KR100614422B1 - 베타-니트로스티렌계 화합물 및 이를 함유하는 항암 조성물 - Google Patents

베타-니트로스티렌계 화합물 및 이를 함유하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 가지며 항암 효과를 나타내는 베타-니트로스티렌계 화합물, 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 수화물에 관한 것으로서, 이 화합물들은 암세포에서 특이적으로 발현되는 텔로머라제의 활성을 선택적으로 억제하므로 기존의 항암제들이 가지는 부작용을 최소화할 수 있는 유용한 항암제로 사용될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112003522355043-pct00033
[상기 식에서, R1 내지 R5 는 각각 수소, 할로겐, 활로겐화펜옥시, 및 R6-Y-X-로 표시되는 치환기(-X-는 -O- 또는 -NH-을 나타내고, -Y-는 -SO2- 또는 -CO-를 나타내고, R6은 수소, 알킬, 할로겐, 및 NO2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 치환된 벤젠을 나타낸다)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이거나; R3는 R4와 함께 벤젠 고리를 형성하며, 단, R1, R2, R3 , R4 및 R5가 동시에 수소는 아니다.]

Description

베타-니트로스티렌계 화합물 및 이를 함유하는 항암 조성물{BETA-NITROSTYRENE COMPOUND AND ANTICANCER COMPOSITION COMPRISING IT}
본 발명은 항암 효과가 있는 신규 베타-니트로스티렌계 화합물, 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 수화물과 이들을 함유하는 텔로머라제(telomerase) 활성억제용 및 항암용 조성물에 관한 것이다.
사람의 염색체 말단에는 TTAGGG의 염기서열이 반복되어 있는 텔로미어(Telomere)라는 특수한 구조가 있으며, 이 구조는 유전정보를 지닌 부분이 상실되지 않도록 염색체의 끝부분을 보호하는 역할을 한다. 정상적인 세포는 염색체의 DNA 복제가 일어날 때 복제 갈래에서 생기는 마지막 RNA 프라이머가 제거되기 때문에 세포분열이 거듭됨에 따라 텔로미어는 점차적으로 손실되어 염색체의 길이가 조금씩 줄어들어(염색체 말단 복제의 문제점) 결국에는 유전물질이 손실되고 세포가 죽게 된다(Harley, C.B. et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59, 307-316, 1994). 그러나 암세포에는 텔로머라제 (Telomerase)라는 효소가 있어서 텔로미어의 반복된 단일염기서열에서 자신의 일부인 RNA 부분을 프라이머로 이용하여 역전사 효소로서의 활성으로 계속해서 텔로미어의 길이를 연장시켜주기 때문에 세포분열이 지속적으로 일어나도 세포는 죽지않게 된다. 보나르(Bodnar, A.G.)등에 의하면, 텔로머라제는 유한한 분열능력을 갖는 사람의 세포를 불멸화시킬 수 있으며, 텔로미어가 계속 짧아지는 것이 세포가 몇 번 분열할 것인가를 결정하는 생물학적 시계의 역할을 한다고 한다 (Science, 279: 349-352, 1998). 이렇듯 염색체 말단의 길이는 세포의 수명과 연관이 있으며 염색체의 말단 길이를 계속 유지시키는 텔로머라제는 암세포가 불멸화되는 원인이 되는 것으로 추측되고 있다. 지금까지의 연구결과에 의하면 성인의 조혈간세포(hematopoietic stem cells)와 생식세포를 제외한 대부분의 정상적인 체세포에서는 텔로머라제 활성이 발견되지 않지만 암세포의 경우 약 85 %가 텔로머라제 활성을 가지고 있다(Kim, N.W. et al., Science, 266, 2011-2015, 1994). 따라서 과학자들은 암세포에 있는 텔로머라제의 활성을 억제함으로써 다양한 종류의 암세포 증식을 중단시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다.
현재까지 알려진 텔로머라제 억제제는 크게 4가지 그룹으로 나뉜다.
첫째는 텔로머라제의 RNA 구성요소를 표적으로 억제하는 올리고 뉴클레오티드이다. 가장 대표적인 방법은 텔로머라제의 RNA에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 이용하는 방법이다(Feng, J. et al., EMBO J., 14, 4240-4248, 1995). 안티센스 뉴클레오티드는 목적 RNA에 상보적으로 결합하여 RNA의 번역을 억제하게 된다. 그러나 이러한 뉴클레오티드가 세포 안으로 들어가기 위해서는 트랜스펙션 약제(transfection reagents)를 이용하여야 하며, 세포 내로 들어간 뉴클레오티드는 다양한 핵산 분해제들에 의하여 파괴되므로 이를 막기 위해 뉴클레오티드에 다양한 화학적 수정을 가하게 되는데 이는 결국 목적 염기서열로의 결합력을 감소시키는 문제점이 있다. 이 외에 펩티드 핵산(peptide nucleic acids, PNAs)을 이용하는 방법이 있는데(Artandi, S.E. and DePinho, R.A., Nat. Med., 6, 849-851, 2000), 펩티드 핵산은 오탄당-인 구조가 N-(2-아미노에틸)글리신으로 대치된, RNA와 DNA의 유사물로 RNA에 대한 친화성과 특이성이 높고 각종의 핵산 분해제에 강한 내성을 가지고 있다.
둘째는 텔로머라제 핵산 서열을 절단할 수 있는 핵산분자인 리보자임이다. 리보자임 역시 텔로머라제의 RNA 구성요소를 표적으로 억제 작용을 가지며 요코야마 등(Yokoyama, Y. et al., Cancer Res., 58, 5406-5410, 1998)은 해머헤드 리보자임을 암세포주에서 발현시켜 텔로머라제의 활성이 줄어들고 텔로미어의 길이도 줄어드는 것을 확인하였다.
