KR100563600B1

KR100563600B1 - 부갑상선 호르몬의 아날로그

Info

Publication number: KR100563600B1
Application number: KR1020047006338A
Authority: KR
Inventors: 동젱신
Original assignee: 소시에떼 더 콘세이유 더 레세르세 에 다플리까띠옹 시엔띠피끄, 에스.아.에스.
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-07-03
Publication date: 2006-03-22
Also published as: CN1521189A; EP0847278A1; ES2207680T3; PT847278E; DE69638025D1; PT1405861E; JP2003238595A; MX9800418A; KR20040041709A; ATE442159T1; DE69630133T2; KR20040042907A; HK1096976A1; NZ312899A; DK1405861T3; SK3198A3; JPH11509201A; KR19990028947A; EP1405861A2; WO1997002834A1

Abstract

3, 16, 17, 18, 19 및 34의 위치의 아미노산 잔기의 적어도 하나는 α-아미노이소부틸산인 부갑상선 호르몬의 분획(1-34)의 펩타이드 변종.

부갑상선 호르몬, 아미노이소부틸산, 펩타이드 변종

Description

부갑상선 호르몬의 아날로그 {ANALOGS OF PARATHYROID HORMONE}

부갑상선 호르몬("PTH")은 부갑상선에서 생산되는 폴리펩타이드이다. 상기 호르몬의 성숙한 순환 형태는 84개의 아미노산 잔기를 포함한다. PTH의 생물학적 활성은 이의 N-말단의 펩타이드 분획(예를 들면, 1 내지 34개의 아미노산 잔기)에 의해서 재생될 수 있다. 부갑상선 호르몬-관련 단백질("PTHrP")은 PTH에 상동인 N-말단을 가진 139 내지 173개의 아미노산 단백질이다. PTHrP는 PTH의 공통 PTH/PTHrP 수용체에 결합하는 것을 포함한 PTH의 수 많은 생물학적 효과를 공유한다(Tregear, et al., Endocrinol., 93:1349(1983)). 수많은 다른 공급원, 예를 들면 인간, 소, 래트, 닭에서 유래된 PTH 펩타이드는 특이적이다(Nissenson, et al., Receptor, 3:193 (1993)).

PTH는 뼈 질량(bone mass) 및 질을 향상한다는 것이 밝혀졌다(Dempster, et al., Endocrine Rev., 14: 690(1993); 및 Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suppl. 5B):37S(1991)). 항 흡수성 치료를 동시에 실시하거나 실시하지 않거나 모두에서 간헐적으로 투여된 PTH의 동화성 효과는 골다공성 남성과 여성에게서 관찰되었다(Slovik, et al., J. Bone Miner. Res., 1:377(1986); Reeve, et al., Br. Med. J., 301:314 (1990); 및 Hesch, R-D., et al., Calcif. Tissue Int'l, 44:176 (1989)).

본 발명의 한 양태는 다음의 일반식인 PTH(1-34)의 펩타이드 변형체 및 그의 제약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

R₁

＼

A₁-Val-A₃-Glu-A₅-Gln-A₇-A₈-His-Asn-A₁₁-A₁₂-Lys-His-A₁₅-

／

R₂

A₁₆-A₁₇-A_l8-A_l9-Arg-A₂₁-Glu-A₂₃-A ₂₄-Arg-Lys-A₂₇-A₂₈-Gln-

A₃₀-A₃₁-A₃₂-A₃₃-A₃₄-R₃,

식 중, A₁은 Ser, Ala, 또는 Dap;

A₃은 Ser, Thr, 또는 Aib;

A₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Phe 또는 p-X-Phe(단, X는 OH, 할로겐, 또는 CH₃);

A₇는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Phe, 또는 p-X-Phe(단, X는 OH, 할로겐, 또는 CH₃);

A₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Cha 또는 Nle;

A₁₁는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Phe 또는 p-X-Phe(단, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₁₂는 Gly 또는 Aib;

A₁₅는 Leu, Nle, Ile, Cha, β-Nal, Trp, Pal, Phe 또는 p-X-Phe(단, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₁₆는 Ser, Asn, Ala, 또는 Aib;

A₁₇는 Ser, Thr, 또는 Aib;

A₁₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, Nle, Cha, 또는 Aib;

A₁₉는 Glu 또는 Aib;

A₂₁는 Val, Cha, 또는 Met;

A₂₃는 Trp 또는 Cha;

A₂₄는 Leu 또는 Cha;

A₂₇는 Lys, Aib, Leu, hArg, Gln, 또는 Cha;

A₂₈는 Leu 또는 Cha;

A₃₀는 Asp 또는 Lys;

A₃₁는 Val, Nle, Cha, 또는 결손;

