KR20090107380A - 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는핵산 보관용 용기 - Google Patents

리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는핵산 보관용 용기 Download PDF

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Abstract

본 발명은 채취된 리보핵산의 분해를 촉진하는 리보핵산 분해효소의 활성을 효과적으로 억제하기 위한 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는 시료보관용 용기에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112008025423918-PAT00001
[화학식 2]
Figure 112008025423918-PAT00002
본 발명의 리보핵산분해효소 활성 억제용 화합물 및 시료보관용 용기는 리보핵산 추출 과정 중, 또는 추출된 리보핵산의 보관에 효과적으로 사용될 수 있다.
리보핵산 분해효소, 리보핵산, 활성억제제, 보관용 용기

Description

리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는 핵산 보관용 용기{Compounds for inhibiting decomposition enzyme of ribonucleic acid, and container for storage of ribonucleic acid}
본 발명은 채취된 리보핵산의 분해를 촉진하는 리보핵산 분해효소의 활성을 효과적으로 억제하기 위한 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는 시료보관용 용기에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체로부터 리보핵산의 채취과정, 채취된 리보핵산 시료 보관에 사용될 수 있는 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물 및 이를 포함하는 리보핵산 시료보관용 용기에 관한 것이다.
리보핵산은 핵산의 한 종류로서 디옥시리보핵산과는 구조적으로 디옥시리보오스 대신 리보오스를 가지고 있으며, 염기는 티민 대신 우라실을 가지고 있다. 구조와 기능에 따라 리보좀을 구성하는 리보좀 리보핵산(rRNA), 디옥시리보 핵산(DNA)로부터 전달받은 단백질을 합성하는 유전정보를 가지고 있는 전령 리보핵산(mRNA), 전령 리보핵산의 코돈에 대응되는 아미노산을 전달하는 운반 리보핵산(tRNA)로 나눌 수 있다. 이들 리보핵산은 사용 용도와 시기에 따라 분해되고 다시 합성 되는데 이 과정에 리보핵산 분해효소가 관여하게 된다.
리보핵산 분해효소는 디옥시리보핵산 분해효소와 달리 쉽게 그 활성이 억제되지 않으며, 시료를 수집하는 과정부터 시료에서 리보핵산을 추출하는 과정 중 어느 과정에서든지 쉽게 오염될 수 있는 문제가 있으며, 이들 리보핵산 분해효소는 생물 시료로부터 순수한 리보핵산을 분리하는 과정에 있어서 수율 저하 및 순도 저하의 요인으로 작용할 수 있어 반드시 그 활성을 억제해야할 필요가 있다.
일반적으로 리보핵산은 단일가닥이므로 디옥시리보핵산에 비해 쉽게 분해되는 특징을 가지고 있다. C형 간염 바이러스의 진단과 같은 경우 수집된 혈액 샘플내 C형 간염 바이러스의 리보핵산이 리보핵산 분해효소에 의해 분해되기 전에 C형 간염 바이러스의 리보핵산을 추출해야 하며 이의 존재 여부를 확인하는 실험을 수행해야만 한다. 이때 혈액중의 리보핵산분해효소에 의해 이미 C형 간염 바이러스의 리보핵산이 분해되었다면 C형 간염 바이러스 감염자임에도 불구하고 비감염자로 판정을 내릴 수 있는 심각한 상황을 초래할 수도 있다.
결국 생물시료로부터 리보핵산을 추출하는 과정 중 노출되는 리보핵산분해효소의 활성을 억제하는 것도 중요하지만 무엇보다 생물시료를 보관하기 시작하면서부터 리보핵산분해효소에 노출되는 것을 효과적으로 차단해야 하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.
한편, 혈액이나 동물, 식물의 조직, 배양 세포 등으로부터 순수한 리보핵산을 추출하는 데에는 크게 두 가지의 방법, 즉 페놀을 사용하는 방법과 카오트로픽 염을 사용하는 방법이 사용되고 있다고 할 수 있다.
