상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되며 텔로머라제 억제 활성을 나타내는 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 텔로머라제 억제 및 항암용 조성물을 제공한다:
화학식 1
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린은 비-펩티드성 GLP-1 수용체 및 글루타메이트 수용체의 길항제 (WO 00/42026 및 WO 99/62887)로 알려져 있었으나, 하기 설명하는 바와 같은 텔로머라제 분획물을 이용한 검색을 통하여 텔로머라제 활성을 억제하는 효과가 있음을 알아내었다.
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리토금속염(마그네슘염, 칼슘염 등)과 같은 무기금속염, 암모늄염, 유기염기염(예: 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜린염 등) 등 당업계에서 공지된 다양한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화 물은 통상적인 방법에 따라 제조하거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인하여 시간이 경과함에 따라 생성될 수도 있다.
본 발명에서는 텔로머라제 활성 억제 화합물을 얻기 위하여 대량의 소분자 화합물을 효율적으로 검색하는 방법으로서, 전통적인 텔로머라제 활성 측정법으로 알려져 있는 TRAP 방법(Kim, N.W. et al., Science, 266, 2011-2015, 1994)을 일부 변형한, 하기 단계를 포함하는 검색 방법을 사용하였다.
(1) 텔로머라제의 활성이 높은 세포 추출 분획을 얻는 단계;
(2) 상기 분획에 시험 물질을 처리하고 텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물을 얻는 단계;
(3) 상기 확장 생성물을 증폭시키는 단계; 및
(4) 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계.
이하에서 상기 검색 방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
1) 텔로머라제의 활성이 높은 세포 추출물의 분획을 얻는 단계
기존의 방법에서는 암세포로부터 용해 완충액을 이용하여 얻은 미정제된 추출물(crude extracts)로 텔로머라제 활성을 측정하지만, 본 발명에서는 이를 좀 더 순화시켜 텔로머라제의 민감성을 높이기 위하여 미정제된 추출물을 다시 글라이세롤 그라디언트를 이용하여 초고속 원심분리하고 각각의 분획물을 얻고 각 분획물로 텔로머라제 활성을 측정하여 가장 활성이 높은, 부분적으로 순화된 텔로머라제 분획물을 얻은 다음 이를 이용하여 각 화합물의 억제 정도를 측정한다.
2) 시험물질을 처리하고 텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물을 얻는 단계
1) 단계에서 얻은 분획물(약 60 ng의 단백질)을 반응 완충액 및 시험 물질, 예를 들어, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 첨가하여 텔로머라제에 의한 텔로미어 확장 반응을 수행한다. 한편 대조군으로 디메틸술폭시드(DMSO)를 시험 물질과 동량으로 첨가하여 텔로머라제의 활성에 미치는 화합물의 효과를 확인한다. 텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물은 이 후 증폭을 위한 주형으로 사용한다.
3) 상기 확장 생성물을 증폭하는 단계
2) 단계에서 생성된 텔로머라제 생성물을 PCR반응을 통하여 증폭시킨다. 예를어, TS 프라이머(서열번호: 1)와 ACX 프라이머(서열번호: 2)를 이용할 수 있으며, 이 때 내부 대조 표준의 주형으로 TSNT (서열번호: 3)를, 내부 대조 표준 프라이머로 NT (서열번호: 4)를 함께 증폭하여 증폭과정에서 생기는 인위적 생성물의 효과를 배제할 수 있다.
4) 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계
텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물을 확인하기 위하여 기존의 방법에서는 방사선 동위원소를 이용하여 PCR을 수행하고 그 생성물을 전기영동으로 확인하지만, 본 발명의 방법에서는 이중 가닥 DNA에만 특이적으로 반응하는 피코그린(PicoGreen) 형광 염색제를 PCR 산물과 반응시킨 후 형광을 육안으로 확인함으로써, 방사선 동위원소 사용의 위험성과 전기영동의 불편함을 배제하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다. 이 때, DMSO를 처리하여 텔로머라제에 의해 증폭된 확장 생성물을 피코그린과 반응시키고 형광계측기로 측정한 값을 기준으로 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 처리하여 증폭된 확장 생성물의 측정치를 백분율로 나타 냄으로써 억제 정도를 알 수 있다.