A₃₂는 His 또는 결손;

A₃₃는 Asn 또는 결손;

A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, Aib, 또는 결손;

R₁ 및 R₂의 각각은 독립적으로 H, C_1∼12 알킬, C_2∼12 알켄일, C_7∼20 페닐알킬, C_11∼20 나프틸알킬, C_l∼12 하이드록시알킬, C_2∼12 하이드록시알켄일, C_7∼20 하이드록시페닐알킬, 또는 C_11∼20 하이드록시나프틸알킬; 또는 R₁ 및 R₂의 하나 및 단지 하나는 COE₁(단, E₁는 C_1∼12 알킬, C_2∼12 알켄일, C_7∼20 페닐알킬, C_11∼20 나프틸알킬, C_l∼12하이드록시알킬, C_2∼12하이드록시알켄일, C_7∼20 하이드록시-페닐알킬, 또는 C_11∼20 하이드록시나프틸알킬; 및

R₃는 OH, NH₂, C_1∼12알콕시, 또는 NH-Y-CH₂-Z(단, Y는 C _1∼12 하이드로카본 모이어티 및 Z는 H, OH, C0₂H, 또는 CONH₂;

단, (ⅰ) A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이거나, A₃, A₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A ₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib; 또는 ( ⅱ) A₁은 Dap, A₇은 β-Nal, Trp, Pal, Phe 또는 p-X-Phe, A₁₅은 β-Nal, Trp, Pal, Phe, 또는 p-X-Phe, A₂₇은 hArg 또는 A₃₁은 Nle인 것으로 제공됨.

상기 식에 의해서 포함되는 화합물의 일부는 A₅, A₇, A₁₁, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이다. 예를 들면, A₃는 Ser; A₅는 Ile; A₇는 Leu 또는 Cha; A₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, 또는 Nle; A₁₁는 Leu 또는 Cha; A₁₂는 Gly; A₁₅는 Leu 또는 Cha; A₁₆는 Asn 또는 Aib; A₁₇는 Ser; A₁₈는 Met 또는 Nle; A₂₁는 Val; A₂₇는 Lys, hArg, 또는 Cha; A₃₂는 His; A₃₁는 Val, Nle, 또는 Cha; A³³는 Asn; A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, 또는 Aib; R₁은 H; R₂은 H; 및 R₃은 NH₂; 단, A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A₂₃, A₂₄, A ₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이고, A₃, A₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib이다. 소망된다면, A₇ 및 A_ll의 적어도 하나는 Cha일 수 있거나; 또는 A₁₅, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이다.

다른 일부는 A₃, A₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib이다. 예를 들면, A₃는 Ser 또는 Aib; A₅는 Ile; A₇는 Leu 또는 Cha; A ₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, 또는 Nle; A₁₁는 Leu 또는 Cha; A₁₅는 Leu 또는 Cha; A₁₆는 Asn 또는 Aib; A₁₈는 Met, Aib 또는 Nle; A₂₁는 Val; A₂₇는 Lys, Aib, Leu, hArg, 또는 Cha; A₃₁는 Val, Nle, 또는 Cha; A₃₂는 His; A₃₃는 Asn; A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, 또는 Aib; R₁은 H; R₂은 H; 및 R₃은 NH₂; 단, A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₅, A₁₈, A₂₁, A ₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이거나, A₃, A ₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib이다. 소망된다면, A₇ 및 A_ll의 적어도 하나는 Cha일 수 있거나; 또는 A₁₅, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이다.

또 다른 일부는 A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₅, A ₁₈, A₂₁, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, 및 A ₃₁의 적어도 하나는 Cha이거나, 또는 A₃, A₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib이다. 예를 들면, A₃는 Ser 또는 Aib; A₅는 Ile; A₇는 Leu 또는 Cha; A₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, 또는 Nle; A₁₁는 Leu 또는 Cha; A₁₅는 Leu 또는 Cha; A₁₆는 Asn 또는 Aib; A₁₈는 Met, Aib 또는 Nle; A₂₁는 Val; A₂₇는 Lys, Aib, Leu, hArg, 또는 Cha; A₃₁는 Val, Nle, 또는 Cha; A₃₂는 His; A₃₃는 Asn; A₃₄는 Phe, Tye, Amp, 또는 Aib; R₁은 H; R₂은 H; 및 R₃은 NH₂이다. 만약 소망된다면, A₇ 및 A_ll의 적어도 하나는 Cha; 및 A₁₆, A₁₉, 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib; 또는 A₂₄, A₂₈, 및 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이고, A₁₆ 및 A_l7의 적어도 하나는 Aib이다.

