KR100543180B1

KR100543180B1 - 혈소판 응집 억제활성이 우수한 알카로이드계 화합물

Info

Publication number: KR100543180B1
Application number: KR1020020043645A
Authority: KR
Inventors: 허태린; 박병수; 이성은
Original assignee: 주식회사 티지 바이오텍
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2002-07-24
Publication date: 2006-01-20
Also published as: KR20040009637A

Abstract

본 발명은 혈소판 응집 억제 활성이 우수한 피페리딘(piperidine) 또는 피리돈(pyridone) 알카로이드계 화합물을 제공한다. 상기 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물은 후추나무과(Piperaceae)에 속하는 후추나무 열매의 추출물에서 분리 정제된 화합물로 이들의 바람직한 예로는 피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘, 및 피페론구민이 있다. 본 발명은 또한 상기 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물을 포함하는 뇌·심혈관계 질환 치료제를 제공한다.

피페리딘, 피리돈, 알카로이드, 혈전제

Description

혈소판 응집 억제활성이 우수한 알카로이드계 화합물{A ALKALOIDE-BASED COMPOUND HAVING POTENT INHIBITING ACTIVITY FOR PLATELET AGGREGATION}

도 1 내지 도 5는 각각 피페린 화합물, 피페노날린 화합물, 피페레틴 화합물, 피페로옥타데칼리딘 화합물, 및 피페론구민 화합물의 질량 분석 스펙트럼이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 혈소판 응집 억제활성이 우수한 알카로이드계 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 혈소판 응집 억제활성이 우수하여 뇌·심혈관계 질환의 예방 및 치료에 유용한 알카로이드계 화합물에 관한 것이다.

[종래기술]

일반적으로 질병은 사회, 경제, 문화, 환경 등의 요인이 변화함에 따라 여러 가지 다른 형태로 표출된다. 근래 급속한 경제발전과 생활수준 향상으로 식생활을 포함한 생활방식의 다양화를 가져왔고 이로 인하여 과거의 감염 위주의 질병이 감소하고 선진국형의 만성퇴행성 질환이 증가하는 추세이다.

1993년 우리나라 사망자 통계를 보면 인구 10만명당 523.8명이 사망하고, 그 가운데 고혈압성 질환이 27.3명, 심장병 43.3명, 뇌혈관 질환 83.8명 등 순환계 질환으로 인한 사망률은 전체의 30.2%를 차지하는 등 해마다 그 수치가 증가하고 있다. 이와 같이 순환계 질환중 고혈압, 동맥경화, 허혈성 심장질환, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중 등의 뇌·심혈관계 질환으로 인한 사망률이 지난 10여년 사이에 약 6배정도 증가하였다.

이러한 뇌·심혈관계 질환은 혈중 콜레스테롤 증가, 지질조성의 변화에 따른 혈액성분의 변화와 과도한 정신적 긴장상태가 가장 큰 원인으로 혈액과 밀접한 관계가 있다. 정상적인 상태에서 혈액은 혈관내에서 응집작용이 일어나지 않지만, 출혈이 발생할 경우 신체 방어작용의 하나로 혈액응고가 일어나게 된다. 하지만 혈액성분의 변화에 의해 혈관이 손상되거나 동맥경화에 의해 혈관의 내경이 좁아져 혈류가 원활치 못할 경우 만들어지는 혈전(thrombus)이 혈류를 통해 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이나 미세한 뇌혈관을 막을 경우 뇌·심혈관계 질환이 발병된다. 또한 병의 진행 상태로 보아 재발의 위험이 높기 때문에 평생치료를 요하는 경우가 대부분이다.

