KR100535259B1 - 생약재 추출물을 함유하는 식작용 억제제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정공등(Sorbus commixta Hedl), 현지초(Geranium nepalense), 화피(Betula pllatyphylla), 토복령(Smilax glabra), 마황근(Ephedrae Radix)에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 세포의 식작용 (phagocytosis) 억제제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 자외선에 노출된 각질형성세포(keratinocyte)의 활성화된 식작용을 세포 독성 없이 효과적으로 억제하여 멜라노사이트로부터 전달되는 멜라노좀이 각질형성세포내로 분포하는 것을 감소시키고, 또한 세포수준에서 식작용의 활성을 조절함으로써 식작용에 의해 영향을 받는 각종 질병을 치료 또는 예방에 효과적이다.

Description

생약재 추출물을 함유하는 식작용 억제제 조성물{Phagocytosis inhibitor composition containing extract of galenical medicines}

본 발명은 정공등(Sorbus commixta Hedl), 현지초(Geranium nepalense), 화피(Betula platyphylla), 토복령(Smilax glabra), 마황근(Ephedrae Radix)에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 세포의 식작용 (phagocytosis) 억제제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 자외선에 노출된 각질형성세포(keratinocyte)의 활성화된 식작용을 세포 독성 없이 효과적으로 억제하여 멜라노사이트로부터 전달되는 멜라노좀이 각질형성세포내로 분포하는 것을 감소시키고, 또한 세포수준에서 식작용의 활성을 조절함으로써 식작용에 의해 영향을 받는 각종 질병을 치료 또는 예방에 효과적이다.

'식작용(phagocytosis)'이란 자연 상태에서 생기는 조직의 파편이나 낡은 혈구 또는 노폐 조직 뿐만 아니라, 외부로부터 침입한 병원균, 미립자 물질을 세포 안으로 잡아들여 세포내 소화를 하는 작용을 의미하는 것이다. 통상적으로, 세포가 환경으로부터 고형입자를 잡아들여 분리 또는 파괴를 하는 세포내 과정을 의미한다. 척추동물에서 이와 같은 기능을 갖는 세포는 다양한 백혈구(leukocytes) 및 세망내피계(reticulo endothelial)에 속하는 세포들이며, 망상세포, 조직구, 혈관내상피세포, 성상세포, 림프구, 백혈구, 간의 쿠베세포, 플라스마 세포 등이 이에 해당한다. 상기 식작용은 미생물에 의한 감염에 대해서나 외래 입자와 조직 파편(debris)에 의한 점막 표면 및 조직의 폐색(occlusion)에 대한 중요한 신체방어 메카니즘으로 작용하게 된다. 또한, 식작용은 함입(invagination)및 원형 질막(plasma membrane)의 수축을 통해 세포에 의해 유체를 흡수(uptake)하는 것인 세포흡수작용(pinocytosis)과 구분되며, 여기서 '식작용' 및 '세포내 소화'라는 용어는 서로 교환하여 사용된다.

피부의 색을 조절하는 기전으로서 멜라닌 생성의 화학적 및 효소적 기초에 대한 지식은 잘 알려져 있다. 멜라노사이트(melanocyte)는 그것들이 분비한 입자인 멜라닌을 생산하는 멜라노좀을 생산하기 위해 배아신경 크레스트(embryonal neural crest)로부터 피부로 이동한다. 멜라닌 생성에서 핵심적 효소는 티로시나제(tyrosinase)이며, 이것은 티로신을 생고분자 멜라닌으로 전환시키는 반응 케스케이드를 일으킨다. 두 개의 티로시나제-관련 단백질(TRP's)은 TRP-1과 TRP-2로 알려져 있다. 이들 단백질은 티로시나제와 약 40%의 동족관계(homology)를 공유하고 멜라닌 생성에 있어서 조절 역할 뿐만 아니라 촉매 활성을 가진다. 멜라닌은 상기 효소들이 분포하고 있는 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관 내에서 일어나고, 멜라닌을 포함하고 있는 멜라노좀은 후에 멜라노사이트 덴드라이트(dendrites)를 통해 각질형성세포(케라티노사이트, keratinocyte)로 전달된다. 케라티노사이트-멜라노사이트 상호작용의 조절과 케라티노사이트로의 멜라노좀 전이의 메카니즘은 지금까지 정확히 알려져 있지 않았으나, 여러 유력한 증거들을 통해 멜라노좀은 피부 조직에서 멜라노사이트로부터 분비된 멜라노좀을 각질형성세포가 섭취하는 식작용 기능과 관련되어 각질형성세포로 전달될 가능성이 매우 높다는 것이 알려져 있다.