페놀은 잘 알려진 바와 같이 강력한 유기용매로써 단백질 및 세포 구성 성분을 녹여버리는 성질을 가지고 있어서 세포가 용리되는 순간 리보핵산 분해효소의 활성이 나타나기 전에 리보핵산분해효소를 분해시켜 버림으로써 리보핵산의 분해를 원천적으로 차단할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 페놀은 인체에 유해한 물질이라는 단점이 있고, 유기용매가 완전히 제거되지 않았을 경우 후속 작업에 심각한 영향을 미칠 수 있다.
구아니딘 염과 같은 카오트로픽 염은 강력한 단백질 변성 작용으로 리보핵산분해효소를 변성시켜 그 활성을 억제시키는 성질을 가지고 있다. 또한, 카오트로픽 염은 실리카 표면에 리보핵산을 부착시키는 역할도 수행할 수 있어 유기용매를 사용하지 않고도 매우 쉽게 리보핵산을 분리/ 정제 할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
그러나, 이들 방법은 생물 시료로부터 리보핵산을 분리하는 과정 중 노출되는 리보핵산분해효소의 활성을 억제하는 방법으로서 생물 시료를 보관하는 동안에 이미 리보핵산 분해효소에 노출되었다면 아무리 리보핵산 분리과정 중 리보핵산분해효소의 활성을 억제한다 해도 전혀 그 효과를 볼 수 없게 된다.
사람의 태반으로부터 추출한 리보핵산 분해효소 억제효소는 리보핵산과 1:1 복합체를 형성하여 비경쟁적 억제작용에 사용될 수 있음이 알려져 널리 사용되어 오고 있다(Peter Blackburn et. al., JBC, 252:5904-5910(1977)). 사람의 태반으로부터 추출한 이 리보핵산 분해효소 억제효소는 효소의 특성상 설프히드릴 시약인 p-히드록시머큐리벤조에이트나 N-에틸말레이미드를 처리할 경우 리보핵산분해효소 와 리보핵산분해효소 억제효소 혼성체가 분해되어 불활성화되는 단점이 있어 이를 극복하기 위해 반드시 과량의 DTT(dithiothreitol)를 함께 사용해야만 한다.
동물 조직 시편 등을 보관할 때 50% 이상의 알콜 용액에 보관하거나 PEG(Poly Ethylene Glycol)등의 용액에 보관하게 함으로써 조직 절편이 수분과 접촉하지 못하게 하여 리보핵산 분해효소에 의한 분해를 막는 방법도 보고된바 있으나 이는 염색법에 조직 시편 관찰 등의 실험에 국한된 것으로 범용으로 사용되기에는 한계가 있다고 하겠다(USP 7,250,270).
바나딜 클로라이드(Vanadyl chloride)는 리보핵산 분해효소와 혼성체를 형성함으로써 분해효소의 활성을 억제하는 효과가 있으나, 리보핵산 중합효소 등의 작용마저 억제하는 영향이 있어 리보핵산 추출과정 중 반드시 완벽하게 제거되어야 하는 단점을 가지고 있다(Sambrook et al., 1989).
현재 상용화 되어 있는 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물은 상기에서 언급한 자료를 토대로 사람 태반에서 분리한 리보핵산 분해효소 저해효소를 주재료로 사용하는 제품군, 50% 이상의 알콜을 함유하여 시료가 수분이 아닌 알콜에 노출되어 리보핵산의 분해를 방지하는 방법을 사용하는 제품군, 고농도의 염을 사용함으로써 리보핵산분해효소의 활성을 억제하는 방법을 사용하는 제품군 등이 있지만 각각 효과적으로 그 활성을 억제할 수 있는 리보핵산 분해효소의 종류가 한정되어 있을 뿐 아니라 리보핵산분해효소의 활성 억제력을 지속시키기 위하여 보조제 및 안정화제를 첨가해야 하는 단점을 가지고 있다.
본 발명의 목적은 리보핵산을 분해시키는 리보핵산 분해효소에 대해 강한 활성 억제력을 갖는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 제공하는 것이며, 시료 보관 중 리보핵산 분해효소에 노출됨으로써 쉽게 분해되는 리보핵산을 안정적으로 보관하기 위한 본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 포함하는 리보핵산 보관용 용기를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 채취된 리보핵산의 분해를 촉진하는 리보핵산 분해효소의 활성을 효과적으로 억제하기 위한 리보핵산 분해효소 활성억제제 화합물은 하기 화학식 1 및 화학식 2 구조의 화합물을 포함한다.
