용시 상당한 주의를 필요로 한다는 단점이 있다. 특히, 브로민화 에티듐은 DNA와 RNA의 합성을 방해함으로써 DNA 복제를 저해함에 따라 돌연변이를 유발할 수 있다는 연구 결과도 보고된 바 있다.
이에 따라, 비유전독성을 나타내는 대체 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ가 주로 사용되었다. 다만, SYBR® green Ⅰ는 PCR 공정을 억제하기 때문에 단순히 SYBR® green Ⅰ의 농도를 증가시킨다 하여 보다 높은 최대 형광 신호를 얻을 수 없다는 한계가 있다.
즉, SYBR® green Ⅰ의 농도가 PCR 공정을 유의적으로 억제하기 시작하는 기준 농도에 도달할 때까지는 SYBR® green Ⅰ의 농도에 비례하여 형광 신호의 강도가 증가하나, 이후부터는 SYBR® green Ⅰ의 농도의 추가적인 증가에 따라 DNA 증폭이 감소된다. 이에 따라, 관찰되는 형광 신호의 강도가 감소하거나, 소정의 강도 이상의 형광 신호를 관찰하기 위한 역치 사이클 수(threshold cycle)가 증가하게 된다.
또한, SYBR® green Ⅰ은 특정 화학적 환경 하에서 불안정하기 때문에 완충액 내에서 수일 내 상당량이 분해된다고 알려져 있다.
상술한 기술적 배경 하에서 본 발명은 인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 qPCR에 사용하기 적합한 인터컬레이팅 형광 염료로서 메로시아닌계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 브로민화 에티듐과 달리 비-유전독성임의 메로시아닌계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 역치 사이클 수를 증가시키지 않으면서 핵산 농도에 비례하여 형광 신호의 강도를 증가시킬 수 있는 메로시아닌계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상술한 메로시아닌계 화합물을 포함하는 염료, 키트 및 조영제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
아울러, 본 발명은 상술한 메로시아닌계 화합물을 이용한 핵산의 존부 또는 세포의 생존도의 결정 및 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 메로시아닌(merocyanine)계 화합물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
여기서,
Ar은 치환 또는 비치환된 방향족환이며,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 황, 산소, 셀레늄, NR8 및 -CR8=CR9-로부터 선택되며,
R1 내지 R9는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR10), 알데하이드, 에스터(-COOR10), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택되며,
Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)가 케톤기(-COR10) 또는 에스터기(-COOR10)일 때, R10은 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 아미노알킬로부터 선택되며,
Rb (여기서, b는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수)가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있으며,
m은 1 내지 3의 정수이며,
L은 3 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커이며,
Z는 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가지며,
화학식 1로 표시되는 구조는 하나 또는 두 개의 -L-Z 작용기를 가진다.
여기서, 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단으로서, Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, -L-Z 작용기는 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되거나 이외의 형광단 구조를 가질 수 있다.
다른 변형예에 따르면, A1 내지 A10 중 하나는 하기의 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
여기서, R11은 탄소, 질소 또는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, R12는 하기의 화학식 4로 표시된다.
[화학식 4]
-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-]y13-A14-L3-Z
여기서, L3은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A11 내지 A14는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x11 내지 x13은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y11 내지 y13는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 메로시아닌계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 염료가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 메로시아닌계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 키트가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 메로시아닌계 화합물을 포함하는 조영제 조성물이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 전기영동 키트가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 샘플 내 핵산의 존부를 결정하는 방법 또는 정량하는 방법이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 샘플 내 세포의 생존도를 분석 또는 정량하는 방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 메로시아닌계 화합물은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 가시광선 영역에서 형광 신호를 나타낼 수 있으며, 비-유전독성을 나타내는 바, 이를 기반으로 본 발명에 따른 메로시아닌계 화합물은 생체분자 표지용 염료, 생체분자 표지용 키트 및 조영제 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 상용화된 염료인 SYBR® safe의 전기영동 결과를 나타낸 것이며, 도 2 내지 도 10은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 상용화된 염료인 SYBR® safe의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, 도 12 및 도 13은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 상용화된 염료인 SYBR® safe의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이며, 도 15 내지 도 17은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이다.
도 18은 상용화된 세포 사이클 분석 염료인 propidium iodide를 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 19는 화합물 6을 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 형광 염료로서 화합물 38을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 21은 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 22는 형광 염료로서 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이다.
도 23 내지 도 25는 화합물 38의 광퇴색 실험 결과는 나타낸 그래프이며, 도 26 내지 도 28은 SYBR®green Ⅰ (Invitrogen사 제품)의 광퇴색 실험 결과를 나타낸 그래프이며, 도 29 내지 도 31은 EvaGreenTM (Biotium사 제품)의 광퇴색 실험 결과를 나타낸 그래프이고,
도 32 및 도 33은 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ 및 화합물 38을 사용한 qPCR의 증폭 곡선 및 qPCR의 용융 곡선(melting curve)을 나타내는 나타낸 그래프이고,
도 34는 형광 염료로서 화합물 38을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이고,
도 35는 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이고,
도 36은 형광 염료로서 EvaGreenTM 을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이며,
도 37 내지 도 42는 형광 염료로서 화합물 36, 화합물 38, 화합물 39 및 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 증폭 곡선 및 용융 곡선(melting curve)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 상용화된 염료인 SYBR® safe의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, 도 12 및 도 13은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 상용화된 염료인 SYBR® safe의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이며, 도 15 내지 도 17은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이다.
도 18은 상용화된 세포 사이클 분석 염료인 propidium iodide를 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 19는 화합물 6을 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 형광 염료로서 화합물 38을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 21은 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 22는 형광 염료로서 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이다.
도 23 내지 도 25는 화합물 38의 광퇴색 실험 결과는 나타낸 그래프이며, 도 26 내지 도 28은 SYBR®green Ⅰ (Invitrogen사 제품)의 광퇴색 실험 결과를 나타낸 그래프이며, 도 29 내지 도 31은 EvaGreenTM (Biotium사 제품)의 광퇴색 실험 결과를 나타낸 그래프이고,
도 32 및 도 33은 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ 및 화합물 38을 사용한 qPCR의 증폭 곡선 및 qPCR의 용융 곡선(melting curve)을 나타내는 나타낸 그래프이고,
도 34는 형광 염료로서 화합물 38을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이고,
도 35는 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이고,
도 36은 형광 염료로서 EvaGreenTM 을 사용한 형광 염료 농도에 따른 qPCR의 증폭 곡선을 나타낸 그래프이며,
도 37 내지 도 42는 형광 염료로서 화합물 36, 화합물 38, 화합물 39 및 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 증폭 곡선 및 용융 곡선(melting curve)을 나타낸 그래프이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
신규한
메로시아닌계
화합물
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 메로시아닌(merocyanine)계 화합물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
여기서, Ar은 치환 또는 비치환된 방향족환이고, 예를 들면,벤조(benzo) 또는 나프토(naphto)기이며, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 황, 산소, 셀레늄, NR8 및 -CR8=CR9-로부터 선택될 수 있으며, m은 1 내지 3의 정수이다.
R1 내지 R9는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR10), 알데하이드, 에스터(-COOR10), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택될 수 있다.
Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 10개 이하(예를 들어, C1-C10의 직쇄, C3-C10의 분쇄), 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 3개 이하의 탄소 원자를 가진다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o- 터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3-페난트레닐, 4-페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로 아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로 아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로 아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)가 케톤기(-COR10) 또는 에스터기(-COOR10)일 때, R10은 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 아미노알킬로부터 선택될 수 있다.
Rb (여기서, b는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수)가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
본 발명의 다양한 변형예에 따르면, Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)는 적어도 하나의 -L-Z 작용기를 가질 수 있다.
여기서, L은 화학식 1로 표시되는 구조와 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단인 Z를 연결하는 L은 3 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커이고, 구체적으로, 8 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커이다.
또한, Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, -L-Z 작용기는 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-Z
여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되거나 이외의 형광단 구조를 가질 수 있다.
다른 변형예에 따르면, A1 내지 A10 중 하나는 하기의 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
여기서, R11은 탄소, 질소 또는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, R12는 하기의 화학식 4로 표시된다.
[화학식 4]
-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-]y13-A14-L3-Z
여기서, L3은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A11 내지 A14는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x11 내지 x13은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y11 내지 y13는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물은 카운터 이온을 더 포함하는 구조를 가질 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 메로시아닌계 화합물의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물은 다음과 같다.