상기의 변형된 방법으로 대량의 소분자 화합물을 검색한 결과, 본 발명의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린은 텔로머라제 활성을 50 % 억제하는 농도(IC50)가 2 μM 이하로서 우수한 텔로머라제 억제 활성을 나타낸다 (도 1).
또한, 상기 화합물은 암세포에 대한 세포독성을 확인하기 위한 MTT 분석에서 텔로머라제의 활성을 억제하는 농도에서는 세포독성을 나타내지 않으며, 텍(Taq) 폴리머라제, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역 전사효소 등의 다른 유사한 핵산 폴리머라제에는 영향을 미치지 않고 텔로머라제에만 특이적으로 억제효과를 가진다.
텔로머라제 억제 활성을 나타내는 본 발명의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 항암제로 작용하기 위해서는 시험관 내에서 텔로머라제의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라, 실제로 텔로머라제 활성이 있는 암세포에 처리하였을 때 암세포의 텔로미어 길이 감소를 유도하고 세포노화를 유발시켜야 한다. 이를 확인하기 위하여 약 300 bp의 길이의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 탐침으로 하여 서던블럿팅을 실시하면 본 발명의 화합물을 장기간 처리하였을 때 텔로미어의 길이가 짧아지는 것을 확인할 수 있다. 또한 PD(population doubling) 191 이후에 화합물의 처리를 중단하고 화합물이 없는 상태에서 PD 140동안 더 배양하면 텔로미어의 길이가 다시 원래 상태로 회복된다 (도 3).
이러한 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린에 의한 텔로머라제의 활성 감소 와 텔로미어의 길이 감소는 텔로머라제의 주요 구성 유전자인 hTR과 hTERT의 발현을 감소시킴으로써 나타나는 현상은 아님을 알 수 있다 (도 4).
암세포에 본 발명의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리하면 텔로미어의 길이가 짧아질 뿐만 아니라, 노화가 실제로 유도됨을 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색법으로 확인할 수 있다 (도 5).
이와 같이, 본 발명의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린은 암세포에 세포독성 없이 특이적으로 텔로머라제의 활성을 억제하며, 암세포에 장기간 처리 시 텔로미어의 길이를 현저히 줄이고 노화를 유발한다. 이러한 결과는 본 화합물이 기존의 항암제에 비하여 정상세포에 대한 부작용 없이 텔로머라제 활성을 가지는 암세포만을 특이적으로 죽일 수 있는 유용한 항암제로 사용될 수 있음을 의미한다.
한편, 본 발명의 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학적 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하거나 이들로 희석하여 제조된 조성물을 캅셀, 새세이(sachet) 또는 기타 용기 형태의 담체 등에 봉입시키는 것이 바람직하다. 이러한 제형은, 예를 들어, 정제, 환제, 과립제, 분말, 새세이, 엘렉실제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사액, 멸균 분말, 연고제, 패취제 등의 형태일 수 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 물, 생리식염수, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤 조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 텔로머라제 활성 억제제 및 항암제 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 본 발명의 텔로머라제 억제제 및 항암제 조성물의 통상적인 1일 투여량은 활성 화합물로서 0.01 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학 조성물의 실제 투여량은 치료 대상 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 : 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 합성
단계 1: 화합물 2의 합성
4-클로로-2,6-디니트로아닐린 (화합물 1, 10.8g, 50mmol)을 무수 에탄올 (100 mL)에 녹여 질소 대기하에서 교반하였다. 그 반응 용액에 Pd/C (0.05 mol %)을 서서히 첨가한 후 10 psi에서 수소화 반응을 하였다. 반응이 종료되면 셀라이트(celite, 동양제철화학) 필터로 여과하여 Pd/C를 제거하고 여액은 감압농축하여 5-클로로벤젠-1,2,3-트리아민 (화합물 2)를 얻었다(수율 96%, 7.56g).
단계 2 : 화합물 3의 합성
5-클로로벤젠-1,2,3-트리아민 (화합물 2, 7.0g, 44.4 mmol)를 4N HCl (70 mL)에 녹이고 oxalic acid(4.4g, 49 mmol)를 넣고 반응 혼합액을 2시간 동안 환류하였다. 환류가 끝난 후 고체를 여과하고 물과 메탄올로 세척하여 원하는 화합물 5-아미노-7-클로로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 3)을 얻었다(수율 82%, 7.7 g).
