KR100490808B1 - 수소 라디칼의 검출 방법 및 정량 분석 방법 - Google Patents

수소 라디칼의 검출 방법 및 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 검출 방법으로서, 시료에 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)을 첨가하고, 그 흡수 특성에 의한 착색에 의해 수소 라디칼을 검출하는 것을 특징으로 하며, 또한 517 nm 근방에 흡수를 갖는 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 용액 및 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS) 용액에 백금흑의 존재하에서 일정한 속도로 수소 가스를 취입하고, DBNBS 아조 화합물에 유래하는 450 nm 근방의 흡광도와 수소 라디칼 발생 농도와의 상관 그래프의 검량선 C로부터 수소 라디칼의 농도를 정량 분석하는 것을 특징으로 한다.

Description

수소 라디칼의 검출 방법 및 정량 분석 방법 {Detection Method and Quantitative Analysis Method for Hydrogen Radical}
본 발명은 물, 특히 전해 환원수 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 검출 방법 및 수소 라디칼의 농도를 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
종래부터 수산화나트륨 등의 전해질 용액을 전기 분해하여 음극실에서 얻어지는, 이른바 전해 환원수는 체내에서 활성 산소 소거 활성 및 DNA 절단 억제 활성을 갖는다고 여겨지고 있다. 이것은 전해 환원수에 포함되는 활성 수소의 환원성에 따른 것이라고 여겨진다.
또한, 전해 환원수 등에 포함되는 수소 라디칼의 농도가 체내에서의 활성 산소 소거 활성에 영향을 주기 때문에, 수소 라디칼의 검출 방법과 함께 그 정량 분석 방법의 확립이 요구되고 있다.
여기서 활성 수소란 자외선 조사나 방전 등의 방법에 의해 화학 반응을 쉽게 일으키게 된 수소 라디칼을 의미하며, 금속에 산을 작용시켰을 때나 전기 분해시 음극측으로부터 발생하는 수소도 반응성이 높은 수소 라디칼이다. 활성 수소는 알칼리 금속염으로부터 금속을 유리시켜 각종 금속 원소의 산화물, 황화물 등을 쉽게 환원하여 금속으로 한다. 또한, 비소, 인, 산소, 할로겐, 안티몬, 주석 등은 수소화물을, 일산화탄소 및 이산화탄소는 포름알데히드를 제조한다. 또한, 각종 유기 화합물과 부가, 치환, 수소 원자 인출 반응을 일으키며, 불포화 유기 화합물에는 수소 부가를 행한다. 수소 라디칼은 그 상태에서는 비교적 안정하지만, 금속 표면에 접촉되면 극히 다량의 열을 방출하여 통상의 분자로 되돌아간다.
2Hㆍ→H2+435kJ/mol
그러한 검출 방법으로서는 고농도의 경우에는 압력차, 미량의 경우에는 산화텅스텐의 변색 등이 이용되고 있다. 그러나, 이들은 기체 중에서 발생했을 때의 검출 방법으로 수중의 수소 라디칼의 측정에 응용할 수는 없었다. 수소 라디칼은 수용성 라디칼 트랩제로 트랩되어 검출 및 정량이 가능하다면 전해 환원수 중에 수소 라디칼의 존재를 증명할 수 있기 때문에, 검출법 및 정량법의 확립을 목표로서 연구가 진행되고 있었다.
따라서, 전자 스핀 공명 장치(ESR)를 이용하여 물 시료만으로 또는 수용성 라디칼 트랩제 5,5-디메틸-1-피롤린-N-옥시드(DMPO)와 수용액 시료를 반응시켜 ESR 스펙트럼을 측정하였지만, 수소 라디칼의 스펙트럼은 확인되지 않았다.
또한, 펜톤 시약으로 수산화 라디칼을 발생시켜 수용액 시료의 환원력에 의한 수산화 라디칼의 감소를 ESR 스펙트럼으로 확인하고자 시도하였지만, 명확한 차이를 확인할 수 없었다. 이러한 점으로부터 전해 환원수 중의 수소 라디칼의 농도가 낮아 검출 감도가 낮은 방법에서는 검출이 곤란하다고 여겨졌다.
도 1은 BNBS 아조 화합물의 흡수 특성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 450 nm에서의 수소 가스 취입 시간과 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 3은 전해 환원수와 수소 라디칼 반응치의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 염화나트륨 농도와 수소 라디칼 반응치의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 DBNBS 비가열 처리 반응물의 HPLC 측정 결과를 나타내는 차트이다.
도 6은 DBNBS 비가열 처리 반응물의 자외 가시 흡수 스펙트럼을 나타내는 차트이다.