[화합물 1]
[화합물 2]
[화합물 3]
[화합물 4]
[화합물 5]
[화합물 6]
[화합물 7]
[화합물 8]
[화합물 9]
[화합물 10]
[화합물 11]
[화합물 12]
[화합물 13]
[화합물 14]
[화합물 15]
[화합물 16]
[화합물 17]
[화합물 18]
[화합물 19]
[화합물 20]
[화합물 21]
[화합물 22]
[화합물 23]
[화합물 24]
[화합물 25]
[화합물 26]
[화합물 27]
[화합물 28]
[화합물 29]
[화합물 30]
[화합물 31]
[화합물 32]
[화합물 33]
[화합물 34]
[화합물 35]
[화합물 36]
[화합물 37]
[화합물 38]
[화합물 39]
생체분자 표지용 염료,
키트
및 조영제 조성물
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물이 제공될 수 있다.
또한, 필요에 따라, 생체분자 표지용 키트는 타겟 생체분자인 핵산 내 인터컬레이션을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 시아닌계 화합물에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 염료 내에서 이량체 및/또는 삼량체 형태의 메로시아닌계 화합물들은 분자간 상호작용에 의해 서로 응집된 상태로 존재할 수 있다.
이 때, 이량체 및/또는 삼량체 형태의 메로시아닌계 화합물은 응집된 상태에서는 형광 신호를 발생시키지 않는다. 반면, 생체분자(예를 들어, 핵산)가 존재할 경우, 응집된 상태로 존재하는 이량체 및/또는 삼량체 형태의 메로시아닌계 화합물들은 서로 분리되어 핵산 내 인터컬레이션됨에 따라 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
즉, 인터컬레이션 가능한 생체분자의 존재 여부가 본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 염료의 소광자(quencher)로서 역할하게 된다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 키트는 생체분자인 핵산을 크기별로 분리한 후 생체분자 표지용 염료 내 메로시아닌계 화합물이 핵산 내 인터컬레이션됨에 따라 핵산을 표지하도록 구성된 전기영동 키트로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 전기영동 키트는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물; 완충액, 겔 매트릭스, 겔 매트릭스를 형성하기 위한 적어도 하나의 물질, 표면 또는 표면을 형성하기 위한 적어도 하나의 물질; 및 사용 설명서;를 포함하고, 핵산이 샘플 내 존재할 경우, 상기 매트릭스 또는 상기 표면에 고정되는 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 전기영동 키트일 수 있다.
상기 표면은 고체 표면, 막 표면, 유리 표면, 플라스틱 표면 또는 폴리실리콘 표면일 수 있다.
상기 매트릭스는 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 및 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으며, 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
또한, 상기 실시예에 따른 조영제 조성물은 경구 또는 비경구 방식으로 투여되기 위해 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물 외에 약학적으로 허용하는 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체의 구체적인 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 있다.
이하에서는 상술한 생체분자 표지용 염료 또는 생체분자 표지용 키트를 이용한 생체분자의 표지 방법에 대하여 설명하도록 한다.
생체분자 표지용 염료를 이용한 생체분자의 표지 방법
본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물로 생체분자를 표지하는 방법으로는 표지된 고체 또는 반고체 상태의 생체분자의 형광을 측정하는 표지 방법이 가능한 모든 생체분자의 표지에 적용될 수 있다.
종래의 형광 염료 대신 메로시아닌계 화합물을 사용함으로써, 고감도로 화학적으로 안정적이고 조작성이 뛰어난 표지 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 타겟 생체분자에 메로시아닌계 화합물을 인터컬레이션시켜 생체분자를 표지하는 방법 등이 구현될 수 있다. 또한, 이를 이용하여 액 또는 겔 내 생체분자의 정량화, 생세포 또는 사멸 세포 내 생체분자의 염색, 및 마이크로어레이에서의 생체분자 검출 및 정량화 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 메로시아닌계 화합물을 이용하여 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산이 샘플 내 존재할 경우, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물에 핵산을 노출시켜, 상기 메로시아닌계 화합물이 핵산 내 인터컬레이션되어 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 메로시아닌계 화합물의 형광 또는 그것의 부재를 결정하는 단계;를 포함하는 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 있을 수 있다.
상기 메로시아닌계 화합물은 고감도로 화학적으로 안정하여 샘플 내에 존재하는 핵산과 용이하게 인터컬레이션되어 복합체를 형성한다. 그리고, 상기 형성된 복합체에 충분한 파장의 광을 조사하여, 방출된 형광 신호로 샘플 내의 핵산의 존부를 쉽게 결정할 수 있다.
상기 형광 신호는 예를 들어 플레이트 리더, 현미경, 플루오로미터, 양자 카운터 및 유세포분류기와 같은 각종 기기 또는 육안을 통해 검출될 수 있다.
또한, 상기 메로시아닌계 화합물을 이용하여 증폭된 표적 핵산의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
구체적으로, 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법으로서, 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약, 및 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; 상기 반응 혼합물을 증폭된 표적 핵산의 형성에 적합한 조건 하에서 중합 반응 시키는 단계; 상기 반응 혼합물을 빛으로 조명하는 단계; 및 상기 반응 혼합물로부터 형광 방출을 검출하는 단계;를 포함하는 증폭된 표적 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법일 수 있다.
상기 반응 혼합물은 표적 핵산 외에 증폭 효소들, 표적 핵산 서열 증폭에 충분한 프라이머들 및 데옥시뉴클레오시드 삼인산염과 같은 시약 등을 포함할 수 있다.
상기 메로시아닌계 화합물은 PCR 반응의 억제 없이 사용 가능하므로, 증폭된 표적 핵산의 존부를 결정하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 상기 메로시아닌계 화합물을 이용하여 샘플 내 핵산을 정량할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 혼합물과 핵산을 포함하는 샘플을 혼합하는 단계; 상기 메로시아닌계 화합물이 상기 샘플 내 핵산과 인터컬레이션하여 복합체를 형성하고, 형광 신호를 발생시키도록 상기 샘플과 상기 혼합물을 충분한 시간 동안 배양(incubating) 하는 단계; 및 감지되는 형광 신호와 정해진 핵산 량의 형광 표준 특성을 비교하여 샘플 내 핵산을 정량하는 단계;를 포함하는 샘플 내 핵산을 정량하는 방법일 수 있다.
상기 샘플 내의 핵산의 량은 특정 핵산 량의 형광 표준 특성을 기초로 감지되는 형광 신호와 비교하여 정량화 할 수 있다.
핵산의 양과 형광 강도 간의 실질적으로 일차적인 관계가 핵산의 정량화를 위해 사용될 수 있거나, 세포 추출물이 사용될 경우에는 세포 수 평가를 위해 사용될 수 있다. 일 예로, 핵산은 블롯(blot) 또는 겔과 같은 불활성 매트릭스에 함침되거나, 마이크로어레이 칩 또는 임의의 다른 고체 표면과 같은 고체 표면에 부착될 수 있다. 이때, 상기 메로시아닌계 화합물을 포함하는 용액을 핵산-포함 매트릭스의 표면, 또는 마이크로어레이 칩의 표면 또는 다른 고체 표면에 도포하고, 염료-핵산 복합체가 형성하도록 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행된다.
또한, 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 타겟 세포 내에 포함된 생체분자에 메로시아닌계 화합물을 인터컬레이션시켜 타겟 세포의 생존도 및 타겟 세포를 정량하는 방법 등이 구현될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 혼합물과 사멸 세포를 포함하는 샘플을 혼합하는 단계; 상기 메로시아닌계 화합물이 상기 샘플 내 사멸 세포와 인터컬레이션하여 복합체를 형성하고, 형광 신호를 발생시키도록 상기 샘플과 상기 혼합물을 충분한 시간 동안 배양(incubating) 하는 단계; 및 감지되는 형광 신호와 정해진 사멸 세포 량의 형광 표준 특성을 비교하여 샘플 내 사멸 세포를 정량하는 단계;를 포함하는 샘플 내 세포의 생존도를 정량하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 메로시아닌계 화합물은 세포, 즉 생세포를 투과하지 않으나, 사멸 세포는 투과할 수 있다. 이와 같은 특성을 이용하여, 상기 메로시아닌계 화합물이 사멸 세포의 막을 통과하여 막 내의 핵산과 복합체를 형성하도록 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행된다.