[화학식 1]
Figure 112008025423918-PAT00003
[화학식 2]
Figure 112008025423918-PAT00004
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, A는 CH 또는 N이고; R1은 1 내지 3개의 (C1-C7)알킬이 치환되거나 치환되지 않은 (C6-C20)아릴 또는 (C5-C15)헤테로아릴이고; R2 또는 R4는 서로 독립적으로
Figure 112008025423918-PAT00005
또는
Figure 112008025423918-PAT00006
이고; R3은 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬이며; 상기 치환체 R2 또는 R4에서 B는
Figure 112008025423918-PAT00007
또는
Figure 112008025423918-PAT00008
이며; R5 내지 R9는 서로 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬, 카르복실산, 할로겐 원자, 시아노, 아미노, 모노- 또는 디(C1-C7)알킬아미노, 구아니딘, 우레아 또는 포밀이고; R11, R12 또는 R13은 서로 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬, (C3-C7)시클로알킬, (C3-C10)시클로알킬(C1-C7)알킬, 카르복실산, 할로겐 원자, 시아노, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디(C1-C7)알킬아미노, (C3-C7)시클로알킬아미노, 모포린, 모포린 옥시드, 피페라진, 피페라진 옥시드, 구아니딘, 우레아, 벤질, 벤질옥시 또는 포밀이고; R21은 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬기이며; D는 O, S 또는 -NR22이고; R22는 수소 또는 (C1-C7)알킬이다.
구체적으로는 본 발명에 따른 상기의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 3 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물을 포함한다.
[화학식 3]
Figure 112008025423918-PAT00009
[화학식 4]
Figure 112008025423918-PAT00010
[화학식 5]
Figure 112008025423918-PAT00011
[화학식 6]
Figure 112008025423918-PAT00012
화학식 3 내지 화학식 6에서, R41 또는 R42는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 i-프로필이고; R43 또는 R44는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 카르복실산 또는 니트로이고; R45 또는 R46은 서로 독립적 으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 카르복실산이며; R47 또는 R48은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 시아노 또는 아미노이다.
상기 화학식 5의 화합물은 엔올-케토 형태의 토토머로 존재할 수 있다.
Figure 112008025423918-PAT00013
본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물은 구체적으로는 하기 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물을 포함한다.
Figure 112008025423918-PAT00014
Figure 112008025423918-PAT00015
Figure 112008025423918-PAT00016
Figure 112008025423918-PAT00017
상기 화합물 3은 엔올-케토 형태의 토토머로 존재할 수 있다.
Figure 112008025423918-PAT00018
리보핵산 분해효소는 바람직하게는 엔도 리보핵산 분해효소이며, 상기 엔도 리보핵산 분해효소로서 구체적으로는 RNase A, RNAse H, RNAse I, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1 및 RNase V를 포함한다.
본 발명에서 적용되는 리보핵산은 리보솜 리보핵산(ribosomal RNA), 전령 리보핵산(massanger RNA), 운반 리보핵산(transfer RNA)등을 포함하며, 본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물에 의하여 활성이 억제되는 바람직한 리보핵산 분해효소는 엔도 리보핵산 분해효소로써 구체적으로는 RNase A, RNase H, RNase I, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1, RNase V이며, 이외에 엑소 리보핵산 분해효소로써 PNPase(Polynucleotide Phosphorylase), RNase PH, RNase II, RNase R, RNase D, RNase T, Oligoribonuclease, Exoribonuclease I, Exoribonuclease II 등을 포함한다.
본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물은 용이하게 사용하기 위하여 물, DMF, DMSO, 탄소수 1 내지 5의 저급알콜(예를 들어 메틸알콜, 에틸알콜, 이소프로필알콜, 부탄올 등) 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상에 용해될 수 있다.
상기 리보핵산은 동물조직, 식물조직, 미생물, 혈액, 플라즈마, 혈청, 배양 세포 및 상기 시료를 재조합 유전자로 형질전환시킨 시료를 포함한다.
본 발명은 시료 보관 중 리보핵산 분해효소에 노출됨으로써 쉽게 분해되는 리보핵산을 안정적으로 보관하기 위한 본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 포함하는 리보핵산 보관용 용기를 포함하며, 상기 리보핵산 시료보관용 용기는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 용기 내벽에 도포된 것을 포함한다.