셋째는 텔로머라제의 촉매성 도메인인 hTERT를 표적으로 억제하는 방법이다. 텔로머라제는 그 자체로서 역 전사효소(Reverse Transcriptase)의 활성을 가지고 있으므로 이 역 전사효소의 활성을 억제하는 다양한 억제제가 텔로머라제의 억제제로 이용되고 있다 (Strahl, C. and Blackburn, E.H., Mil. Cell. Biol., 16, 53-56, 1996; Melana, S. M. et al., Cancer Res., 4, 693-696, 1997; Murakami, J. et al., Eur. J. Cancer, 35, 1027-1034, 1998). 이 밖에 도미넌트 네거티브 hTERT 구조물(dominant negative hTERT constructs)을 세포 내에서 발현시키는 방법이 있다(Zhang, X. et al., Genes Dev., 13, 2388-2399, 1999).
넷째는 소분자 억제제를 이용하는 방법이다. 텔로미어의 3'쪽에는 구아닌이 풍부한데 이 부위는 G-쿼드러플럭스(quadruplux)라는 구조를 형성하게 된다. 이 G-4중체의 형성이 텔로머라제의 활성을 억제하므로 이러한 테트라플럭스를 안정화시키는 물질이 바로 텔로머라제의 억제제로 사용될 수 있다. 대표적인 G-쿼드러플럭스 안정화 물질로는 포피린 유도체와 아크리딘 유도체, 2,6-디아미노안트라퀸논 등이 있다(Harrison et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 9, 2463-2468, 1999; Sun, D. et al., J. Med. Chem., 40, 2113-2116, 1997; Read, M.A. et al., J. Med. Chem., 42, 4538-4546, 1999). WO 9940087은 페릴렌 화합물 및 두 헤테로 사이클을 포함한 적어도 7개의 환을 함유하는 카보시아닌인 G-쿼드러플렉스 구조와 상호 작용하는 화합물의 용도에 대해 기술하고 있다. 또한, WO0140218에는 DNA를 G-쿼드러플렉스 구조로 안정화시키는 데 특히 유용한 화합물로서 아릴아민 유도체 및 안티-텔로머라제로서 이의 용도에 대하여 기재하고 있다.
이들 이외에도, EP0938897 A 및 US2003/0022878 A에는 텔로머라제 억제제로서 카테신(catechin)이 유용하다고 기재하고 있고, WO02076975, WO03024997, WO0230932, WO0208193, WO0140218, WO0002581, WO9702279, US2002/0103169, US6362210, US6004939, US6054442, FR2819255 등에 텔로머라제에 대해 억제능이 있는 다양한 화합물 또는 펩타이드가 기재되어 있다. 특히, US6362210에서는 텔로머레이제 활성 억제능이 있는 카르복실 아미드에 대하여 기재하고 있다.
이 밖에 콤비네토리알 라이브러리를 직접 스크리닝하여 선별한 새로운 소분자 화합물들이 있다. 최근에는 HTS(High Throughput Screening)의 기술 개발로 짧은 시간 내에 많은 양의 화합물을 대량 검색할 수 있는 방법이 모색됨에 따라 현재 많은 연구소에서 이 방법을 이용하여 신약 개발을 보다 빠르게 진행하고 있다.
불과 10년 전까지만 해도 대부분의 제약회사에 이루어진 신약 개발은 기존의 효과 있는 약물에 대한 유도체 합성이나 우연한 발견에 의존하고 있었다. 하지만 1990년대 이후 일부 선진 제약회사에서 이러한 신약개발 과정의 비효율성을 극복하고자 개발 기간과 비용 절감을 위하여 화합물 라이브러리의 개념을 도입하여 전 세계의 화합물을 모으기 시작하였으며, 그 이후 분자조합기술(Combinatorial chemistry)의 발달로 보다 많은 화합물을 초고속으로 합성함으로써 수십 만개의 화합물을 동시에 검색할 수 있는 방법이 모색되었다. 이에 따라 확률적으로 많은, 새로운 약물이 빠른 속도로 개발되고 있다. 최근 들어 텔로머라제의 억제제도 이러한 방법에 의하여 개발되고 있으며(Nobuki, H. et al., Biochemistry, 38, 11501-11507, 1999; Imad, N. et al., Cancer Res., 59, 4004-4011, 1999), 이러한 광범위한 검색은 결국 새로운 부류의 텔로머라제 억제제 개발을 가능케 할 것이다.
본 발명의 목적은 다양한 암세포에서 특이적으로 항암 활성을 나타내며 정상 세포에 대한 부작용이 없는 신규 화합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 텔로머라제 억제 및 항암용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되며 텔로머라제 억제 활성을 나타내는 신규 베타-니트로스티렌계 화합물, 이의 염 및 수화물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112003522355043-pct00001
[상기 식에서, R1 내지 R5 는 각각 수소, 할로겐, 활로겐화펜옥시, 및 R6-Y-X-로 표시되는 치환기(-X-는 -O- 또는 -NH-을 나타내고, -Y-는 -SO2- 또는 -CO-를 나타내고, R6은 수소, 알킬, 할로겐, 및 NO2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 치환된 벤젠을 나타낸다)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이거나; R3는 R4와 함께 벤젠 고리를 형성하며, 단, R1, R2, R3 , R4 및 R5가 동시에 수소는 아니다.]