또 다른 구체예로서, 사멸 세포와 인터컬레이션하는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물 및 세포와 인터컬레이션할 수 있는 상기 메로시아닌계 화합물 외의 화합물을 포함하는 수용액과 세포를 포함하는 샘플을 혼합하는 단계; 상기 메로시아닌계 화합물 및 그 외의 상기 화합물과 인터컬레이션된 세포를 포함하는 샘플을 빛으로 조명하는 단계; 및 상기 샘플로부터 형광 방출을 검출하는 단계;를 포함하고, 상기 샘플로부터 방출된 상기 형광은 상기 메로시아닌계 화합물 및 그 외의 상기 화합물이 함께 샘플 내 세포와 인터컬레이션하여 세포간에 형광 반응으로 발생하고, 방출된 상기 형광은 상기 메로시아닌계 화합물만의 형광 반응으로 발생한 형광과는 다른 것으로서, 샘플 내 세포의 생존도를 분석하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 메로시아닌계 화합물은 사멸 세포와 인터컬레이션할 수 있다. 구체적으로, 상기 메로시아닌계 화합물은 사멸 세포를 투과하여 사멸 세포 내의 핵산과 인터컬레이션할 수 있다.
반면, 상기 메로시아닌계 화합물 외의 화합물, 예를 들어 Acridine orange (AO)
은 세포, 즉 사멸 세포 뿐만 아니라 생세포와도 인터컬레이션 할 수 있다. 즉, Acridine orange (AO)은 사멸 세포 뿐만 아니라 생세포의 막을 투과하여 세포 내의 핵산과 인터컬레이션할 수 있다.
상기 메로시아닌계 화합물 및 메로시아닌계 화합물 외의 화합물과 핵산이 인터컬레이션하여 형성된 복합체로부터 발생한 형광 신호를 측정하여 샘플 내의 세포의 생존도를 분석할 수 있다. 구체적으로, 상기 메로시아닌계 화합물과 핵산의 복합체가 발생시키는 형광 신호의 파장과 그 외의 화합물과 핵산의 복합체가 발생시키는 형광 신호의 파장을 측정 및 구분하여 세포의 생존도를 분석할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 특정을 이용한 샘플 내 세포의 생존도를 분석하는 키트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물; 및 사용설명서를 포함하고, 사멸 세포가 샘플 내 존재할 경우, 상기 메로시아닌계 화합물과 인터켈레이션하여 형광이 검출되는 샘플 내 세포의 생존도를 분석하는 키트일 수 있다.
아울러, 메로시아닌계 화합물로 표지한 생체분자를 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA
마이크로어레이법
DNA 마이크로어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응(즉, 메로시아닌계 화합물이 표적 핵산 내 인터컬레이션)시켜 표지하는데, 이 때 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화한 후, 형광 염료가 표적 핵산 내로 인터컬레이션되도록 함으로써 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
PCR
법
PCR법은, 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 염료로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 염료를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다.
또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 표지용 염료를 결합하여, 표지용 염료가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다.
이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다.
통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확율로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 표지용 염료로 표지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 표지용 염료를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다.
또한, 터미네이터 대신에 미리 표지용 염료로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH (in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 표지용 염료로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광 강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다.
이를 위해, 형광 염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다.
예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 표지용 염료를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다.
뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 표지용 염료를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지용 염료를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다.
RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 표지용 염료로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다.
제조예
제조예
1. 화합물 1의 합성
(1) 중간체 1 및 중간체 2의 합성
250 mL 1구 반응기에 2-메틸티오벤조티아졸(2-(methylthio)benzothiazole) (11.115 g, 0.0614 mol)과 아세토나이트릴(110 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 Oxolane, 즉 2-아이오도에틸-1,3-다이옥소란(21 g, 0.0921 mol)을 넣고 환류 하에 40시간 교반한 후 냉각한 다음 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 1 (14 g, 0.0523 mol, 85%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.45-7.48 (m, 1H), 7.38-7.43 (m, 1H), 7.26-7.32 (m, 2H), 5.00 (t, J=4.0 Hz, 1H), 4.54-4.58 (m, 2H), 3.89-4.02 (m, 4H), 2.18-2.23 (m, 2H)
이어서, 100 mL 1구 반응기에 중간체 1 (2.37 g, 0.01 mol)과 아세토나이트릴(30 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 반응기에 아이오도메탄(methyl iodide, MeI)(1.26 g, 0.03 mol)을 넣고 환류 하에 12시간 교반한 후 냉각한 다음 농축하고 에틸아세테이트(50mL)을 넣고 고체를 석출시켰다. 석출된 고체를 여과 및 진공 건조하여 중간체 2 (3 g, 0.00733 mol, 73%)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.51 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.92 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.76 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.64 (t, J=8.0H, 1H), 5.03 (t, J=3.6Hz, 1H), 4.78 (t, J=7.2Hz, 2H), 3.84-4.00 (m, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.38-2.42 (m, 2H)
(2) 중간체 3의 합성
50 mL 1구 반응기에 4-메틸-5-퀴놀린올(2 g, 0.0125mol), 에틸 6-아이오도헥사노에이트(10 g, 0.0375 mol), 다이메틸포름아마이드(4 mL)을 넣고 120℃에서 12시간 교반한 다음 냉각 후 농축하고 컬럼 정제하여 중간체 3 (3.5 g, 0.00828 mol, 67%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.19 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.952 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.73-7.77 (m, 2H), 7.22 (d, J=7.6Hz, 1H), 4.85 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.01 (q, J=7.6Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 2.35 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.89-1.93 (m, 2H), 1.55-1.61 (m, 4H), 1.12 (t, J=6.8Hz, 3H)
(3) 중간체 4의 합성
100 mL 1구 반응기에 중간체 2 (1.55 g, 3.814 mmol), 중간체 3 (1.64 g, 3.814 mmol) 및 다이클로로메탄(30 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 트리에틸아민(1.15 g, 11.442 mmol)을 넣고 상온에서 12시간 동안 교반한 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 4 (1.5 g, 2.263 mmol, 59%)를 수득하였다.
(4) 중간체 5의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 4 (1.5 g, 2.263 mmol), 클로로포름(45 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반한 후 반응기에 50% 황산 수용액(9 mL)을 넣고 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 물(10 mL)을 넣고 다이클로로메탄(2 x 50 mL)으로 추출하여 유기층을 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 5 (0.4 g, 0.666 mmol, 29%)을 합성하였다. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.35 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.91 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.62-7.65 (m, 2H), 7.54 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.42-7.44 (m, 1H), 7.36 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.11 (d, J=8.0Hz, 1H), 5.21-5.25 (m, 1H), 4.70-4.75 (m, 1H), 4.45-4.60 (m, 2H), 4.13-4.20 (m, 1H), 2.87-2.92 (m, 1H), 2.52-2.56 (m, 1H), 2.33 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.94-2.02 (m, 2H), 1.66-1.73 (m, 2H), 1.46-1.52 (m, 2H)
(5) 화합물 1의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 5 (200 mg, 0.35 mmol), 다이메틸포름아마이드 (4 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반한 후 반응기에 TSTU (106 mg, 0.35 mmol), 트리에틸아민(50 μl, 0.35 mmol)을 넣고 상온에서 15 동안 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민(50 μl, 0.35 mmol), 2,2'-옥시비스에틸아민(13 μl, 0.119 mmol)을 넣고 상온에서 3일 동안 교반한 후 에틸아세테이트(40 mL)에 반응액을 부어 고체를 석출시켰다. 석출된 고체는 여과 및 컬럼정제하여 화합물 1 (110 mg, 0.0906 mmol, 26%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=6.8Hz, 2H), 7.77-7.80 (m, 2H), 7.68-7.73 (m, 2H), 7.51-7.54 (m, 4H), 7.41 (t, 2H, J=8.8Hz, 2H), 7.29-7.35 (m, 2H), 7.16-7.20 (m, 2H), 7.01 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.04-5.11 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.32-4.43 (m, 4H), 4.00-4.09 (m, 2H), 3.44-3.47 (m, 4H), 3.30-3.32 (m, 4H), 2.79-2.82 (m, 2H), 2.35-2.45 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.85-1.92 (m, 4H), 1.61-1.69 (m, 4H), 1.39-1.45 (m, 4H)
제조예
2. 화합물 2 내지 화합물 4의 합성
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 각각 4,7,10-트리옥사-1,13-트라이데칸다이아민, 1,2-비스(2-아미노에톡시)에탄, 1,11-다이아미노-3,6,9-트리옥사운데칸을 사용하여 화합물 2, 화합물 3 및 화합물 4를 합성하였다.
