CN103913428B - 一种利用乙酰胆碱酯酶快速判断水中含氢量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，属于生物技术领域酶法分析领域。将乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱、反应缓冲体系试剂以及显色剂DTNB，混合均匀，至少分成相同的两份，其中一份加入待测的含氢的氢水，另一份加入去离子水，氢水和去离子水的加入量相同，使溶液均为中性，反应后，采用在可见光412nm进行吸收比较法，或通过黄色产物的深浅可辨别氢含量的高低，相对于去离子水的吸光值越大或颜色越深，氢含量越高。通过酶活测定的显色反应，直接判断水中的含氢量。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用乙酰胆碱酯酶快速判断水中含氢量的方法，尤其是能够实现氢水与普通水的定性快速鉴定，属于生物技术领域酶法分析领域。
背景技术
氢气是一种无色、无味、无嗅、易燃的气体，是自然界中最轻的双原子分子。在潜水医学领域，人们利用氢氧混合气作为呼吸介质以缩短减压时间。长期以来，人们一直认为氢气只是肠道菌群的代谢废气，不具有任何生物学作用。因此，氢气一直被人们认为是生理惰性气体。2007年，日本学者在《自然科学》上发表文章，发现采用在体模型证明呼吸2％的氢气可有效的降低脑缺血再灌注造成的梗死面积，随后氢作为一种新型的抗氧化剂广泛的关注并掀起了氢分子治疗的研究热潮。在证明氢具有抗氧化作用后，陆续有报道证明氢分子对其他组织器官的缺血再灌注损伤也有明显的改善作用。大量的实验结果证明氢分子可以显著地降低缺血再灌注过程中氧化应激造成的各种损伤。此外，氢分子对炎性反应也有着明显的改善作用。同时，氢分子还可以缓解药物或化学制品对正常细胞的损伤。
人体利用氢气的方法之一就是将氢气溶入高纯度的水中，借助水为载体进入身体，在体内散发，从而对人体因有害自由基产生的氧化起到一个还原作用。氢气在水中的溶解度很低并且难以保存，因此水中是否含氢、含氢量多少就成为衡量氢水优劣的一个重要指标。
目前用于测量氢水浓度的方法主要是电极法，即利用玻璃电极及参考电极，测定水样中电位变化。这种方法需要购买精密的电极，并且在测量前需要严格的平衡过程，耗时长且受温度等周边环境影响大。
检测乙酰胆碱酯酶活性的方法有Ellman法：5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与乙酰胆碱酯酶和硫代乙酰胆碱的反应产物硫代胆碱进行反应，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)。TNB在412nm有很强的吸收，可以用于对乙酰胆碱酯酶进行定量分析。乙酰胆碱酯酶在氢水环境中的活性比在普通水中的活性强，因此等量的乙酰胆碱酯酶在氢水环境中与DTNB反应得到的产物TNB更多，黄色产物的深浅可辨别。相同情况下，氢水组的颜色应比普通水组的颜色深。
检测乙酰胆碱酯酶活性的方法还有：乙酰胆碱与胆碱酯酶作用水解后，将剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用，生成乙酰羟胺，其在酸性溶液中与三氯化铁作用，可生成深褐色异羟肪酸铁络合物，其颜色的深浅与剩余乙酰胆碱成正比。因为在氢水环境中的乙酰胆碱酯酶酶活会提高，因此剩余的乙酰胆碱会比普通水组的少，相应的颜色也会更浅。
此外，检测乙酰胆碱酯酶活性的方法还有荧光法和其他比色法等，均可用本发明所述的方法对氢水浓度进行检测。
发明内容
本发明的目的是寻求一种快速灵敏的定性和半定量方法，来解决目前样品水中氢分子浓度的检测方法均需要一定的仪器设备且操作繁琐苛刻，不能应用于实时快速检测，以及目前没有快速检测样品中氢浓度的试剂盒的问题。本发明提供一种对样品水中的氢浓度进行快速半定量测定的方法，根据乙酰胆碱酯酶在氢水环境中酶活会提高的原理，在样品水中含有一定氢水浓度时能起不同的显色反应，根据颜色可直接进行对样品中氢浓度的定性检测，该方法操作方便，简单快捷，应用范围广，可制作各种产品，进行规模化生产。
本发明所采用的技术方案是：
一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，其特征在于：将乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱、反应缓冲体系试剂以及显色剂DTNB，混合均匀，其中乙酰胆碱酯酶与硫代乙酰胆碱的质量比为1:(200-300)，更优选为1:(240-260)，硫代乙酰胆碱与显色剂DTNB的质量比为1:1至5:1(优选1:1-3:1)，至少分成相同的两份，其中一份加入待测的含氢的氢水，另一份加入去离子水，氢水和去离子水的加入量相同，使溶液均为中性，反应后，采用在可见光412nm进行吸收比较法，或通过黄色产物的深浅可辨别氢含量的高低，相对于去离子水的吸光值越大或颜色越深，氢含量越高。