최근 환경오염, 오존층의 파괴로 인한 자외선의 증가 등으로 인하여, 미백에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있을 뿐만 아니라, 인공합성물로 제조된 화학합성 화장품에 대한 부작용과 과민반응이 다량 보고됨에 따라 화장품의 원료를 다시 천연소재로부터 얻으려는 시도가 활발히 진행되고 있으며, 이에 따라, 천연물, 그 중에서도 한약재를 이용한 화장품이 지속적으로 개발되고 있다. 구체적인 예로는 천연물에서 얻어진 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 아스코르빈산(Ascorbic acid) 및 그 유도체 등이 있는데 이들은 티로시나아제 활성을 억제하고, 햇볕에 의한 검버섯, 주근깨 방지와 같은 목적으로 의약부외품 및 기능성 화장품에 첨가제로 사용되고 있다.

그러나, 코지산은 티로시나아제의 활성 부위에 존재하는 구리 이온을 킬레이트화하여 효소 활동을 저해하는 작용을 함으로써 성능이 비교적 우수하지만, 화장품에 배합했을 때 안정성에 문제가 있어 화장료로서 사용하기에 적합하지 않았다. 또한, 아스코르빈산은 빛과 열에 대한 분자 자체의 안정성이 낮을 뿐만 아니라 비교적 비용도 많이 들고, 티로시나아제 활성 저해 효과도 그다지 높지 않아서, 미백 원료로는 적합하지 않았으며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 자극성이 높아 안전성 문제로 현재 화장료로 사용하지 못하고 있는 실정이다.

이에, 천연물, 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구가 계속 이루어져왔고, 그 중 상백피, 감초, 작약, 계피, 고삼, 갈근, 당귀, 목단피, 반하, 알로에 등 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나아제 억제 활성이 있다는 사실은 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 미백 효과에 있어서는 명백하지 않다는 한계가 있었다. 특히, 대부분의 식물 추출물의 경우 고농도에서만 유효한 티로시나아제 활성 저해 효과를 나타내며, 저농도에서는 저해 효과가 거의 나타나지 않는다는 것도 문제점으로 지적되어 왔다.

한편, 본 발명에서 사용되는 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 피부 각질형성세포의 식작용과 관련된 효능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 피부에서 멜라노사이트가 각질형성세포로 멜라노좀을 전달하는 과정을 효과적으로 억제하는 물질을 개발하기 위하여 광범위하게 연구 및 검토한 결과, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 각질형성세포의 식작용을 억제한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 우수한 각질형성세포의 식작용 억제 효과를 갖는 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 세포의 식작용 억제제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 식작용 억제제 조성물은 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 정공등, 현지초, 토복령 추출물에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하여 피부미백용 외용제 조성물 또는 약제 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 추출물에 화피, 마황근 추출물을 더 함유한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

정공등은 마가목이라고도 불리우고 장미과 활엽 소교목으로 울릉도에서는 마구마 나무라고 부르며 성인봉을 비롯하여 해발 500m이상 전역에 야생하고 있다. 이들의 줄기와 가지는 정공등((丁公藤) 'Sorbus cortex')이라 하며, 줄기껍질은 정공피(丁公皮)라 해서 역시 약용으로 사용한다. 정공등은 주로 해표발한(解表發汗), 풍습(風濕), 소종지통(消腫止痛), 발신불수, 제 비통(除痺痛), 치풍습비통(治風濕痺痛) 등을 주치한다고 알려져있으며, 열매로 술을 담아 음용하면 강장에 효력이 있다고 알려져있다.