화합물 2 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77 (t, J=8.0Hz, 2H), 7.69-7.73 (m, 2H), 7.50-7.55 (m, 4H), 7.41 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.30-7.32 (m, 2H), 7.17-7.20 (m, 2H), 7.01 (d, J=8.0Hz, 2H), 5.05-5.10 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.34-4.45 (m, 4H), 4.04-4.10 (m, 2H), 3.54-3.56 (m, 4H), 3.48-3.50 (m, 4H), 3.42 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.18 (t, J=6.8Hz, 4H), 2.79-2.83 (m, 2H), 2.37-2.44 (m, 2H), 2.16 (t, J=6.8Hz, 4H), 1.85-1.92 (m, 4H), 1.60-1.70 (m, 8H), 1.37-1.42 (m, 4H)
화합물 3 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.26 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.77-7.79 (m, 2H), 7.69-7.72 (m, 2H), 7.52-7.54 (m, 4H), 7.42 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.17-7.20 (m, 2H), 7.02 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.05-5.12 (m, 2H), 4.60-4.64 (m, 2H), 4.33-4.43 (m, 4H), 4.01-4.10 (m, 2H), 3.54-3.57 (m, 4H), 3.50 (t, J=6.4Hz, 4H), 3.32 (t, J=6.4Hz, 4H), 2.80-2.83 (m, 2H), 2.40-2.43 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.86-1.92 (m, 4H), 1.63-1.68 (m, 4H), 1.42-1.46 (m, 4H)
화합물 4 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.27 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.80 (m, 2H), 7.69-7.73 (m, 2H), 7.52-7.54 (m, 4H), 7.42 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.18-7.20 (m, 2H), 7.02 (m, J=7.6Hz, 2H), 5.06-5.11 (m, 2H), 4.60-4.64 (m, 2H), 4.35-4.44 (m, 4H), 4.05-4.08 (m, 2H), 3.54-3.58 (m, 8H), 3.48 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.32 (t, J=4.8Hz, 4H), 2.80-2.84 (m, 2H), 2.39-2.43 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.87-1.94 (m, 4H), 1.63-1.40 (m, 4H), 1.40-1.46 (m, 4H)
제조예
3. 화합물 5의 합성
제조예 3은 제조예 1의 중간체 1의 생성시 2-메틸티오벤조티아졸 대신 5-클로로-2-메틸티오벤조티아졸을 사용한 것을 제외하고 제조예 1과 동일한 방법에 따라 화합물 5를 합성하였다. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.34 (d, J=6.4Hz, 2H), 7.71-7.77 (m, 4H), 7.58 (m, 2H) 7.46 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.27 (t, J=7.2Hz, 2H), 7.20 (t, J=6.8Hz, 2H), 7.05 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.07 (m, 2H), 4.55-4.58 (m, 2H), 4.41 (m, 4H), 400-4.03 (m, 2H), 3.46 (m, 4H), 3.29 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.40-2.42 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 1.90 (m, 4H), 1.65 (m, 4H), 1.41 (m, 4H)
제조예
4. 화합물 6 내지 화합물 8의 합성
제조예 3의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 각각 1,2-비스(2-아미노에톡시)에탄, 1,11-다이아미노-3,6,9-트리옥사운데칸, 4,7,10-트리옥사-1,13-트라이데칸다이아민을 사용하여 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8을 합성하였다.
화합물 6 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.33-8.36 (m, 2H), 7.74-7.78 (m, 4H), 7.62-7.64 (m, 2H), 7.46-7.51 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 2H), 7.25 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.05-7.07 (m, 2H), 5.09-5.12 (m, 2H), 4.50-4.61 (m, 2H), 4.42-4.47 (m, 4H), 4.01-4.05 (m, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.46-3.48 (m, 4H), 3.29 (m, 4H), 2.80-2.82 (m, 2H), 2.41-2.45 (m, 2H), 2.17-2.20 (m, 4H), 1.89-1.92 (m, 4H), 1.62-1.66 (m, 4H), 1.40-1.42 (m, 4H)
화합물 8 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.36-8.38 (m, 2H), 7.75-7.82 (m, 4H), 7.62-7.65 (m, 2H), 7.49-7.54 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 2H), 7.27 (t, J=7.2Hz, 2H), 7.08-7.10 (m, 2H), 5.11-5.17 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.44-4.53 (m, 4H), 4.05-4.08 (m, 2H`), 3.56-3.59 (m, 4H), 3.50-3.53 (m, 4H), 3.45 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.20 (t, J=6.8Hz, 4H), 2.82-2.84 (m, 2H), 2.44-2.49 (m, 2H), 2.19 (t, J=6.4Hz, 4H), 1.90-1.97 (m, 4H), 1.63-1.72 (m, 8H), 1.40-1.65 (m, 4H)
상기 제조예 1 내지 4에서 얻어진 화합물 1 내지 화합물 8과 시판되는 SYBR® safe의 흡수 스펙트럼(λabs), 발광 스펙트럼(λem), 몰 흡광계수(ε) 및 양자 효율을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
상기 제조예 1 내지 4에서 얻어진 화합물 1 내지 화합물 8은 SYBR® safe과 유사하거나 우수한 몰 흡광계수를 나타내며, 특히 양자 효율 측면에서도 상당히 우수한 것을 확인할 수 있다.
제조예
5. 화합물 9 내지 화합물 20의 합성
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 각각 1,6-다이아미노헵테인, 1,8-다이아미노옥테인, 1,10-다이아미노데케인, 1,12-다이아미노도데케인, 3,3-다이아미노-N-메틸다이프로필아민을 사용하여 화합물 9 내지 화합물 13을 합성하였다.
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 하기의 화학식으로 표시되는 아민 브릿지를 사용하여 화합물 14를 합성하였다.
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 피페라진, 2,6-다이아미노피리딘, p-페닐다이아민, 1,4-다이아미노나프탈렌을 사용하여 화합물 15 내지 화합물 18을 합성하였다.
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 하기의 화학식으로 표시되는 아민 브릿지를 사용하여 화합물 19를 합성하였다.
제조예 1의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 하기의 화학식으로 표시되는 아민 브릿지를 사용하여 화합물 20을 합성하였다.
제조예
6. 화합물 36의 합성
(1) 중간체 1 및 중간체 2의 합성
1L 1구 반응기에 Oxolane, 즉, 2-브로모에틸-1,3-다이옥소란(52.6 g, 0.290 mol), 포타슘아이오다이드(64.3 g, 0.387 mol), 아세토나이트릴(320 mL)을 넣고 50?에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 2-메틸싸이오벤조옥사졸(2-(methylthio)benzoxazole)(32.0 g, 0.193 mol)을 넣고 환류 하에 20시간 동안 교반한 다음 냉각 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 1 (30.2 g, 0.120 mol, 62%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.40-7.28 (m, 4H), 4.93 (t, J=4.4Hz, 1H), 4.33 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.10-3.90 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 2H), 2.22-2.00 (m, 2H)
이어서, 50 mL 1구 반응기에 중간체 1 (1.0 g, 3.979 mmol), 메틸 토실레이트(methyl tosylate, MeOTs)(0.9 mL, 5.968 mmol), 다이메틸포름아마이드(2 mL)를 120?에서 1시간 동안 교반한 다음 냉각 후 반응기에 에틸 아세테이트를 넣고 상온에서 교반하였다. 그리고 나서, 상층액을 버리고 진공 건조시켜 중간체 2 (0.9 g, 2.057 mmol, 52%)를 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.95-7.89 (m, 2H), 7.73-7.66 (m, 4H), 7.22 (d, J=7.8Hz, 2H), 4.96 (t, J=3.6Hz, 1H), 4.54 (t, J=6.6Hz, 2H), 3.93-3.77 (m, 4H), 3.19 (s, 3H), 2.44-2.35 (m, 5H)
(2) 중간체 3의 합성
50 mL 1구 반응기에 4-메틸-5-퀴놀린올(2 g, 0.0125mol), 에틸 6-아이오도헥사노에이트(10 g, 0.0375 mol), 다이메틸포름아마이드(4 mL)을 넣고 120℃에서 12시간 교반한 다음 냉각 후 농축하고 컬럼 정제하여 중간체 3 (3.6 g, 0.00828 mol, 67%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.19 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.952 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.73-7.77 (m, 2H), 7.22 (d, J=7.6Hz, 1H), 4.85 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.01 (q, J=7.6Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 2.35 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.89-1.93 (m, 2H), 1.55-1.61 (m, 4H), 1.12 (t, J=6.8Hz, 3H)
(3) 중간체 4의 합성
100 mL 1구 반응기에 중간체 2 (1.87 g, 4.292 mmol), 중간체 3 (1.45 g, 4.292 mmol) 및 다이클로로메탄(20 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 트리에틸아민(triethylamine, TEA)(0.868 g, 8.584 mmol)을 넣고 상온에서 12시간 동안 교반한 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 4를 수득하였다.