进一步乙酰胆碱酯酶采用电鳗乙酰胆碱粉末，总活性为827U/mg(但不仅限于此种乙酰胆碱)；硫代乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶反应，生成含巯基产物均能体现氢水环境。
作为优选，所述反应装入管中，磷酸氢二钠作为缓冲物质，使反应体系中的pH＝7.0，在碱性环境中，产物TNB容易出现解离情况，需要保证反应环境在中性环境中，使显色产物稳定。
上述快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱、反应缓冲体系试剂以及显色剂DTNB粉末混合均匀，装入透明的容器内，用封口膜密闭，冷冻保存。
所述快速检测试剂盒的制备方法为：将原料各组分按照比例干燥成粉末，一起装入透明离心管中，用封口膜密闭，冷冻保存。
本发明能够快速区别检测氢含量不同的水的情况。反应五分钟内观察有效。所用氢水中氢的浓度范围大于200μmol/L，上限浓度为氢在水中的饱和浓度。
本发明基于乙酰胆碱酯酶在氢水环境中酶活会提高的原理，通过酶活测定的显色反应，直接判断水中的含氢量。本方法操作简单，反应快速，具有用于日常检测的商业化潜力。
附图说明
图1是实施例1对应的吸收值图；
图2是实施例2对应的吸收值图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
分别准确称取0.029mg硫代乙酰胆碱，0.024mgDTNB，其中乙酰胆碱酯酶(来自电鳗，总活性为827U/mg)0.1μg，加入磷酸氢二钠适量(使最终溶液体系的PH为7)放入离心管中，干燥后，密封冷冻保存。使用氢电极测出所用氢水为3000μmol/L、200μmol/L，用这两种不同浓度的氢水以及纯水作为溶剂，分别取200μL同时加入到离心管中，混匀，在可见光吸收值为412nm处进行检测，吸收值大的对应浓度大的，见图1。
实施例2
分别准确称取0.029mg硫代乙酰胆碱，0.024mgDTNB，其中乙酰胆碱酯酶(来自电鳗，总活性为827U/mg)0.11μg，加入磷酸氢二钠适量(使得最终溶液PH为6.5)放入离心管中，干燥后，密封冷冻保存。使用氢电极测出所用氢水为100μmol/L浓度，用纯水和该浓度氢水分别作为溶剂，分别取200μL同时加入到离心管中，混匀，在可见光吸收值为412nm处进行检测，见图2。
实施例3
分别准确称取0.87mg硫代乙酰胆碱，0.24mgDTNB，其中乙酰胆碱酯酶(来自电鳗，总活性为827U/mg)0.36μg，加入磷酸氢二钠(使得最终溶液PH为7.5)适量放入离心管中，密封冷冻保存。使用氢电极测出所用氢水为500μmol/L浓度，用纯水和该浓度氢水分别作为溶剂，分别取200μL同时加入到离心管中，混匀，在可见光吸收值为412nm处进行检测，颜色深的为500μmol/L浓度。
本发明的检测步骤是：
根据本发明的方法，分别准确称取0.03mg硫代乙酰胆碱和0.024mgDTNB，乙酰胆碱酯酶和磷酸二氢钠，放入离心管中，取同样剂量各物质于另一离心管中，分别同时加入去离子水和样品水，振荡混匀，静置1分钟后观察反应液颜色，进行对比，若样品水处理管的反应液颜色较去离子水处理的更显亮黄色，则样品水中确为氢水，反应五分钟内观察有效。
Claims (4)
1.一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，其特征在于：将乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱、反应缓冲体系试剂以及显色剂DTNB，混合均匀，至少分成相同的两份，其中一份加入待测的含氢的氢水，另一份加入去离子水，氢水和去离子水的加入量相同，使溶液均为中性，反应后，采用在可见光412nm进行吸收比较法，或通过黄色产物的深浅可辨别氢含量的高低，相对于去离子水的吸光值越大或颜色越深，氢含量越高。
2.按照权利要求1所述的一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，其特征在于：乙酰胆碱酯酶与硫代乙酰胆碱的质量比为1:(200-300)，硫代乙酰胆碱与显色剂DTNB的质量比例为1:1至5:1。
3.按照权利要求1所述的一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，其特征在于：乙酰胆碱酯酶与硫代乙酰胆碱的质量比为1:(240-260)。
4.按照权利要求1所述的一种可快速检测样品水中是否含有有效浓度的氢的快速检测方法，其特征在于：所用氢水中氢的浓度范围大于200μmol/L，上限浓度为氢在水中的饱和浓度。
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