또 다른 일부는 A₁의 적어도 하나는 Dap, A₇는 β-Nal, Trp, Pal, Phe, 또는 p-X-Phe, A₁₃는 β-Nal, Trp, Pal, Phe, 또는 p-X-Phe이다. 예를 들면, A₁는 Ser, Gly 또는 Dap; A₃는 Ser 또는 Aib; A₈는 Met, Nva, Leu, Val, Ile, 또는 Nle; A ₁₆는 Asn 또는 Aib; A₁₈는 Met, Aib 또는 Nle; A₂₁는 Val; A₂₇는 Lys, Aib, Leu, hArg, 또는 Cha; A₃₁는 Val, Nle, 또는 Cha; A₃₂는 His; A₃₃는 Asn; A₃₄는 Phe, Tyr, Amp, 또는 Aib; R₁은 H; R₂은 H; 및 R₃은 NH₂이다.

이하는 상기 식에 의해서 포함되는 본 발명의 상기 펩타이드의 일례들이다. [Cha⁷]hPTH(1-34)NH₂, [Cha¹¹]hPTH(1-34)NH₂, [Cha¹⁵]hPTH(1-34)NH₂, [Cha^7,11]hPTH(1-34)NH₂, [Cha^7,11, Nle^8,l8, Tyr³⁴]hPTH(l-34)NH₂; [Cha²³]hPTH(1-34)NH₂, [Cha²⁴]hPTH(1-34)NH₂, [Nle^8,l8, Cha²⁷]hPTH(l-34)NH₂; [Cha²⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Cha³¹]hPTH(1-34)NH₂; [Cha²⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^27,29]hPTH(1-34)NH₂; [Cha ²⁸]bPTH(1-34)NH₂; [Cha²⁸]rPTH(1-34)NH₂; [Cha^24,28,31]hPTH(1-34)NH₂; [Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH ₂; [Aib¹⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Aib^16,19]hPTH(1-34)NH₂; [Aib ^16,19,34]bPTH(1-34)NH₂; [Aib^16,34]hPTH(1-34)NH₂; [Aib^19,34]hPTH(1-34)NH₂; [Cha ^7,11, Nle^8,18, Aib^16,19, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11, Nle^8,18,31, Aib^16,19, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha⁷, Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH₂; [Cha¹¹, Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH₂; [Cha⁷, Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha¹¹, Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha²⁷, Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH ₂; [Cha²⁷, Aib³⁴ ]hPTH(1-34)NH₂; [Cha²⁸, Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH₂; [Cha²⁸, Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Nle³¹] hPTH(1-34)NH₂; [hArg²⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Dap¹, Nle^8,18, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Nle³¹]bPTH(1-34)NH₂; [Nle³¹]rPTH(1-34)NH₂; [hArg²⁷]bPTH(l-34)NH ₂; [hArg²⁷]rPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11, Aib¹⁹, Lys³⁰]hPTH(1-34)NH₂; [Aib¹²]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^24,28,31, Lys³⁰]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^28,31]hPTH(1-34)NH₂; [Cha ^7,11, Nle^8,18, Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Aib³]hPTH(1-34)NH₂; [Cha⁸]hPTH(1-34)NH₂; [Cha¹⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11, Aib¹⁹]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11, Aib¹⁶]hPTH(1-34)NH ₂; [Aib¹⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Cha⁵]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂; [Cha ^7,11, Nle^8,18, Aib¹⁹, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11, Nle^8,18, Aib¹⁹, Lys³⁰, Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂; [Aib¹⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Cha ^7,11, Leu²⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11,15, Leu²⁷]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^7,11,27]hPTH(l-34)NH ₂; [Cha^7,11,15,27]hPTH(1-34)NH₂; [Trp¹⁵]hPTH(l-34)NH₂; [Nal¹⁵]hPTH(1-34) NH ₂; [Trp¹⁵, Cha23]hPTH(1-34)NH₂; [Cha^15,23]hPTH(1-34)NH₂; [Phe^7,11]hPTH(1-34)NH₂; [Nal ^7,11]hPTH(1-34)NH₂; [Trp^7,11]hPTH(1-34)NH₂; [Phe^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂; [Nal ^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂; [Trp^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂; 및 [Tyr^7,11,15]hPTH(1-34)NH₂있다.