(4) 중간체 5의 합성
500 mL 1구 반응기에 중간체 4 (8.6 g, 0.0133 mmol), 50% 황산 수용액(50 mL), 클로로포름(250 mL)을 넣고 상온에서 교반하였다. 이어서, 반응기에 물(10 mL)을 넣고 다이클로로메탄(2 x 50 mL)으로 추출하여 유기층을 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 5 (0.37 g, 0.665 mmol, 5%)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.80 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.69 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.53-7.47 (m, 3H), 7.44-7.40 (m 1H), 7.08 (d, J=8.0Hz, 1H), 5.31-5.27 (m, 1H), 4.57-4.50 (m, 2H), 4.47-4.40 (m, 1H0, 4.18-4.10 (m, 1H), 2.87-2.83 (m, 1H), 2.57-2.47 (m, 1H)m 2.31 (s, J=7.2Hz, 2H), 1.99-1.92 (m, 2H), 1.71-1.64 (m, 2H), 1.51-1.43 (m, 2H)
(5) 화합물 36의 합성
250 mL 1구 반응기에 중간체 5 (123 mg, 0.220 mmol), TBTU (106 mg, 0.330 mmol), 다이메틸포름아마이드(2 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반한 후 반응기에 트리에틸아민(92 μl, 0.660 mmol), 2,2'-옥시비스에틸아민(23 μl, 0.220 mmol)을 넣고 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 에틸아세테이트(40 mL)에 반응액을 부어 고체를 석출시켰다. 석출된 고체를 여과 및 컬럼정제하여 화합물 36 (30 mg, 0.0906 mmol, 11%)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.21 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.72 (m, 2H), 7.66 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.60 (t, J=6.8Hz, 2H), 7.49-7.44 (m, 6H), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.06-7.03 (m, 2H), 5.24-2.18 (m, 2H), 4.54-4.49 (m, 2H), 4.44-4.37 (m, 4H), 4.14-4.07 (m, 2H), 3.49-3.47 (m, 4H), 3.32 (m, 4H), 2.84-2.81 (m, 2H), 2.52-2.39 (m, 2H), 2.23 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.94-1.91 (m, 4H), 1.70-1.65 (m, 4H), 1.49-1.40 (m, 4H)
제조예
7. 화합물 37 내지 화합물 39의 합성
제조예 6의 중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 각각 1,2-비스(2-아미노에톡시)에탄, 1,11-다이아미노-3,6,9-트리옥사운데칸, 4,7,10-트리옥사-1,13-트라이데칸다이아민 을 사용하여 화합물 37, 화합물 38 및 화합물 39를 합성하였다.
화합물 37 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.20 (d, J=7.2, 2H), 7.76-7.70 (m, 2H), 7.65 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.48-7.42 (m, 6H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 2H), 5.23-5.17 (m, 2H), 4.52-4.47 (m, 2H), 4.44-4.34 (m, 4H), 4.12-4.06 (m, 2H), 3.57 (s, 4H), 3.51-3.48 (m, 4H), 3.36-3.30 (m, 4H), 2.83-2.80 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 2H), 2.25-2.21 (m, 4H), 1.93-1.89 (m, 4H), 1.68-1.64 (m, 4H), 1.46-1.39 (m, 4H)
화합물 38 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.20 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.72 (m, 2H), 7.66 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.62-7.59 (m, 2H), 7.47-7.44 (m, 6H), 7.41-7.36 (m, 2H), 7.03 (d, J=8.0Hz, 2H), 5.25-5.19 (m, 2H), 4.52-4.48 (m, 2H), 4.44-4.39 (m, 4H), 4.13-4.07 (m, 2H), 3.59-3.58 (m, 8H), 3.50-3.48 (m, 4H), 3.33-3.30 (m, 4H), 2.84-2.81 (m, 2H), 2.49-2.40 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.94-1.89 (m, 4H), 1.69-1.65 (m, 4H), 1.44-1.43 (m, 4H)
화합물 39 - 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.22-8.21 (m, 2H), 7.78-7.72 (m, 2H), 7.67 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.63-7.60 (m, 2H), 7.51-7.44 (m, 6H), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.05-7.03 (m, 2H), 5.26-4.20 (m, 2H), 4.53-4.49 (m, 2H), 4.47-4.37 (m, 4H), 4.15-4.07 (m, 2H), 3.60-3.58 (m, 4H), 3.54-3.53 (m, 4H), 3.48-3.45 (m, 4H), 3.23-3.20 (m, 4H), 2.85-2.82 (m, 2H), 2.50-2.42 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.97-1.89 (m, 4H), 1.73-1.68 (m, 8H), 1.46-1.40 (m, 4H)
상기 제조예 6 및 7에서 얻어진 화합물 36 내지 화합물 39와 시판되는 SYBR®safe의 흡수 스펙트럼(λabs), 발광 스펙트럼(λem), 몰 흡광계수(ε) 및 양자 효율을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
상기 제조예 6 및 7에서 얻어진 화합물 36 내지 화합물 39는 SYBR®safe과 유사하거나 우수한 몰 흡광계수를 나타내며, 특히 양자 효율 측면에서도 상당히 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예
실험예
1. 핵산 표지 실험
제조예에 따라 제조된 화합물 1 내지 화합물 8, 화합물 38과 시판 중인 염료인 SYBR® safe의 핵산 표지 특성을 비교하기 위해, 1% 아가로즈 겔 (40ml 1X TAE 버퍼 + 0.4 g 아가로즈)에 각각 4 μl씩 혼합하여 9개의 아가로즈 겔을 준비하였다.
[SYBR® safe]
준비된 9개의 아가로즈 겔을 1X TAE 버퍼에 완전히 잠기게 넣은 후 5개의 웰에 10 μl, 5 μl, 2.5 μl, 1 μl, 0.5 μl의 DNA 샘플을 각각 로딩하였다. 전기 영동은 100V의 전원에서 30분 동안 수행되었다. 상기 전기영동 결과는 도 1 및 도 2 내지 도 10에 나타내었다.
도 2 내지 도 10은 각각 화합물 1 내지 화합물 8, 화합물 38의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 1 내지 도 10을 참조하면, SYBR® safe에 비해 본 발명의 다양한 실시예에 따른 메로시아닌계 화합물을 염료로서 사용할 경우, background signal이 균일한 것을 확인할 수 있으며, 전반적인 밴드의 밝기가 SYBR® safe보다 밝아 표지 결과의 판독성을 향상시킨 것을 확인할 수 있다.
또한, SYBR® safe의 경우, UV를 0.5초 간 조사했음에도 불구하고 전반적인 밴드의 밝기가 어두운 반면, 도 6 내지 도 10을 참조하면, SYBR® safe보다 짧은 시간 동안 UV를 조사하였음에도 불구하고 더 밝은 밴드가 관찰된 것을 확인할 수 있다.
도 11은 상용화된 염료인 SYBR® safe의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, 도 12 및 도 13은 각각 화합물 3 및 화합물 6의 흡수 및 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
SYBR® safe, 화합물 3 및 화합물 6 모두 DNA에 인터컬레이션되면서 흡수 파장이 장파장으로 이동(red shift)하고, 형광 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있으나, red shift된 화합물 3 및 화합물 6에 따른 형광 강도는 SYBR® safe의 형광 강도보다 상당히 향상된 것을 확인할 수 있다.