순환계 질환의 원인이 되는 혈전증(thrombosis)과 지혈증(haemostasis)에서 혈소판은 중요한 역할을 담당하고 있는 인자이다. 여러 원인에 의하여 혈관이 손상되면 혈소판들은 응집됨과 동시에 변형되어진 표면에 비가역적으로 유착한다. 혈전은 혈관내에 생긴 혈액응괴(blood-drived mass)를 말하는데, 이것이 병적 상태나 기계적 손상(trauma), 여러 화학 물질에 의해 혈관벽이 손상을 받게 되면, 특히 콜라겐에 노출되어 여기에 혈소판이 유착하게 된다. 유착된 혈소판은 ADP, 트롬 빈, 칼슘 등을 유리하고, 트롬복신 A₂(TXA₂)를 생성하여 주위 혈소판을 활성화시켜 응집하게 된다. 이렇게 생긴 응집물이 혈류에 의해 떨어져 나간 것을 혈전이라 하며, 혈전은 혈류를 따라 흐르다 미세혈관을 막아 심근경색, 허혈 등의 혈액장애를 유발한다.

최근에 이러한 만성퇴행성 질환, 특히 순환계 질환의 예방 및 치료를 위하여 항혈소판 응집제와 항응고제 활성이 우수한 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 특히 식품성분에 의한 생체방어와 항상성 유지 및 질병의 예방과 빠른 치유 등의 생리활성 기능은 식생활과 관련성이 큰 질환에 좋은 대처방안으로 인식되고 있어 적극적으로 연구 개발되고 있다.

예를 들어 청혈, 양혈 등의 질병에 사용하여온 파(Allium fistulosum), 마늘(Allium sativum) 및 양파(Allium cepa)에서 혈소판응집 억제 작용을 가지는 아조엔(ajoene)이 분리되었으며, 이 물질은 피브리노겐이 피브린으로 변하는 것을 차단하는 새로운 항혈소판 응집제(antiplatelet agent)로 개발 중에 있다. 또한 동양에서 많이 사용하는 향신료인 투마릭(turmaric)의 주성분인 쿠쿠민(curcumin; diferuloylmethane)이 혈소판 유발인자인 PAF와 아라키돈산(arachidonic acid)에 대한 IC₅₀ 값이 20∼25 μM로 강한 억제효과가 나타내므로 혈소판응집 억제제로 주목을 받고 있으며, 그 작용기작이 TXA₂ 합성과 Ca²⁺ 신호전달을 저해한다고 알려져 있다(Biochem. Pharmacol., 58, 1167-1172, 1999).

이외에도 환경 친화적인 천연물로부터 유래된 생리활성물질의 탐색에 관한 국내외의 연구가 많은 성과를 얻고 있으나 아직 체계적인 연구가 미흡한 실정이다.

상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 혈소판 응집 억제 활성이 우수한 천연물에서 추출 분리된 알카로이드계 화합물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 천연물에서 추출 분리된 알카로이드계 화합물을 포함하는 뇌·심혈관계 질환 치료제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 혈소판 응집 억제 활성이 우수한 피페리딘(piperidine) 또는 피리돈(pyridone) 알카로이드계 화합물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물의 혈전생성 억제제를 포함하는 뇌·심혈관계 질환 치료제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 혈소판 응집 억제 활성이 우수한 피페리딘(piperidine) 또는 피리돈(pyridone) 알카로이드계 화합물은 후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진 천연물 유래 생리활성물질이다. 상기 후추나무과에 속하는 나무로는 Piper retrofrctum Vahl., Piper amalago Linn., Piper chaba, Piper brachystachyum Wall., Piper futokadsura Sieb. et Zucc., Piper guineense Schum., Piper falconeri 등이 있으며, 이중에서 Piper retrofrctum Vahl.이 가장 바람직하다. 후추나무과에 속하는 나무는 Piper 종에 속하고, 열대 및 아열대에 걸쳐 약 700종 이상이 존재하며 상업, 경제 및 의학적으로 가치가 있는 식물이다. 후추과 식물은 오래 전부터 전통적인 농약으로 사용되어 왔고, 위·치아 등의 통증들을 비롯한 여러 가지 질병을 치료하기 위해 사용되어온 전통 민간 유래 약용식물이다.