다른 양상에서 본 발명은 이하의 식에 포함되는 펩타이드; 또는 그의 제약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

R₁

＼

A₁-Val-A₃-Glu-A₅-Gln-A₇-A₈-His-A₁₀-A₁₁-A₁₂-Lys-A₁₄-A₁₅-

／

R₂

A₁₆-A₁₇-A_l8-A_l9-Arg-Arg-A₂₂-A₂₃-A ₂₄-A₂₅-A₂₆-A₂₇-A₂₈-

A₂₉-A₃₀-A₃₁-A₃₂-A₃₃-A₃₄-R₃,

식 중, A₁은 Ala, Ser, 또는 Dap;

A₃은 Ser 또는 Aib;

A₅는 His, Ile, 또는 Cha;

A₇는 Leu, Cha, Nle, β-Nal, Trp, Pal, Phe, 또는 p-X-Phe(단, X는 OH, 할로겐 또는 CH₃);

A₈는 Leu, Met, 또는 Cha;

A₁₀는 Asp 또는 Asn;

A₁₁는 Lys, Leu, Cha, Phe, 또는 β-Nal;

A₁₂는 Gly 또는 Aib;

A₁₄는 Ser 또는 His;

A₁₅는 Ile 또는 Cha;

A₁₆는 Gln 또는 Aib;

A₁₇는 Asp 또는 Aib;

A₁₈는 Leu, Aib, 또는 Cha;

A₁₉는 Arg 또는 Aib;

A₂₂는 Phe, Glu, Aib, 또는 Cha;

A₂₃는 Phe, Leu, Lys, 또는 Cha;

A₂₄는 Leu, Lys, 또는 Cha;

A₂₅는 His, Aib, 또는 Glu;

A₂₆는 His, Aib, 또는 Lys;

A₂₇는 Leu, Lys, 또는 Cha;

A2₈는 Ile, Leu, Lys, 또는 Cha;

A₂₉는 Ala, Glu, 또는 Aib;

A₃₀는 Glu, Cha, Aib, 또는 Lys;

A₃₁는 Ile, Leu, Cha, Lys, 또는 결손;

A₃₂는 His 또는 결손;

A₃₃는 Thr 또는 결손;

A₃₄는 Ala 또는 결손;

R₁및 R₂의 각각은 독립적으로 H, C_1∼12알칸일, C_7∼20페닐알킬, C_11∼20 나프틸 알킬, C_l∼12하이드록시알킬, C_2∼12하이드록시알켄일, C_7∼20 하이드록시페닐알킬, 또는 C_11∼20하이드록시나프틸알킬; 또는 R₁및 R₂의 하나 및 단지 하나는 COE₁(단, E₁는 C_1∼12 알킬, C_2∼12 알킬, C_2∼12 알켄일, C_7∼20페닐알킬, C_11∼20 나프틸알킬, C_l∼12 하이드록시알킬, C_2∼12하이드록시알켄일, C_7∼20하이드록시페닐알킬, 또는 C _11∼20 하이드록시나프틸알킬; 및

R₃는 OH, NH₂, C_1∼12알콕시, 또는 NH-Y-CH₂-Z(단, Y는 C _1∼12 하이드로카본 모이어티 및 Z는 H, OH, C0₂H, 또는 CONH₂);

단, (ⅰ) A₅, A₇, A₈, A₁₁, A₁₅, A₁₈, A₂₂, A₂₃, A₂₄, A₂₇, A₂₈, A₃₀, 또는 A₃₁의 적어도 하나는 Cha이고, 또는 A₃, A₁₂, A₁₆, A₁₇, A₁₈, A₁₉, A₂₂, A₂₅, A₂₆, A₂₉, A₃₀, 또는 A₃₄의 적어도 하나는 Aib이고; 또는 (ⅱ) A₂₃, A₂₄, A₂₇, A ₂₈, 또는 A₃₁의 적어도 하나는 Lys인 것을 제공함. 한 실시예에서는, A₇ 또는 A₁₁의 적어도 하나는 Cha이다. 또 다른 실시예에서는, A₁₆ 또는 A₁₉의 적어도 하나는 Aib이다. 이상에서 언급된 식 의 펩타이드의 특정 예는 다음을 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다.

N-말단 아미노산을 제외하고는, 본 명세서에 있는 아마노산의 모든 약자(예를 들면, Ala 또는 A₁)는 -NH-CH(R)-CO-(단, R은 아미노산의 측쇄(예를 들면 Ala에서 CH₃))의 구조를 의미한다. N-말단 아미노산에 대해서는, 약어는 =N-CH(R)-CO-(단, R은 아미노산의 측쇄)의 구조를 의미한다. β-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, 및 Aib는 각각 β-(2-나프틸)알라닌, 노어로이신, α,β-디아미노프로피온산, 사이클로헥실알라닌, 노어발린, 4-아미노-페닐알라닌, 3-피리디닐알라닌, 및 α-아미노이소부틸산과 같은 아미노산의 약어이다. 상기 식에서, 하이드록시알킬, 하이드록시페닐-알킬 및 하이드록시나프틸알킬은 1-4 하이드록시 치환체를 함유할 수가 있다. 또한, COE1은 -C=O·E1를 의미한다. -C=O·E1의 일례는 제한되는 것은 아니지만, 아세틸 및 페닐프로피오닐을 포함한다.