화합물 1 내지 화합물 8, 화합물 36 내지 화합물 39와 시판되는 SYBR® safe의 DNA 존재 하에 측정된 흡수 스펙트럼(λabs), 발광 스펙트럼(λem) 및 양자 효율을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
| 구분 | λabs(nm) | λem(nm) | 양자효율 |
| SYBR®safe | 503 | 535 | 0.021 |
| 화합물 1 | 517 | 541 | 1.00 |
| 화합물 2 | 517 | 541 | 0.93 |
| 화합물 3 | 517 | 540 | 0.86 |
| 화합물 4 | 517 | 539 | 0.88 |
| 화합물 5 | 517 | 537 | 0.86 |
| 화합물 6 | 517 | 538 | 0.73 |
| 화합물 7 | 517 | 538 | 0.71 |
| 화합물 8 | 517 | 538 | 0.80 |
| 화합물 36 | 492 | 511 | 0.67 |
| 화합물 37 | 492 | 512 | 0.64 |
| 화합물 38 | 492 | 512 | 0.76 |
| 화합물 39 | 492 | 513 | 0.70 |
화합물 1 내지 화합물 8, 화합물 36 내지 화합물 39는 DNA 존재 하에 시판되는 SYBR® safe과 유사한 파장 영역에서 형광 신호를 나타내는 한편, SYBR® safe에 비해 상당히 우수한 양자 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예
2. 세포 투과성 실험
SYBR® safe와 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1, 화합물 4 및 화합물 6의 세포 투과성을 확인하기 위하여, 헬라세포 측정을 이용하였다.
헬라 세포를 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen)을 함유하는 MEM 배지에, CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 헬라 세포를 3번 미디어로 세척 후 1 μM 농도의 SYBR® safe와 화합물 6을 각각 헬라세포(Hela Cell)에 처리하고, 37℃로 30분 동안 배양하였다. 위와 동일하게 3번 미디어로 세척한 후 현미경으로 이미지를 관찰하였으며, 그 결과를 도 14 내지 도 17에 나타내었다.
도 14는 상용화된 염료인 SYBR® safe의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이며, 도 15는 화합물 1, 도 16은 화합물 4 및 도 17은 화합물 6의 세포 투과성 실험 결과를 나타낸 이미지이다.
도 14를 참조하면, SYBR® safe는 세포 투과성을 나타내는 반면. 도 15 내지 도 17을 참조하면, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 화합물들은 세포를 투과하지 않는다는 것을 확인할 수 있다.
실험예
3. 세포 사이클(cell cycle) 분석 실험
6-웰 플레이트의 각 웰에 5x105 ~ 1x106으로 분주한 세포를 vehicle 및 TNFα (tumor necrosis factor alpha)로 처리한 후, trypsin-EDTA로 회수한 다음 FACS튜브에 옮겨 PBS (4℃) 1ml로 세척하였다. 이어서, 300 μl의 PBS (4℃)를 튜브에 넣은 후 세포를 부유시켰다.
부유시킨 세포가 담긴 튜브를 vortex해 주면서 100% Et-OH 700 μl을 한 방울씩 떨어뜨려준 후 4℃에서 1시간 이상 반응시켜 세포 고정(cell fixation)시킨 후 Et-OH를 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척한 후 1ml의 PBS로 현탁한 세포를 각각 화합물 6 (2 μM) 또는 PI (propidium iodide)(50mg/ml) 10 μl 와 1mg/ml농도의 RNase 1μl을 첨가하여 30분동안 암실에서 반응시켜 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
즉, FSC-A, SSC-A를 이용하여 핵을 구획(gating)하고 FITC-A, FITC-W plot을 voltage로 조절하여 singlet을 구분해낸다. singlet으로 구분된 것은 다시 FITC-A histogram을 보면서 voltage를 조절하여 DNA 2N, 4N이 되는 peak를 지정하고 G0/G1, S 그리고 G2/M기를 구분하였으며, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 18은 상용화된 세포 사이클 분석 염료인 propidium iodide를 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이며, 도 19는 화합물 6을 이용한 세포 사이클 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18과 도 19를 비교하면, 도 19의 세포 사이클 분석 결과가 도 18에 비해 각 단계간 구분이 명확하고, 신호의 가시성도 향상된 것을 확인할 수 있다.
실험예
4.
복귀돌연변이
실험(Ames test)
본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 6의 유전 독성을 평가할 목적으로 박테리아 균주를 이용한 복귀돌연변이 실험(Ames test)을 수행하였다.
시험 균주로서 동결 보존된 Histidine 요구성 변이주인 쥐 티푸스균(Salmonella typhimurium TA98주)에 대사활성 효소인 S9 혼합물을 처리한 시험계에서 화합물 6, EtBr 및 SYBR® safe 처리에 따른 시험 균주의 생육 정도를 관찰하였다.
Deep freezer에서 보관 중인 시험 균주를 취하여 멸균된 액체배지(2.5% Oxoid Nutrient Broth No. 2)에 접종하여 shaking incubator (37℃, 200rpm)에서 10시간 동안 배양하였다. 최소배지(Minimal Glucose Agarplate)는 1.5% Bacto agar(Difco)와 Vogel-Bonner medium E 및 2% glucose를 함유한 것을 petri dish (90×15mm)에 20 ml씩 분주하여 사용하였다. top agar는 0.6% agar와 0.5% NaCl로 조제하였으며, Salmonellatyphimurium 균주용 top agar는 0.05 mM의 농도가 되도록 histidine-biotin을 첨가하였다.
고압 멸균한 top agar를 45℃로 예열한 heating block에 꽃은 멸균 tube (12×75mm)에 2 ml씩 분주한 다음, 각각 화합물 6, EtBr 및 SYBR® safe 0.1 ml와 S9 혼합물과 시험 균주 배양액 0.1 ml 넣은 즉시 vortex-mixer로 2~3초간 진탕하여 minimal glucose agar plate에 부어 여러 방향으로 기울인 다음 굳힌다. top agar가 굳으면 plate를 뒤집어 37℃에서 48시간 배양 후 집락수를 계수하였다.
화합물 6, EtBr 및 SYBR® safe의 처리 농도(μg/plate)와 plate 당 계수된 집락수는 다음과 같다.
| 화합물 | 농도(μg/plate) | plate 당 집락수 |
| EtBr | 0 | 19 ± 4 |
| 40 | 3051 ± 181 | |
| 화합물 6 | 0 | 20 ± 4 |
| 40 | 57 ± 3 |
상기 표 4의 결과를 살펴보면, 기존 유전독성을 나타내는 것으로 알려진 EtBr의 집락수와 비교할 때, 화합물 6은 S9 대사 활성 TA98 주에서 집락수가 유의적으로 증가하지 않았음을 확인할 수 있다. 즉, 화합물 6은 비유전독성 염료로서 EtBr을 충분히 대체할 수 있다.
| 화합물 | 농도(μg/plate) | plate 당 집락수 |
| SYBR®safe | 0 | 24 ± 2 |
| 1.6 | 81 ± 7 | |
| 화합물 6 | 0 | 20 ± 4 |
| 8 | 24 ± 6 |
상기 표 5의 결과를 살펴보면, 현재 시판되는 SYBR® safe 염료는 화합물 6의 처리 농도(8 μg/plate)보다 더 낮은 농도(1.6 μg/plate)에서도 화합물 6보다 더 많은 집락수가 계수되었다.
일반적으로 전기영동시 겔의 염색 농도가 1 내지 3 μg/ml (3 내지 8 μg/plate)인 점을 고려할 때, 상기 농도 범위 내에서 화합물 6은 SYBR® safe 보다 낮은 유전독성을 나타낼 수 있다.
실험예
5.
qPCR
실험
(1) qPCR은 2X Real-Time PCR Master Mix (Cellsafe) 10 μl, 각종 농도의 Hela cDNA, 10 pmol 정방향 프라이머 1 μl, 10 pmol 역방향 프라이머 1 μl 및 1 μl의 화합물 38을 포함하는 20 μl 반응 용액에서 수행하였다. cDNA 내 단편을 프라이머(GAPDH)를 이용하여 증폭시켰다. 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 60℃에서 20초 및 72℃에서 15초로 수행되는 사이클을 40회 반복하였으며, 72℃ 단계에서 형광을 측정하였다. qPCR 결과는 하기의 표 6과 같다.
| 구분 | cDNA 함량 | 10 ng | 1 ng | 100 pg | 10 pg | 1 pg |
| 화합물 38 | 사이클수(Ct) | 19.649 | 23.267 | 26.852 | 29.901 | 33.256 |
| Tm (℃) | 83.982 | 83.982 | 83.982 | 83.982 | 83.982 |
여기서, 역치 사이클수(Ct)는 일반적으로 형광 신호가 임의의 역치에 도달하는 사이클 수를 의미하며, 예를 들어, qPCR 증폭 그래프에서는 형광 신호가 기준선을 넘기 시작하는 지점에서의 사이클 수를 의미한다.