현지초는 이질풀 또는 현초라고 불리우며 다년초에 해당한다. 전초(全草)를 현초((玄草) 'Geranii Herba')라 하는데, 그 효능은 수렴, 정장, 지시약으로 설사, 복통에 사용하고 민간에서 종기, 피부병 등에 외용(外用)으로 사용하며, 항진균작용(抗眞菌作用)이 있다고 알려져 있다.

화피(樺皮)는 자작나무과에 속하는 활엽 교목의 수피에 해당한다. 한의학과 민간에서는 자작나무 껍질을 백화피, 화피 등으로 부르고, 열을 내리고 습을 없애며 기침을 멈추고 담을 삭이는 작용과 해독작용, 이뇨작용이 있어서 신장염이나 부종을 고치는데에 사용하고, 황달, 설사, 신장염, 폐결핵, 위염, 갖가지 옹종 등의 치료에 이용해 왔다. 또한, 장미과에 해당하는 산벚나무의 껍질 역시 화피로 명명하여 혼용해서 사용되고 있다.

토복령은 백합과(백합과;Liliaceae)식물인 토복령(Smilax glabra Roxb.)의 근경이고, 각종 해독작용에 효능이 있어 매독성 관절염, 임파선염, 임질, 류머티즘성 관절염 치료에 사용된다고 알려져 있다.

마황근은 Ephedra sinica Stapf, E.equisisetina Bge., E. intermedia Schrenk et Mey. 등의 뿌리에 해당하는 것으로, 발한(發寒) 작용이 현저하며 정유 성분은 체열(體熱) 강하 작용이 고르게 나타난다. 또한, 바이러스의 증식 작용을 억제시키는 효능도 알려져 있다.

본 발명에 의한 조성물은 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에서 선택된 1종 이상의 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%인 것이 바람직하다. 이는 0.0001중량% 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 10중량% 초과에서는 안전성 및 제형 안정성에 어려움이 있기 때문이다. 또한, 유효한 효과와 안전성 및 제형 안정성을 고려한다면, 0.01~1 중량%로 함유하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물의 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근를 자연 건조 또는 강제 건조 등 임의의 방법으로 건조하여 잘게 자른 후, 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤 등의 극성 용매; 에테르, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 비극성 용매; 상기 비극성 용매와 극성 용매의 혼합 용매; 알카리 수 등의 용매, 또는 콩기름, 참기름 등의 식물유 등을 사용하여 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침 등의 임의의 방법에 의해서 침출 처리하여 유효 성분을 함유한 침출물을 얻는다. 침출 처리는 냉침과 페르콜레이션의 경우 12~96시간 정도, 온침의 경우는 사용하는 용매 등의 종류와 온도에 따라 상이하나, 적합하게는 용매의 환류 온도에 가까운 온도로 0.5~24시간 정도 수행하는 것이 좋다. 특히, 함수 알코올에 침출한 틴크나 유동 엑기스 또는 엑기스의 것을 사용하는 것이 좋다.

본 발명에서 사용되는 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근의 침출액, 전출하여 얻은 침출액, 또는 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축액, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스(이하, 추출 엑기스라 함), 및 생약 중에 함유되어 있는 주효과를 발휘하는 화학 물질 그 자체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식작용 억제제 조성물은 세포의 식작용에 관련된 각종 질병, 구체적으로는 면역계통 관련 폐기종, 알레르기성 폐 기관 아스페르길루스증, 치주염, 아테롬성(atherosclerotic) 플라크(plaque)에 의해 유발되는 심장혈관계 질병, 암환자의 2차 감염, 당뇨병 환자의 면역 관련 질병, 알츠하이머병, 우울증, 노화 등을 치료 또는 예방할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 멜라닌 색소의 피부에의 과도한 침착의 예방 및 치료에 효과적이다.