본 발명의 펩타이드는 다른 형태 예를 들면, [Cha7,11]hPTH(1-34)NH2로, 두 번째 괄호와의 사이에 위치한 천연 서열에서 치환된 아미노산을 가진 형태로 나타날 수도 있다(예를 들면, hPTH에서 Leu⁷대신 Cha⁷ 그리고 Leu¹¹대신 Cha ¹¹). 약어 hPTH는 인간 PTH를 의미하는 것이고, hPTHrP는 인간 PTHrP이고, rPTH 는 쥐(rat) PTH이고, bPTH는 소의 PTH이다. 괄호 사이의 숫자는 펩타이드에 존재하는 아미노산의 수를 의미하는 것이다(예를 들면, hPTH(1-34)는 인간 PTH의 펩타이드 서열의 아미노산 1 내지 34이다). hPTH(1-34), hPTHrP(1-34), bPTH(1-34), 및 rPTH(1-34)는 Nissenson, et al., Receptor, 3:193(1993)에 나타나 있다. PTH(1-34)NH₂에서 "NH₂"는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미데이트되었다는 것을 의미한다. 다른 한편으로, PTH(1-34)는 유리 산 C-말단을 가진다.

본 발명의 상기 펩타이드 각각은 대상(즉, 인간 환자와 같은 포유류)의 뼈의 성장을 자극할 수가 있다. 따라서, 이는 단독 투여 또는 항흡수치료(antiresorptive therapy) 예를 들면 비스포스포네이트 및 칼시토닌과 동시에 투여할 때 골다공증 및 골절의 치료에 유용하다.

본 발명의 펩타이드는 치료학적으로 수용가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 상기 염들의 예로는 제한되는 것은 아니지만 유기산(아세틱, 락틱, 말레익, 시트릭, 말릭, 아스코르빅, 숙시닉, 벤조익, 메탄술포닉, 톨루엔술포닉 또는 팔모익 에시드), 무기산(예를 들면, 하이드로클로익 에시드, 술퍼릭 에시드, 또는 포스포릭 에시드) 및 폴리머릭 에시드(예를 들면, 탄닉 에시드, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리락틱, 폴리글리코릭, 또는 폴리락틱-글리코릭 에시드의 코폴리머)로 형성된다.

본 발명의 치료학적 효과량의 펩타이드 및 제약학적으로 수용가능한 캐리어 물질(예를 들면, 치료학적 화합물과 함께 마이셀을 형성할 수 있는 포스포리피드, 마그네슘 카보네이트, 또는 락토스)은 함께 치료학적 조성물(예를 들면, 필, 정제, 캡슐, 또는 액상)을 대상에게 투여(예를 들면, 구강, 정맥내, 경피, 폐, 질, 피하, 비강, 이온삼투압 또는 기관지 내로의)하도록 형성된다. 구강으로 투여되는 상기 필, 정제 또는 캡슐은 위에서 소장으로 소화되지 않고 통과하도록 하는 충분한 시간동안 위산 또는 장내의 효소로부터 상기 활성 조성물을 보호하도록 코팅될 수 있다. 상기 치료학적 조성물은 또한 생체분해 가능하거나 또는 생체분해가능하지 않은 지속적으로 분비되는 제제의 한 형태로 피하 또는 근육내로 투여될 수 있다. 미국 특허 제3,773,919호 및 제4,767,628호 및 PCT 출원번호 제WO94/15587호 참조. 연속적인 투여는 매몰식 또는 외부의 펌프(예를 들면 INFUSAIDTM 펌프)를 사용하여 성사될 수 있다. 상기 투여는 1일 일회 투여와 같은 간헐적으로 또는 지속적 분비 제제와 같은 낮은 투여량에서 연속적으로 실시될 수도 있다.

상기 언급된 질병 또는 이상을 치료하기 위한 본 발명의 펩타이드 투여량은 투여방법, 대상의 연령 및 체중, 및 처치될 대상의 상태에 따라 변하고, 결론적으로는 진료하는 내과의사 또는 수의사에 의해서 결정될 것이다.

또한 본 발명의 범주 안에 있는 양태는 골다공증 또는 골절과 같은 뼈의 성장의 결핍 등과 관련된 병 또는 이상을 처리하는데 사용되는 상기 일반식에 포함된 펩타이드이다. 본 발명의 다른 특징과 장점은 이하의 상세한 설명 및 청구의 범위에서 확연해질 것이다.