본 발명에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물은 리보핵산을 추출하기위해 수집한 시료를 보관하는 동안 엔도 리보핵산분해효소 및 엑소 리보핵산분해효소의 영향으로 리보핵산이 분해되는 것을 효과적으로 억제할 수 있으며, 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물이 처리된 생물시료 보관용 용기는 생물시료의 보관 및 이송 중 발생할 수 있는 리보핵산의 분해를 효과적으로 억제하여 병원 및 학교, 연구소의 진단 업무 및 실험 업무에 효과적으로 사용될 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다.
하지만, 본 발명의 제조방법은 바람직한 일 실시예의 방법일 뿐, 본 발명이 상술한 제조방법으로 국한되는 것은 아니며, 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있는 자명한 것이다.
이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다
본 발명에 따른 화합물들은 인터 바이오 스크린(미국) 사, 스펙스(네덜란드)사, 아시넥스(러시아)사로부터 화합물 라이브러리로부터 수득할 수 있는 것이다.
[ 실시예 1]
리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물의 처리가 리보핵산의 분해효소 활성에 미치는 영향
1) 리보핵산 분해효소 활성억제용 조성물의 제조
본 특허에서 사용된 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물은 네덜란드 스펙스로부터 구매하여 사용하였으며, 각 화합물의 특성을 표 1 에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112008025423918-PAT00019
상기 화합물들을 각각 2 mg씩 덜어 DMSO(Dimethyl sulfoxide, F.W 78.13, Sigma, D2650) 1ml에 녹인 후 암병에 넣어 보관하였다.
2) 리보핵산 분해효소의 준비
일반인의 경우 사람 혈청 1ml당 120unit 정도의 리보핵산분해효소들이 존재하고 있으며, 이들 리보핵산분해효소들은 상온에서도 매우 안정한 구조를 가지고 있어 다양한 실험에서 사용되어 오고 있는 것으로 알려져 있다(K. K. Reddi et. al., PNAS, 73:2308-2310(1976)).
사람 혈청 내에 존재하는 다양한 엔도 리보핵산분해효소들에 대해 높은 활성억제력을 갖는 물질을 스크리닝 하기위해 미국 이노베이티브 리서치(Innovative Research)사로부터 Pooled Human Normal Serum(Cat. No. IPLA-5, Lot No. IR07-010)을 구매하였고, 멸균된 PBS(Phosphate Buffered Saline) buffer를 이용하여 10배 희석한 것을 실험에 사용하였다.
3) 리보핵산 분해효소 활성 억제 양상 확인
전체 리보핵산(total RNA)은 (주)바이오니아의 AccuZol TM Total RNA Extraction Reagent(K-3090)와 동봉된 실험방법에 따라 헬라세포(HeLa, 1× 106 cells/rxn)로부터 추출하였다.
전체 리보핵산의 추출과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. 먼저 수집된 헬 라세포(1× 106 cells)에 AccuZol TM Total RNA Extraction Reagent 1ml을 넣고 잘 섞어 준 후 200ul의 클로로포름을 넣고 15초간 잘 섞어준다. 얼음에서 15분간 방치한 후 12,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한다. 원심분리가 끝난 튜브에서 상층액만을 조심스럽게 새 튜브에 옮겨 담고 동량의 이소프로필알콜을 넣고 잘 섞어준다. -20℃에서 10분간 방치한 후 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 전체 리보핵산만 가라앉힌다. 1ml의 80% 에틸알콜을 이용하여 튜브 내벽의 잔존 유기용매나 염등을 세척한 후 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 순수한 전체 리보핵산만 튜브 바닥에 가라앉도록 한다. 잔존 에틸알콜이 모두 제거되도록 튜브를 상온에서 건조시키고 리보핵산분해효소가 오염되지 않도록 DEPC(Diethylpyrocarbonate, Sigma, D5758)가 처리된 3차증류수를 이용하여 전체 리보핵산을 녹인 후 -80℃에서 보관한다.