도 7은 DBNBS 가열 처리 반응물의 HPLC 측정 결과를 나타내는 차트이다.
도 8은 DBNBS 가열 처리 반응물의 자외 가시 흡수 스펙트럼을 나타내는 차트이다.
도 9는 DBNBS 비가열 처리 반응물의 매스 스펙트럼 측정 차트이다.
도 10은 DBNBS 가열 처리 반응물의 매스 스펙트럼 측정 차트이다.
도 11은 DBNBS 비가열 처리 반응물의 NMR 스펙트럼 측정 차트이다.
도 12는 DBNBS 가열 처리 반응물의 NMR 스펙트럼 측정 차트이다.
도 13은 검량선 A를 나타내는 그래프이다.
도 14는 검량선 B를 나타내는 그래프이다.
도 15는 검량선 C를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 물 또는 수용액에 존재하는 수소 라디칼을 고정밀도로 검출하는 방법 및 그 정량 분석 방법을 제공한다. 본 발명자는 대량의 물 시료를 중화하여 라디칼 트랩제인 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)과 반응시킨 후, 회전식 증발기로 농축하는 것을 시도하였다. 그 결과, 활성 산소 소거 활성이 확인된 전해 환원수 시료에 있어서는 오렌지색의 착색이 확인되었다. 그러나, 초순수(Milli Q 수용액)나 다른 광천수 및 수돗물에서는 착색이 확인되지 않았다. 이것은 DBNBS가 전해 환원수 중의 활성 수소와 반응하여 새롭게 착색 물질을 만들었기 때문이라고 여겨졌다. 이 현상을 이용하여 수용액 중의 수소 라디칼을 고정밀도로 검출할 수 있다고 생각하여 수소 라디칼의 검출법 및 정량 분석법을 개발하였다. 본 발명은 상기 사실에 기초한 것으로서, 전해 환원수 등에 라디칼 트랩제로서 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)을 사용하여 수소 라디칼의 검출 및 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 검출 방법으로서, 시료에 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(이하, "DBNBS"라고 함)을 첨가하고, 이것이 수소 라디칼과 반응함으로써 DBNBS 아조 화합물을 생성하여 그 흡수 특성에 기초한 착색에 의해 수소 라디칼을 검출하는 방법이다.
여기서 상기 물 또는 수용액은 전해 환원수가 바람직하게 사용된다.
또한, 상기 착색은 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)이 수소 라디칼과 반응하여 DBNBS 아조 화합물을 생성하는 착색 반응을 이용한다. 또한, 착색은 파장이 425 내지 450 nm의 흡수 피크에 기인한다.
본 발명은 또한 이하의 (1) 내지 (4)의 공정을 포함하는 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 정량 분석 방법이다.
(1) 517 nm 근방에 흡수를 갖는 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(이하, "DPPH"라고 함) 용액에 백금흑의 존재하에서 일정한 속도로 수소 가스를 취입하고, 517 nm 근방의 흡광도의 감소와 수소 가스의 취입 시간과의 상관 그래프를 구한다 (검량선 A의 작성).
(2) 시스테인과 DPPH를 반응시켜 DPPH의 517 nm 근방에서의 흡광도의 감소와 시스테인 농도와의 상관 그래프를 구한다 (검량선 B의 작성). 또한, 여기서 시스테인 대신에 아스코르빈산 등의 환원제를 사용할 수 있다.
(3) 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS) 용액에 상기 (1)과 동일한 조건에서 백금흑의 존재하에 일정한 속도로 수소 가스를 일정 시간 취입한 후, 450 nm 근방의 흡광도를 측정하고, 그 흡광도의 값과 검량선 A 및 검량선 B로부터 산출한 수소 가스의 취입 시간당 수소 라디칼 발생 농도와의 상관 그래프를 구한다 (검량선 C의 작성).
(4) 시료에 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)을 첨가하고, 450 nm 근방의 흡광도를 측정하여 그 흡광도의 값으로부터 상기 검량선 C를 이용하여 수소 라디칼의 농도를 읽어낸다.
여기서 물 또는 수용액은 10 내지 500배의 수소 라디칼 농도가 되도록 농축되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 기초하여 설명한다.
본 발명에서 수소 라디칼의 검출 방법은 이하에 나타낸 반응에 기초한 광흡수 특성을 이용하는 것이다. 즉, 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염 (DBNBS)이 수소 라디칼과 반응하여 DBNBS 아조 화합물을 생성한다. 또한, DBNBS 아조 화합물은 파장이 425 내지 450 nm의 흡수 피크를 갖기 때문에, 그 착색에 의해 수소 라디칼을 검출할 수 있다.