형광 염료로서 화합물 38을 사용하여 qPCR 수행한 경우, 증폭 효율은 97.44%로서, 반응 용액 중 화합물 38이 포함되어 있다 하더라도 qPCR의 증폭 효율이 저하되지 않는 것을 확인할 수 있다.
또한, 표 6을 참조하면, 1 pg와 같이 상당히 낮은 농도의 cDNA 샘플을 사용하더라도 PCR 산물이 생성되는 점에 비추어 볼 때, qPCR 반응에 대한 화합물 38의 민감도가 높은 것을 확인할 수 있다.
(2) qPCR은 TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (TagMan Probe, Enzynomics사 제품) 10 μl, 각종 농도의 Hela cDNA, 0.5 μM 정방향 프라이머 1 μl, 0.5 μM 역방향 프라이머 1 μl 및 SYBR® green Ⅰ (0.45X) 또는 화합물 38 (1X)를 포함하는 20 μl 반응 용액에서 CFX96을 사용하여 수행하였다. Hela cDNA 내 단편을 0.5 μM 정방향 프라이머 5'-GTATGACAACAGCCTCAAGAT-3', 0.5 μM 역방향 프라이머 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'을 이용하여 증폭시켰다. 95℃에서 10분, 95℃에서 10초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 15초로 수행되는 사이클을 40회 반복하였으며, 72℃ 단계에서 형광을 측정하였다. qPCR은 총 3회 반복되었으며, qPCR 결과는 도 32, 33 및 하기의 표 7과 같다.
| 구분 | cDNA 함량 | 사이클수(Ct) | End point RFU | Tm (℃) |
| SYBR®green Ⅰ | 1 ng | 24.70 | 6209.44 | 82.50 |
| 0.1 ng | 28.47 | 5458.15 | 82.50 | |
| 0.01 ng | 31.97 | 4736.22 | 82.50 | |
| 0.001ng | 35.66 | 2818.84 | 82.50 | |
| 0.0001 ng | 36.99 | 1250.30 | 82.50 | |
| 화합물 38 | 1 ng | 24.45 | 31885.43 | 83.17 |
| 0.1 ng | 28.12 | 24568.08 | 83.00 | |
| 0.01 ng | 31.42 | 16545.25 | 83.00 | |
| 0.001ng | 35.63 | 5033.85 | 83.00 | |
| 0.0001 ng | 36.88 | 1818.80 | 83.25 |
형광 염료로서 화합물 38을 사용하여 qPCR 수행한 경우, SYBR® green Ⅰ에 비해 Ct 값이 최대 0.5 정도 작은 것을 확인할 수 있으며, RFU 값은 약 5배 이상을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
(3) qPCR은 2X Real-Time PCR Master Mix (DQ372, 바이오팩트사 제품) 10 μl, 2 μl의 HgDNA (25 ng/μl), Primer (HSP98) 1 μl 및 각종 농도(희석 배수)의 형광 염료(화합물 38, SYBR®green Ⅰ (Invitrogen사 제품) 또는 EvaGreenTM (Biotium사 제품))를 포함하는 20 μl 반응 용액에서 ABI 7500 FAST를 사용하여 수행하였다. 95℃에서 15분, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초 및 72℃에서 30초로 수행되는 사이클을 40회 반복하였으며, 72℃ 단계에서 형광을 측정하였다. qPCR은 총 3회 반복되었으며, qPCR 결과는 도 34 내지 도 36 및 하기의 표 8과 같다.
| 형괌 염료 | 형광 염료 농도 | 1X | 0.5X | 0.25X |
| 화합물 38 | 사이클수(Ct) | 23.17 | 23.61 | 24.53 |
| 형광 강도(Rn) | 37.83 | 21.42 | 11.18 | |
| Tm (℃) | 79.04 | 79.2 | 79.04 | |
| SYBR®green Ⅰ | 사이클수(Ct) | N/D | 25.61 | 24.93 |
| 형광 강도(Rn) | 0.22 | 8.04 | 4.01 | |
| Tm (℃) | 89.3 | 80.75 | 80.13 | |
| EvaGreenTM | 사이클수(Ct) | 25.29 | 25.8 | 26.82 |
| 형광 강도(Rn) | 17.25 | 9.58 | 4.59 | |
| Tm (℃) | 79.04 | 79.04 | 78.89 |
형광 염료로서 화합물 38을 사용하여 qPCR 수행한 경우, 동일한 희석 배수의 SYBR® green Ⅰ 또는 EvaGreenTM을 사용한 경우에 비해 Ct 값이 작은 것을 확인할 수 있다. 또한, 형광 강도 역시 동일한 희석 배수의 SYBR® green Ⅰ 또는 EvaGreenTM을 사용한 경우에 비해 약 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 표 8의 결과를 통해, SYBR® green Ⅰ의 농도 대비 높은 농도의 화합물 38을 qPCR 반응의 억제 없이 사용 가능한 것을 확인할 수 있다.
도 20은 형광 염료로서 화합물 38을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 21은 형광 염료로서 SYBR® green Ⅰ을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이며, 도 22는 형광 염료로서 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 용융 곡선(melt curve)을 나타낸 그래프이다.
도 20 내지 도 22를 참조하면, 화합물 38 및 EvaGreenTM을 사용한 qPCR의 경우, 단일한 특이적 피크를 나타내나, SYBR® green Ⅰ을 사용한 qPCR의 경우, extra 프라이머-이량체 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
(4) qPCR은 2X Real-Time PCR Master Mix (Cellsafe) 10 μl, 각종 농도(희석 배수)의 형광 염료(화합물 36, 화합물 38, 화합물 39, SYBR®green Ⅰ (Invitrogen사 제품) 또는 EvaGreenTM (Biotium사 제품)), Hela cDNA (0.5 ng/μl) 4 μl 및 1 μl의 프라이머(GAPDH) 세트를 포함하는 20 μl 반응 용액에서 CFX96을 사용하여 수행하였다. 95℃에서 10분, 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분로 수행되는 사이클을 46회 반복하였으며, 60℃ 단계에서 형광을 측정하였다. qPCR 결과는 도 37 내지 도 42 및 하기의 표 9와 같다.
| 형괌 염료 | 형광 염료 농도 | 2X | 1X | 0.5X |
| 화합물 36 | 사이클수(Ct) | 39.66 | 30.55 | 24.32 |
| End point RFU | 14645 | 21485 | 11100 | |
| Tm (℃) | 78.3 | 84.0 | 84.0 | |
| 화합물 38 | 사이클수(Ct) | 26.2 | 24.59 | 25.40 |
| End point RFU | 27677 | 15460 | 7212 | |
| Tm (℃) | 84.0 | 83.5 | 83.5 | |
| 화합물 39 | 사이클수(Ct) | 26.87 | 24.69 | 25.31 |
| End point RFU | 24717 | 13320 | 6176 | |
| Tm (℃) | 84.0 | 83.5 | 83.5 | |
| EvaGreenTM | 사이클수(Ct) | 27.48 | 27.09 | 30.80 |
| End point RFU | 10223 | 5941 | 2487 | |
| Tm (℃) | 83.5 | 83.3 | 83.0 |
상대적으로 고농도(2X, 1X)의 형광 염료 농도에서 화합물 38 및 화합물 39를 사용한 경우, 동일한 희석 배수의 EvaGreenTM을 사용한 경우에 비해 Ct 값이 작음과 동시에 형광 강도 역시 높은 것을 확인할 수 있다. 상대적으로 저농도(0.5X)의 형광 염료 농도에서는 화합물 36을 사용한 경우 역시 동일한 희석 배수의 SYBR® green Ⅰ 또는 EvaGreenTM을 사용한 경우에 비해 Ct 값이 작음과 동시에 형광 강도 역시 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예
6. 열적 안정성 실험
PCR 반응시 형광 염료의 안정성을 확인하기 위해 1 μl의 화합물 38과 1 μl의 EvaGreenTM (Biotium사 제품)을 각각 포함하는 20 μl의 PCR 반응 완충액을 준비하였다. 각각의 PCR 반응 완충액은 95℃로 가열되었으며, 95℃에서의 방치 시간에 따라 변화하는 흡광도를 측정하였다.