추출된 전체 리보핵산은 Pico-drop 장비를 이용하여 흡광도를 측정하고 이로부터 전체 수율과 순도를 확인하였다. 5 마이크로그램의 사람 전체 리보핵산을 1.5ml 튜브에 넣고 상기에서 준비한 4종의 물질 각 5 마이크로리터(10 마이크로그램)씩 넣은 후 잘 섞어준다. 상기에서 준비된 사람혈청 5 마이크로리터를 넣은 후 37도 배양기에서 5분간 배양한다. 배양이 끝난 후 즉시 AccuZol TM Total RNA Extraction Reagent(바이오니아, K-3090)를 사용하여 사람 혈청을 정제하고 리보핵산은 최종적으로 10 마이크로리터의 DEPC(Diethyl pyrocarbonate, Sigma, D5758)처리된 멸균 3차 증류수에 녹였다. 리보핵산용 아가로오스 겔에서 전기영동하여 사람 혈청 내 리보핵산에 의한 분해양상을 확인하였다(도 2).
그 결과 사람 혈청을 처리하지 않은 대조구(레인 1)는 37℃에서 5분간 반응시킨 후에도 리보핵산이 온전히 보존되고 있었으며, 사람 혈청을 처리하였지만 리보핵산분해효소 활성 억제 물질을 처리하지 않은 대조구(레인 2)는 리보핵산이 모두 분해된 것을 확인할 수 있었다. 시판중인 리보핵산 분해효소 활성 억제 물질이 처리된 대조구(레인 3)은 리보핵산이 분해되지 않은 채 보존되고 있었으며, 본 발명에서 선발된 리보핵산분해효소 활성 억제 물질이 처리된 실험구(레인 4, 5, 6, 7)은 모두 리보핵산이 분해되지 않은 채 온전히 보존되고 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 2]
리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물의 처리가 다른 실험에 미치는 영향
리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 처리함으로써 다른 분자생물학적 실험에 영향을 미친다면 그 화합물은 아무리 리보핵산 분해효소 저해효과가 뛰어나다 할지라도 사용될 수 없으므로, 이러한 부반응(side-effect)를 확인하고자 리보핵산 저해물질이 처리된 리보핵산을 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)와 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)를 수행하였다.
1) 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 저해양상 확인
리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물이 처리된 리보핵산을 주형가닥으로 하 여 사람의 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트와 AccuPowerRT-PCR premix(바이오니아, K-2055)를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 역전사 중합효소반응의 조건은 다음과 같다. 42℃에서 60분간 반응하여 단일가닥 cDNA(Complementary DNA)를 합성하고 94℃에서 5분간 역전사 효소 불활성화 과정을 거친 후 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응은 디옥시리보핵산 변성을 위해 94℃ 20초, 각 프라이머의 표적부위 부착을 위해 60℃ 20초, 상보가닥 합성을 통한 이중가닥 디옥시리보 핵산의 제조를 위해 72℃ 30초의 과정을 30번 반복 수행하였다. 역전사 중합효소연쇄반응의 반응산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 그 크기를 확인하였다(도 2).
그 결과 선발된 4개의 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물 중 하나(레인 4)에서만 역전사 중합효소 연쇄반응에 있어서 약하게나마 반응 저해효과가 있는 것으로 보였으며, 나머지 3개의 리보핵산분해효소 활성 억제용 화합물은 역전사 중합효소 연쇄반응에 있어서 반응 저해효과가 전혀 없는 것으로 확인되었다(레인 1, 2, 3).
2) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)의 저해양상 확인
사람의 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 부위를 타겟으로 하여 프라이머 세트와 5'-말단에 FAM, 3'-말단에 BHQ가 붙은 프로브를 제조하고 리보핵산 분해효소 저해물질이 처리된 리보핵산을 주형가닥으로 한 실시간 역 전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 45℃에서 15분간 반응하여 단일가닥 cDNA(Complementary DNA)를 합성하고, 94℃에서 5분간 역전사 효소 불활성화 과정을 거치는 과정으로 수행하였다. 디옥시리보핵산 변성을 위해 94℃ 5초, 각 프라이머의 표적부위 부착과 상보가닥 합성을 통한 이중가닥 디옥시리보 핵산의 제조를 위해 55℃ 5초의 과정을 45번 반복 수행하였다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 위한 장비는 (주)바이오니아의 ExiCyclerTM 96 Quantitative Thermal Block을 사용하였고, 역전사 효소 및 중합효소는 (주)바이오니아의 M-MLV Reverse Transcriptase(E-3121), Top DNA Polymerase (E-3100)를 사용하였다.