반응식으로 나타내면, DBNBS(화학식 A)는 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼과 반응하여 DBNBS-Hㆍ(화학식 B)가 되고, 그 두분자가 반응하여 이량체(화학식 C)를 생성한다. 그 후, 가열하에서 탈수하여 DBNBS 아족시 화합물(화학식 D)이 생성된다. 또한, 1개의 산소가 떨어져 안정한 DBNBS 아조 화합물(화학식 E)이 생성된다. 이 DBNBS 아조 화합물에 유래하는 425 내지 450 nm의 흡수를 검출함으로써, 수소 라디칼의 정성 분석이 가능해진다. 상기 화학식 A 내지 화학식 E의 일련의 반응은 발명자에 의해 최초로 발견된 신규한 반응이지만, 니트로벤젠 및 니트로소벤젠의 환원 반응에 의해 아족시벤젠 및 아조벤젠을 생성하는 유사 반응은 알려져 있다 (A.Streitwieser, Jr.& C.H.Heathcock: Introduction to Organic Chemistry, pp960-965, Macmillan Publishing co., Inc., New York(1976)). 아족시벤젠과 아조벤젠은 산화 환원 반응에 의해 서로 변환될 수 있다.
이어서, 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 정량 분석은 이하의 방법에 따른다.
DPPH는 517 nm 근방의 파장에 특이 흡수를 갖는 안정한 유리 라디칼이다. DPPH는 수소 라디칼과 정량적으로 반응하여 517 nm 근방의 흡수가 소실된다. 한편, 입자형 백금흑은 큰 표면적을 가지며, 가스형의 수소 분자를 수소 라디칼(원자형 수소)로 변환시켜 유지한다. 따라서, 용액 중에서 백금흑의 존재하에 수소 가스를 취입함으로써 쉽게 수소 라디칼을 발생시킬 수 있다. 따라서, 백금흑의 존재하에서 일정 조건으로 소정 농도의 DPPH 수용액에 수소 가스를 취입함으로써, 그 취입 시간과 DPPH의 517 nm에서의 흡광도의 감소와의 관계를 나타내는 검량선 (A)를 작성할 수 있다.
이어서, 수소 가스의 취입 시간당 수소 라디칼의 발생 농도를 산출하기 위해, 정량적으로 반응하는 것이 알려져 있는 환원성 물질, 예를 들면 시스테인과 DPPH를 반응시켜 시스테인 농도와 DPPH의 517 nm 근방에서의 흡광도의 감소와의 관계를 나타내는 검량선 (B)를 작성한다. 1 몰의 시스테인이 1 몰의 수소 라디칼에 상당한다고 가정하여 검량선 (A)로부터 수소 가스의 취입 시간당 발생한 수소 라디칼의 농도를 산출한다.
한편, 상술한 바와 같이 DBNBS(화학식 A)는 수소 라디칼과 반응하여 화학식 B의 디히드록시 중간체(DBNBS-Hㆍ) 및 그 이량체(화학식 C)를 거쳐 DBNBS 아조 화합물(화학식 D)을 생성한다. 또한, DBNBS 아조 화합물의 450 nm 근방에서의 특이 흡수를 정량 분석에 이용한다. 백금흑의 존재하에서 수소 가스를 취입하면 수소 라디칼이 발생하는 것은 상술한 바와 같으며, 따라서 450 nm 근방의 흡광도와 수소 가스의 취입 시간과의 관계를 구함으로써, 검량선 (A) 및 검량선 (B)를 이용하여 450 nm 근방의 흡광도와 수소 라디칼 농도와의 관계를 나타내는 검량선 (C)를 구할 수 있다.
따라서, 시료 중의 수소 라디칼 농도를 구하기 위해서는, 시료 용액에 소정 농도의 DBNBS를 첨가하고, DBNBS와 수소 라디칼을 반응시켜 DBNBS 아조 화합물을 생성시킨 후, 그 450 nm 근방의 흡광도를 측정하여 상기 검량선 (C)로부터 수소 라디칼 농도를 측정한다.
시료로서 전해 환원수를 사용하는 경우, 이것을 10 내지 500배로 농축하여 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 전해 환원수 125 ㎖에 DBNBS 보존액 200 ㎕를 첨가하여 교반한 후, 회전식 증발기로 60 ℃의 항온조에서 농축 건고한다. 이것을 1 ㎖의 초순수(Milli Q 수용액)로 농축 건고물을 용해하여 회수한다. 이어서, 60 ℃의 항온조에서 약 1시간 보온하고, 얼음 위에 5분간 정치하여 예를 들면 12,000 rpm으로 원심 분리하여 상청을 얻는다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
<실시예 1: DBNBS를 이용한 백금흑-수소에 의한 수소 라디칼 발생의 검출>
1-1 시약
DBNBS는 라보텍(주) 제조의 것을, 백금흑은 이시후꾸 금속 광업(주) 제조의 것을, 수소 가스는 다이요 산소(주) 제조의 것을 사용하였다. DBNBS는 초순수 (Milli Q 수용액)에 12.5 mg/㎖의 농도로 용해하여 4 ℃로 보존하고, 2주 이내에 모두 사용하도록 하였다.