단계 3: 화합물 4의 합성
5-아미노-7-클로로-1,4-디하이드로퀴녹살린-2,3-디온(화합물 3, 7.0 g, 33 mmol)을 무수 메틸렌클로라이드(70 mL)에 녹이고 CF3CO3H (9.44g, 72.6 mmol)을 천천히 가하고 1-2시간 동안 환류 시켰다. 반응이 종료되면 감압농축하여 용매를 제거하고 에탄올로 재결정하여 화합물 7-클로로 -5-니트로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3
-디온 (화합물 4)를 얻었다(수율 70%, 5.58g).
단계 4 : 화합물 5(2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린)의 합성
7-클로로 -5-니트로-1,4-디히드로퀴녹살린-2,3-디온 (화합물 4, 5.0g, 20.7 mmol)를 인산 옥시클로라이드 (50 mL)에 녹이고 촉매량으로 DMF를 소량 가한 후 1-2시간 환류하였다. 반응이 종료되면 반응 혼합액을 감압농축하여 POCl3를 제거하고 조심스럽게 얼음물을 가하면 고체가 생성된다. 물로 세척하고 차가운 에탄올로 세척하여 화합물 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 (화합물 5)를 얻었다(수율 89%, 5.13g).
1H NMR(300 MHz, d6-DMSO): d8.73(s, 1H), 8.60(s, 1H).
실시예 1: 텔로머라제 활성에 대한 효과 검색
1 단계: 효과적인 텔로머라제 억제제를 검색하기 위해서 먼저 부분적인 텔로머라제 분획물을 얻어야 한다. 이를 위하여 1 ×108 개의 HeLa 세포 (ATCC CCL-2)를 준비한 다음, 차가운 용해 완충액 (10 mM 트리스 (pH 7.5), 0.5 M 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 1 mM EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether) -N,N,N'N'-tetra acetic acid), 0.5 % CHAPS(3-(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio-1-propane-sulfonate), 0.1 mM PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride), 5 mM 베타-머캅토에탄올)에 재현탁하여 이를 4 ℃에서 30분간 용해시켰다. 용해된 세포를 15,000 rpm으로 30분간 원심 분리한 후, 상층액을 분리하여 10~40 % 글라이세롤 그레디언트 용액(glycerol gradient: 10 mM 트리스 (pH 7.5), 1 mM 염화마그네슘, 1 mM EGTA, 0.1 mM PMSF, 5 mM β-머캅토에탄올, 10 ~ 40 % 글라이세롤)에 로딩하였다. 이를 벡크만(Beckman) SW-28 로터(rotor)를 이용하여 4 ℃에서 24시간 동안 25,000 rpm으로 초고속 원심 분리하고 단백질 그레디언트를 96웰 딥 플레이트에 분획화하였다. 각각의 분획물을 다음의 방법으로 먼저 텔로머라제 활성을 테스트하여 가장 높은 활성을 보이는 분획물을 선택하고 이후의 억제제 검색에 이용하였다.
텔로머라제의 효소 활성을 대량으로 측정하기 위하여 가장 일반적으로 이용 되고 있는 TRAP(텔로미어 반복 서열 증폭 프로토콜: Kim, N.W. et al., Science, 266, 2011-2015, 1994)법을 변형하여 사용하였다.
2 단계: 위에서 얻은 분획물(약 60 ng의 단백질)을 반응 완충액 (20 mM 트리스 (pH 8.3), 15 mM 염화마그네슘, 63 mM 염화칼륨, 0.005 % Tween-20, 1 mM EGTA, 100 μM dNTPs, 50 nM TS 프라이머 (서열번호: 1))과 섞어서 37 ℃에서 8분간 반응시킨 후, 94 ℃에서 90초 동안 열을 가하여 반응을 정지시켰다. 처리군에는 0.1 내지 10 μM의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 첨가하고, 대조군에는 디메틸술폭시드(DMSO)를 동량으로 첨가하여 텔로머라제의 활성에 미치는 화합물의 효과를 확인하였다. 텔로머라제에 의해 생성된 확장 생성물은 이 후 증폭을 위한 주형으로 사용하였다.