본 발명에서 '치료'란 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법으로, 본 발명의 목적을 위해 유익하거나 바람직한 임상적 결과를 감지가능하거나 가능하지 않거나를 불문하고 또한 부분적이든 전체적이든 상관없이, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉 더 나빠지지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 속도감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 치료는 치료가 수용되지 않는 경우에 예측되는 생존과 비교해서 연장된 생존을 의미하기도 하며, 한 질환의 병변이 발전되거나 변경되는 것을 예방하는 의도로 수행되는 중재이다. 따라서, 치료는 치료법적 치료 및 예방적인 차원의 것들 모두를 가리키며, 치료할 필요가 있는 것들은 이미 질환을 가지고 있는 상태 뿐만 아니라 질환이 예방되어야 할 상태를 포함한다.

본 발명의 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 식작용 억제제 조성물은 경구, 비경구, 직장, 질, 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 등으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직한 투여 루트는 경피 투여이다. 또한, 활성 화합물의 투여량은 치료 받을 대상, 치료할 특정 질환 또는 병리상태, 질환 또는 병리상태의 심각도, 투여 경로, 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준내에 있으며, 일반적으로, 투여량은 대략 0.001㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일 범위이다. 바람직한 투여량은 0.5㎎/㎏/일 내지 2.5㎎/㎏/일이다.

본 발명에 의한 식작용 억제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학 조성물로 제형화될 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, by E.W. Martin(Merck Publ. Co., Easton, PA]. 또한, 본 발명의 화합물은 기타 다른 약제와 함께 투여될 수 있으며, 질환 치료를 위한 다른 조성물 및 과정과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의한 조성물의 투여와 함께 수술, 레이저 또는 화학요법이 병행될 수 있다.

한편, 의도된 투여양식에 따라 약학 조성물은 고체, 반고체, 또는 액체 투여 형태일 수 있다. 투여 형태의 예는 정제, 알약, 캡슐, 좌약, 작은 봉지, 과립, 분말, 크림, 로션, 연고, 반창고, 액체 용액, 현탁액, 및 분산액, 에멀젼, 시럽 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 활성 성분은 리포솜, 미세입자, 또는 마이크로캡슐 등에 캡슐화될 수도 있다. 그러나, 가장 바람직한 제형은 크림, 로션, 연고, 액체 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼 등의 경피 투여용 제형이다.

한편, 통상적인 무독성 담체는 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 덱스트로스, 글리세롤, 마그네슘 카보네이트, 트리글리세라이드, 오일, 용매, 멸균수, 및 등장 식염수의 약제 등급을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

정제, 알약, 과립 등과 같은 고체 조성물은 편의상 코팅될 수 있으며, 전형적으로 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장 수성 완충액내의 용액이고 주사 부위의 통증을 완화시키기 위해 국부 마취제를 포함한다. 또한, 원한다면 약제는 습윤제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 무독성 보조 물질을 함유할 수도 있으며, 이러한 보조 물질의 예는 나트륨 아세테이트, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민, 및 트리에탄올아민 올리에이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 안정제, 항산화제, 결합제, 착색제, 향미제, 방부제, 및 농후제와 같은 부형제를 포함할 수도 있다.

이하, 시험예 및 참조예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<참조시험예 1> 자외선에 의한 각질형성세포의 식작용 촉진 효과

자외선에 의해 각질형성세포의 식작용이 촉진되는지 여부를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 본 실험에서 인간의 각질형성세포 라인 HaCaT를 자외선이 각질형성세포의 식작용에 미치는 영향을 연구하기 위한 시험관 모델 시스템으로 사용되었다.