상기 식에서, R1 및 R3은 각각 수소이고, R2는 수소 또는 디클로로페녹시이고, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 염소인 것이 바람직하며, 구체적 화합물로서는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌, 2,3-디클로로-베타-니트로스티렌, 2-(2-니트로-비닐)-나프탈렌, 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 톨루엔-4-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 벤젠설포닉산 4-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로-3-니트로벤젠설포닉산 3- (2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐에스테르, 4-브로모벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 디페닐아세트산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 나프탈렌-1-설포닉산 [3-(2-니트로-비닐)-페닐]아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물임을 특징으로 하는 베타-니트로스티렌계 화합물, 또는 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 수화물이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적을 위해서, 상기 본원발명에 따른 화합물들은 유효성분으로 함유하는 베타-니트로스티렌계 화합물, 또는 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 수화물을 유효성분으로 함유하는 텔로머라제 활성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 위해서, 상기 본원발명에 따른 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물들을 항암 또는 암 예방용으로 사용하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 베타-니트로스티렌 화합물의 제조는 다음과 같이 두 가지 방법으로 제조하였다. 방법1은 설포닐이나 아세틸 또는 아실이 치환되지 않은 형태의 화합물 제조 방법(실시예 1내지 4)이며 방법2는 방법1에서 제조된 화합물에 설포닐이나 아세틸 또는 아실이 결합된 (실시예 5 내지 11) 제조방법이다. 그 구체적인 내용은 실시 예에 기재되어 있다.
방법 1
10 mL의 밀폐된 반응용기에 알데히드 (1당량)와 니트로메탄 (4당량), NH4OAC (0.5 당량)를 넣은 후 반응온도를 60 ℃ 하에서 고주파 반응을 진행하였다. 반응의 진행은 TLC로 확인하였고, 1시간 정도 반응을 진행하였다. 반응 종결후 혼합물에 H2O을 넣고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층은 H2O, brine으로 씻어준 후 무수 MgSO4로 수분을 제거하였고, 감압증류로 용매를 제거한 후 관크로마토그래피를 이용하여 원하는 생성물인 니트로스티렌을 얻어 1H-NMR로 확인하였다.
방법 2
상기 방법1로 제조된 3 또는 4-(2-니트로-비닐)-페놀 (1당량)을 25 mL 플라스크에 넣고 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 교반하면서 트리에틸아민 (1.2 당량)을 천천히 적가한 후, 실온에서 1시간가량 교반하였다. 반응 용액에 적당한 설포닐 또는 아세틸클로라이드 (1.2 당량)를 넣고 3시간가량 교반하였다. 반응의 진행은 TLC로 확인하였고 반응 종결 후 감압증류로 용매를 제거하였다. 혼합물은 관크로마토크래피를 이용하여 원하는 생성물을 얻어 1H-NMR을 확인하였다.
상기 화학식 1의 베타-니트로스티렌계 화합물은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리토금속염(마그네슘염, 칼슘염 등)과 같은 무기금속염, 암모늄염, 유기염기염(예: 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜린염 등) 등 당업계에 공지된 다양한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화 물은 통상적인 방법에 따라 제조하거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 수화물이 생성될 수도 있다.
본 발명에서는 텔로머라제 활성 억제 화합물을 얻기 위하여 대량의 소분자 화합물을 효율적으로 검색하는 방법으로서 전통적인 텔로머라제 활성 측정법으로 알려져 있는 TRAP 방법(Kim, N.W. et al., Science, 266, 2011-2015, 1994)을 일부 변형한 방법을 사용한다.
첫째, 텔로머라제의 분획물을 얻는 방법을 변형하여 사용한다.
기존의 방법에서는 암세포로부터 용해 완충액을 이용하여 얻은 미정제된 추출물(crude extracts)로 텔로머라제 활성을 측정하지만, 본 발명에서는 이를 좀 더 순화시켜 텔로머라제의 민감성을 높이기 위하여 미정제된 추출물로 다시 글라이세롤 그라디언트를 이용한 초고속 원심분리를 하여 각각의 분획물을 얻고 각 분획물로 텔로머라제 활성을 측정하여 가장 활성이 높은, 부분적으로 순화된 텔로머라제 분획물을 얻은 다음 이를 이용하여 각 화합물의 억제 정도를 측정한다.
둘째, 결과를 확인하는 방법을 변형하여 사용한다.
텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물을 확인하기 위하여 기존의 방법에서는 방사선 동위원소를 이용하여 PCR을 수행하고 그 생성물을 전기영동으로 확인하지만, 본 발명의 방법에서는 이중 가닥 DNA에만 특이적으로 반응하는 피코그린(PicoGreen) 형광 염색제를 PCR 산물과 반응시킨 후 형광을 측정함으로써 방사선 동위원소 사용의 위험성과 전기영동의 불편함을 배제하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다.
상기의 변형된 방법으로 대량의 소분자 화합물을 검색한 결과, 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물들은 텔로머라제 활성을 50 % 억제하는 농도(IC50)가 모두 3 μM 이하로서 우수한 텔로머라제 억제 활성을 나타낸다.
또한, 상기 화합물들은 암세포에 대한 세포독성을 확인하기 위한 MTT 분석에서 텔로머라제의 활성을 억제하는 농도에서는 세포독성을 나타내지 않으며, 텍(Taq) 폴리머라제, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역 전사효소 등의 다른 유사한 핵산 폴리머라제에는 영향을 미치지 않고 텔로머라제에만 특이적으로 억제효과를 가진다.
텔로머라제 억제 활성을 나타내는 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물들이 항암제로 작용하기 위해서는 시험관 내에서 텔로머라제의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라, 실제로 텔로머라제 활성이 있는 암세포에 처리하였을 때 암세포의 텔로미어길이 감소를 유도하고 세포노화를 유발시켜야 한다. 이를 확인하기 위하여 약 300 bp의 길이의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 탐침으로 하여 서던블럿팅을 실시하면 본 발명의 화합물의 처리 기간이 늘어남에 따라 점점 텔로미어의 길이가 짧아진다(도 3). 또한 PD(population doubling) 130 이후에 화합물의 처리를 중단하고 화합물이 없는 상태에서 PD 60동안 더 배양하면 텔로미어의 길이가 다시 원래 상태로 회복된다 (도 4). 이러한 결과에 상응하게 세포에 내재하는 텔로머라제 활성이 화합물 처리에 의하여 줄어들며, 화합물 처리 중단 후 화합물이 없는 상태에서 배양했을때 다시 회복된다 (도 5a 및 5b).