하기의 표 10에 기재된 흡광도 측정 결과를 살펴보면, 95℃에서의 방치 시간에 따른 흡광도 편차는 화합물 38이 EvaGreenTM보다 작은 것을 확인할 수 있다. 즉, 화합물 38의 고온 안정성은 EvaGreenTM보다 클 것이다.
| 구분 | 방치 시간(hr) | 0 | 0.5 | 1 | 2 | 3 |
| 흡광도 | 화합물 38 | 0.127 | 0.149 | 0.162 | 0.163 | 0.178 |
| EvaGreenTM | 0.095 | 0.125 | 0.135 | 0.167 | 0.190 |
실험예
7.
광퇴색
(
photobleaching
) 실험
각종 농도(희석 배수)의 형광 염료(화합물 38, SYBR® green Ⅰ (Invitrogen사 제품) 또는 EvaGreenTM (Biotium사 제품)) 5 μl 만 포함하는 20 μl 반응 용액에서 Real-Time PCR을 수행하였다. 25℃에서 30초 및 25℃에서 30초로 수행되는 사이클을 60회 반복하였으며, 각 사이클(1분)마다 형광 강도를 측정하여 각종 농도(희석 배수)의 형광 염료에 대한 광퇴색을 관찰하였다.
상술한 방법에 따라 측정한 화합물 38의 광퇴색 실험 결과는 도 23 내지 도 25, SYBR® green Ⅰ (Invitrogen사 제품)의 광퇴색 실험 결과는 도 26 내지 도 28 및 EvaGreenTM (Biotium사 제품)의 광퇴색 실험 결과는 도 29 내지 도 31에 나타내었다.
도 26은 0.5X, 도 27은 0.25X, 도 28은 0.125X의 희석 배율로 SYBR® green Ⅰ을 사용한 경우 측정된 형광 강도의 변화를 나타낸 것으로서, SYBR® green Ⅰ의 경우 저농도에서의 반감기가 5.5시간에 불과한 것을 확인할 수 있다.
도 23와 도 29는 1X, 도 24와 도 30는 0.5X, 도 25와 도 31은 0.25X의 희석 배율로 화합물 38 또는 EvaGreenTM을 사용한 경우 측정된 형광 강도의 변화를 나타낸 것으로서, 화합물 38을 사용한 경우, 동일 농도의 EvaGreenTM 과 유사하거나 높은 수준의 반감기를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
Claims (16)
- 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 메로시아닌(merocyanine)계 화합물:
[화학식 1]
여기서,
Ar은 치환 또는 비치환된 방향족환이며,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 황, 산소, 셀레늄, NR8 및 -CR8=CR9-로부터 선택되며,
R1 내지 R9는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR10), 알데하이드, 에스터(-COOR10), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-Z 작용기로부터 선택되며,
Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)가 케톤기(-COR10) 또는 에스터기(-COOR10)일 때, R10은 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 아미노알킬로부터 선택되며,
Rb (여기서, b는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수)가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있으며,
m은 1 내지 3의 정수이며,
L은 3 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커이며,
Z는 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가지며,
화학식 1로 표시되는 구조는 하나 또는 두 개의 -L-Z 작용기를 가진다.
- 제1항에 있어서,
Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되는,
메로시아닌계 화합물.
- 제1항에 있어서,
-L-Z 작용기는 하기의 화학식 2로 표시되는 메로시아닌(merocyanine)계 화합물:
[화학식 2]
-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-Z
여기서,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며,
A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며,
x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
Z는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택된다.
- 제3항에 있어서,
A1 내지 A10 중 하나는 하기의 화학식 3으로 표시되는 메로시아닌(merocyanine)계 화합물:
[화학식 3]
여기서,
R11은 탄소, 질소 또는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며,
R12는 하기의 화학식 4로 표시되며,
[화학식 4]
-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-]y13-A14-L3-Z
여기서,
L3은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며,
A11 내지 A14는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며,
x11 내지 x13은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
y11 내지 y13는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 염료.
- 제5항에 있어서,
상기 메로시아닌계 화합물은 생체분자인 핵산 내 인터컬레이션되는,
생체분자 표지용 염료.
- 제6항에 있어서,
상기 생체분자는 단일사슬 RNA, 이중사슬 RNA, 단일사슬 DNA 및 이중사슬 DNA로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산인
생체분자 표지용 염료.
- 제5항에 따른 생체분자 표지용 염료; 또는 제5항에 따른 생체분자 표지용 염료 및 완충액을 포함하는 생체분자 표지용 키트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물;
완충액, 겔 매트릭스, 겔 매트릭스를 형성하기 위한 적어도 하나의 물질, 표면 또는 표면을 형성하기 위한 적어도 하나의 물질; 및
사용 설명서;를 포함하고,
핵산이 샘플 내 존재할 경우, 상기 매트릭스 또는 상기 표면에 고정되는
샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 전기영동 키트.
- 핵산이 샘플 내 존재할 경우,
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물에 핵산을 노출시켜, 상기 메로시아닌계 화합물이 핵산 내 인터컬레이션되어 복합체를 형성하는 단계; 및
상기 메로시아닌계 화합물의 형광 또는 그것의 부재를 결정하는 단계;를 포함하는 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
- 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법으로서,
표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약, 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
상기 반응 혼합물을 증폭된 표적 핵산의 형성에 적합한 조건 하에서 중합 반응 시키는 단계;
상기 반응 혼합물을 빛으로 조명하는 단계; 및
상기 반응 혼합물로부터 형광 방출을 검출하는 단계;를 포함하는
증폭된 표적 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 혼합물과 핵산을 포함하는 샘플을 혼합하는 단계;
상기 메로시아닌계 화합물이 상기 샘플 내 핵산과 인터컬레이션하여 복합체를 형성하고, 형광 신호를 발생시키도록 상기 샘플과 상기 혼합물을 충분한 시간 동안 배양(incubating) 하는 단계; 및
감지되는 형광 신호와 정해진 핵산 량의 형광 표준 특성을 비교하여 샘플 내 핵산을 정량하는 단계;를 포함하는
샘플 내 핵산을 정량하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 혼합물과 사멸 세포를 포함하는 샘플을 혼합하는 단계;
상기 메로시아닌계 화합물이 상기 샘플 내 사멸 세포와 인터컬레이션하여 복합체를 형성하고, 형광 신호를 발생시키도록 상기 샘플과 상기 혼합물을 충분한 시간 동안 배양(incubating) 하는 단계; 및
감지되는 형광 신호와 정해진 사멸 세포 량의 형광 표준 특성을 비교하여 샘플 내 사멸 세포를 정량하는 단계;를 포함하는
샘플 내 세포의 생존도를 정량하는 방법.
- 사멸 세포와 인터컬레이션하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물 및 세포와 인터컬레이션할 수 있는 상기 메로시아닌계 화합물 외의 화합물을 포함하는 수용액과 세포를 포함하는 샘플을 혼합하는 단계;
상기 메로시아닌계 화합물 및 그 외의 상기 화합물과 인터컬레이션된 세포를 포함하는 샘플을 빛으로 조명하는 단계; 및
상기 샘플로부터 형광 방출을 검출하는 단계;를 포함하고,
상기 샘플로부터 방출된 상기 형광은 상기 메로시아닌계 화합물 및 그 외의 상기 화합물이 함께 샘플 내 세포와 인터컬레이션하여 세포간에 형광 반응으로 발생하고,
방출된 상기 형광은 상기 메로시아닌계 화합물만의 형광 반응으로 발생한 형광과는 다른
샘플 내 세포의 생존도를 분석하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물; 및
사용설명서를 포함하고,
사멸 세포가 샘플 내 존재할 경우, 상기 메로시아닌계 화합물과 인터켈레이션하여 형광이 검출되는
샘플 내 세포의 생존도를 분석하는 키트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 메로시아닌계 화합물을 포함하는 조영제 조성물.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101880502B1 (ko) | 2018-08-20 |
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