Piper종에 함유된 생리활성물질에 대한 연구가 광범위하게 진행되어 왔고, 이들은 강한 살충성과 항종양 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 P. guineense의 뿌리 추출물에서 분리된 아미드계 화합물중 극성이 높은 메틸 치환기를 가진 아미드 화합물인 펠리토린(pellitorine)은 집파리 성충에 대하여 강력한 살충효과를 보이며, P. nigum의 열매에서 얻어진 방향족 탄화수소와 아미드기 사이에 9개의 탄소사슬을 가지고 있는 4차 피롤리딘(pyrolidin) 아미드가 최소치사 농도값이 0.05 mM로 강한 살충활성이 존재한다고 알려져 있다. 또한 P. aborescens의 잎에서 분리한 피플라틴(piplartine)과 피플라틴 이중합체는 AP-388 lymphocytic leukemia, HT-29 colon carcinoma, KB nasopharyngal carcinoma과 A-549 lung carcinoma 암세포에 대하여 우수한 세포독성을 가진다고 보고되었다.

본 발명의 후추나무과 나무의 열매에서 추출된 천연물 유래의 생리활성 알카로이드 화합물은 기존의 화합물과는 달리 혈소판 응집 억제활성과 혈전 생성 억제 활성이 우수하여 항혈소판 응집제 및 혈전제로 사용가능한 화합물이다. 상기 알카로이드계 화합물은 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물이다. 이들 알카로이드계 화합물의 바람직한 예로는 피페린(piperine; (2E,4E)-N-[5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4-펜타디에노일]피페리딘), 피페노날린(pipernonaline; (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘), 피페레틴(piperettine; (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘), 피페로옥타데칼리딘(piperoctadecalidine; (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘, 피페론구민(piperlongumine; N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온)이 있으며 이들의 치환 유도체 또한 본 발명에 포함됨은 물론이다.

본 발명의 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물은 후추나무과 나무 열매의 유기용매 추출물을 실리카겔 크로마토그래피법, 및 고속액체 크로마토그래피법(HPLC)으로 분리, 정제하여 얻는다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 후추나무과 나무 열매의 유기용매 추출물을 순차적 용매분획법에 의하여 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획을 얻은 후 헥산 분획으로부터 실리카겔 크로마토그래피법, 및 고속액체 크로마토그래피법을 이용하여 분리, 정제하여 얻을 수 있다. 상기 유기용매로는 메탄올이 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 후추나무과 나무의 유기 용매 추출물은 상기 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물을 다량 함유하므로 알카로이드계 화합물과 마찬가지로 혈소판 응집 억제활성이 우수하다. 이중 헥산을 이용한 추출물이 활성이 가장 우수하다.

콜라겐, PAF 및 아라키돈산은 주로 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 경로에 의하여 혈소판을 활성화시키는 혈소판 유발인자로 알려져 있다. 본 발명의 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물은 혈소판 활성화 유발인자인 콜라겐, PAF, 및 아라키돈산에 대한 혈소판 응집 억제활성이 매우 우수하다.

상기 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드 화합물, 이들의 치환 유도체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 혈소판 응집 억제활성과 혈전 생성 억제 활성이 우수하기 때문에 항혈소판 응집제 또는 혈전제와 같은 뇌·심혈관계 질환을 예방 및 치료하기 위한 치료제로 사용될 수 있다.

상기 치료제의 적합한 제형으로는 정제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌약제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피페리딘 또는 피리돈 화합물 또는 그의 염을 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 옥수수 전분 또는 그 유도체, 활석, 스테아르산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 또한 제형이 연질 캡슐제의 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올이 사용가능하다. 용액 또는 시럽 형태의 경우에는 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 사용될 수 있다. 좌약용 담체로는 천연 오일 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 액체 폴리올 등이 사용가능하다.

본 발명의 치료용 약제는 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.