1-2 백금흑-수소에 의한 수소 라디칼 발생
수소 가스는 백금 표면 상에서 원자형의 수소가 된다. 따라서, 0.01 mg/㎖의 백금흑을 포함하는 2.5 mg/㎖의 DBNBS 용액 20 ㎖에 45 ㎖/분의 취입 속도로 수소 가스를 취입하였다. 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분 후에 각각 200 ㎕씩 회수하여 12,000 rpm으로 5분간 원심 분리한 후, 상청을 60 ℃의 항온조에서 1시간 보온하였다. 대조군으로서는 수소 가스를 취입시키지 않은 것을 60 ℃에서 1시간 보온 처리한 것을 사용하였다.
1-3 수소 라디칼의 검출
반응 후의 대조군의 DBNBS 수용액을 캘리브레이션(calibration)하여 DBNBS 자체의 흡광도를 0으로 하고, 각 DBNBS 시료의 350 내지 600 nm의 파장을 스캔하여 스펙트럼 차이를 얻었다. 이 스펙트럼 차이의 측정은 백금흑-수소 처리에 의해 DBNBS가 새로운 물질로 변화되었음을 검출하기 위한 것이다. 또한, 백금흑-수소 처리에 의해 생성되는 수소 라디칼에 DBNBS가 특이적으로 반응하는가를 조사하기 위해 백금흑 단독으로, 수소 가스 단독으로, 질소 가스 단독으로, 백금흑-질소 가스로 처리한 시료도 사용하였다.
백금흑-수소 반응에 의해 얻어진 DBNBS 아조 화합물 시료의 흡수 스펙트럼은 도 1(Pt-H2)에 나타낸 바와 같이 425 nm 내지 450 nm에 피크를 갖는 완만한 가시 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 이들 시료는 오렌지색으로 착색되어 있었다. 이것은 백금흑-수소 처리에 의해 DBNBS가 새로운 오렌지색의 착색 물질인 DBNBS 아조 화합물로 변화된 것을 나타낸다. 또한, 그 피크의 높이는 도 2에 나타낸 바와 같이, 취입된 수소 가스량에 의존하여 증가해서 45분간의 취입으로 최대가 되며, 그 후에는 감소하였다.
또한, 백금흑-수소 반응 특이성을 조사하기 위해 행한 백금흑 단독으로, 수소 가스 단독으로, 질소 가스 단독으로, 백금흑-질소 가스로 처리한 시료에서는 전혀 착색이 확인되지 않았고, 자외부 흡수에 있어서도 파형에 변화가 확인되지 않았다. 수소 라디칼과 반응하여 얻어진 것의 흡수 스펙트럼의 450 nm에서의 흡광치를 수소 라디칼 반응치(AH치)로 하였다.
<실시예 2: DBNBS를 이용한 전해 환원수 중의 수소 라디칼의 검출>
2-1 시약
실시예 1과 동일한 것을 사용하였다.
2-2 전해 환원수
0.01 % 염화나트륨수를 닛본 트림사 제조의 전해 환원수 장치 TI-8000으로 레벨 4(5A)에서 전해 환원하여 음극측의 전해 환원수를 얻었다.
2-3 수소 라디칼의 검출
전해 환원수 125 ㎖에 DBNBS 보존액 200 ㎕를 첨가하여 교반한 후, 회전식 증발기로 60 ℃의 항온조에서 농축 건고하였다. 1 ㎖의 초순수(Milli Q 수용액)로 농축 건고물을 용해하여 회수하였다. 이어서, 60 ℃의 항온조에서 1시간 보온하고, 얼음 위에 5분간 정치하여 12,000 rpm으로 원심 분리하고 상청을 얻었다. 대조군으로서는 상기 초순수로 동일하게 행한 DBNBS 시료를 측정하여 DBNBS 시료의 350 내지 600 nm의 파장을 스캔하여 스펙트럼 차이를 얻었다.
실시예 1에서 구한 흡수 스펙트럼과 동일한 스펙트럼이 전해 환원수에서 확인되었고 (도 1: 전해 환원수), 전해 환원수 중에 수소 라디칼이 존재하는 것이 확인되었다.
