JP2020000097A - ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤を提供することを目的とする。【解決手段】 ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのアンチセンス鎖に対して８０％以上のホモロジーを有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１３個以上同一の塩基である配列を含む、１３個以上４０個以下のオリゴマーをライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤とする。【選択図】なし

Description

本発明は、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤に関する。

ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症（Lysosomal acid lipase deficiency；ＬＡＬ−Ｄ）は、進行性の常染色体劣性遺伝疾患であって、臨床的には、乳児期に致死的に発症するウォルマン（Wolman）病と、成人期になって発症するコレステロールエステル蓄積症が知られている。ＬＡＬ−Ｄ患者では、ライソゾーム酸性リパーゼ（Lysosomal acid lipase；ＬＡＬ）の活性が遺伝的に著しく低下するため、肝臓や脾臓などの臓器に脂質が慢性的に蓄積し、その結果、重篤な肝臓病をはじめとする臓器異常、中枢疾患、心血管系疾患などによって、早期に死に至る場合もある。

ＬＡＬ−Ｄの責任遺伝子は、１０番染色体上にあるライソゾーム酸性リパーゼ（Lysosomal acid type lipase gene；ＬＩＰＡ）遺伝子であることが知られている。この遺伝子のｃＤＮＡの８９４番目に対応する塩基がＧ（野生型）からＡ（変異型）に変異することにより（以下、この変異をｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異と称する）、第８番目のエクソンからの転写領域を欠失した異常ｍＲＮＡを産生するスプライシングが起こるようになる。それにより、ライソゾーム酸性リパーゼの産生量が顕著に低下することでＬＡＬ−Ｄが発症する。

従来、ＬＡＬ−Ｄの治療には、造血幹細胞移植、またはＬＡＬ酵素を投与することによって行われてきた。

特開２０１３−５４０７３３

本発明は、新規なライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤を提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのアンチセンス鎖に対して８０％以上のホモロジーを有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１３個以上同一の塩基である配列を含む、１３個以上４０個以下のオリゴマーである。５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１５個以上同一の塩基である配列を含み、１５個以上４０個以下であってもよい。５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１７個以上同一の塩基である配列を含み、１７個以上４０個以下であってもよい。５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）である配列を含み、１８個以上４０個以下であってもよい。また、上記オリゴマーは、ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖に対して１００％の相補的な塩基を有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）からなる配列を含んでもよい。また、上記オリゴマーは、配列１に記載のヒトライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖の塩基配列における、５’末端から第７〜２４番目、第８〜２５番目、第９〜２６番目、第１０〜２７番目、第１１〜２８番目、第１２〜２９番目、第１３〜３０番目、及び第１４〜３１番目からなる群から選択される塩基配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなってもよい。

また、上記オリゴマーは、オリゴヌクレオチドまたは１以上の糖部分及び／またはリン酸結合部分が修飾されている修飾オリゴヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾された糖部分の２’位が修飾されていてもよい。前記修飾された糖部分の２’位の‐ＯＨ基が、‐Ｈ、‐ＯＲ、‐Ｒ、‐Ｒ’ ‐ＯＲ、‐ＳＨ、‐ＳＲ、‐ＮＨ_２、‐ＮＨＲ、‐ＮＲＲ’’、‐ＯＮＨ、‐ＯＮＲ、‐Ｎ_３、‐ＣＮ、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ及び‐Ｉからなる群より選択されるいずれかの基（‐Ｒ、‐Ｒ’’は、それぞれ独立にＣ_１-Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、Ｃ_１-Ｃ_６アルキルカルボニル又はアリールから選択され、上記‐Ｒ’は、アルキレンを表す。）で置換されることによって、前記糖部分の２’位が修飾されていてもよい。前記修飾された糖部分の２’位の‐ＯＨ基が、‐ＯＣＨ_３または‐ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３で置換されていてもよい。前記修飾された糖部分の２’位と４’位が架橋されていてもよい。前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ， ４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＮＡ）、Ａｍｉｄｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＡｍＮＡ）、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＧｕＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｃｐＢＮＡ）からなる群から選択されてもよい。前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐リボヌクレオチドであってもよく、前記２’‐デオキシ‐リボヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐アデノシン、または２’‐デオキシ‐グアノシンであってもよい。また、前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、２’‐フルオロ‐シチジン、２’‐フルオロ‐ウリジン、２’‐フルオロ‐アデノシン、２’‐フルオロ‐グアノシン、２’‐アミノ‐シチジン、２’‐アミノ‐ウリジン、２’‐アミノ‐アデノシン、２’‐アミノ‐グアノシン、および２’‐アミノ‐ブチリルピレン‐ウリジンからなる群から選択されるヌクレオチドであってもよい。前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、５‐ブロモ‐ウリジン、５‐ヨード‐ウリジン、５‐メチル‐シチジン、リボチミジン、２‐アミノ‐プリン、５‐フルオロ‐シチジン、５‐フルオロ‐ウリジン、２、６‐ジアミノ‐プリン、４‐チオ‐ウリジン、５‐アミノ‐アリル‐ウリジンからなる群から選択されるヌクレオチドであってもよい。前記修飾されたリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択される結合で構成されてもよい。

また、前記オリゴマーが、モルフォリノオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーでもよい。前記モルフォリノオリゴヌクレオチドがホスホロジアミデ‐トモルフォリノオリゴヌクレオチドを含んでもよい。５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基であってもよい。

また、前記オリゴマーが、ペプチド核酸を含んでもよい。

また、前記オリゴマーが、オリゴヌクレオチドまたは１以上の糖部分及び／またはリン酸結合部分が修飾されている修飾オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノオリゴヌクレオチドの両方を含むオリゴマーであってもよい。前記修飾オリゴヌクレオチドが、上記いずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を有効成分として含有する、スプライシング機能調節剤である。

本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を有効成分として含有する、医薬組成物である。

本発明のさらなる実施態様は、上記医薬組成物を含有する医薬またはライソゾ‐ム酸性リパーゼ欠損症治療薬である。

本発明のさらなる実施態様は、哺乳動物細胞において、ライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体に対し、第８番目のエクソンからの転写領域を欠失した異常ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構を、第８番目のエクソンからの転写領域を有する正常ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構にする、スプライシング機構調節方法であって、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を、前記ヒト細胞に投与する工程を含む、スプライシング機構調節方法である。