3 단계 : 1 단계에서 생성된 텔로머라제 생성물을 TS 프라이머와 ACX 프라이머 (서열번호: 2)를 이용하여 94 ℃, 60 ℃, 72 ℃에서 각각 30초씩 30 사이클 동안 증폭시켰다. 이 때 내부 대조 표준의 주형으로 TSNT (서열번호: 3)를, 내부 대조 표준 프라이머로 NT (서열번호: 4)를 함께 증폭하여 증폭과정에서 생기는 인위적 생성물의 효과를 배제하였다.
4 단계: 기존의 TRAP 방법에서는 증폭된 결과를 확인하기 위하여 전기 영동하여 분석하였지만 이 방법은 대량의 화합물을 검색하기에는 많은 시간과 노동력이 소모될 뿐만 아니라 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움도 있다. 이를 해결하기 위해서 본 발명에서는 텔로머라제에 의해 확장된 생성물이 두 종류의 프라이머에 의해서 이중 가닥의 염기서열로 증폭되는 점에 착안하여 이중 가닥 DNA에만 특이적으로 반응하여 정량적으로 결과를 확인할 수 있는 피코그린 형광 염색제 (PicoGreen, Molecular Probes사 제품)를 사용하였다. 2 단계에서 증폭된 생성물 (총 부피의 1/10)을 피코그린 형광 염색제(1 ㎕)와 잘 섞어준 후 2분 뒤에 형광계측기로 여기 파장은 485 nm에서, 방사 파장은 535 nm에서 측정하였다.
화합물의 텔로머라제 활성 억제율은 화합물(처리군)의 존재 하에서 계측된 수치 대 DMSO(대조군)의 존재 하에서 계측된 수치의 비율을 기준으로 산출하였다. 또한 대조군을 기준으로 텔로머라제 활성의 50 %를 억제하는 화합물의 농도를 IC50로 사용하였다.
텔로머라제의 활성을 유의적으로 억제하는 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 각각 0 내지 10 (0, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10) μM로 시험관 내에서 TRAP 반응을 수행한 후, 각 시료의 1/5 부피 (10 ㎕)를 10% 비-변성화 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing polyacrylamide gel)에서 전기 영동한 결과를 도 1a에, 이 결과를 정량화하여 텔로머라제 활성을 50 % 억제시키는 양(IC50)을 확인한 결과를 도 1b에 각각 나타내었다. 본 발명의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 텔로머라제에 대한 IC50은 2 μM이하로 나타났다.
실시예 2: 화합물의 동역학적 분석
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 텔로머라제 억제 효과의 양태를 살피기 위하여 다양한 농도의 TS 프라이머에 의한 TRAP 반응에 다양한 농도의 2,3,7-트 리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 미치는 영향을 라인위버-버크 플롯(Pascolo, E. et al., J. Biol Chem., 277(18), 15566-15572, 2002)으로 나타내었다. 그 결과 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린에 의한 텔로머라제 억제는 TS 프라이머에 대하여 혼합형 비경쟁적 억제제(mixed-type noncompetitive inhibitor)임을 알 수 있다 (도 2a). 또한, 다양한 농도의 dNTP에 의한 TRAP 반응에 다양한 농도의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 미치는 영향을 라인위버-버크 플롯으로 나타내었다. 그 결과 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린에 의한 텔로머라제 억제는 dNTP에 대하여도 역시 혼합형 비경쟁적 억제제(mixed-type noncompetitive inhibitor)임을 알 수 있다(도 2b).
실시예 3: 세포 독성 실험
세포독성은 사람의 유방암 세포주인 MCF-7(ATCC HTB-22)와 사람의 섬유육종 세포주인 HT-1080 (ATCC CCL-121)를 이용하여 MTT 방법(Klemke, R.L. et al., J. Cell Biol., 127, 859-866, 1994, 본 실험은 Promega사의 CellTiter 96R Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit 제품을 사용하였으며 실험 방법 또한 Promega사의 실험 방법을 따라 수행하였다)으로 세포 성장에 미치는 단기간의 약물독성을 실험하였다. 먼저 세포를 96 웰 플레이트에 각각 5 ×104 개씩 분주한 후 다음날 텔로머라제 억제제를 여러 농도로 처리하여 3일 동안 배양한 후 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-1]-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드) 염색제를 분주하였다. 그 후 배양기에서 2시간 방치한 후 배지를 제거하고 MTT 용해 완충액을 분주한 후 세포가 완전히 용해될 때까지 방치하였다. 결과는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 측정값을 환산하여 % 세포 생존율을 계산하였다. 반복 실험을 통한 평균 세포성장억제 그래프로부터 50 % 억제를 일으키는 농도(IC50)를 계산하였으며 이는 표 1에 나타낸 바와 같다.