<실시예 3: 전해 환원수의 농도와 수소 라디칼 반응치의 관계 및 전해 강도와 수소 라디칼 반응치의 관계>
전해 환원수의 농도와 수소 라디칼량의 상관 관계가 있는지를 시험하였다. 전해 환원수를 초순수(Milli Q 수용액)로 희석하여 각각 시료의 수소 라디칼 반응치를 측정하였다. 또한, 전해 강도와 수소 라디칼 반응치의 관계를 조사하기 위해 NaCl 농도가 0.0001 %에서 0.01 %까지인 물을 준비하고, 각각에 대하여 전해 환원된 물의 활성 수소 반응을 측정하였다. 전해 환원수는 닛본 트림사 제조의 전해 환원수 장치 TI-8000으로 레벨 4(5 A)에서 전해 환원하여 음극측의 환원수를 얻었다.
전해 환원수의 %체적이 25, 50, 75, 100 %인 물을 희석하여 제조하고, 수소 라디칼 반응치를 측정했더니 도 3에 나타낸 바와 같이 전해 환원수의 농도와 함께 수소 라디칼 반응치가 상승하였기 때문에, 이 측정계는 전해 환원수의 시료에 있어서도 정량성이 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 전기 분해로 전해 환원수를 얻을 때의 전해 강도를 변화시킨 수용액을 제조하기 위해, 수용액의 염농도(NaCl 농도)를 바꾸어 얻어진 전해 환원수에 있어서는 도 4에 나타낸 바와 같이 전해 강도(NaCl 농도)와 함께 수소 라디칼 반응치도 상승하였다. 이것은 전해 강도를 강하게 함으로써 수소 라디칼도 많이 발생하는 것을 의미한다.
<실시예 4: 수소 라디칼과 DBNBS의 반응 과정 해석>
4-1 시료
DBNBS는 라보텍(주) 제조의 것을, 백금흑 분말 M 타입은 이시후꾸 금속 광업(주) 제조의 것을, 수소 가스는 다이요 산소(주) 제조의 것을 각각 사용하였다.
4-2 DBNBS의 반응
0.01 mg/㎖의 백금흑을 포함하는 2.5 mg/㎖의 DBNBS 용액 20 ㎖에 45 ㎖/분의 취입 속도로 수소 가스를 1시간 취입하고, 가열 처리를 행하지 않은 것과, 60 ℃에서 1시간 가열 처리한 것을 빙냉하여 반응을 정지시킨 것을 분석 시료로 사용하였다.
4-3 분석 시료의 조정
(1) 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 시료
분석 시료를 각각 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 그 2000 ㎕를 사용하였다.
(2) NMR, TOF-MASS 분석에서의 분석 시료
HPLC로부터 분리된 비가열 처리된 반응 중간체는 무수 아세트산(와꼬 쥰야꾸 (주) 제조)을 이용하여 아세틸화해서 안정화시킨 것을 사용하고, 가열 처리에 의해 분리된 아조 화합물은 다시 HPLC로 분취함으로써 분리도를 완전하게 하여 사용하였다.
(3) 미량 원소 분석에서의 분석 시료
비가열 처리의 반응 중간체는 HPLC로부터 분리된 것을 사용하고, 가열 처리에 의해 분리된 아조 화합물은 NMR, TOF-MASS 분석과 동일한 것을 사용하였다.
4-4 기기 측정 조건
(1) HPLC는 위터즈(Waters)사의 Waters 600E, 이동상은 Milli-QWater, 유속은 5 ㎖/분, 주입량은 Waters717의 오토 샘플러로 채취한 2000 ㎕, 칼럼은 워터즈사 제조의 Nova-Pak C18 19×300 mm를 사용하였다. 또한, 검출기에는 워터즈사의 Waters996 포토 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 200-600 nm의 파장 영역에서 1.2 nm 간격으로 데이타를 입력하였다. 스펙트럼 크로마토그래피에 의한 해석은, 컴팩 V700 퍼스널 컴퓨터를 이용하여 밀레니엄32(워터즈사)로 작성한 프로그램으로 행하였다.
(2) TOF-MASS 분석계는 Voyager(퍼셉티브, 바이오 시스템사)를 사용하였다. Voyager는 질소 레이저(337 nm)를 탑재한 가속 전압 20 kV의 레이저 이온화 비행 시간형 질량 분석 장치이다. 가속 전압은 20 kV를 사용하며, 비행 모드는 리니어 모드로 분석을 행하였다. 매트릭스는 2-(4-히드록시-페닐아조)-벤조산(HABA)(알드리치 케미컬사 제조) 1.3 mg을 50:50의 물ㆍ아세토니트릴 1 ㎖에 용해하여 사용하였다. 시료 슬라이드에 0.5 ㎕의 시료를 도포하여 자연 건조한 후, 동량의 매트릭스 용액을 첨가하여 다시 자연 건조시켜 이온원에 도입하였다.