투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 병증의 정도, 성별, 연령에 따라 다를 수 있으나 통상 건강한 성인 남성의 경우 1일 0.1 내지 50 mg/kg의 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 투여회수 또한 환자의 체중, 병증의 정도, 성별, 연령에 따라 용이하게 조절될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 알카로이드계 화합물의 분리 및 구조확인

후추나무과(Piperaceae)에 속하는 인도네시아산 Piper retrofrctum Vahl.의 열매를 미국 농무성 WRRC(West Regional Research Center)에서 분양받아 음지에서 건조하였다. 후추 열매 2.5kg을 마쇄하여 10L의 메탄올에 넣은 후 진탕기로 진탕시키면서 3일 동안 추출하였다. 3일 후 여과하여 여액을 30℃ 이하의 온도에서 감압농축하여 메탄올 조추출물을 얻었다. 이 과정을 2회 반복 추출하여 245g을 얻어 알카로이드 화합물의 분리 정제용 시료로 사용하였다.

후추열매의 메탄올 조추출물 20g을 800㎖의 증류수에 녹인 후, 2000㎖의 분획깔대기에 부은 다음, 동량의 헥산을 넣어 잘 섞이도록 흔들어 물층과 헥산층으로 분리하였으며, 이 과정을 반복하여 헥산층 1600㎖를 얻었다. 남아있는 물층에 클로로포름 800㎖로 2회 반복 추출하여 클로로포름층 1600㎖를 얻었다. 다시 남아 있는 물층에 에틸아세테이트 800㎖로 2회 반복 추출하여 에틸아세테이트층 1600㎖와 물층을 얻었으며, 부탄올 800㎖로 2회 반복 추출하여 부탄올 층과 물층을 얻었다. 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트층, 및 부탄올층을 감압농축한 후 입자크기 25-100㎛의 실리카겔을 포함하는 실리카겔 크로마토그래피로 분리하였다. 분 리된 각 분획들을 고속 액체 크로마토그래피로 분리하여 알카로이드계 화합물을 얻었다. HPLC 분석용 용매는 TEDIA사, NMR 분석용 CDCl₃-d₃(0.03% TMS)(Aldrich사 제품)를 사용하였다.

분리된 알카로이드계 화합물중 피페린 화합물의 질량 분석 스펙트럼은 도 1에 도시되어 있다. MS (m/e): 285, 201, 173, 143, 115, 84의 피크를 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR를 이용하여 구조를 확인한 결과 피페린은 하기 화학식 1의 (2E,4E)-N-[5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4-펜타디에노일]피페리딘임을 확인할 수 있었다.

[화학식 1]

분리된 알카로이드계 화합물중 피페노날린 화합물의 질량 분석 스펙트럼은 도 2에 도시되어 있다. MS (m/e): 341, 273, 228, 206, 193, 166, 153, 131, 103, 84의 피크를 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR를 이용하여 구조를 확인한 결과 피페노날린은 하기 화학식 2의 (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘임을 확인할 수 있었다.

[화학식 2]

분리된 알카로이드계 화합물중 피페레틴 화합물의 질량 분석 스펙트럼은 도 3에 도시되어 있다. MS (m/e): 311, 227, 199, 169, 141, 126, 110, 84의 피크를 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR를 이용하여 구조를 확인한 결과 피페레틴은 하기 화학식 3의 (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘임을 확인할 수 있었다.

[화학식 3]

분리된 알카로이드계 화합물중 피페로옥타데칼리딘 화합물의 질량 분석 스펙트럼은 도 4에 도시되어 있다. MS (m/e): 345, 285, 201, 164, 135, 112, 84의 피크를 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR를 이용하여 구조를 확인한 결과 피페로옥타데칼리딘은 하기 화학식 4의 (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘임을 확인할 수 있었다.

[화학식 4]

분리된 알카로이드계 화합물중 피페론구민 화합물의 질량 분석 스펙트럼은 도 5에 도시되어 있다. MS (m/e): 317, 289, 274, 221, 205, 190, 177, 131, 103, 84의 피크를 나타내었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR를 이용하여 구조를 확인한 결과 피페론구민은 하기 화학식 5의 N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온임을 확인할 수 있었다.