본 명세서의 설명을 기준으로 하여, 본 발명은 완전히 정도까지 이용될 수 있다. 다음의 특정 실시예는 단순한 도시만을 위한 것이지 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 또한 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 자료로서 병합된다.

실시예

구조

PTH(1-34)는 2개의 양쪽 친화성 알파 헬리칼 영역을 가진 것으로 보고되었다. 예를 들면 Barden, et al., Biochem., 32:7126(1992) 참조. 제1 α-헬릭스는 아미노산 잔기 4 내지 13 사이에 형성되고, 반면 제2 α-헬릭스는 아미노산 잔기 21 내지 29 사이에 형성된다. 본 발명의 일단의 펩타이드는 PTH(1-34)의 두 영역안 또는 인근에 하나 이상의 잔기에 대한 Cha의 치환(예를 들면 제1 α-헬릭스 안에 Cha⁷ 및 Cha¹¹ 및 제2 α-헬릭스 안에 Cha²⁷ 및 Cha²⁸)을 함유한다.

또한 본 발명은 상기 α-헬릭스에 인접한 잔기에 대해서 (예를 들면 Aib¹⁶, Aib¹⁹, 및 Aib³⁴; hArg²⁷ 및 Nle³¹) Aib의 치환 또는 N-말단 잔기에 대해서 Dpa의 치환을 가진 PTH(1-34)의 변형체를 포함한다.

합성

본 발명의 펩타이드는 표준 고체상 합성으로 제조될 수 있다. Stewart, J.M., et al., Solid Phase Synthesis(Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984) 참조. 다음은 [Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂의 제조방법을 설명하고 있다. 본 발명의 다른 펩타이 드는 당업자에 의해서 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

상기 펩타이드는 Boc-화학 고체상 펩타이드 합성을 가속화하도록 수정된 Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A 펩타이드 합성기로 합성된다. Schnoize, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992)을 참조. 0.93 mmol/g의 치환을 갖는 4-메틸벤즈-하이드릴아민(4-Methylbenz-hydrylamine)(MBHA) 수지 (Peninsula, Belmont, CA)가 사용되었다. Boc 아미노산 (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA)가 다음의 측쇄를 보호하기 위해서 사용되었다: Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHxl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Glu(OcHxl)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Asn-GH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Met-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, 및 Boc-Trp(Fm)-OH. 상기 합성은 0.14 mmol 규모로 실행되었다. 상기 Boc 기는 2×1 분 동안 100% TFA로 처리하여 제거되었다. Boc 아미노산 (2.5 mmol)은 4 mL의 DMF에서 HBTU (2.0 mmol) 및 DIEA (1.0 mL)로 예비 활성화되고 상기 펩타이드-수지 TFA 염의 전중성화 없이 커플링되었다. 커플링시간(coupling time)은 Boc-Aib-OH 및 다음 잔기, Boc-Asn(Xan)-OH의 커플링시간이 20분인 것을 제외하고는 5분이었다.

상기 펩타이드 사슬의 조합의 말단에서, 상기 수지는 2×30분 동안 DMF에서 20% 메르캅토에탄올/10% DIEA의 용액으로 처치되어 His 측쇄에서 DNP 기를 제거하였다. 그후, N-말단 Boc 기는 2×2분 동안 100% TFA로 처리되어 제거된다. DMF에서 10% DIEA로 상기 펩타이드-수지를 중성화(1×1 min.)한 후에, 2×30분 동안 15% 에탄올아민/15% 물/70% DMF의 용액으로 처치하여서 Trp의 측쇄에 있는 포르밀기를 제거하였다. 부분적으로 보호 해지된 펩타이드 수지는 DMF 및 DCM으로 세척되고 감압하에서 건조되었다. 최종 분할(cleavage)은 75분 동안 0℃에서 아니솔(anisole) 1mL을 함유한 HF 10 mL에서 상기 펩타이드-수지를 교반하여 실행된다. HF는 질소흐름으로 제거되었다. 상기 잔기는 에테르(6×10 mL)로 세척되고 4N HOAc (6×10 mL)로 추출되었다.

상기 수계 추출물에서 상기 펩타이드 혼합물은 역상 VydacTM C18 칼럼(Nest Group, Southborough, MA)을 사용하여 역상으로 준비된 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정화되었다. 상기 칼럼은 10mL/분의 유속으로 선상의 변화도(130분 상에 용액 B를 10% 내지 45%)로 용출되었다(용액 A = 0.1% 수계 TFA; 용액 B = TFA 0.1%를 함유한 아세토니트릴). 분획은 수집되었고 분석 HPLC로 체크되었다. 이들은 정제품을 함유한 것은 혼합되고 동결건조되어서 건조되었다. 백색고체의 62.3mg이 획득되었다. 순도는 분석 HPLC 분석을 기준으로 >99%이었다. 전자-스프레이 매스 스펙트로메터 분석은 4054.7의 분자량을 내었다(계산된 분자량은 4054.7과 동일).