각질형성세포의 식작용 활성 정도는 형광 마이크로스피어를 3시간동안 배양하여 세포 안으로 흡수된 형광 비드의 밝기를 측정함으로 판단하였다. 먼저, 세포를 96웰 배양접시에 1 X 10⁴ 세포가 되도록 깔고 하루 동안 바닥에 잘 붙게 놔둔다. 다음, 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하고, 각 웰당 PBS 100㎕를 채운 후 자외선A를 단위 면적당 각각 0(대조군), 5, 10, 15J을 조사하였고, 자외선B는 단위 면적당 0(대조군), 10, 20, 30mJ을 조사하여 각각의 조사량에 따른 각질형성세포의 식작용 활성 정도를 측정해보았다.

또한, 각질형성세포의 식작용력이 자외선 조사 후 얼마 동안 활성능력이 유지되는지 시험해 보기 위해, 위와 동일 시스템으로 자외선 A, B의 각 조사량에 대하여 0, 2, 24 시간후의 식작용 활성을 측정하였다. 측정 방법은 자외선 조사 후 원하는 시간 동안 DMEM배지 첨가하에 배양시킨 후, 세포는 FITC 형광 마이크로스피어(직경 1~0.5㎛, 과량의 마이크로스피어/세포)로 37도에서 3시간동안 노출시킨다. 마이크로스피어는 분자 프로브(molecular probes)(유진,OR)로부터 유래되었고, 제조자의 지시에 따라 공정이 진행되었다. 상기 처리 후, 세포는 트립판블루(trypan blue)를 1분간 처리하여 각질형성세포에 의해 섭취되지 않은 비드를 제거하고 형광측정기(fluorometer)로 세포의 형광 정도를 측정하였으며, 이때 형광의 밝기는 섭취된 비드의 양에 비례하게 된다. 자외선 A의 조사량과 조사 후 경과 시간에 따른 시험 결과는 도1a에, 자외선 B의 조사량과 조사 후 경과 시간에 따른 식작용력의 변화 결과는 도 1b에 나타내었다.

하기 도 1a 및 1b에서 보는 바와 같이, 인간 각질형성세포 라인 HaCaT에서의 자외선 조사 후 식작용 활성에 대해서는 자외선을 조사하지 않은 대조군과 비교하여 자외선을 조사한 군에서는 조사량에 따라 식작용력, 즉 형광 마이크로스피어의 섭취량이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 도 1a에서 보듯이 자외선 A에 대한 마이크로스피어 흡수량은 조사하지 않은 대조구에 비해서 조사 직후에는 크게 증가되는 양상이 보였으나, 2시간 이후에는 그 효과가 없어지는 것을 관찰되었다. 한편, 도1b에서 보는 바와 같이, 자외선B에 대해서는 각질형성세포의 식작용 능력이 자외선 조사량에 따라 비례해서 증가하며, 그 활성이 24시간까지 지속되는 것을 알 수 있었다.

<참조시험예 2> 자외선이 각질형성세포의 증식 및 사멸에 미치는 영향

자외선에 노출된 각질형성세포의 증가된 식작용 활성이 각질형성세포의 일시적인 증식에 의한 영향에 관련된 것인지의 여부와 자외선 조사량에 따른 각질형성세포의 사멸 정도를 시간별로 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 시험예 1과 동일한 조건과 시스템으로 인간 각질형성세포 라인 HaCaT 세포를 부착시키고 배양하여 자외선A, B를 조사하였다. 자외선 조사 후 원하는 시간동안 DMEM 배양액에서 배양한 후, 50㎕의 테트라졸리움 염색약을 가하여 37도에서 4시간 배양하였다. 다음, 살아 있는 세포에 의해 생성된 포마잔 양을 150㎕의 용액에 넣고 용해시켜 570㎚에서 흡광도를 측정함으로써, 조사량에 따른 시간별(0, 2, 24 시간)로 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 이때, 용해된 포마잔에 의한 흡광도는 살아 있는 세포 수에 비례하며, 자외선 A가 각질형성세포 성장에 미치는 영향에 대한 시험 결과는 도 2a에, 자외선 B에 대한 시험 결과는 도 2b에 나타내었다.