(3) NMR은 400 MHz NMR(JEOL JNM-GSX400NMR 시스템 스펙트럼 미터)을 사용하여 1H-NMR 측정을 행하였다. 용매로서 디메틸술폭시드(DMSO) (와꼬 쥰야꾸(주) 제조) 및 중수소옥시드(D2O)(알드리치 케미컬사 제조)를 사용하였다.
4-5 해석 결과
(A) 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 측정 결과
(i) 분석 시료 (1)
0.01 mg/㎖의 백금을 포함하는 2.5 mg/㎖의 DBNBS 용액 20 ㎖에 45 ㎖/분의 취입 속도로 수소 가스를 1시간 취입하고, 0.45 ㎛의 필터로 여과하여 그 2000 ㎕를 포토 다이오드 어레이 검출기가 부착된 HPLC를 이용하여 비가열 처리의 시료를 측정하였다. 그 측정 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 비가열 처리의 DBNBS 반응물의 유지 시간 약 9.0분에서 확인되는 피크는 도 6에 그 자외 가시 흡수 스펙트럼을 나타낸 바와 같이 220 nm에 흡수 피크를 나타내며, 450 nm에는 흡수를 보이지 않았다. 이것은 식 화학식 C로 표시되는 이량체에 상당하는 것이라고 추정되었다.
(ii) 분석 시료 (2)
0.01 mg/㎖의 백금을 포함하는 2.5 mg/㎖의 DBNBS 용액 20 ㎖에 45 ㎖/분의 통기 속도로 수소 가스를 1시간 취입하고, 60 ℃에서 1시간 가열 처리한 것을 빙냉하여 반응을 정지시킨 것을 0.45 ㎛의 필터로 여과하고, 그 2000 ㎕를 포토 다이오드 어레이 검출기가 부착된 HPLC를 이용하여 가열 처리의 시료를 측정하였다. 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 가열 처리의 DBNBS 반응물의 유지 시간 8.5분에서 확인되는 피크는 도 8에 그 자외 가시 흡수 스펙트럼에 나타낸 바와 같이 320 nm 및 450 nm에 흡수 피크가 확인되었고, 공지된 아조벤젠과 유사한 자외선 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 이것은 화학식 E로 표시되는 DBNBS 아조 화합물에 상당한다.
(B) 매스 스펙트럼(MALDI-TOF-MS)의 측정 결과
(i) 분석 시료 (1)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 280 nm에 흡수를 갖는 비가열 처리 DBNBS 반응물을 매스 스펙트럼(MALDI-TOF-MS)을 이용하여 측정하였다.
아세틸화된 280 nm에 흡수를 갖는 비가열 처리의 DBNBS 반응물의 매스 스펙트럼은 도 9에 나타낸 바와 같이 m/z 675.449에 이온 피크가 표시되며, 이것은 중간체(화학식 C)로부터 Br 및 Na가 1개 이탈하여 화학식 C의 중간체의 히드록실기가 1개 아세틸화된 것과 일치하였다.
(ii) 분석 시료 (2)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 450 nm에 흡수를 갖는 가열 처리 DBNBS 반응물을 매스 스펙트럼(MALDI-TOF-MS)을 이용하여 측정하였다.
450 nm에 흡수를 갖는 가열 처리의 DBNBS 반응물의 매스 스펙트럼이 도 10에 나타낸 바와 같이 m/z 656.329에 이온 피크가 표시되며, Na가 2개 이탈한 DBNBS 아조 화합물(화학식 E)과 일치하였다.
(C) NMR 측정 결과
(i) 분석 시료 (1)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 280 nm에 흡수를 갖는 비가열 처리 DBNBS 반응물을 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 아세틸화된 280 nm에 흡수를 갖는 비가열 처리 DBNBS 반응물의 스펙트럼이 표시되었다. 대조군으로서 아세틸화에 사용한 무수 아세트산을 동일하게 HPLC 분취에 의해 채취한 것을 측정하였다. 대조군의 무수 아세트산의 메틸기가 2.5 ppm에 시그널을 나타낸 것과 비교하여, 화학적 이동 (chemical shift) 2.0 ppm에 메틸기의 존재가 표시됨으로써 비가열 처리 DBNBS 반응물의 히드록실기와 무수 아세트산이 직접 반응을 보인 것을 나타내었다.