本発明のさらなる実施態様は、哺乳動物におけるライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療方法であって、前記哺乳動物に対し、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物の有効量を投与する工程を含む、予防または治療方法である。

本発明のさらなる実施態様は、ライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療に使用するための、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物である。

本発明のさらなる実施態様は、ライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療剤を製造するための、上記いずれかのオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物の使用である。

本発明によって、新規なライソゾーム酸性リパーゼ欠損症の予防または治療剤を提供することが可能になった。

本発明の実施例において、正常ＬＩＰＡ遺伝子と変異ＬＩＰＡ遺伝子の検出方法とその結果を示す図である。（Ａ）ＧＭ０３１１１患者ゲノムにおける各変異［ｃ．８９４Ｇ＞Ａと９６７＿９６８ｄｅｌＡＧ（ｐ．Ｓ３２３Ｌｆｓ＊４４）］の位置を示す。（Ｂ）ＦＬ ＬＩＰＡ検出用のプライマー／プローブセットの位置を示す。（Ｃ）ＦＬ ＬＩＰＡ検出用のプライマー／プローブセットを用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の結果を示す。（Ｄ）Ｄｅｌｔａ８ ＬＩＰＡ検出用のプライマー／プローブセットの位置を示す。（Ｅ）Ｄｅｌｔａ８ ＬＩＰＡ検出用のプライマー／プローブセットを用いたｑＰＣＲの結果を示す。 本発明の実施例において、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異及びｃ．９６７＿９６８ｄｅｌＡＧ（ｐ．Ｓ３２３Ｌｆｓ＊４４）変異を複合ヘテロ接合で有する患者（ＧＭ０３１１１）とｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有しないがｃ．１９３Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有する保因者（ＧＭ０３５５８）において、実施例１のｑＰＣＲ法で、（Ａ）エクソン８を含有した正常ｃＤＮＡと（Ｂ）エクソン８を含有しない変異ｃＤＮＡを検出した時の結果の一例である。 本発明の実施例において、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲによる患者由来のＬＩＰＡｃＤＮＡの検出結果を示した図である。（Ａ）ＬＩＰＡｃＤＮＡの検出原理（Ｂ）検出結果を示す図である。 本発明の実施例において、ＬＩＰＡ遺伝子のイントロン８に対するアンチセンスオリゴマーがＬＩＰＡ遺伝子発現におけるスプライシング調節機能を有することを示す図である。 本発明の実施例において、アンチセンスオリゴマーＬ９−２６の（Ａ）用量依存性および（Ｂ）時間依存性を評価した結果を示す。 本発明の実施例において、Ｌ９−２６によるスプライシング調節の正確性を評価する実験の結果を示す図である。 本発明の実施例において、ＬＩＰＡスプライシングを調節するアンチセンスオリゴマーによるＬＡＬ酵素活性への影響を調べた結果を示す。 本発明の実施例において、ＬＡＬ酵素活性増強に対するアンチセンスオリゴマーＬ９−２６の濃度依存性を評価した結果を示す。 ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子（lipase A, lysosomal acid type [Homo sapiens］、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ３９８８）の塩基配列（配列番号１）を示した図である。 ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子（lipase A, lysosomal acid type [Homo sapiens］、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ３９８８）の第８番目のイントロンのセンス鎖の塩基配列を示した図である。下線は、オリゴマーのコア配列である。

本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

なお、実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

［オリゴマー］
本発明の一実施形態であるオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA）オリゴマーを含む。

オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成単位とする。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。

本発明の一実施形態のオリゴマーは、ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのアンチセンス鎖に対してホモロジーを有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）（配列番号３）に対して１３個以上同一の塩基である配列を含む、１３個以上４０個以下のアンチセンスオリゴマーである。

ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子（lipase A, lysosomal acid type [Homo sapiens］、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ３９８８）の塩基配列（配列番号１）の一例と第８番目のイントロンのセンス鎖の塩基配列（配列番号２）を、図９と図１０に示す。

このオリゴマーと第８番目のイントロンのアンチセンス鎖とのホモロジーは、８０％以上であればよいが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、１００％であることがもっとも好ましい。ここで、ホモロジーの測定は、Pro.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 5873 (1993))によって決定することができる。各パラメータはデフォルト値で行うものとする。

このオリゴマーは、１３個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは１７個以上、さらに好ましくは１８個以上で、４０個以下、好ましくは３２個以下、より好ましくは２４個以下、さらに好ましくは１６個以下のオリゴマーからなり、５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）（配列番号３）に対して、１３個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは１７個以上、さらに好ましくは１８個の同一の塩基を有する。

具体的には、このオリゴマーは、配列１に記載のヒトライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖の塩基配列における、５’末端から第４〜２１番目、第７〜２４番目、第８〜２５番目、第９〜２６番目、第１０〜２７番目、第１１〜２８番目、第１２〜２９番目、第１３〜３０番目、及び第１４〜３１番目からなる群から選択される塩基配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなっていてもよい。

このオリゴマーを構成するヌクレオチドは、天然核酸であってもよく、人工核酸であってもよい。天然核酸の場合、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルであってもよく、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）であってもよい。このオリゴマーは、全部のヌクレオチドがＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＲＮＡとＤＮＡが混成するキメラ核酸であってもよい。人工核酸の場合、例えば、１以上の糖部分及び／またはリン酸結合部分が修飾されているものでもよいが、特に限定されない。ここで、糖部分とは、各ヌクレオチドのリボースまたはデオキシボースを構成する原子団のことをいう。また、リン酸結合部分とは、各ヌクレオチド間のフォスフォジエステル結合を構成する原子団のことをいう。

糖部分の修飾は、どの原子においてでもよいが、２’位が好ましい。例えば、糖部分の２’位の‐ＯＨ基が、‐Ｈ、‐ＯＲ、‐Ｒ、‐Ｒ’ ‐ＯＲ、‐ＳＨ、‐ＳＲ、‐ＮＨ_２、‐ＮＨＲ、‐ＮＲＲ’’、‐ＯＮＨ、‐ＯＮＲ、‐Ｎ_３、‐ＣＮ、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ及び‐Ｉからなる群より選択されるいずれかの基（‐Ｒ、‐Ｒ’’は、それぞれ独立にＣ_１-Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、Ｃ_１-Ｃ_６アルキルカルボニル又はアリールから選択され、‐Ｒ’は、アルキレンを表す。）で置換されてもよいが、特に‐ＯＣＨ_３または‐ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３で置換されていることが好ましい。あるいは、ヌクレオチドが、２’‐フルオロ‐シチジン、２’‐フルオロ‐ウリジン、２’‐フルオロ‐アデノシン、２’‐フルオロ‐グアノシン、２’‐アミノ‐シチジン、２’‐アミノ‐ウリジン、２’‐アミノ‐アデノシン、‐アミノ‐グアノシン、および２’‐アミノ‐ブチリルピレン‐ウリジンからなる群から選択されてもよく、５‐ブロモ‐ウリジン、５‐ヨード‐ウリジン、５‐メチル‐シチジン、リボチミジン、２‐アミノ‐プリン、５‐フルオロ‐シチジン、５‐フルオロ‐ウリジン、２、６‐ジアミノ‐プリン、４‐チオ‐ウリジン、５‐アミノ‐アリル‐ウリジンからなる群から選択されてもよい。