[화학식 5]

실시예 2: 혈소판 응집 억제 활성

수컷 토끼(체중: 2.5∼3.5 kg)의 귀 동맥을 70% 에탄올로 확장시킨 후, 20G의 주사바늘로 혈액 30㎖를 채취하여 시트레이트-덱스트로스(citrate-dextrose) 용액 (65 mM cirtric acid, 85 mM trisodium citrate, 2% dextrose, pH 4.5) 5㎖에 현탁한 후, 1,600 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 분리하여 1,400 rpm으로 5분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고, 2,600 rpm으로 10분간 다시 원심 분 리하여 상등액을 제거하였다. 그리고 침전물을 Tyrode HEPES buffer (pH 6.35) 용액으로 두 번 세척한 후, 2,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 마지막으로 Tyrode HEPES buffer (pH 7.35) 용액으로 부유하여 세정 혈소판을 조제하였다. 혈소판 수를 광학 현미경 및 혈구 계수기로 계측하여 혈소판 수가 4×10⁸/㎖가 되도록 Tyrode HEPES buffer(pH 7.35) 용액으로 희석하여 실험에 사용하였다. Tyrode HEPES buffer의 조성은 표 1과 같다.

Tyrode HEPES buffer (pH 7.35)의 조성

조성성분	농도
NaCl KCl MgCl₂·6H₂O NaCO₃ HEPES 알부민(Bovine) 글루코스	138.3 mM 2.68 mM 1.048 mM 4.0 mM 10 mM 0.35 % 0.1 %

혈소판 현탁액 250 ㎕를 cuvette에 취하고 CaCl₂을 최종농도가 1 mM이 되게 희석한다. 1,200 rpm에서 교반하면서 37℃에서 3분간 incubation한 후 각각의 시료(알칼로이드계 화합물)를 최종농도 1 ㎎/㎖가 되게 주입하고 다시 3분간 incubation한 후 각 혈소판 유발인자를 최적 농도로 투여하였다. 혈소판 유발인자의 최적 농도는 다음과 같다: 콜라겐: 2 ㎍/㎖, PAF: 10nM, 아라키돈산: 100 μM.

각 혈소판 유발인자에 의한 혈소판의 응집율은 흡광도 측정장치를 사용하여 측정한 광투과도 변화로 평가하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 통계처리하였다.

혈소판 활성화는 응집율(%)로 나타내었고 혈소판 응집에 대한 결과는 대조군 에 대한 억제율(%)로 나타내었으며, 대조군으로는 시료 대신에 DMSO를 사용하여 측정하여 표 2에 기재하였다. 억제율(%)은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

억제율(%) = [(A-B)/A] × 100

A는 대조군의 응집율이고, B는 시료의 응집률이다.

화합물	농도 (㎍/㎖)	콜라겐 (2 ㎍/㎖)		PAF (10nM)		아라키돈산 (100 μM)
화합물	농도 (㎍/㎖)	응집율 (%)	억제율 (%)	응집율 (%)	억제율 (%)	응집율 (%)	억제율 (%)
대조군	-	72.7±2.9	-	69.3±1.8	-	69±2.0	-
피페린	100	6±0.3^**	92	1±0.1^**	99	2±0.1^**	97
피페린	50	49±1.1^*	33	16±0.5^**	77	32±0.7^*	54
피페노날린	100	3±0.3^**	96	3±0.2^**	96	2±0.3^**	97
피페노날린	50	12±0.6^*	84	30±0.7^*	57	41±1.5^*	41
피페레틴	100	10±0.5^*	86	15±0.4^*	78	18±0.8^**	74
피페레틴	50	42±1.3^*	42	43±0.9^*	38	49±1.4^**	30
피페로옥타데칼리딘	100	14±2.1^*	81	21±0.7^**	70	29±0.8^*	58
피페로옥타데칼리딘	50	49±1.5^*	33	52±1.1^*	25	54±1.6^*	22
피페론구민	100	0±0.0^**	100	0±0.0^**	100	0±0.0^**	100
	50	0±0.0^**	100	0±0.1^**	100	5±0.3^**	93
	10	5±0.4^**	93	34±0.7^**	51	41±1.7^*	41
	5	34±0.9^*	53	41±0.8^**	41	50±1.8^*	28