화합물의 암세포주에 대한 세포 독성
세포주 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 IC50
(μM) |
MCF-7 |
10.8 |
HT-1080 |
15.4 |
실시예 4: 다른 핵산 폴리머라제의 활성에 미치는 영향 실험
텔로머라제는 그 자체로 역전사 효소의 활성을 가지기 때문에 이 화합물이 텔로머라제에 특이적으로 작용하는지 알아보기 위해서는 이와 유사한 다른 여러 가지의 폴리머라제에 대한 효과를 시험해 보아야 한다. 따라서 본 발명에서는 아래의 네 가지 종류의 효소에 대한 효과를 살펴보았다.
1) 텍 폴리머라제(Taq polymerase) 활성
텍 폴리머라제 활성 실험은 GAPDH 유전자의 450 bp의 단편을 증폭하는 K136 프라이머(서열번호 : 5)와 K137 프라이머(서열번호 : 6)를 이용한 PCR 조건에서 텔로머라제 억제제를 농도별(0.1 내지 10 μM)로 첨가하여 통상의 방법(Nakamura, T.M. et al., Scinece, 277, 955-959, 1997)으로 수행하였다. 텍 폴리머라제는 다카라(Takara)사의 제품을 이용하였고 94 ℃, 55 ℃, 72 ℃에서 각각 1분씩 25 사이클 동안 반응한 후 반응 산물은 1.2 % 아가로오즈 젤에서 전기 영동하였다. 사이버그린 (SYBRGreen, Moleculr Probes사의 제품) 염색을 수행하고 LAS-1000 CCD 시스템(Fujifilm사 제품)에서 결과를 얻어 이미지 게이지 프로그램(Fuji film사 제품)을 이용해 정량 분석하였다. 대표적인 텔로머라제의 억제제로 알려진 PIPER(Calbiochem사 제품) 및 TMPyP4(Calbiochem사 제품)와 비교하여 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 텍 폴리머라제 활성에 대한 효과를 표 2에 나타내었다.
텍 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
화합물 |
IC50
(μM) |
10 μM에서의 잔류 효소 활성 (% 활성) |
PIPER |
0.9 |
3.2 |
TMPyP4
|
0.3 |
0.1 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 |
10< |
89.2 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린은 이들 억제제에 비하여 텍 폴리머라제 활성의 억제 효과가 거의 없었으며, 이는 상기 화합물이 텔로머라제에만 특이적이라는 것을 나타낸다.
2) DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 활성
DNA 폴리머라제 활성실험은 재조합 클레노우 단편(recombinant Klenow fragment, Promega사 제품)을 사용하였고, 50 mM 트리스(pH 7.2), 10 mM MgSO4, 1 mM DTT, 1 ㎍ 블루스크립트 플라스미드, 100 ng 랜덤 헥사머 올리고, 각 0.2 mM의 디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP), 디옥시사이토신 5'-트리포스페이트(dCTP) 및 디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(dGTP), 0.07 mM 디그옥시제닌-11-2'-디옥시유리딘-5'-트리포스페이트(DIG-11-dUTP) 및 1 단위 클레노우 단편으로 이루어진 반응액에 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린(최종 처리 농도 10 μM)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물은 슬롯 블럿(slot blot) 장치(Amersham Pharmacia Biotech사 제품)를 이용하여 나일론 막에 전이한 후 디그옥시제닌 항체(Anti-digoxigenin-AP; Roche사 제품)를 이용하여 합성된 반응물을 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 3에 나타내었으며, 이로부터 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 DNA 폴리머라제 활성에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
DNA 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
화합물 |
IC50
(μM) |
10 μM에서의 잔류 효소 활성 (% 활성) |
PIPER |
10< |
67.6 |
TMPyP4
|
9.1 |
43.6 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 |
10< |
95.2 |
3) RNA 폴리머라제(RNA polymerase) 활성
T7 RNA 폴리머라제 활성에 대한 영향을 알아보기 위해 2,3,7-트리클로로-5- 니트로-퀴녹살린(최종 처리 농도 10 μM)을 반응액(40 mM 트리스(pH 7.9), 6 mM 염화마그네슘, 2 mM 스퍼미딘(spermidine), 10 mM 염화나트륨, 10 mM DTT, 1 ㎍ 선형 블루스크립트 플라스미드, 0.5 mM 라이보뉴클레오타이드 혼합물(rNTP mix), 40 단위 T7 RNA 폴리머라제, 100 단위 RNAse 억제제)과 혼합하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 라이보그린(RiboGreen, Molecular Probes사의 제품)을 이용하여 합성된 RNA의 양을 형광계측기(fluorospectrometer)로 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 4에 나타냈으며, 이로부터 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 T7 RNA 폴리머라제 활성에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