糖部分の２’位と４’位が直接に、またはリンカーなどで間接的に架橋されていてもよい。その場合、糖部分を有するヌクレオチドが、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ， ４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＮＡ）、Ａｍｉｄｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＡｍＮＡ）、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＧｕＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｃｐＢＮＡ）からなる群から選択されることが例示できる。

また、一部または全部の糖部分がモルフォリンで置換されていてもよい。モルフォリンの製造方法や使用方法については、公知の方法に従えばよい（たとえば、Biochem Biophys Res Commun. 2007 Jun 29;358(2):521-7; WO2014189142; WO2016060135）。なお、本明細書では、一部または全部の糖部分がモルフォリンで置換されたモルフォリノオリゴヌクレオチドもオリゴマーに含まれる。ここで、モルフォリンは、ホスホロジアミデートモルフォリンなどの修飾モルフォリンであってもよい。

また、修飾されたリン酸結合部分は特に限定されないが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択される結合で構成されることが好ましい。

また、オリゴマーの５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基であってもよい。

本発明の一実施形態のオリゴマーは、これらの修飾を複数種類含んでもよい。

オリゴマーに対してこれらの修飾をすることにより、非特異的な分解を防止すること、アニーリングの安定性や特異性を高めることができ、従ってスプライシング調整の効率を上げることができるようになる。

オリゴマーまたはその修飾部分は、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体等の異性体を有する場合には、いずれか一方の異性体であっても混合物であってもよい。これらの異性体は、公知の合成手法、分離手法（例、濃縮、溶媒抽出、カラムクロマ卜グラフィー、再結晶、等）によりそれぞれを単品として得ることができる。例えば、光学異性体は、ラセミ体から分割された光学異性体であってもよい。

オリゴマーは、薬学的に許容され得る結晶であってもよく、結晶形が単一であっても結晶形混合物であってもよい。結晶は、公知の結晶化法を適用して製造することができる。

また、オリゴマーは、薬学的に許容され得る共結晶または共結晶塩であってもよい。共結晶または共結晶塩は、公知の共結晶化法に従い製造することができる。オリゴマーにおける共結晶または共結晶塩のカウンタ一分子としては、酸（例えば、カルボン酸、リン酸、糖酸、スルホン酸）、アミド、尿素、塩基、マルトール、アミノ酸などが挙げられる。カルボン酸の好適な例としては、フマル酸、クエン酸、グルタル酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、マンデル酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、安息香酸、ゲンチシン酸、サリチル酸、馬尿酸が挙げられる。糖酸の好適な例としては、アスコルビン酸が挙げられる。スルホン酸の好適な例としては、２−ナフタレンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸、メタンスルホン酸が挙げられる。アミドの好適な例としては、ニコチンアミド、ベンズアミド、ラクトアミド、グリコールアミド、サッカリンが挙げられる。塩基の好適な例としては、トロメタミン、メグルミンが挙げられる。マルトールの好適な例としては、エチルマルトールが挙けられる。アミノ酸の好適な例としては、チロシン、アラニン、セリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、リジン、プロリン、トリプトファン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチ才ニン、システイン、フエニルアラニン、グルタミン、ヒスチジンが挙げられる。

オリゴマーは、水和物であっても、非水和物であっても、溶媒和物であっても、無溶媒和物であってもよい。

オリゴマーは、同位元素（例、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５I）で標識されていてもよい。同位元素で標識または置換された化合物（Ｉ）は、例えば、陽電子断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＰＥＴ）において使用するトレーサー（ＰＥＴトレーサー）として用いることができ、医療診断などの分野において有用である。

［医薬］
本発明の一実施形態のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物は、スプライシング機能調節剤、医薬組成物、医薬、ライソゾ‐ム酸性リパーゼ欠損症治療薬に用いることができる。投与対象は特に限定されず、哺乳類であればよいが、ヒトであることがより好ましい。

オリゴマーは、ヒトを含む動物へ投与され、代謝された後に、生物学的に活性な物質となるプロドラッグであってもよい。例えば、細胞内のエステラーゼにより除去される保護基をリン酸ジエステル部位に導入したオリゴマーが挙げられよう。

本医薬組成物は、共溶媒系を含む。例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、水相、ＶＰＤ共溶媒系（３ｗ／ｖ％のベンジルアルコール、８ｗ／ｖ％の非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）、および６５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液）が挙げられるが、これらに限定されない。共溶媒系の割合は、それらの溶解度および毒性特性を著しく変化させることなく大幅に変化することができる。さらに、共溶媒成分の同一性は変更するこができる。例えば、他の界面活性剤をポリソルベート８０（商標）の代わりに使用してもよく、他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンに取って代わり、他の糖または多糖は、デキストロースと置き換わり得るが、これらに限定されない。

これらは、有効成分以外の様々な目的の各種成分を含有してもよい。例えば、１種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定化剤、コーティング剤、局所麻酔剤、等張化剤などが挙げられる。具体的には、賦形剤としては、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、アミラーゼ、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、カオリン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロース、滑石、珪酸、粘性パラフィン、ポリビニルピロリドンなどを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを、等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。

上記医薬の投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。いずれの場合も、経口経路、非経口経路のどちらであってもよい。非経口経路としては、静脈内投与、動脈内投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができる。局所投与の場合、くも膜下注入、脳室内注入、脳せき髄液内注入（例えば髄腔内注入）などが例示できる。脳関門の通過を考慮に入れて、全身投与と局所投与（特に、脳内投与）を併用してもよい。

剤形は、特に限定されず、上記投与経路に適した剤形であればよい。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができる。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。