하기 도 2a 및 2b에서 보는 바와 같이, 자외선 A경우에 모든 조사량에서 동일하게 세포수가 오히려 10% 정도 감소하였음을 알 수 있었다. 이와 마찬가지로 자외선 B에 대한 시험 결과에서도 모든 조사량에 대해서 세포수가 오히려 10% 정도 감소한 것을 알 수 있었다. 따라서, 자외선에 의한 각질형성세포의 식작용 활성 증가는 각질형성세포 수의 증가에 의한 것이 아님이 입증되었다. 상기와 같은 약간의 세포수 감소 이외에는 대조구와 비교하여 별다른 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 자외선이 대조구와 비교해서 세포의 증식 및 사멸에 대해 크게 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 상기의 결과로부터 자외선에 의한 각질형성세포의 식작용 증가 현상은 각각의 자외선에 대한 세포의 일시적인 증식 반응에 의해 일어난 것이 아니며 식작용 활성 자체가 증가한 것임을 알 수 있으며, 이와 같이 자외선에 의해 증가된 식작용 활성을 억제하는 물질의 중요성이 입증되었다.

[실시예 1] 정공등 추출물의 제조 방법

정공등의 목피부분 600g을 잘게 분쇄한 후 냉각콘데서가 달린 추출기에서 70% 에탄올 3L를 넣고 2시간 동안 가열하였다. 다음, 정공등 추출물을 냉각시켜 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 이렇게 얻어진 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압 증발기에서 감압 증발시켜 건조 중량 43g의 추출물을 얻었다.

[실시예 2] 현지초 추출물의 제조 방법

화피의 목피부분 600g을 잘게 분쇄한 후 냉각콘데서가 달린 추출기에서 70% 에탄올 3L를 넣고 2시간 동안 가열하였다. 다음, 화피 에탄올 추출액을 냉각시켜 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 이렇게 얻어진 추출액을 냉각콘덴서가 달린 감압 증발기에서 감압 증발시켜 건조 중량 60.57g의 추출물을 얻었다.

[실시예 3] 토복령 추출물의 제조 방법

토복령 600g을 잘게 분쇄한 후 냉각콘데서가 달린 추출기에서 70% 에탄올 2.4L를 넣고 2시간 동안 가열하였다. 다음, 가열된 추출물을 냉각시켜 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 이렇게 얻어진 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압 증발기에서 감압 증발시켜 건조 중량 71.58g의 추출물을 얻었다.

[실시예 4] 마황근 추출물의 제조 방법

마황근 600g을 잘게 분쇄한 후 냉각콘데서가 달린 추출기에서 70% E에탄올 3L를 넣고 2시간 동안 가열하였다. 다음, 가열된 추출물을 냉각시켜 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 이렇게 얻어진 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압 증발기에서 감압 증발시켜 건조 중량 63g의 추출물을 얻었다.

[시험예 1] 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 자외선이 조사된 각질형성세포의 식작용에 미치는 영향

상기 참조예 1~2로부터 자외선에 의해 각질형성세포의 식작용 활성 자체가 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 바탕으로 하여 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 상기와 같은 자외선에 의해 증가된 식작용 활성을 저해하는 지의 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

본 시험예에서는 세포의 사멸에 영향을 주지 않으면서도 가장 효과적으로 각질형성세포의 식작용을 증가시켰던 자외선 B의 20mJ을 사용하였고, 증가된 식작용을 억제할 수 있는 억제제의 처리 시간은 자외선 B조사 후 24시간 동안으로 결정하였다. 조사 후 24시간은 자외선 B에 의해 유도된 각질형성세포의 식작용 활성이 꾸준하게 지속되는 시간이므로, 처리구에서는 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물의 처리에 의해 줄어든 세포 식작용 활성을 비처리구의 활성과 비교해서 결과적으로 감소된 양을 측정할 수 있는 조건이다.