(ii) 분석 시료 (2)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 450 nm에 흡수를 갖는 가열 처리 DBNBS 반응물을 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과를 도 12에 나타내었다. DBNBS가 8.0 ppm에 1개의 시그널을 나타낸 것과 비교하여, 450 nm에 흡수를 갖는 가열 처리된 DBNBS 반응물의 양성자, 화학적 이동은 6.6 내지 6.8 ppm이며, 6.7575 ppm 및 6.634 ppm의 시그널은 좌우에 또 하나씩의 대칭 시그널이 분열되어 있었다. 이것은 아조기의 형성에 따라 메타 위치의 양성자가 비대칭이 되고, 또한 양성자 사이에 커플링이 발생한 것을 나타낸다.
(D) 미량 원소 분석 결과
(i) 분석 시료 (1)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 220 nm에 흡수 피크를 갖는 비가열 처리 DBNBS 반응물을 미량 원소 분석하였다. 탄소 함량 19.93 %(계산치 19.35 %), 수소 함량 1.61 %(계산치 1.61 %), 질소 함량 3.76 %(계산치 3.76 %)가 되었다. 이것은 중간체의 3수화물로부터 Na가 2개 이탈한 것과 일치하였다.
(ii) 분석 시료 (2)
상기 HPLC 측정에서 얻어진 450 nm에 흡수를 갖는 가열 처리 DBNBS 반응물을 미량 원소 분석하였다.
탄소 함량 21.53 %(계산치 21.43 %), 수소 함량 1.73 %(계산치 1.79 %), 질소 함량 3.84 %(계산치 4.17 %)가 되었다. 이것은 DBNBS 아조 화합물의 4수화물로부터 Br 및 Na가 1개씩 이탈한 것과 일치하였다.
<실시예 5: 수소 라디칼의 정량 분석>
5-1 검량선 A의 작성 (1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH)과 수소 가스 취입 시간과의 관계)
0.1 M의 아세트산 완충액(pH 5.5) 1.96 ㎖에 에탄올 및 0.5 mM의 DPPHㆍ에탄올 용액 1 ㎖와 1.0 mg/㎖의 백금흑ㆍ아세트산 완충액 0.05 ㎖를 첨가하여 전량을 5 ㎖로 하고, 45 ㎖/분의 속도로 수소 가스를 취입하고, 일정 시간마다 200 μ의 시료를 채취하여 DPPH의 특이 흡수인 517 nm의 흡광도를 측정하고, 흡광도의 감소와 취입 시간과의 관계를 나타내는 그래프(검량선 A)로서 도 13을 얻었다.
5-2 검량선 B의 작성
0 내지 100 μM의 시스테인과 DPPH를 반응시켜 DPPH의 517 nm 근방에서의 흡광도의 감소와, 시스테인 농도와의 상관 그래프를 구하였다. 검량선 B의 그래프로서 도 14를 얻었다.
5-3 검량선 C의 작성 (3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염 아조 화합물(DBNBS 아조 화합물)의 흡광도와 수소 라디칼 농도와의 관계)
0.01 mg/㎖의 백금을 포함하는 2.5 mg/㎖의 DBNBS 용액 5 ㎖에 45 ㎖/분의 속도로 수소 가스를 취입하고, DBNBS와 수소 라디칼을 반응시키면서 일정 시간마다 200 ㎕의 시료를 채취하여 60 ℃에서 1시간 가온한 후, DBNBS와 수소 라디칼의 반응 생성물인 DBNBS 아조 화합물의 특이 흡수인 450 nm의 흡광도를 측정하여 도 15에 나타낸 검량선 C를 작성하였다.
5-4 시료 중의 수소 라디칼 농도의 측정
(1) 시료 제조
전해 환원수를 pH 7.0으로 제조하고, 그 제조 조건에 의해 레벨 1 내지 레벨 4의 시료를 제조하였다. 여기서 전해 환원수는, 격막으로 격리된 각각의 음극실과 양극실에 NaOH를 포함하는 수용액을 도입하여 음극과 양극 사이에 통전시키고, 상기 NaOH 수용액을 전기 분해하여 상기 음극실로부터 얻어진 것이다. 이들 산화 환원 전위(ORP) 및 pH를 표 1에 나타내었다. 대조예로서 초순수(Milli Q 수)를 사용하였다.
125 ㎖의 Milli Q 수용액, 레벨 1 내지 4의 각각의 전해 환원수에 DBNBS 스톡 용액(12.5 mg/㎖)을 200 ㎕ 첨가하여 125배로 감압 농축하였다. Milli Q 수용액 1 ㎖로 농축한 후 크젤달(Kjeldahl) 플라스크의 내벽을 세정하고, 잠시 정치하여 용액을 회수하였다. 회수 후의 용액을 60 ℃ 유욕중(차광)에서 가열하고, 그 후 얼음으로 냉각하여 반응을 정지하였다. 회전 속도 12000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상청을 채취하였다.