주) 응집율은 평균±표준편차 (n=3)

*P<0.05, **P<0.01

표 2에 기재된 바와 같이 혈소판 유발인자로 콜라겐을 2 ㎍/㎖로 투여할 경우 피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘 및 피페론구민을 100 ㎍/㎖로 투여시 각각 92, 96, 86, 81 및 100%의 억제효과를 나타내었고, PAF를 10nM로 투여할 경우 피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘 및 피페론구민을 100 ㎍/㎖로 투여시 각각 99, 96, 78, 70 및 100%의 억제효과를 나타내었고, 아라키돈산을 100 μM로 투여할 경우 피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘 및 피페론구민을 100 ㎍/㎖로 투여시 각각 97, 97, 74, 58 및 100%의 억제효과를 나타내었다.

피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘 및 피페론구민의 혈소판 응집억제율과 시료농도로부터 IC₅₀을 계산하여 하기 표 3에 나타내었다.

	IC₅₀(μM)
	콜라겐 (2 ㎍/㎖)	PAF (10nM)	아라키돈산 (100 μM)
피페린	213	134	158
피페노날린	127	132	166
피페레틴	192	208	231
피페로옥타데칼리딘	190	191	258
피페론구민	16.3	53.1	59.9

표 3에 기재된 바와 같이 본 발명의 피페리딘 알카로이드계 화합물 또는 피리돈 알카로이드계 화합물인 피페린, 피페노날린, 피페레틴, 피페로옥타데칼리딘 및 피페론구민은 콜라겐, PAF 및 아라키돈산에 대하여 127∼258 μM의 IC₅₀ 값을 보였다. 이중 피페론구민의 경우에는 IC₅₀ 값이 각 혈소판 유발인자 콜라겐 PAF 및 아라키돈산에 대하여 16.3, 53.1, 59.9 μM로 뛰어난 응집억제 활성을 보였으며, 특히 콜라겐에 대해서는 강력한 응집 억제 작용이 있는 것을 확인하였다. 구조적으로 볼 때 메틸렌디옥시페닐 모핵을 가지는 피페리딘 알카로이드계 화합물보다는 트리메톡시벤젠 모핵을 가지는 피리돈 알카로이드계 화합물이 더 우수한 억제 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 알카로이드계 화합물의 항혈전 효과

동물을 이용한 항혈전 효과 검증은 생쥐 혈전색전증 시험으로 수행하였으며 DiMinno와 Silver의 방법을 참조하였다. 밤 동안 사료공급을 중단한 25-30 g의 체중을 가진 수컷 ICR 생쥐들을 실험동물로 이용하였다. 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 수용액에 현탁한 피페론구민(50 ㎎/㎏)을 경구투여하여 90 분 경과 후, 약 90%의 혈전 색전증을 나타내는 114 ㎍의 콜라겐과 13.2 ㎍의 에피네프린 수용액을 생쥐의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 아스피린(50 ㎎/㎏)을 경구투여한 그룹을 양성대조군으로, 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스 수용액만 경구투여한 그룹을 음성대조군으로 이용하였다. 사망하거나 마비된 생쥐의 수를 15 분간 측정하여 하기 수학식 2를 사용하여 퍼센트(%) 항혈전 효과를 계산하였다.

[수학식 2]

% 항혈전 효과 = [1 - (사망 혹은 마비 개체수)/전체] × 100

생쥐에 대한 피페론구민의 경구투여는 폐혈전증에 의한 사망에 대한 유의성있는 보호 효과를 보여주었다. 50 ㎎/㎏의 피페론구민은 50.00%의 보호 효과를 나타냈으나, 아스피린 (50 ㎎/㎏)은 39.93%의 보호 효과를 보여주었다.