암세포에 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물을 장기간 처리하면 텔로미어의 길이가 짧아질 뿐만 아니라, 노화가 실제로 유도됨을 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색법으로 확인할 수 있다 (도 6).
이와 같이, 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물들은 암세포에 세포독성없이 특이적으로 텔로머라제의 활성을 억제하며, 암세포에 장기간 처리 시 텔로미어의 길이를 현저히 줄이고 노화를 유발한다. 이러한 결과는 본 화합물이 기존의 항암제에 비하여 정상세포에 대한 부작용 없이 텔로머라제 활성을 가지는 암세포만을 특이적으로 죽일 수 있는 유용한 항암제로 사용될 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명에서는 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 수화물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 텔로머라제 억제용 및 항암용 조성물이 제공된다.
한편, 본 발명의 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학적 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하거나 이들로 희석하여 제조된 조성물을 캅셀, 새세이(sachet) 또는 기타 용기형태의 담체 등에 봉입시키는 것이 바람직하다. 이러한 제형은, 예를 들어, 정제, 환제, 과립제, 분말, 새세이, 엘렉실제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사액, 멸균 분말, 연고제, 패취제 등의 형태일 수 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 물, 생리식염수, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미 정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. US6362210에서는 텔로머레이제 활성 억제능이 있는 카르복실 아미드의 제형화에 대하여 기재하고 있는데, 여기에 기재된 방법도 이용가능하다.
조성물에 함유되는 본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물의 함유량은 대략 20 내지 95 중량%가 적당하다.
본 발명의 텔로머라제 억제제 및 항암제 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 본 발명의 텔로머라제 억제제 및 항암제 조성물의 통상적인 1일 투여량은 활성 화합물로서 0.01 내지 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학 조성물의 실제 투여량은 치료 대상 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
도 1a는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌(DPNS)이 시험관 내에서 농도에 의존적으로 텔로머라제의 활성을 현저하게 억제시킴을 보여주는 전기영동 결과이며, 도 1b는 상기 결과를 정량화하여 텔로머라제 활성을 50 % 억제시키는 양 (IC50)을 나타낸 것이다.
도 2a는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 TS 프라이머에 대하여 혼합형 비경쟁적 억제제로 작용하여 텔로머라제의 활성을 억제함을 보여주는 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plots)의 결과이며, 도 2b는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 dNTP에 대하여 역시 혼합형 비경쟁적 억제제로 작용하여 텔로머라제의 활성을 억제함을 보여주는 라인위버-버크 플롯의 결과이다.
도 3은 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 자궁 경부암 세포주(HeLa Cell line)에 처리하여 처리기간에 따라 텔로머라제 활성이 특이적으로 억제됨으로써 텔로미어의 길이가 감소함을 서던블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 4는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 자궁 경부암 세포주에 장기간 처리하면 텔로미어의 길이가 감소하다가 이 후 처리를 중단하면 다시 회복되는 것을 서던블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 5a는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 자궁 경부암 세포주에 처리하여 세포 내에 존재하는 텔로머라제의 활성이 억제됨을 보여주는 전기영동 결과이며, 도 5b는 상기 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 자궁 경부암 세포주에 노화 특이적인 X-gal 염색을 하여 노화가 일어난 세포가 푸른 색으로 보이는 현미경 사진으로, 도 6a는 자궁 경부암 세포주에 DMSO만을 처리한 대조군이고, 도 6b는 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타- 니트로스티렌 을 처리한 실험군이다.
이하에서 본 발명을 제조예와 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 : 니트로스티렌계 화합물의 합성
제조예 1 : 베타-니트로스티렌의 제조
Figure 112003522355043-pct00002
0 ℃ 하에서 50 mL 플라스크에 벤즈알데히드 1.06 g, 니트로메탄 0.82 mL과 메탄올 2 mL를 넣고 1분간 교반하였다. 미리 만들어둔 5 M 농도의 수산화나트륨 2 mL를 첨가한 후 10분간 교반하니 흰색 고체의 염이 생성되었다. 다시 메탄올 1 mL를 넣고 5분간 교반하여 염을 녹였다. 투명한 용액이 되면 3 mL의 차가운 얼음물을 넣어 희석한 후 진한 염산 3 mL를 넣고 10분간 교반하면 노란색의 고체가 생성되었다. 교반을 중지하고 반응 용액을 여과하고 여과물을 물로 3회 이상 세척하고 에탄올로 2회 세척하였다. 생성된 고체를 진공 건조하여 결과물인 베타-니트로스티렌을 85 %의 수율로 얻었다.
Figure 112003522355043-pct00003
제조예 2 : 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌의 제조
Figure 112003522355043-pct00004
0 ℃ 하에서 50 mL 플라스크에 3-(3,5-디클로로펜옥시)-벤즈알데히드 2.67g, 니트로메탄 0.82 mL과 메탄올 2 mL를 넣고 1분간 교반한 후 미리 만들어둔 5 M 농도의 수산화나트륨 2 mL를 첨가한 후 10분간 다시 교반한 후 메탄올 1 mL를 넣고 5분간 교반하였다. 반응액에 3 mL의 차가운 얼음물을 넣어 희석한 후 진한 염산 3 mL를 넣고 10분간 교반하고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화과탄산나트륨수용액으로 세척한 후 감압증류시켰다. 잔류물에 디클로로메탄 3 mL, 아세틱언하이드라이드 1.02 mL 및 촉매량의 디메틸아미노피리딘을 넣고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 에틸아세테이트로 추출하고 감압증류로 용매를 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출액: 에틸아세테이트/노말-헥산=1:4v/v)로 분리하여 결과물인 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 45 %의 수율로 얻었다.