上記医薬に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定できる。用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択できる。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．１μｇ〜約１ｍｇの範囲である。上記投与は１日１回であってもよく、数回に分けてもよい。

薬学的に許容可能な塩は、有機塩、無機塩、酸性塩、塩基性塩、金属塩、非金属塩、酸付加塩、塩基付加塩など様々な分類の塩や様々な態様の塩が考えられる。例としては、酢酸塩、酸性リン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、ゲンチシン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、二塩化水素化物、ヨウ化水素酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、糖酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、ジエタノールアミン塩などが挙げられるが、これらに限定されない。

スプライシング機能調節剤は、哺乳動物細胞において、ライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体に対し、第８番目のエクソンからの転写領域を欠失した変異ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構を、第８番目のエクソンからの転写領域を有する正常ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構に正常化する機能を有するものである。この細胞は、培養細胞であっても個体（ヒトであってもよく、ヒト以外であってもよい。）中の細胞であっても構わない。

なお、本明細書において、正常ｍＲＮＡとは、正常な位置でスプライシングが起きることでエクソン８を有して生じたｍＲＮＡを意味し、異常ｍＲＮＡとは、正常な位置でスプライシングが起きず、エクソン８を飛ばして生じたｍＲＮＡを意味する。変異の例としては、ｃ．８９４Ｇ＞Ａが挙げられる．従って、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有していても、正常な位置でスプライシングが起きることでエクソン８を有して生じたｍＲＮＡは正常ｍＲＮＡと称する。

［実施例１］合成オリゴヌクレオチドを鋳型とした、正常配列と変異配列の検出と定量
本実施例では、ＬＩＰＡ遺伝子のエクソン７〜１０の配列を有する以下の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として用い、プライマー及びプローブがｑＰＣＲで機能することを確認した。

＜方法＞
用いた合成オリゴヌクレオチドは、以下の目的を有する（原理を図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄに示した）。

０５：エクソン８の配列を欠失している。

０６：ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するが、エクソン８の配列を有する。なお、８９４番目のヌクレオチドは、エクソン８とエクソン９が結合した境界のエクソン８側のヌクレオチドである。

０７：野生型配列である。

０８：ｃＤＮＡの９６７〜９６８番目の配列ＡＧを欠失したｃ．９６７＿９６８ｄｅｌＡＧを有している。この欠失は、プライマー０３上にあるので、この合成オリゴヌクレオチドに対しては、プライマー０３が機能しないと考えられる。

そして、各オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。

０５−Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｌｔａ８＿Ｅ７＿９＿１０ （５’−ＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号４）；
０６−Ｓｔａｎｄａｒｄ ＦＬ＿ｍｕｔａｎｔ＿８９４ Ｇ ｔｏ Ａ＿Ｅ７＿８＿９＿１０ （５’−ＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号５）；
０７−Ｓｔａｎｄａｒｄ ＦＬ ＷＴ＿８９４Ｇ ｔｏ Ｇ＿Ｅ７＿８＿９＿１０ （５’−ＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号６）；
０８−Ｓｔａｎｄａｒｄ ＦＬ ｃ９６７＿９６８ｄｅｌＡＧ＿８９４Ｇ ｔｏ Ｇ＿Ｅ７＿８＿９＿１０ （５’−ＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号７）。

具体的には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （Ｔｏｙｏｂｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｑＰＣＲプローブ（０．２２５μＭ）、プライマー（０．６μＭ）、ＰＣＲ酵素を含むＰＣＲ反応液を調製した。合成オリゴヌクレオチド溶液（０５、０６、０７、０８）５μＬと１０μＬのＰＣＲ反応溶液とを混合した。ＰＣＲの増幅効率を正確に評価し、且つコピー数を絶対値として定量するため、濃度が既知の合成オリゴクレオチド（ｇＢｌｏｃｋｓ， Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．／ＩＤＴ）を段階希釈し、得られたＣｔ値で検量線を作成した。ｑＰＣＲにはＶｉｉＡ７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、
初期変性： ９５℃ （１分）；
サイクル： ９５℃ （１５秒）／６０℃ （１分）を４０回
以上の条件で反応させた。なお、プライマーとプローブは以下のものを用いた。

＜Ｄｅｌｔａ８ ＬＩＰＡ 検出用（エクソン８を欠失したｃＤＮＡを検出）＞
０１−Ｆｗ−ＬＩＰＡ （Ｅｘｏｎ７， ９） （５’−ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴ−３’）（配列番号８）；
０３−Ｒｖ−ＬＩＰＡ （５’−ＴＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号９）；
０２−Ｐｒｏｂｅ−ＬＩＰＡ （５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＡＡＡＡＧＴＴ／ＺＥＮ／ＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧ／３ｌＡＢｋＦＱ／−３’）（配列番号１０）。

＜ＦＬ ＬＩＰＡ 検出用（エクソン８を有するｃＤＮＡを検出）＞
０４−Ｆｗ−ＬＩＰＡ （Ｅｘｏｎ８） （５’−ＡＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡ）（配列番号１１）；
０３−Ｒｖ−ＬＩＰＡ （５’−ＴＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号９）；
０２−Ｐｒｏｂｅ−ＬＩＰＡ （５’−／５６−ＨＥＸ／ＣＣＡＡＡＡＧＴＴ／ＺＥＮ／ＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧ／３ｌＡＢｋＦＱ／−３’）（配列番号１２）、または検出の蛍光色素が異なる（５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＡＡＡＡＧＴＴ／ＺＥＮ／ＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧ／３ｌＡＢｋＦＱ／−３’）（配列番号１０）。

得られた結果からＣｔを計算し、標準曲線から絶対的なコピー数を算出した。そして、コピー数（ｘ軸）とＣｔ（ｙ軸）のグラフに、得られた結果をプロットし、図１Ｃ及び図１Ｅとした。

＜結果＞
図１（Ｂ）より、ＦＬ ＬＩＰＡ 検出用のプライマー／プローブセットを用いた場合、エクソン８が存在するｃＤＮＡが検出されるので、０５が検出できず、図１（Ｄ）より、Ｄｅｌｔａ８ ＬＩＰＡ 検出用のプライマー／プローブセットを用いた場合、エクソン８が存在しないｃＤＮＡが検出されるので、０６〜０７が検出できないと予測される。なお、いずれの場合も、０８はプライマー０３が機能しないので、検出できないと予想される。