인간 각질형성세포 라인 HaCaT 세포는 상기 참조예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로 깔고, 자외선 B를 단위면적당 20mJ로 조사하여 식작용의 증가를 유도하였다. 조사 후, 인간 각질형성세포는 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물을 1, 10, 100㎍/㎖의 농도별로 처리를 하였고, 24시간 후 형광 마이크로스피어를 처리하여 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근에 의한 식작용 억제능을 알아보았다. 형광측정기에 의해 측정된 결과는 하기 표 1 및 도 3에 도시하였다.

추출물농도(㎍/㎖)	식작용 억제율(%)
	정공등	현지초	화피	토복령	마황근
대조군	0	0	0	0	0
1	3.9	3.3	14.8	2.6	29.2
10	28.2	10.0	27.8	45.3	36.3
100	57.5	43.9	48.7	69.7	73.9

상기 표 1 및 도 3에서 보는 바와 같이, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 농도에 의존적으로 각질형성세포의 식작용을 억제하였으며, 100㎍/㎖를 처리했을 경우에는 자외선 조사 전의 수준까지 식작용을 감소시켰다.

[시험예 2] 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 자외선이 조사된 각질형성세포의 사멸에 미치는 영향

본 발명의 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에 의한 각질형성세포의 식작용 감소가 자외선에 노출된 각질형성세포의 사멸과 직접적인 연관이 있는 지의 여부를 다음의 시험을 통해 알아보았다.

상기 참조예 2와 동일한 시스템으로 실시되었고, 식작용 효능을 평가하는 시스템에서 사용한 자외선과 처리시간을 동일하게 사용하였다. 즉, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물을 자외선B 20mJ을 조사한 뒤 농도별로 처리하고, 24시간 후에 세포 독성 정도를 포마잔을 정량하여 결정하였다. 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에 의한 각질형성세포의 독성은 하기 표 2 및 도 4에 나타내었다.

추출물농도(㎍/㎖)	세포 증식율(%)
	정공등	현지초	화피	토복령	마황근
대조군	100	100	100	100	100
1	96.6	100.1	97.9	95.3	99.6
10	94.7	99.2	102.5	96.7	104.3
100	96.2	98.7	96.5	97.4	98.3

상기 표 2 및 하기 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 자외선B에 노출된 각질형성세포에 대해서 24시간 동안 전혀 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물에 의한 각질형성세포의 식작용 억제 효과는 세포에 대한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근의 직접적인 독성에 의해 일어난 것이 아님을 알 수 있으며, 나아가 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근는 각질형성세포에 매우 안전한 물질이라는 것을 알 수 있었다.

[시험예 3] 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 각질형성세포의 멜라노좀 획득에 미치는 영향

체외 멜라닌 또는 멜라노좀을 획득하는 각질형성세포의 능력을 테스트하는 것으로서, 즉 피부에서 멜라노좀이 흡수되는 단순화된 시스템의 기능을 테스트하는 것이다. 각질세포는 챔버 슬라이드 글라스에서 배양되었고, 자외선B를 20mJ/㎠로 조사하였다. 그리고, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근를 1% 포함하는 배양액을 첨가하여 24시간동안 배양시킨 다음, 멜라노사이트로부터 분리된 멜라노좀이 첨가되었다. 세포는 PBS로 씻어내고 폰타나-마손('F＆M')으로 염색하였으며, 상기 F＆M은 질산은-환원 분자를 염색해서 각질형성세포 내부의 멜라닌을 확인하는 방법이다. 그 결과는 하기 표 3 및 도5a~f에 나타내었다. 이때, 도 5a는 자외선 B를 20mJ 조사한 후의 비처리 대조군의 사진이며, 도 5b~f는 자외선 조사 후 정공등(도 5b), 현지초(도 5c), 화피(도 5d), 토복령(도 5e), 마황근(도 5f) 추출물 100㎍/㎖를 24시간 동안 처리한 사진이다.