(2) 흡광도의 측정
상기 시료의 주파수 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정은 동일 시료에 대하여 각각 3개의 시료를 사용하여 측정하고, 그 평균치를 구하였다. 흡광도의 측정 결과를 표 1에 나타내었다. HPLC를 이용한 분석 결과, 전해 환원수와 DBNBS의 반응 결과, 생성된 착색 물질은 백금흑의 존재하에서 수소 가스를 취입하였을 때 생성되는 DBNBS 아조 화합물과 동일한 물질인 것이 용출 위치 및 자외선 가시 흡수 스펙트럼으로부터 동정되었다.
(3) 수소 라디칼 농도의 측정
대조군으로서 사용한 DBNBS의 Milli Q 수용액의 450 nm에서의 평균 흡광도 0.0358를 각 레벨 시료의 흡광도로부터 차감하고, 그 흡광도값의 차이로부터 검량선 (C)를 이용하여 수소 라디칼 농도를 구하였다. 또한, 125배로 농축한 전해 환원수는 수소 라디칼 농도가 레벨 1 내지 4에서 7 내지 34 μM(μmol/ℓ)의 범위였다.
Milli Q 레벨 1 레벨 2 레벨 3 레벨 4
pH - 8.52 9.27 9.84 10
산화 환원 전위ORP(mV) - 56 38 4 1
흡광도(평균)(450 nm) 0.0358 0.0927 0.1037 0.0975 0.1462
흡광도 차이(Milli Q을 기준으로) - 0.0569 0.0679 0.0617 0.1104
(125배 농축액)수소 라디칼 농도(μM) - 17 11 8 34
이번에 개시된 실시 형태 및 실시예는 모든 점에서 예시로서, 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 범위는 상기한 설명이 아니라 특허 청구의 범위에 의해 표시되며, 특허 청구의 범위와 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경이 포함되는 것을 의도한다.
상술한 수소 라디칼의 검출 방법 및 정량 분석 방법을 이용하면, 물 또는 수용액 중에서의 수소 라디칼의 미량 존재를 검출할 수 있음과 동시에, 그 농도도 정확하게 측정할 수 있게 된다. 특히, 이 분석 방법을 이용함으로써 전해 환원수에서의 수소 라디칼의 농도를 쉽고 정확하게 정량할 수 있게 된다. 따라서, 이 분석 방법을 이용함으로써 의료 분야, 식품 분야, 음료 분야 등의 각종 제품 용도에 적용할 수 있으며, 이들 용도에 따른 수소 라디칼(활성 수소)의 농도를 조정한 전해 환원수를 제조할 수 있다. 또한, 수소 흡장 합금의 성능 평가에도 이용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 검출 방법으로서, 시료에 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)을 첨가하고, 그 시료의 착색에 의한 수소 라디칼의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 물 또는 수용액은 전해 환원수인 수소 라디칼의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 착색은 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염 (DBNBS)이 수소 라디칼과 반응하여 생성되는 DBNBS 아조 화합물의 흡수 피크에 의한 것인 수소 라디칼의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 파장 425 내지 450 nm의 흡수 피크를 검출하는 것을 특징으로 하는 수소 라디칼의 검출 방법.
  5. (1) 517 nm 근방에 흡수를 갖는 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 용액에 백금흑의 존재하에서 일정한 속도로 수소 가스를 취입하고, 517 nm 근방의 흡광도의 감소와 수소 가스의 취입 시간과의 상관 그래프를 구하는 공정 (검량선 A의 작성),
    (2) 시스테인과 DPPH를 반응시켜 DPPH의 517 nm 근방에서의 흡광도의 감소와 시스테인 농도와의 상관 그래프를 구하는 공정 (검량선 B의 작성),
    (3) 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS) 용액에 상기 (1)과 동일한 조건에서 백금흑의 존재하에 일정한 속도로 수소 가스를 일정 시간 취입한 후, 450 nm 근방의 흡광도를 측정하고, 그 흡광도의 값과 검량선 A 및 검량선 B로부터 산출한 수소 가스의 취입 시간당 수소 라디칼 발생 농도와의 상관 그래프를 구하는 공정 (검량선 C의 작성),
    (4) 시료에 3,5-디브로모-4-니트로소벤젠술폰산의 나트륨염(DBNBS)을 첨가하고, 450 nm 근방의 흡광도를 측정하여 그 흡광도의 값으로부터 상기 검량선 C를 이용하여 수소 라디칼의 농도를 읽어내는 공정을 포함하는 물 또는 수용액 중의 수소 라디칼의 정량 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서, 물 또는 수용액은 10 내지 500배로 농축되어 있는 정량 분석 방법.
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