実際にｑＰＣＲを行ったところ、図１Ｃ及び図１Ｅに示すように、ＦＬ ＬＩＰＡ 検出用のプライマー／プローブセットでは、０６及び０７が検出され、０５及び０８が検出されず、Ｄｅｌｔａ８ ＬＩＰＡ 検出用のプライマー／プローブセットでは、０５のみが検出され、０６〜０８が検出されなかった。従って、予測通りの結果が得られたことになる。

また、本条件で、Ｃｔ値と鋳型ＤＮＡのコピー数が相関を示し、Ｃｔの値から、反応溶液に含まれているＤＮＡのコピーが算出できることが明らかになった。なお、（Ｃ）において、０６のオリゴヌクレオチドに対して、ＰＣＲの増幅効率は９２％で１５０ ｃｏｐｉｅｓ／ｗｅｌｌ以上で定量可能であり、０５のオリゴヌクレオチドに対して、ＰＣＲの増幅効率は１００％で１５ ｃｏｐｉｅｓ／ｗｅｌｌ以上で定量可能であった。

以上のように、実施例１のＰＣＲの条件で、正常ＬＩＰＡｍＲＮＡと異常ＬＩＰＡｍＲＮＡが判別でき、そのコピー数を計算できた。

［実施例２］ウォルマン病患者の繊維芽細胞のＲＮＡを用いた、内在性ＬＩＰＡｍＲＮＡ含量の測定
本実施例では、ウォルマン病患者の繊維芽細胞を用い、実施例１と同様の方法で、内在性ＬＩＰＡｍＲＮＡを測定した。

＜方法＞
ｃ．８４９Ｇ＞Ａ及びｃ．９６７＿９６８ｄｅｌＡＧを複合ヘテロ接合で有するウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）とｃ．１９３Ｃ＞Ｔをヘテロ接合で有する保因者（ＧＭ０３５５８）由来の繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓをより入手）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて培養した。０．５ｘ１０^４個の細胞をｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）のウェルに播種し、所定時間培養した後に、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ｗａｋｏ社）で洗浄した。次に、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（Ｔｏｙｏｂｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、Ｌｙｓｉｓ緩衝液を２５μＬ／ウェル添加して細胞を溶解してゲノムＤＮＡを分解し、５μＬの反応停止用緩衝液を添加し、ＲＮＡ含有溶液を得た。４μＬのＲＮＡ含有液を、ｄＮＴＰ，ランダムおよびオリゴｄＴプライマーと逆転写酵素含有の逆転写用緩衝液の１６μＬと混合した。３７℃（１５分）、５０℃（５分）、９８℃（５分）で反応させ、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡをＵｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、ＬＩＰＡｃＤＮＡを測定するために４倍希釈、もしくはＧＡＰＤＨを測定するために４４倍希釈した。こうして得られたｃＤＮＡを用い、実施例１と同様にして定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。

なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡコピー数を測定のために、２０Ｘ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＰＣＲ ａｓｓａｙ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，品番４３２６３１７Ｅ）とｓｔａｎｄａｒｄ−ＧＡＰＤＨ （５’−ＡＡＡＴＴＧＡＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴ−３’）（配列番号１３）を用いた。ｃＤＮＡを用いた測定結果の定量値は、ＧＡＰＤＨの定量値で標準化した。

＜結果＞
図２（Ａ）ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来のｍＲＮＡ、（Ｂ）保因者（ＧＭ０３５５８）由来のｍＲＮＡを用いた、ＬＩＰＡｍＲＮＡの解析結果を示す。ウォルマン病患者では、ＬＩＰＡｍＲＮＡ全体を１００％とすると、異常ｍＲＮＡのＤｅｌｔａ８が９９．９％、正常ｍＲＮＡのＦＬ ＬＩＰＡが０．１％生成していた。一方、保因者では、Ｄｅｌｔａ８は検出感度以下であった。

このように、実施例１の検出方法は、ウォルマン病患者のｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異による異常スプライシングを特異的に検出することができる。そして、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）は、ｃ．８９４Ｇ＞Ａを有する変異アレルからのｍＲＮＡの１００％近くが異常ｍＲＮＡを占めることがわかる。

［実施例３］エンドポイントＲＴ−ＰＣＲによる内在性ＬＩＰＡｍＲＮＡの検出
本実施例では、エンドポイントＲＴ−ＰＣＲを用い、ＬＩＰＡｃＤＮＡのエクソン８の有無を検出した。

＜方法＞
ＬＩＰＡｃＤＮＡに対し、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、図３Ａに示したように、エクソン８が存在する場合、３２０ｂｐの長さのＤＮＡ断片が検出され、エクソン８が存在しない場合、２４８ｂｐの長さのＤＮＡ断片が検出される。

１１１３， ［ｋｐｎ］−ｈＬＩＰＡ（Ｅ７）−Ｆ：５’−ＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡ−３’（配列番号１４）
１０９８， ｈＬＩＰＡ（Ｅ９）−（ａｔｔＢ２）−Ｒ：５’−ＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号１５）
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎの添付文書に従いＰｒｉｍｅｒの終濃度を１μＭになるようにして行った。そして、１０μＬの増幅産物に１μＬのＸＣｄｙｅ（ニッポンジーン社）を混合し、３％アガロースゲルで電気泳動した。エチジウムブロマイド溶液とＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ （ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ， Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で可視化した。その結果を図３Ｂに示す。

＜結果＞
図３Ｂに示すように、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）では、３２０ｂｐと２４８ｂｐの両方のシグナルが得られたが、保因者（ＧＭ０３５５８）では、３２０ｂｐだけのシグナルが得られた。

実施例２の結果を考慮すると、ＧＭ０３１１１の２４８ｂｐのシグナルは、３２０ｂｐからエクソン８の７２ｂｐが欠損しており、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するアレルからのｃＤＮＡであることがわかる。

［実施例４］ＬＩＰＡスプライシングを調節するオリゴマー
本実施例では、オリゴマーが、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するアレルから正常ｍＲＮＡを作るように、ＬＩＰＡスプライシングを調節することを示す。

＜方法＞
本実施例では、イントロン８のオリゴマーを、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞に投与し、細胞が発現するＬＩＰＡ遺伝子のｍＲＮＡを調べた。オリゴマーの配列は、ＬＩＰＡ遺伝子のイントロン８のｐ番目のヌクレオチドからｑ番目のヌクレオチドに対応するものとし、Ｌｐ−ｑと名付けた。ヌクレオチドの構成として、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを交互に配置させたものを用いた。用いたオリゴマーの構成を以下に記す。