Figure 112003522355043-pct00005
제조예 3 : 2,3-디클로로-베타-니트로스티렌의 제조
Figure 112003522355043-pct00006
2,3-디클로로-벤즈알데히드 1.75 g을 사용하여 제조예 2와 동일한 방법에 따라 2,3-디클로로-베타-니트로스티렌을 48%의 수율로 얻었다.
Figure 112003522355043-pct00007
제조예 4 : 2-(2-니트로-비닐)-나프탈렌의 제조
Figure 112003522355043-pct00008
2-나프타알데히드 1.86 g을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법에 따라 2-(2-니트로-비닐)나프탈렌을 68 %의 수율로 얻었다.
Figure 112003522355043-pct00009
설포닐 또는 아세틸이 치환된 3 또는 4-(2-니트로-비닐)-페놀 에스테르의 일 반적인 제조방법
Figure 112003522355043-pct00010
온도 25 ℃에서 25 mL 플라스크에 3- 또는 4-(2-니트로-비닐)-페놀 (1 당량)을 넣고, 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 교반하면서 트리에틸아민 (1.2 당량)을 천천히 적가한 후, 실온에서 1시간 정도 교반하였다. 용액에 설포닐클로라이드 또는 아세틸클로라이드(1.2 당량)을 넣고, 3시간 정도 교반하였다. 반응의 진행은 TLC로 확인하였고, 반응 완결 후에 감압증류로 용매를 제거하였다. 혼합물은 관크로마토그래피를 이용하여 원하는 생성물을 얻어 1H-NMR로 확인하였다.
제조예 5 : 톨루엔-4-설포닉 산 3-(2-니트로-비닐)-페닐에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00011
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을 사용하였고 p-톨루일설포닐클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 82%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00012
제조예 6 : 벤젠설포닉산 4-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00013
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을 사용하였고 벤젠설포닐 클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 85%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00014
제조예 7 : 4-클로로-3-니트로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00015
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을 사용하였고 4-클로로-3-니트로벤젠설포닐 클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 78%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00016
제조예 8 : 4-클로로-벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00017
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을 사용하였고, 4-클로로벤젠설포닐 클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 81%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00018
제조예 9 : 4-브로모-벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00019
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을사용하였고, 4-브로모벤젠설포닐 클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 82%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00020
제조예 10 : 디페닐아세트산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르의 제조
Figure 112003522355043-pct00021
상기 일반적인 제조예와 동일한 방법을 사용하였고, 디페닐아세틸클로라이드를 첨가하여 표제의 화합물을 77%의 수율로 제조하였다.
Figure 112003522355043-pct00022
제조예 11 : 나프탈렌-1-설포닉산 [3-(2-니트로-비닐)-페닐]-아미드의 제조
Figure 112003522355043-pct00023
온도 25 ℃에서 10 mL 밀페용 반응기에 합성된 나프탈렌-1-설포닉산(3-포밀-페닐)아미드 (343 mg, 1.10 mmol)와 니트로멘탄 (480 μL, 8.76mmol), NH4OAc (43 mg, 0.55 mmol)을 넣고, 반응 온도는 60℃하에서 고주파 반응을 진행하였다. 반응의 진행은 TLC로 확인하였고 1시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종결 후, 혼합물에 H2O 50 mL를 넣고, 에틸아세테이트(50 mL * 3)로 추출하였다. 유기층은 H2O 50 mL, brine 50 mL로 씻어주었다. 무수 MgSO4로 수분을 제거하였고, 감압증류로 용매를 제거한 후, 관크로마토그래피를 이용하여 원하는 생성물인 나프탈렌-1-설포닉산[3-(2-니트로-비닐)-페닐]아미드 (250 mg, 수율: 65%)을 얻어 1H-NMR로 확인하였다.
Figure 112003522355043-pct00024
실시예 1: 텔로머라제 활성에 대한 효과 검색
효과적인 텔로머라제 억제제를 검색하기 위해서 먼저 부분적인 텔로머라제 분획물을 얻어야 한다. 이를 위하여 1 ×108 개의 HeLa 세포 (ATCC CCL-2)를 준비한 다음, 차가운 용해 완충액 (10 mM 트리스 (pH 7.5), 0.5 M 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 1 mM ECTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N'-tetra acetic acid), 0.5 % CHAPS(3-(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio-1- propane-sulfonate), 0.1 mM PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride), 5 mM 베타-머캅토에탄올)에 재현탁하여 이를 4 ℃에서 30분간 용해시켰다. 용해된 세포를 15,000 rpm으로 30분간 원심 분리한 후, 상층액을 분리하여 10~40 % 글라이세롤 그레디언트 용액(glycerol gradient: 10 mM 트리스 (pH 7.5), 1 mM 염화마그네슘, 1 mM EGTA, 0.1 mM PMSF, 5 mM β-머캅토에탄올, 10 ~ 40 % 글라이세롤)에 로딩하였다. 이를 벡크만(Beckman) SW-28 로터(rotor)를 이용하여 4 ℃에서 24시간 동안 25,000 rpm으로 초고속 원심 분리하고 단백질 그레디언트를 96웰 딥 플레이트에 분획화하였다. 각각의 분획물을 다음의 방법으로 먼저 텔로머라제 활성을 테스트하여 가장 높은 활성을 보이는 분획물로 이후의 억제제 검색에 이용하였다.
텔로머라제의 효소 활성을 대량으로 측정하기 위하여 가장 일반적으로 이용되고 있는 TRAP(텔로미어 반복 서열 증폭 프로토콜: Kim, N.W. et al., Science, 226, 2011-2015, 1994)법을 변형하여 사용하였다.