[Cha^7,11]hPTH(1-34)NH₂의 합성 및 정제는 [Aib³⁴]hPTH(1-34)NH₂의 상기 합성방법과 동일하게 수행되었다. 상기 보호된 아미노산 Boc-Cha-OH는 Bachem, CA로부터 구입되었다. 상기 최종산물의 순도는 >98%였고, 상기 전자-스프레이 매스 스펙트로메터는 4197.0의 분자량을 내었다(계산된 분자량은 4196.9과 동일).

상기에서 사용된 상기 약어의 온전한 이름은 다음과 같다. 즉, Boc는 t-부틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl), HF는 불화수소(hydrogen fluoride)이고, Fm 은 포르밀(formyl)이고, Xan은 크산틸(xanthyl)이고, Bzl는 벤질(benzyl)이고, Tos 는 토실(tosyl)이고, DNP는 2,4-디니트로페닐(2,4-dinitrophenyl)이고, DMF는 디메틸포름아미드(dimethylformamide)이고, DCM은 디클로로메탄(dichloromethane)이고, HBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로니움 헥사플루오로포스페이트((2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate)이고, DIEA는 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)이고, HOAc는 아세트산(acetic acid)이고, TFA는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이고 , 2ClZ는 2-클로로벤질옥실카보닐(2-chlorobenzyloxycarbonyl)이고, OcHxl는 O-사이클로헥실(0-cyclohexyl)이다.

상기 일반식의 치환기 R₁, 및 R₂는 본 기술에 알려진 표준방법에 의해서 상기 N-말단 아미노산의 유리 아민에 부착될 수가 있다. 예를 들면, 알킬기(예를 들면 C1∼12 알킬)는 환원 알킬레이션을 이용하여 부착될 수가 있다. 하이드록시알킬기(예를 들면 C1∼12 하이드록시알킬)는 상기 유리 하이드록시기가 t-부틸 에스테르로 보호된 경우에 환원성 알킬레이션을 이용하여 부착될 수가 있다. 아실기(예를 들면 COE₁)는 한 시간 동안 메틸렌 클로라이드에서 유리 산과 디이소프로필카르보디이미드 모두의 3몰 당량을 상기 완전한 수지에 혼합하고 상기 결과 수지를 상기 세척공정에서 단계 (a) 내지 (f)를 걸쳐서 사이클링하므로써 상기 유리 산(예 를 들면 E₁COOH)을 N-말단 아미노산의 유리 아민기에 커플링하여 부착될 수 있다. 만약 상기 유리 산이 유리 하이드록시(예를 들면 p-하이드록시페닐프로피온산)을 함유한다면, 상기 커플링은 HOBT의 추가의 3몰 당량과 함께 실행될 것이다.

본 발명의 다른 펩타이드는 당업자에 의해서 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

기능분석

A. PTH 수용체의 결합

본 발명의 펩타이드는 SaOS-2 (인간 골다공증 세포)에 존재하는 PTH 수용체에 결합되는 능력에 대해서 실험되었다. SaOS-2 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC # HTB 85)는 공기 중에 5% CO2의 습식 분위기; 37℃에서 10% 소 태아의 혈청(FBS) 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지(Sigma, St. Louis, MO)에 배양되었다. 상기 배지는 3 내지 4일 마다 교체되었고 상기 세포는 트립신화에 의해서 매주 보충배양되었다.

SaOS-2 세포는 군락에 다다를 때까지 4일간 배양된다. 상기 배지는 RPMI 1640 내 5% FBS 배지로 대치되어 본 발명의 경쟁 펩타이드가 10^-11M 내지 10^-4M 사이의 다양한 농도에서 존재할 때 10x10⁴ cpm 모노-¹²⁵ I-(Nle^8,18, Tyr ³⁴(3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH₂로 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 상기 세포는 아이스-콜드 PBS로 4시간 동안 세척되고, 0.1M의 NaOH로 분해되었고, 상기 세포와 결합된 방사활성은 섬광(scintillation) 계수기로 계수된다. 모노-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴(3- ¹²⁵I)] bPTH(1-34)NH₂의 합성은 Goldman, M.E., et al., Endocrinol., 123:1468 (1988)에 설명된 바와 같이 수행되었다.

결합분석은 본 발명의 다양한 펩타이드로 수행되었고, 각 펩타이드에 대해서 IC₅₀ 값(모노-¹²⁵ I-(Nle^8,18, Tyr³⁴(3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH ₂의 결합의 최대 방지의 절반)이 계산되었다.