Ｌ４−２１， ５’−ａ＾Ｔ(Ｌ)＾ｇ＾５(Ｌ)＾ａ＾５(Ｌ)＾ｔ＾５(Ｌ)＾℃＾Ｔ(Ｌ)＾ｇ＾Ｇ(Ｌ)＾ａ＾Ａ(Ｌ)＾ｔ^Ｇ(Ｌ)＾ｃ＾ｃ−３’（配列番号１６）
Ｌ７−２４， ５’−ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｇ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾ｔ−３’（配列番号１７）
Ｌ８−２５， ５’−ｃ＾５（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｔ＾５（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾Ｇ（Ｌ）＾ａ＾ａ−３’（配列番号１８）
Ｌ９−２６， ５’−ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｇ＾ａ−３’（配列番号１９）
Ｌ１０−２７， ５’−ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｔ＾５（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾ｇ−３’（配列番号２０）
Ｌ１１−２８， ５’−ａ＾５（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｔ＾ｇ−３’（配列番号２１）
Ｌ１２−２９， ５’−ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｔ＾５（Ｌ）＾ｃ＾ｔ−３’（配列番号２２）
Ｌ１３−３０， ５’−ｇ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾ｃ−３’（配列番号２３）
Ｌ１４−３１， ５’−ｔ＾Ｇ（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ｃ＾５（Ｌ）＾ａ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｔ＾ｃ−３’（配列番号２４）
Ｓｃｒａｍｂｌｅ ＡＳＯ （ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ＮＣ）， ５’− ｔ＾Ａ（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｇ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ａ＾５（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ｃ＾ｃ−３’（配列番号２５）
Ｓｃｒａｍｂｌｅ ＡＳＯ （ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ−２， ＮＣ−２）， ５’− ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾５（Ｌ）＾ａ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾Ｔ（Ｌ）＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾Ｔ（Ｌ）＾ｇ＾Ｔ（Ｌ）＾ａ＾Ｇ（Ｌ）＾ｔ＾ｃ−３’（配列番号２６）
上記配列中、Ｎ（Ｌ）はリボース環が架橋されたＬＮＡと核酸塩基を有する修飾核酸を示し、５（Ｌ）は塩基にメチルシトシンを有するＬＮＡを示す。＾はホスホロチオエート修飾を示す。小文字はデオキシリボヌクレオチドを示す。

これらのオリゴマーをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ウォルマン病患者由来の繊維芽細胞に導入した。具体的には、導入の前日に１ウェル当たり０．５ｘ１０^４個の細胞をｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、オリゴマー（３０または１００ｎＭ）を導入してから２４時間後にＤ−ＰＢＳ（−）（ｗａｋｏ社）で洗浄し、実施例２と同様にして、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。図４に、Ｎ＝２の平均値とそれぞれの値を示す。

＜結果＞
図４に示すように、Ｌ１４-３１以外のオリゴマーは、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するアレルから正常ｍＲＮＡを作るような、ＬＩＰＡスプライシングを調節する作用を有していた。特に、Ｌ７-２４、Ｌ８-２５、Ｌ９-２６、Ｌ１０-２７は、優れた作用を有し、中でもＬ９-２６が最も優れた作用を有していた。

［実施例５］オリゴマーＬ９−２６の用量依存性および時間依存性の評価
本実施例では、オリゴマーＬ９−２６の持つスプライシング調節作用の用量依存性および時間依存性を評価した。

＜方法＞
まず、実施例４と同様に、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞に３０ｎＭのＬ９−２６をリポフェクトし、細胞を１，６，２４，４８，７２，９６時間後に回収してｃＤＮＡを合成した。ＦＬ ＬＩＰＡを特異的に測定できるｑＰＣＲ（０４，０２，０３の組み合わせ）またはＤｅｌｔａ８ ＬＩＰＡを特異的に測定できるｑＰＣＲ（０１，０２，０３の組み合わせ）を用いて定量ＰＣＲで測定した。ＧＡＰＤＨに対する測定値で標準化した後、得られた値からネガティブコントロールの測定値を引いたΔ値を算出した。Ｎ＝２で実施した結果を図５Ａに示す。

一方、ＧＭ０３１１１由来の繊維芽細胞に様々な濃度でＬ９−２６を導入し、４８時間後に細胞を回収し、同様に定量ＰＣＲの結果を算出した。Ｎ＝２で実施した結果を図５Ｂに示す。

＜結果＞
図５Ａに示すように、オリゴマーＬ９−２６のスプライシング調節作用は、リポフェクション後、４８時間でほぼほぼプラトーに達する。

また、図５Ｂに示すように、オリゴマーＬ９−２６は、ｎＭオーダーからスプライシング調節作用を発揮する。

［実施例６］Ｌ９−２６によるスプライシング調節の正確性の評価
本実施例では、Ｌ９−２６によって起きるスプライシングが、野生型と同様の正確な位置で生じていることを示す。

＜方法＞
実施例４と同様に、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞にＬ９−２６を導入して２４時間後に回収した細胞から得たｃＤＮＡ溶液に対して、プライマー０３と０４でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の８．７μＬに対し、０．３μＬ ＥｃｏＲＩＩ及び１μＬ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋ（Ｔａｋａｒａ社）、または０．３μＬ ＡｌｕＩ及び１μＬ Ｂｕｆｆｅｒ Ｌ（Ｔａｋａｒａ社）を混合し、３７度で１時間反応させた。次に、２００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（Ｗａｋｏ社）を０．５μＬと１μＬのＸＣｄｙｅ（ニッポンジーン社）を混合した溶液を３％アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド溶液とＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ， Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で可視化した。結果を図６（Ｂ）に示す。

なお、コントロールとして、実施例１で用いたオリゴヌクレオチド０６（ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するが、エクソン８の配列を有する。なお、８９４番目のヌクレオチドは、エクソン８とエクソン９が結合した境界のエクソン８側のヌクレオチドである。）及びオリゴヌクレオチド０７（野生型配列である。）を各制限酵素で切断したもの、Ｌ９−２６で処理しないウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞及び保因者（ＧＭ０３５５８）由来の繊維芽細胞由来のｃＤＮＡを増幅させた産物を各制限酵素で切断したものを同時に電気泳動した。