1 단계: 위에서 얻은 분획물(약 60 ng의 단백질)을 반응 완충액 (20 mM 트리스 (pH 8.3), 15 mM 염화마그네슘, 63 mM 염화칼륨, 0.005 % Tween-20, 1 mM EGTA, 100 μM dNTPs, 50 nM TS 프라이머(서열번호: 1))과 섞어서 37 ℃에서 8분간 반응시킨 후, 94 ℃에서 90초 동안 열을 가하여 반응을 정지시켰다. 처리군에는 0.1 내지 10 μM의 베타-니트로스티렌계 화합물을 첨가하고, 대조군에는 디메틸술폭시드(DMSO)를 동량으로 첨가하여 텔로머라제의 활성에 미치는 화합물의 효과를 확인하였다. 텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물은 이 후 증폭을 위한 주형으로 사용하였다.
2 단계 : 1 단계에서 생성된 텔로머라제 생성물을 TS 프라이머와 ACX 프라이며 (서열번호: 2)를 이용하여 94 ℃, 60 ℃, 72 ℃에서 각각 30초씩 30 사이클동안 증폭시켰다. 이 때 내부 대조 표준의 주형으로 TSNT (서열번호: 3)를, 내부대조 표준 프라이머로 NT (서열번호: 4)를 함께 증폭하여 증폭과정에서 생기는 인위적 생성물의 효과를 배제하였다.
3 단계: 기존의 TRAP 방법에서는 증폭된 결과를 확인하기 위하여 전기 영동하여 분석하였지만 이 방법은 대량의 화합물을 검색하기에는 많은 시간과 노동력이 소모될 뿐만 아니라 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움도 있다. 이를 해결하기 위해서 본 발명에서는 텔로머라제에 의해 확장된 생성물이 두 종류의 프라이머에 의해서 이중 가닥의 염기서열로 증폭되는 점에 착안하여 이중 가닥 DNA에만 특이적으로 반응하여 정량적으로 결과를 확인할 수 있는 피코그린 형광 염색제(PicoGreen, Molecular Probes사 제품)를 사용하였다. 2 단계에서 증폭된 생성물(총 부피의 1/10)을 피코그린 형광 염색제(1 ㎕)와 잘 섞어준 후 2분 뒤에 형광계측기로 여기 파장은 485 nm에서, 방사 파장은 535 nm에서 측정하였다.
화합물의 텔로머라제 활성 억제율은 화합물(처리군)의 존재 하에서 계측된 수치 대 DMSO(대조군)의 존재 하에서 계측된 수치의 비율을 기준으로 산출하였다. 또한 대조군을 기준으로 텔로머라제 활성의 50 %를 억제하는 화합물의 농도를 IC50로 사용하였다.
이러한 방법으로 대량의 화합물로부터 IC50가 3 μM 이하인 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 선별하였으며, 이의 유도체를 합성하여 이들의 텔로머라제 억제효과를 조사하였다(표 1).
[표 1] 시험관 내 텔로머라제 억제 활성
Figure 112003522355043-pct00025
또한, 이 화합물들 중 대표 화합물인 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 0 내지 10 μM 로 시험관 내에서 TRAP 반응을 수행한 후, 각 시료의 1/5 부피 (10 ㎕)를 10% 비-변성화 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing polyacrylamide gel)에서 전기 영동한 결과를 도 1a에, 이 결과를 정량화하여 텔로머라제 활성을 50 % 억제시키는 양(IC50)을 확인한 결과를 도 1b에 각각 나타내었다.
실시예 2: 화합물의 동역학적 분석
3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌의 텔로머라제 억제 효과의 양태를 살피기 위하여 다양한 농도의 TS 프라이머에 의한 TRAP 반응에 다양한 농도의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 미치는 영향을 라인위버-버크 플롯 (Pascolo, E. et al., J. Biol Chem., 277(18), 15566-15572, 2002)으로 나타내었 다. 그 결과 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌에 의한 텔로머라제 억제는 TS 프라이머에 대하여 혼합형 비경쟁적 억제제(mixed-type noncompetitive inhibitor)임을 알 수 있다 (도 2a). 또한, 다양한 농도의 dNTP에 의한 TRAP 반응에 다양한 농도의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 미치는 영향을 라인위버-버크 플롯으로 나타내었다. 그 결과 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌에 의한 텔로머라제 억제는 dNTP에 대하여도 역시 혼합형 비경쟁적 억제제(mixed-type noncompetitive inhibitor)임을 알 수 있다(도 2b).
실시예 3: 세포 독성 실험
세포독성은 자궁경부암 세포주 HeLa(ATCC CCL-2)와 유방암세포주 MCF-7(ATCC HTB-22)를 이용하여 MTT 방법(Klemke, R.L. et al., J. Cell Biol., 127, 859-866, 1994, 본 실험은 Promega사의 CellTiter 96R Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit 제품을 사용하였으며 실험 방법 또한 Promega사의 실험 방법을 따라 수행하였다.)으로 세포 성장에 미치는 단기간의 약물독성을 실험하였다. 먼저 세포를 96 웰 플레이트에 각각 5 × 104 개씩 분주한 후 다음날 텔로머라제 억제제를 여러 농도로 처리하여 약 2-3일 동안 배양한 후 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-1]-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드) 염색제를 분주하였다. 그 후 배양기에서 2시간 방치한 후 배지를 제거하고 MTT 용해 완충액을 분주한 후 세포가 완전히 용해될 때까지 방치하였다. 결과는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하며 측정값을 환산하여 % 세포 생존율을 계산하였다. 반복 실험을 통한 평균 세 포성장억제 그래프로부터 50 % 억제를 일으키는 농도(IC50)를 계산하였으며 이는 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2] 화합물의 암세포주에 대한 세포 독성
Figure 112003522355043-pct00026
실시예 4: 다른 핵산 폴리머라제의 활성에 미치는 영향 실험
텔로머라제는 그 자체로 역전사 효소의 활성을 가지기 때문에 이들 화합물이 텔로머라제에 특이적으로 작용하는지 알아보기 위해서는 이와 유사한 다른 여러 가지의 폴리머라제에 대한 효과를 시험해 보아야 한다. 따라서 본 발명에서는 아래의 네 가지 종류의 효소에 대한 효과를 살펴보았다.