RNA 폴리머라제의 활성에 미치는 영향
화합물 |
IC50 (μM) |
10 μM에서의 잔류 효소 활성 (% 활성) |
PIPER |
3.4 |
28.3 |
TMPyP4
|
0.4 |
0.7 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 |
10< |
94.8 |
4) 역 전사효소(Reverse transcriptase) 활성
역 전사효소 활성은 재조합 M-MLV 역 전사효소(recombinant M-MLV reverse transcriptase, Promega사 제품)를 사용하였으며, 50 mM 트리스 (pH 8.3), 75 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘, 10 mM DTT, 1 ㎍ HeLa 세포 RNA, 100 ng 랜덤 헥사머 올리고, 0.2 mM 디옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP), 디옥시사이토신 5'- 트리포스페이트(dCTP), 디옥시구아노신 5'-트리포스페이트(dGTP), 0.07 mM 디그옥시제닌-11-2'-디옥시유리딘-5'-트리포스페이트(DIG-11-dUTP) 및 10 단위 M-MLV 역 전사효소로 이루어진 반응액에 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린(최종 처리 농도 10 μM)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물은 슬롯 블럿 장치를 이용하여 나일론 막에 전이한 후 디그옥시제닌 항체(Anti-digoxigenin-AP)를 이용하여 합성된 반응물을 정량하였다. 이의 결과는 PIPER 및 TMPyP4의 결과와 비교하여 표 5에 나타냈으며, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 역 전사효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
역 전사효소의 활성에 미치는 영향
화합물 |
IC50 (μM) |
10 μM에서의 잔류 효소 활성 (% 활성) |
PIPER |
3.1 |
12.4 |
TMPyP4
|
2.9 |
2.2 |
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 |
10< |
102.7 |
실시예 5: 텔로미어 DNA의 길이 분석
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 항암제로 작용하기 위해서는 시험관 내에서 텔로머라제의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라, 실제로 텔로머라제 활성이 있는 암세포에 처리하였을 때 암세포의 텔로미어 길이 감소를 유도하고 세포노화를 유발시켜야 한다.
이를 확인하기 위하여 (TTAGGG)50인 약 300 bp 길이의 텔로미어 반복 염기서 열 단편을 주형으로 이용한 랜덤 프라이밍 방법으로 탐침을 만들고 MCF-7과 HT-1080의 두 가지 세포주에 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 처리한 후, 서던 블럿팅을 실시하였다.
MCF-7 세포를 10 %의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지가 들어 있는 10 cm 플레이트에서 5 % CO2, 37 ℃의 조건으로 배양하면서 1 μM의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 배지에 첨가하여 세포에 처리하였다. 대조군은 동일 부피의 DMSO를 처리하였다. 처리 후 배양을 계속하면서 DMSO 대조군의 경우 PD(population doubling) 42와 356에, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 처리군의 경우 PD 35와 305에 각각 트립신을 처리하여 세포를 분리한 다음 PBS로 세척한 후, 용해 완충액(10 mM 트리스 (pH 8.0), 10 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5 % 소디움 도데실 설페이트, 10 μg/ml RNase A)으로 재현탁해서 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 단백질분해효소 K를 20 ㎍/ml로 첨가한 후 60 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 일련의 페놀/크로로포름/이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v) 추출과 이소프로파놀 침전을 통해 게놈 DNA를 회수하여 0.1× TE(1 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에 재현탁하여 4 ℃ 혹은 -20 ℃에 보관하였다.