ここで、野生型アレルの発現において、正確にスプライシングが起きてエクソン８を有する正常ｍＲＮＡが得られると、対応するｃＤＮＡにはＥｃｏＲＩＩの認識配列が生じ、ＥｃｏＲＩＩで切断することにより、１７塩基長と９８塩基長の断片が生じる。一方、変異型アレルの場合は、ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ変異を有するため、正確にスプライシングが起きてエクソン８を有する正常ｍＲＮＡが得られると、対応するｃＤＮＡにはＡｌｕＩの認識配列が生じ、ＡｌｕＩで切断することにより、１９塩基長と９６塩基長の断片が生じる。この原理を図６（Ａ）に示す。

＜結果＞
図６（Ｂ）に示すように、オリゴヌクレオチド０６の増副産物はＡｌｕＩのみで切断され、オリゴヌクレオチド０７の増副産物はＥｃｏＲＩＩのみで切断される。Ｌ９−２６で処理しない保因者（ＧＭ０３５５８）由来の繊維芽細胞由来のｃＤＮＡの場合は、エクソン８については野生型配列を有するので、ＰＣＲによる増幅断片はＥｃｏＲＩＩのみで切断され、Ｌ９−２６で処理しないウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞由来のｃＤＮＡの場合は、エクソン８を有しないので、ＰＣＲによる増幅断片が存在せず、シグナルが検出されない。

しかしながら、Ｌ９−２６で処理しないウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞由来のｃＤＮＡの場合は、ＡｌｕＩのみで切断される。すなわち、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有しているにもかかわらず、スプライシングは正常に起こっていることを示している。

このようにオリゴマーＬ９−２６によって、本来のスプライシング機構が回復し、野生型と同じ正確なスプライシングが起きる。

［実施例７］ＬＩＰＡスプライシングを調節するオリゴマーによるＬＡＬ酵素活性への影響
本実施例では、ウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）由来の繊維芽細胞において、ＬＩＰＡスプライシングを調節するオリゴマーが、ライソゾーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）の酵素活性を増強することを示す。

＜方法＞
１ウェルにつき１．０ｘ１０^４個のウォルマン病患者（ＧＭ０３１１１）繊維芽細胞、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有しないウォルマン病患者（ＧＭ０６１４４）繊維芽細胞および保因者（ＧＭ０３５５８）繊維芽細胞をｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種した。１６時間後にＬ４-２１、Ｌ７−２４、Ｌ８−２５、Ｌ９−２６、Ｌ１０−２７、Ｌ１１−２８、Ｌ１２−２９、Ｌ１３−３０の各オリゴマーおよび比較用としてネガティブコントロールオリゴマー（ＮＣ）を 各１００ｎＭ/ウェルの用量でリポフェクトした。４８時間後にＰＢＳ（−）で洗浄して、５０μＬの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＭｉｌｌｉＱ溶液 （和光純薬）で細胞を溶解させ、抽出物を回収した。１３，２００ｘ ｇで５分間、４℃で遠心分離し、回収した上清を測定に用いた。酵素活性の測定の為、上清各５μＬずつを蛍光測定用３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の２ウェルに分注した。一方のウェルにＭｉｌｌｉＱ溶液、もう一方に７．５μＭ Ｌａｌｉｓｔａｔ２（ｉｎ ｈｏｕｓｅにおいて合成）をそれぞれ１．２５μＬ添加して、３７℃で１０分間インキュベートした後、各ウェルに１８．７５μＬの基質溶液［０．４：１：１４；１３．３ｍＭ ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ４−Ｍｅｔｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｏｎｅ（ＣＡＹＭＡＮ社 ）：０．５％Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）：１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）］を添加、更に３０分間、３７℃でインキュベーションした。反応後、５ｕＬの１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）を加え、ＥｎＳｐｉｒｅ（パーキンエルマー社）を用い、励起および蛍光波長を３２０ｎｍおよび４６０ｎｍに設定して蛍光強度を測定した。標準曲線用として、４−Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｏｎｅ（ｉｎ ｈｏｕｓｅにおいて合成）を細胞懸濁液の代わりに使用した。酵素活性は、同一サンプルのタンパク質量をプロテインアッセイＢＣＡキット（和光純薬）で測定して、１ｍｇタンパク量で１時間あたりに分解される基質濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈｏｕｒ）に標準化して算出し、ＮＣを対照としてｔ検定を実施した （＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｎ＝４で得られた平均値＋ＳＥＭを図７に示す。なお、実験自体のネガティブコントロールとして、Ｉｎｔａｃｔは無処理の結果、Ｖｅｈｉｃｌｅはトランスフェクション試薬のみで処理した結果を示す。

＜結果＞
図７に示したように、ＧＭ０３１１１において、Ｌ７−２４、Ｌ８−２５、Ｌ９−２６、Ｌ１０−２７のオリゴマーにより、ＮＣと比較して有意にＬＡＬ活性の上昇が認められた。Ｌ９−２６がＮＣの１５．１倍と最も強い活性上昇を示した。一方、Ｌ４-２１、Ｌ１１−２８、Ｌ１２−２９、Ｌ１３−３０では、ＮＣと比較して有意差は認められなかった。この結果は、実施例４におけるオリゴマー処理による正常ＬＩＰＡｍＲＮＡ発現増強と相関している。

一方、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有しないウェルマン病患者由来のＧＭ０６１４４の場合、いずれのオリゴマー処理においても有意差は認められなかった。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有しない保因者であるＧＭ０３５５８の場合も、いずれのオリゴマー処理においても有意差は認められなかった。

このように、Ｌ７-２４、Ｌ８-２５、Ｌ９-２６、Ｌ１０-２７のオリゴマーは、ＧＭ０３１１１のｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異によるミススプライシングを特異的に是正して、ＬＡＬ酵素の活性を増強する作用を有し、中でもＬ９-２６が最も強い作用を有していた。

［実施例８］ＬＡＬ酵素活性増強に対するオリゴマーＬ９−２６の濃度依存性の評価
オリゴマーＬ９−２６を用い、用いた濃度以外は実施例９と同様にして、ＬＡＬ酵素活性増強効果を調べた。オリゴマーの濃度は、１０、３０、１００ｎＭで測定を行った。その結果を図８に示す。