1) 텍 폴리머라제(Taq polymerase) 활성
텍 폴리머라제 활성 실험은 GAPDH 유전자의 450 bp의 단편을 증폭하는 K136 프라이머(서열번호 : 5)와 K137 프라이머(서열번호 : 6)를 이용한 PCR 조건에서 텔로머라제 억제제를 농도별(0.1 내지 10 μM)로 첨가하여 통상의 방법(Nakamura, T.M. et al., Scinece, 277, 955-959, 1997)으로 수행하였다. 텍 폴리머라제는 다카라(Takara)사의 제품을 이용하였고 94 ℃, 55 ℃, 72 ℃에서 각각 1분씩 25 사이클 동안 반응한 후 반응 산물은 1.2 % 아가로오즈 젤에서 전기 영동하였다. 사이버그린 (SYBRGreen, Moleculr Probes사의 제품) 염색을 수행하고 LAS-1000 CCD 시스템(Fujifilm사 제품)에서 결과를 얻어 이미지 게이지 프로그램(Fuji film사 제품) 을 이용해 정량 분석하였다. 대표적인 텔로머라제의 억제제로 알려진 PIPER(Calbiochem사 제품) 및 TMPyP4(Calbiochem사 제품)와 비교하여 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌의 텍 폴리머라제 활성에 대한 효과를 표 3에 나타내었다. 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌은 이들 억제제에 비하여 텍 폴리머라제 활성의 억제 효과가 거의 없었으며, 이는 상기 화합물이 텔로머라제에만 특이적이라는 것을 나타낸다.
[표 3] 텍 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
Figure 112003522355043-pct00027
2) DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 활성
DNA 폴리머라제 활성실험은 재조합 클레노우 단편(recombinant klenow fragment, Promega사 제품)을 사용하였고, 50 mM 트리스(pH 7.2), 10 mM MgSO4, 1 mM DTT, 1 ㎍ 블루스크립트 플라스미드, 100 ng 랜덤 헥사머 올리고, 각 0.2 mM의 디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP), 디옥시사이토신 5'-트리포스페이트(dCTP) 및 디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(dGTP), 0.07 mM 디그옥시제닌-11-2'-디옥시유리딘-5'-트리포스페이트(DIG-11-dUTP) 및 1 단위 클레노우 단편으로 이루어진 반응액에 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌(최종 처리 농도 10 μM)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물은 슬롯 블럿(slot blot) 장치(Amersham Pharmacia Biotech사 제품)를 이용하여 나일론 막에 전이한 후 디그옥시제닌 항체(Anti-digoxigenin-AP; Roche사 제품)를 이용하여 합성된 반응물을 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 4에 나타내었으며, 이로부터 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 DNA 폴리머라제 활성에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
[표 4] DNA 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
Figure 112003522355043-pct00028
3) RNA 폴리머라제(RNA polymerase) 활성
T7 RNA 폴리머라제 활성에 대한 영향을 알아보기 위해 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌(최종 처리 농도 10 μM)을 반응액(40 mM 트리스(pH 7.9), 6 mM 염화마그네슘, 2 mM 스퍼미딘(spermidine), 10 mM 염화나트륨, 10 mM DTT, 1 ㎍ 선형 블루스크립트 플라스미드, 0.5 mM 라이보뉴클레오타이드 혼합물(rNTP mix), 40 단위 T7 RNA 폴리머라제, 100 단위 RNAse 억제제)과 혼합하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 라이보그린(RiboGreen, Molecular Probes사의 제품)을 이용하여 합성된 RNA의 양을 형광계측기(fluorospectrometer)로 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 5에 나타냈으며, 이로부터 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 T7 RNA 폴리머라제 활성에 거의 영향 을 미치지 않음을 알 수 있다.
[표 5] RNA 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
Figure 112003522355043-pct00029
4) 역 전사효소(Reverse transcriptase) 활성
역 전사효소 활성은 재조합 M-MLV 역 전사효소(recombinant M-MLV reverse transcriptase, Promega사 제품)를 사용하였으며, 50 mM 트리스 (pH8.3), 75 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘, 10 mM DTT, 1 ㎍ HeLa 세포 RNA, 100 ng 랜덤 헥사머 올리고, 0.2 mM 디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP), 디옥시사이토신 5'-트리포스페이트(dCTP), 디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(dGTP), 0.07 mM 디그옥시제닌-11-2'-디옥시유리딘-5'-트리포스페이트(DIG-11-dUTP) 및 10 단위 M-MLV 역 전사효소로 이루어진 반응액에 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌(최종 처리 농도 10 μM)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물은 슬롯 블럿 장치를 이용하여 나일론 막에 전이한 후 디그옥시제닌 항체(Anti-digoxigenin-AP)를 이용하여 합성된 반응물을 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 6에 나타냈으며, 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 역 전사효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
[표 6] 역 전사효소의 활성에 미치는 영향
Figure 112003522355043-pct00030
실시예 5: 텔로미어 DNA의 길이 분석
3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌이 항암제로 작용하기 위해서는 시험관 내에서 텔로머라제의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라, 실제로 텔로머라제 활성이 있는 암세포에 처리하였을 때 암세포의 텔로미어 길이 감소를 유도하고 세포노화를 유발시켜야 한다.
이를 확인하기 위하여 (TTAGGG)50인 약 300 bp 길이의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 주형으로 이용한 랜덤 프라이밍 방법으로 탐침을 만들고 서던 블럿팅을 실시하였다.