	복용량 (㎎/㎏체중)	사망개체수/ 시험개체수	% 항혈전효과
음성대조군¹⁾	-	41/49	16.33
피페론구민	50	22/44	50.00
양성대조군²⁾	50	28/46	39.93

주) 1) 음성대조군 : 0.5% 카복시메틸 셀룰로오스 수용액만 경구투여한 그룹

2) 양성대조군 : 0.5% 카복시메틸 셀룰로오스 수용액에 아스피린 (50 ㎎/㎏)을 현탁하여 경구투여한 그룹

실시예 4: 알카로이드계 화합물의 돌연변이원성 시험

히스티딘(histidine) 영양요구성 균주인 Salmonella typhimurium Y, TA 1537과 TA 98을 이용하여 알카로이드계 화합물의 돌연변이원성을 알아보았다. 우선 Maron 과 Ames 법에 의해 유전자형이 확인된 Salmonella typhimurium TA 1537과 TA 98을 영양 육즙(Oxoid Ltd. Hampshir, England)에 배양하고 현탁액 1㎖ 당 DMSO 90㎕를 가하여 냉동 보관용 시험관(Nagle Nunc Int, Co. NY, U.S.A.)에 채워 동결건조시킨 후 약 -80℃에서 보관하였다. 냉동균주를 해동시킨 후 0.1㎖를 취하여 25㎖의 영양 육즙에 접종하여 37℃, 120rpm으로 진탕배양하여 균배양액을 제조하였으며, 약 16시간 후에 시험에 사용하였다.

피페린 화합물을 DMSO에 녹여 5 ㎎/㎖ 농도의 액을 만들고 이를 단계적으로 희석하였다. 고압멸균기를 사용하여 멸균한 top agar를 45℃로 예열한 멸균시험관(Falcon #2504, Becton Dickinson, Co. NJ, U.S.A.)에 2㎕씩 분주한 후 피페린 함유 희석용액 100 ㎕와 균배양액 100 ㎕를 top agar와 혼합한 다음 즉시 믹서로 2-3초간 진탕하여 글루코스 한천 평판상에 고르게 분배한 후 굳혔다. 피페린 희석용액은 31.2∼500㎍/plate의 농도가 되도록 사용하였다. top agar가 굳은 다음 37℃에서 약 48시간 동안 배양한 후 histidine^- →histidine⁺ 복귀 돌연변이 집락수를 계수하였다. 수컷 Sprague-Dawley의 간균질액을 원심분리하여 얻은 상등액 분획(대사활성계 혼합조제; S-9)을 피페린 희석용액과 균배양액과 혼합하여 배양한 후 histidine^- →histidine⁺ 복귀 돌연변이 집락수를 계수하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하였고, S. typhimurium TA 1537 양성대조군으로는 9-아미노아크리딘(9-AA)을 DMSO에 녹여 사용하였고, S. typhimurium TA 98 양성대조군으로는 2-아미노플루로렌(2-AF)을 DMSO에 녹여 사용하였다. 시험은 피페린 화합물의 농도당 3개의 평판배지를 사용하여 실시하였으며, 이들의 평균치를 하기 표 5에 기재하였다.

화합물	농도 (㎍/plate)	TA 1537		TA 98
화합물	농도 (㎍/plate)	-S-9¹⁾	+S-9²⁾	-S-9	+S-9
피페린	0	12±2	23±1	41±5	55±3
	31.2	13±3	27±5	46±3	59±6
	62.5	10±2	24±3	42±2	60±6
	125	10±3	28±3	44±3	57±5
	250	14±3	24±5	47±8	54±8
	500	11±3	22±2	45±4	61±4
9-아미노아크리딘	50	187±16	-	-	-
2-아미노플루오렌	1	-	-	-	468±23

주) 1) -S-9: 간균질액을 원심분리하여 얻은 상등액 분획(대사활성계 혼합조제)을 포함하지 않음

2) +S-9: 간균질액을 원심분리하여 얻은 상등액 분획(대사활성계 혼합조제)을 포함함

3) 데이터는 평균±표준편차 (n=3)

피페린 화합물 대신 피페론구민 화합물을 사용하여 복귀 돌연변이원성 실험을 실시하여 그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.