표 1에 보여지는 바와 같이, 상기 실험된 모든 펩타이드는 SaOS-2 세포에서 PTH 수용체에 대한 높은 결합 친화성을 가졌다.

B. 아데닐레이트 사이클라제 활성의 자극

본 발명의 상기 펩타이드의 SaOS-2 세포에서 생리학적 반응을 유도하기 위한 능력이 측정되었다. 보다 상세하게는, 상기 아데닐레이트 사이클라제의 자극이 Rodan, et al., J. Clin. Invest. 72: 1511 (1983) 및 Goldman, et al., Endocrinol., 123:1468 (1988)에서 설명된 방법대로 cAMP (아데노신 3',5'-모노포스페이트)의 합성치를 측정하여 결정되었다. 24개의 웰 플레이트에 있는 군락 SAOS-2 세포는 2시간 동안 37℃에서 0.5 μCi [3H]아데닌(26.9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)으로 배양되었고, Hank의 밸런스된 염 용액(Gibco, Gaithersburg, MD)으로 2회 세척되었다. 상기 세포는 신선한 배지에서 15분 동안 1 mM IBMX [이소부틸메틸-크산틴, Sigma, St. Louis, MO]로 처리되었고 본 발명의 펩타이드는 상기 배지에 첨가되어 5분 동안 배양되었다. 상기 반응은 1.2M 트리클로로아세트산(TCA)(Sigma, St. Louis, Mo)을 첨가하여 정지된 후, 4N KOH로 샘플 중성화하였다. cAMP는 2개의 컬럼 크로마토그래피 방법으로 분리되었다(Salmon, et al., 1974, Anal. Biochem. 58, 541). 방사활성은 섬광 계수기에 의해서 계수되었다(Liquid Scintillation Counter 2200CA, PACKARD, Downers Grove, IL).

실험된 펩타이드에 대한 각각의 EC₅₀ 값 (아데닐레이트 사이클라제의 최대 자극치의 절반)은 계산되어 표 1에 나타내었다. 모든 실험된 펩타이드는 아데닐레이트 사이클라제 활성의 강력한 자극제인 것으로 밝혀지고 이는 조골세포 증식(예를 들면 뼈의 성장)을 위한 근위 시그날로 인식되는 생화학적 경로이다.

[표 1]

기타 실시예

본 발명은 상세한 설명에 연계되어서 설명되고 있지만 다음의 설명은 본 발명을 설명하고자 하는 것이지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니고 이는 첨부된 청구의 범위의 범위에 의해서 한정되는 것이고 청구의 범위 안에서 수정된다.

Claims

다음 식의 펩타이드; 또는 그의 제약학적으로 수용가능한 염.

R₁

＼

A₁-Val-A₃-Glu-A₅-Gln-A₇-A₈-His-Asn-A₁₁-A₁₂-Lys-His-A₁₅-

／

R₂

A₁₆-A₁₇-A_l8-A_l9-Arg-A₂₁-Glu-A₂₃-A₂₄-Arg-Lys-A₂₇-A₂₈-Gln-

A₃₀-A₃₁-A₃₂-A₃₃-A₃₄-R₃,

식 중, A₁은 Ser;

A₃은 Ser, 또는 Aib;

A₅는 Ile;

A₇는 Leu;

A₈는 Met;

A₁₁는 Leu;

A₁₂는 Gly;

A₁₅는 Leu;

A₁₆는 Asn, 또는 Aib;

A₁₇는 Ser, 또는 Aib;

A₁₈는 Met;

A₁₉는 Glu 또는 Aib;

A₂₁는 Val;

A₂₃는 Trp;

A₂₄는 Leu;

A₂₇는 Lys;

A₂₈는 Leu;

A₃₀는 Asp;

A₃₁는 Val;

A₃₂는 His;

A₃₃는 Asn;

A₃₄는 Phe, 또는 Aib;

R₁ 및 R₂의 각각은 독립적으로 H; 및

R₃는 NH₂;

단, A₃, A₁₆, A₁₇, A₁₉ 및 A₃₄의 적어도 하나는 Aib임.
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다음 식의 펩타이드 또는 그의 제약학적으로 수용가능한 염:

H₂-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Aib-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂;

H₂-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Aib-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂;

H₂-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Aib-NH₂;

H₂-Ser-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Aib-Ser-Met-Aib-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂; 또는

H₂-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Aib-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂.
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제1항에 있어서,

A₁₆ 및 A₁₉의 적어도 하나는 Aib인 펩타이드; 또는 그의 제약학적으로 수용가능한 염.
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