이러한 방법으로 회수한 게놈 DNA를 제한 효소 Hinf I, Rsa I으로 완전히 절단시킨 후 일련의 페놀/크로로포름/이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v) 추출과 이소프로파놀 침전을 통해 정제한 후 흡광분석기로 정량하였다. 대조군과 처리군의 절단된 DNA를 동량(약 5 ㎍)으로 0.6 % 아가로오스 겔에서 전기영동하고 나일론 막으로 전이한 후 DNA 혼성교잡 분석을 하였다. 혼성교잡의 탐침은 DIG 시스템 (digoxygenin-labelling kit; Roche사 제품)을 이용하였으며 약 300 bp의 길이의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 이용한 랜덤 프라이밍 방법으로 만들었다.
분석 결과, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 처리군에서 텔로미어 DNA의 길이가 대조군에 비해 약물처리기간이 늘어남에 따라 짧아짐을 확인하였다. DMSO를 처리한 대조군 (레인 1 및 2)에서는 텔로미어의 평균 길이가 약 3.5Kb이고, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 PD 35까지 처리하면(레인 3), 텔로미어의 평균 길이가 3Kb로, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린를 PD 305까지 처리하면(레인 4) 텔로미어의 평균 길이가 2Kb 정도로 감소되는 것을 확인하였다(도 3a). 또한, PD 191을 기점으로 일부 세포를 나누어서 화합물의 처리를 중단하고 화합물이 없는 상태에서 추가로 PD 140 동안 배양한 결과 텔로미어의 길이가 DMSO를 처리한 대조군의 텔로미어 길이만큼 회복됨을 확인하였다(도 3a, 레인 5).
마찬가지의 방법으로 또 다른 암세포인 HT-1080 세포주에 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리하여 텔로미어의 길이 변화를 확인하였다. 즉, HT-1080 세포를 10 %의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 EMEM 배지가 들어 있는 10 cm 플레이트에서 5 % CO2, 37 ℃의 조건으로 배양하면서 1 μM의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 배지에 첨가하여 세포에 처리하였다. 처리 후 배양을 계속하면서 DMSO 대조군의 경우 PD 321와 341에, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 처리군의 경우 PD 294에 각각 트립신을 처리하여 세포를 분리한 다 음 위와 동일한 방법으로 게놈 DNA를 분리하고 제한효소로 절단한 후, (TTAGGG)50의 텔로미어 반복 염기서열 단편을 탐침으로 이용하여 서던 블럿팅을 실시하였다. 그 결과, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 장기간 처리에 의하여 텔로미어의 길이가 줄어듬을 알 수 있다 (도 3b).
실시예 6: 텔로머라제 관련 유전자의 발현 변화 분석
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린에 의해서 텔로머라제의 활성이 감소하고 텔로미어의 길이가 줄어드는 것이 텔로머라제의 주요 구성 유전자인 hTR(텔로머라제 RNA)과 hTERT(텔로머라제 활성 단백질)의 발현이 감소되기 때문에 나타나는 현상인지를 알아보기 위하여 역 전사효소-Taq 폴리머라제 증폭반응(RT-PCR)을 수행하였다. 즉, DMSO, 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리한 MCF-7 세포에서 트라이졸 시약(Trizol, Gibco BRL사 제품)을 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, 300ng의 RNA를 주형으로 실시예 4에서 수행했던 방법과 동일하게 역 전사효소 반응을 수행하였고 역 전사효소 반응물의 1/20 부피를 주형으로 하여 순차적인 Taq 폴리머라제 증폭반응을 각 유전자에 따라 다음과 같은 조건으로 수행하였다.
hTR은 F3b 프라이머(서열번호:7)와 R3c 프라이머(서열번호:8)를 이용하여 94 ℃, 55 ℃, 72 ℃에서 각각 45초, 60초, 60초씩 22 사이클 동안 반응하여 126bp의 증폭물을 얻었고, hTERT는 LT5 프라이머(서열번호:9)와 LT6 프라이머(서열번호:10)를 이용하여 94 ℃, 60 ℃, 72 ℃에서 각각 45초, 60초, 60초씩 31 사이클 동안 반응하여 145bp의 증폭물을 얻었으며, GAPDH는 K136 프라이머(서열번호:5)와 K137 프라이머(서열번호:6)를 이용하여 94 ℃, 55 ℃, 72 ℃에서 각각 45초, 60초, 60초씩 16 사이클 동안 반응하여 450bp의 증폭물을 얻었다. (이때 GAPDH 유전자는 각각의 세포의 반응 결과물의 양적 보정을 위해 대조군으로 사용하였다.)