그 결과 선발된 4개의 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물 중 하나(레인 4)에서만 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응에 있어서 반응 저해효과가 있는 것으로 보였으며, 나머지 3개의 리보핵산분해효소 활성 억제용 화합물은 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응에 있어서 반응 저해효과가 전혀 없는 것으로 확인되었다(레인 1, 2, 3).
도 1은 배양 세포에서 추출한 리보핵산에 사람 혈청을 처리한 후 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물을 처리한 것과 처리하지 않은 것을 아가로오스 겔에 전기 영동하여 분리한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물이 처리된 리보핵산을 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행한 반응물을 아가로오스 겔에 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 리보핵산분해효소 활성억제용 화합물이 처리된 리보핵산을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
    [화학식 1]
    Figure 112008025423918-PAT00020
    [화학식 2]
    Figure 112008025423918-PAT00021
    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, A는 CH 또는 N이고;
    R1은 1 내지 3개의 (C1-C7)알킬이 치환되거나 치환되지 않은 (C6-C20)아릴 또는 (C5-C15)헤테로아릴이고;
    R2 또는 R4는 서로 독립적으로
    Figure 112008025423918-PAT00022
    또는
    Figure 112008025423918-PAT00023
    이고;
    R3은 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬이며;
    상기 치환체 R2 또는 R4에서 B는
    Figure 112008025423918-PAT00024
    또는
    Figure 112008025423918-PAT00025
    이며;
    R5 내지 R9는 서로 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬, 카르복실산, 할로겐 원자, 시아노, 아미노, 모노- 또는 디(C1-C7)알킬아미노, 구아니딘, 우레아 또는 포밀이고;
    R11, R12 또는 R13은 서로 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬, (C3-C7)시클로알킬, (C3-C10)시클로알킬(C1-C7)알킬, 카르복실산, 할로겐 원자, 시아노, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디(C1-C7)알킬아미노, (C3-C7)시클로알킬아미노, 모포린, 모포린 옥시드, 피페라진, 피페라진 옥시드, 구아니딘, 우레아, 벤질, 벤질옥시 또는 포밀이고;
    R21은 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 (C1-C7)알킬기이며;
    D는 O, S 또는 -NR22이고;
    R22는 수소 또는 (C1-C7)알킬이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 3 내지 화학식 6에서 선택되는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
    [화학식 3]
    Figure 112008025423918-PAT00026
    [화학식 4]
    Figure 112008025423918-PAT00027
    [화학식 5]
    Figure 112008025423918-PAT00028
    [화학식 6]
    Figure 112008025423918-PAT00029
    화학식 3 내지 화학식 6에서, R41 또는 R42는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 i-프로필이고;
    R43 또는 R44는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 카르복실산 또는 니트로이고;
    R45 또는 R46은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 카르복실산이며;
    R47 또는 R48은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 시아노 또는 아미노이다.
  3. 제 2 항에 있어서,
    하기 구조의 화합물로부터 선택되는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
    Figure 112008025423918-PAT00030
    Figure 112008025423918-PAT00031
    Figure 112008025423918-PAT00032
    Figure 112008025423918-PAT00033
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 리보핵산 분해효소는 엔도 리보핵산 분해효소인 것을 특징으로 하는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    엔도 리보핵산분해효소는 RNase A, RNAse H, RNAse I, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1 및 RNase V로 이루어지는 군에서 선택되는 엔도 리보핵산분해효소 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물은 물, DMF, DMSO, (C1-C5)의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상에 용해된 것을 특징으로 하는 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 리보핵산은 동물조직, 식물조직, 미생물, 혈액, 플라즈마, 혈청, 배양 세포 및 상기 시료를 재조합 유전자로 형질전환시킨 시료로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리보핵산 시료보관용 용기.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 따른 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물을 함유하는 리보핵산 시료보관용 용기.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 리보핵산 분해효소 활성억제용 화합물이 용기 내벽에 도포된 것을 특징으로 하는 리보핵산 시료보관용 용기.
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