화합물	농도 (㎍/plate)	TA 1537		TA 98
화합물	농도 (㎍/plate)	-S-9¹⁾	+S-9²⁾	-S-9	+S-9
피페론구민	0	21±1	32±4	37±6	61±5
	31.2	19±4	29±7	36±4	63±7
	62.5	23±2	35±4	40±7	59±7
	125	20±2	34±5	39±5	65±4
	250	26±5	33±6	41±5	66±6
	500	21±2	33±4	39±3	64±3
9-아미노아크리딘	50	194±29	-	-	-
2-아미노플루오렌	1	-	-	-	491±37

3) 데이터는 평균±표준편차 (n=3)

표 5와 표 6에서 TA 1537 균주의 양성대조군인 9-아미노아크릴딘 처리군과 TA 98 균주의 양성대조군인 2-아미노플루오렌 처리군에서는 매우 높은 돌연변이 집락수를 보였다. 이에 비하여 피페린과 피페론구민 처리군의 경우에는 모든 균주의 전 농도군에 걸쳐서 처리량 증가에 따른 복귀 돌연변이 집락수의 증가가 관찰되지 않았고 음성대조군인 DMSO 처리군과 거의 유사한 집락수를 나타내었다. 따라서 피페린과 피페론구민은 S. typhimurium TA 1537과 TA 98의 시험균주에 대하여 복귀 돌연변이를 유발하지 않는 매우 안전한 화합물임이 확인되었다.

본 발명의 피페리딘 또는 피리돈 알카로이드계 화합물은 혈소판의 응집 억제 활성이 우수하여 뇌·심혈관계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 단순한 변형 또는 변경은 모두 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진, 피페린(piperine; (2E,4E)-N-[5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4-펜타디에노일]피페리딘), 피페노날린(pipernonaline; (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘), 피페레틴(piperettine; (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘), 피페로옥타데칼리딘(piperoctadecalidine; (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘), 피페론구민(piperlongumine; N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온) 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 혈소판 응집억제제.
제1항에 있어서, 상기 나무는 Piper retrofrctum Vahl., Piper amalago Linn., Piper chaba, Piper brachystachyum Wall., Piper futokadsura Sieb. et Zucc., Piper guineense Schum., 및 Piper falconeri 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 식물인 혈소판 응집 억제제.
후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진, 피페린(piperine; (2E,4E)-N-[5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4-펜타디에노일]피페리딘), 피페노날린(pipernonaline; (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘), 피페레틴(piperettine; (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘), 피페로옥타데칼리딘(piperoctadecalidine; (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘), 피페론구민(piperlongumine; N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온) 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 혈전생성 억제제.
후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진, 피페노날린(pipernonaline; (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘), 피페레틴(piperettine; (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘), 피페로옥타데칼리딘(piperoctadecalidine; (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘), 피페론구민(piperlongumine; N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온) 및 약학적으로 허용가능한 그의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 혈소판 응집 억제제를 포함하는, 고혈압, 동맥경화, 허혈성 심장질환, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 뇌·심혈관계 질환 치료제.
후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진, 피페노날린(pipernonaline; (2E,8E)-N-[9-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,8-논나디에노일]피페리딘), 피페레틴(piperettine; (2E,4E,6E)-N-[7-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4,6-헵타트리에노일]피페리딘), 피페로옥타데칼리딘(piperoctadecalidine; (2E,4E,12Z)-N-(2,4,12-옥타데카트리에노일)]피페리딘), 피페론구민(piperlongumine; N-(3,4,5-트리메톡시신나모일)-Δ³-피리딘-2-온) 및 약학적으로 허용가능한 그의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 혈전생성 억제제를 포함하는, 고혈압, 동맥경화, 허혈성 심장질환, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 뇌·심혈관계 질환 치료제.
후추나무과(Piperaceae)에 속하는 나무 열매에서 얻어진, 피페린(piperine; (2E,4E)-N-[5-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-2,4-펜타디에노일]피페리딘) 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는, 고혈압, 허혈성 심장질환, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 뇌·심혈관계 질환 치료제.