추출물농도(㎍/㎖)	식작용 억제율(%)
	정공등	현지초	화피	토복령	마황근
대조군	100	100	100	100	100
100	65.1	60.8	58.7	70.2	62.3

상기 표 3 및 하기 도 5a~f에서 알 수 있는 바와 같이, 비처리된 각질형성세포는 배양 매체 유래의 멜라닌을 배양매체로부터 흡수한 반면, 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 처리된 세포에서는 현저하게 외부 멜라닌 흡수가 감소되어 있는 현상을 알 수 있었다.

상기한 결과들로부터 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물은 세포의 식작용을 효과적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다. 이로써 식작용에 관련된 질환 또는 상태의 개선 또는 예방에 있어 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 우수한 효과가 있다는 것이 입증되었다. 특히, 멜라노사이트로부터 케라티노사이트(각질형성세포)로 멜라노좀이 전달되는 것을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌이 표피로 이동되는 것을 봉쇄할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

<제형예 1: 영양화장수(밀크스킨로숀)>

본 발명에 따른 영양화장수를 하기 표 4의 조성으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
히아루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
정공등 추출물	0.05
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	8.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알콜	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1

<제형예 2: 영양크림>

본 발명에 따른 영양크림을 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	To 100
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
현지초 추출물	3.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1

<제형예 3: 맛사지 크림>

본 발명에 따른 맛사지 크림을 하기 표 6의 조성으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
토복령 추출물	1.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
파라핀	1.5

<제형예 4: 팩>

본 발명에 따른 팩을 하기 표 7의 조성으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	To 100
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히아루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
토복령 추출물	0.5
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
방부제	적량
향	적량
색소	적량
에탄올	6.0

<제형예 5: 피부외용제 중 연고>

본 발명에 따른 피부외용제 중 연고를 하기 표 8의 조성으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	01
현지초 추출물	1.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알콜	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물을 함유하는 조성물은 각질형성세포에 매우 안전하면서도 식작용을 효과적으로 억제하는 우수한 효과가 있다. 따라서, 세포의 식작용에 관련된 각종 질병, 구체적으로는 면역계통 관련 폐기종, 알레르기성 폐 기관 아스페르길루스증, 치주염, 아테롬성(atherosclerotic) 플라크(plaque)에 의해 유발되는 심장혈관계 질병, 암환자의 2차 감염, 당뇨병 환자의 면역 관련 질병, 알츠하이머병, 우울증, 노화 등을 치료 또는 예방할 수 있는 조성물로 이용될 수 있다. 특히, 멜라노사이트로부터 멜라노좀이 각질형성세포로 전달하는 것을 효과적으로 억제함으로써 피부색의 조절 효과를 기대할 수 있으며, 자외선 등에 의한 과색소 침착증, 주근깨, 기미, 반점 등을 치료 및 예방할 수 있다.

도 1a는 자외선A에 의한 각질형성세포의 식작용 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 1b는 자외선B에 의한 각질형성세포의 식작용 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2a은 자외선A가 각질형성세포의 증식 및 사멸에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 2b는 자외선B가 각질형성세포의 증식 및 사멸에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 자외선에 노출된 각질형성세포의 식작용에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 의한 정공등, 현지초, 화피, 토복령, 마황근 추출물이 각질형성세포의 사멸에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명에 의한 정공등(도 5b), 현지초(도 5c), 화피(도 5d), 토복령(도 5e), 마황근(도 5f) 추출물 및 대조군(도 5a)이 각질형성세포의 체외 멜라닌 또는 멜라노좀 획득에 미치는 영향을 나타내는 사진이다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
3. 정공등 및 토복령 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 외용제 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 마황근, 화피 및 현지초 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 외용제 조성물.