＜結果＞
図８に示すように、ＧＭ０３１１１由来の繊維芽細胞においては、ＧＭ０３５５８由来の繊維芽細胞に比べてＬＡＬ活性が有意に低かったが、Ｌ９−２６が導入されたＧＭ０３１１１由来の繊維芽細胞において、ＬＡＬ活性は１０ｎＭで未処置のＧＭ０３５５８と同レベルまで増加し、３０ｎＭでは未処理ＧＭ０３１１１に比べて有意な増加が観察された。

ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖に対して８０％以上の相補的な塩基を有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１３個以上同一の塩基である配列を含む、１３個以上４０個以下のヌクレオチドからなるオリゴマーは、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＬＩＰＡ遺伝子転写産物のミススプライシングを是正し、ＬＡＬ酵素活性を正常レベルまたはそれ以上に増強できることから、ウォルマン病およびコレステロールエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を含むライソゾーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症の治療に利用できる。

Claims (31)

1. ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのアンチセンス鎖に対して８０％以上のホモロジーを有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１３個以上同一の塩基である配列を含む、１３個以上４０個以下のオリゴマー。
2. ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１５個以上同一の塩基である配列を含み、１５個以上４０個以下である、請求項１に記載のオリゴマー。
3. ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）に対して１７個以上同一の塩基である配列を含み、１７個以上４０個以下である、請求項１に記載のオリゴマー。
4. ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）である配列を含み、１８個以上４０個以下である、請求項１に記載のオリゴマー。
5. ヒトライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖に対して１００％の相補的な塩基を有する配列からなり、かつ５’‐ＣＣＣＡＡＡＸＧＣＡＣＸＣＣＸＧＧＡ‐３’（ＸはＴまたはＵ）からなる配列を含む、１３個以上４０個以下である、請求項１に記載のオリゴマー。
6. 配列１に記載のヒトライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ遺伝子の第８番目のイントロンのセンス鎖の塩基配列における、５’末端から第７〜２４番目、第８〜２５番目、第９〜２６番目、第１０〜２７番目、第１１〜２８番目、第１２〜２９番目、第１３〜３０番目、及び第１４〜３１番目からなる群から選択される塩基配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、請求項５に記載のオリゴマー。
7. オリゴヌクレオチドまたは１以上の糖部分及び／またはリン酸結合部分が修飾されている修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
8. 前記修飾された糖部分の２’位が修飾されている、請求項７に記載のアンチセンスオリゴマー。
9. 前記修飾された糖部分の２’位の‐ＯＨ基が、‐Ｈ、‐ＯＲ、‐Ｒ、‐Ｒ’ ‐ＯＲ、‐ＳＨ、‐ＳＲ、‐ＮＨ_２、‐ＮＨＲ、‐ＮＲＲ’’、‐ＯＮＨ、‐ＯＮＲ、‐Ｎ_３、‐ＣＮ、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ及び‐Ｉからなる群より選択されるいずれかの基（‐Ｒ、‐Ｒ’’は、それぞれ独立にＣ_１-Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、Ｃ_１-Ｃ_６アルキルカルボニル又はアリールから選択され、上記‐Ｒ’は、アルキレンを表す。）で置換されることによって、前記糖部分の２’位が修飾されている、請求項８に記載のオリゴマー。
10. 前記修飾された糖部分の２’位の‐ＯＨ基が、‐ＯＣＨ_３または‐ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３で置換されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
11. 前記修飾された糖部分の２’位と４’位が架橋されている、請求項７または８に記載のオリゴマー。
12. 前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、２’−Ｏ， ４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＮＡ）、Ａｍｉｄｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＡｍＮＡ）、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＧｕＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｃｐＢＮＡ）からなる群から選択される、請求項１１に記載のオリゴマー。
13. 前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐リボヌクレオチドである、請求項請求項７〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー。
14. 前記２’‐デオキシ‐リボヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐アデノシン、または２’‐デオキシ‐グアノシンである、請求項１３に記載のオリゴマー。
15. 前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、２’‐フルオロ‐シチジン、２’‐フルオロ‐ウリジン、２’‐フルオロ‐アデノシン、２’‐フルオロ‐グアノシン、２’‐アミノ‐シチジン、２’‐アミノ‐ウリジン、２’‐アミノ‐アデノシン、２’‐アミノ‐グアノシン、および２’‐アミノ‐ブチリルピレン‐ウリジンからなる群から選択されるヌクレオチドである、請求項７または８に記載のオリゴマー。
16. 前記修飾された糖部分を有するヌクレオチドが、５‐ブロモ‐ウリジン、５‐ヨード‐ウリジン、５‐メチル‐シチジン、リボチミジン、２‐アミノ‐プリン、５‐フルオロ‐シチジン、５‐フルオロ‐ウリジン、２、６‐ジアミノ‐プリン、４‐チオ‐ウリジン、５‐アミノ‐アリル‐ウリジンからなる群から選択されるヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴマー。
17. 前記修飾されたリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択される結合で構成される、請求項７に記載のオリゴマー。
18. モルフォリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
19. 前記モルフォリノオリゴヌクレオチドがホスホロジアミデ‐トモルフォリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項１８に記載のオリゴマー。
20. ５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基である、請求項１８又は１９に記載のオリゴマー。
    
21. ペプチド核酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
22. オリゴヌクレオチドまたは１以上の糖部分及び／またはリン酸結合部分が修飾されている修飾オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノオリゴヌクレオチドの両方を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
23. 前記修飾オリゴヌクレオチドが、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の前記修飾オリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載のオリゴマー。
24. 請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を有効成分として含有する、スプライシング機能調節剤。
25. 請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を有効成分として含有する、医薬組成物。
26. 請求項２５に記載の医薬組成物を含有する医薬。
27. 請求項２５に記載の医薬組成物を含有するライソゾ‐ム酸性リパーゼ欠損症治療薬。
28. 哺乳動物細胞において、ライソゾーム酸性リパーゼ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体に対し、第８番目のエクソンからの転写領域を欠失した異常ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構を、第８番目のエクソンからの転写領域を有する正常ｍＲＮＡを産生するスプライシング機構にする、スプライシング機構調節方法であって、
    請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物を、前記ヒト細胞に投与する工程を含む、スプライシング機構調節方法。
29. 哺乳動物におけるライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療方法であって、
    前記哺乳動物に対し、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物の有効量を投与する工程を含む、予防または治療方法。
30. ライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療に使用するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物。
31. ライソゾ‐ム酸性リパ‐ゼ欠損症の予防または治療剤を製造するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴマー又はその薬学的に許容可能な塩若しくは水和物の使用。