각각의 증폭된 양을 확인하기 위하여 반응 산물 부피의 1/10을 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 한 후, 사이버그린 (SYBR Green, Molecular Probes사의 제품)으로 염색하여 LAS-1000 CCD 시스템(Fujifilm사 제품)으로 확인한 결과 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 처리에 의하여 hTR과 hTRET의 두 유전자의 RNA 발현 양상이 줄어들지 않았음을 알 수 있었다.
이상의 실험결과로 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린이 텔로머라제의 활성을 감소시키는 것은 hTR과 hTERT 유전자의 발현을 감소시켜서 나타나는 현상이 아니라 텔로머라제에 직접 작용하여 나타나는 현상임을 알 수 있었다.
실시예 7: 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색 (Senescence-Associated β-galactosidase assay)
정상적인 세포의 나이에 따른 노화현상은 다양한 형태학적 변화를 일으킨다고 알려져 있다 (Hayflick and Moorhead, Exp. Cell Res., 25, 585-621, 1961). 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리한 세포주에서 텔로머라제의 활성이 억제됨으로써 암세포의 노화현상이 유도되는 지를 알아보기 위하여 광학 현미경(Zeiss사의 Axiovert)으로 관찰하였다. 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 PD 319동안 처리한 세포는 DMSO 대조군에 비하여 세포의 크기가 커지고 평편해지며, 세포내에 액포가 차 있는, 전형적인 노화세포의 형태학적 양상을 띠고 있는 것을 볼 수 있었다(도 5a).
또한 약물에 의한 암세포의 노화현상은 β-갈락토시다제라는 효소의 활성 증가로도 확인할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 1 μM의 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 처리한 세포를 2 % 포름알데히드, 0.2 % 글루타르알데히드에서 고정시킨 후, 1 mg/ml X-gal 용액 (40 mM 시트릭산/인산나트륨 완충용액(pH 6.0), 5 mM 페리시아니드, 5 mM 페로시아니드, 150 mM 염화칼슘, 2 mM 염화마그네슘, 1 mg/ml X-gal)에서 20시간 반응시켰다. 그 후 PBS로 세척하고, 염색된 세포를 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, DMSO를 처리한 대조군의 세포에서는 노화가 일어나지 않아 세포가 거의 염색되지 않은 반면, 암세포에 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리하면 노화가 실제로 유도되어 β-갈락토시다제의 활성에 의하여 세포가 푸른색으로 염색됨을 확인하였다(도 5b).
실시예 8: 세포 주기 분석
2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리하였을 때 암세포의 세포 주기에 변화가 있는지 알아보기 위하여 유세포 분석을 실시하였다.
먼저 DMSO 대조군과 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린 처리군의 세포를 각각 1 ×106씩 준비한 다음, 70% 차가운 에탄올로 고정하여 분석하기 바로 전까지 4 ℃에 보관하였다. 분석하는 당일에 여러 번의 원심분리를 통하여 에탄올을 완전히 제거하고 침전된 세포를 100 mg/ml RNase A와 50 μg/ml 프로피디움 아이오다이드에 재현탁하여 37 ℃에서 30분간 방치함으로써 핵을 염색한 후, FACSCalibur (Beckton Dickinson사 제품)으로 세포 주기를 분석하였다.
그 결과 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린을 장기간 처리한 세포에서는 DMSO를 처리한 세포에 비하여 G1 주기가 현저하게 줄어들고 늦은 S 주기가 증가하는 주기의 정지 현상을 보였다. 따라서 2,3,7-트리클로로-5-니트로-퀴녹살린의 장기간 처리에 의하여 암세포의 세포주기가 느려져서 결국 암세포의 성장이 억제됨을 알 수 있었다.