HeLa 세포를 10 %의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지가 들어 있는 10 cm 플레이트에서 5 % CO2, 37 ℃의 조건으로 배양하면서 100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 배지에 첨가하여 세포에 처리하였다. 대조군은 동일 부피의 DMSO를 처리하였다. 처리 후 배양을 계속하면서 PD(population doubling) 10, 40, 80, 100 및 120에 각각 트립신 처리하여 세포를 분리한 다음 PBS로 세척한 후, 용해 완충액(10 mM 트리스 (pH 8.0), 10 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5 % 소디움 도데실 설페이트, 10 μg/ml RNase A)으로 재현탁해서 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 단백질분해효소 K를 20 ㎍/ml로 첨가한 후 60 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 일련의 페놀/크로로포름/이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v) 추출과 이소프로파놀 침전을 통해 게놈DNA를 회수하여 0.1× TE(1 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에 재현탁하여 4 ℃ 혹은 -20 ℃에 보관하였다.
이러한 방법으로 회수한 게놈 DNA를 제한 효소 Hinf I, Rsa I으로 완전히 절단시킨 후 일련의 페놀/크로로포름/이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v) 추출과 이소프로파놀 침전을 통해 정제한 후 흡광분석기로 정량하였다. 대조군과 처리군의 절단된 DNA를 동량(약 5 ㎍)으로 0.6 % 아가로오스 겔에서 전기영동하고 나일론 막으로 전이한 후 DNA 혼성교잡 분석을 하였다. 혼성교잡의 탐침은 DIG 시스템(digoxygenin-labelling kit; Roche사 제품)을 이용하였으며 약 300 bp의 길이의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 이용한 랜덤 프라이밍 방법으로 만들었다.
분석 결과, 약물 처리군에서 텔로미어 DNA의 길이가 대조군에 비해 약물처리기간이 늘어남에 따라 점진적으로 짧아짐을 확인하였다(도 3).
또한, PD 130을 기점으로 일부 세포를 나누어서 화합물의 처리를 중단하고 화합물이 없는 상태에서 추가로 PD 60 동안 배양한 결과 텔로미어의 길이가 DMSO를 처리한 대조군의 텔로미어 길이만큼 회복됨을 확인하였다(도 4, 레인 1 및 4). 한편, PD 130 이후 100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 배지에 첨가한 상태로 PD 190까지 계속 배양한 세포의 텔로미어 길이는 PD 130동안 100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 처리한 세포의 텔로미어 길이보다 더 짧아짐을 확인하였다(도 4, 레인 2 및 3).
실시예 6: 세포에 기초한 텔로머라제 활성 측정
HeLa 세포의 배양시 100 nM의 DMSO를 배지에 첨가하여 PD 193 동안 배양한 대조군("DMSO")과 100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 배지에 첨가하여 PD 190 동안 처리한 처리군("DPNS") 및 100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 배지에 첨가하여 PD 130 동안 배양한 다음 이후에는 화합물 없이 추가로 PD 60을 배양한 처리군("DPNS 제거")의 세포를 실시예 1에서 사용한 차가운 용해 완충액으로 용해시킨 다음 단백질 양을 정량하였다. 동량의 총 추출액으로 각각 실시예 1과 동일한, 변형된 TRAP법으로 텔로머라제의 활성을 측정하였고, 전기영동 결과 및 이를 정량화한 그래프를 도 5a 및 5b에 각각 나타내었다.
도 5a 및 5b에서, 세포에 내재하는 텔로머라제 활성이 화합물 처리에 의하여 줄어들고, 화합물 처리 중단 후 화합물이 없는 상태에서 배양했을 때 다시 회복됨을 알 수 있다.
실시예 7: 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색 (Senescence-Associated β-galactosidase assay)
100 nM의 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 PD 100 동안 처리한 HeLa 세포를 2 % 포름알데히드, 0.2 % 글루타르알데히드에서 고정시킨 후, 1 mg/ml X-gal 용액 (40 mM 시트릭산/인산나트륨 완충용액(pH 6.0), 5 mM 페리시아니드, 5 mM 페로시아니드, 150 mM 염화칼슘, 2 mM 염화마그네슘, 1 mg/ml X-gal)에서 20시 간 반응시켰다. 그 후 PBS로 세척하고, 염색된 세포를 광학현미경(Zeiss사의 Axiovert)으로 관찰하였다.
그 결과, DMSO를 처리한 대조군의 세포에서는 노화가 일어나지 않아 세포가 거의 염색되지 않은 반면(도 6a), 암세포에 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌을 장기간 처리하면 텔로미어의 길이가 짧아질 뿐만 아니라, 노화가 실제로 유도되어 세포가 푸른색으로 염색됨을 확인하였다 (도 6b).
본 발명의 베타-니트로스티렌계 화합물들은 다른 유사한 핵산 폴리머라제에 대한 영향이 거의 없이 텔로머라제만을 특이적으로 억제하며, 세포독성이 적으므로 텔로머라제 활성이 있는 모든 암세포에 항암제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 삭제
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  3. 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌, 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 톨루엔-4-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 벤젠설포닉산 4-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로-3-니트로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-브로모벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르,디페닐아세트산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 나프탈렌-1-설포닉산 [3-(2-니트로-비닐)-페닐]아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 베타-니트로스티렌계 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
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  6. 3-(3,5-디클로로펜옥시)-베타-니트로스티렌, 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 톨루엔-4-설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 벤젠설포닉산 4-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로-3-니트로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-클로로벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 4-브로모벤젠설포닉산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 디페닐아세트산 3-(2-니트로-비닐)-페닐 에스테르, 나프탈렌-1-설포닉산 [3-(2-니트로-비닐)-페닐]아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 베타-니트로스티렌계 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 베타-니트로스티렌계 화합물을 20 내지 95중량% 함유하는 조성물.
    Figure 112006020382083-pct00043
    Figure 112006020382083-pct00044
    Figure 112006020382083-pct00045
  8. 삭제
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