WO2002097427A1 - Procede de detection et procede d'analyse quantitative de radicaux hydrogene - Google Patents

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Sanetaka Shirahata
Kazumichi Otsubo
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Nihon Trim Co., Ltd.
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    • Y10T436/22—Hydrogen, per se

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting hydrogen radicals in water, particularly electrolytically reduced water or an aqueous solution, and a method for quantitatively analyzing the concentration of hydrogen radicals.
  • electrolytic reduced water obtained in a cathode chamber by electrolyzing an electrolyte solution such as sodium hydroxide is said to have an active oxygen scavenging activity and a DNA cleavage inhibition activity in the body. This is attributed to the reducing nature of the active hydrogen contained in the electrolytically reduced water.
  • active hydrogen refers to hydrogen radicals that have undergone a chemical reaction by a method such as ultraviolet irradiation or discharge, and are generated from the cathode side when an acid is applied to a metal or during electrolysis.
  • the generated hydrogen is also a highly reactive hydrogen radical.
  • Active hydrogen liberates metals from alkali metal salts and easily reduces oxides and sulfides of various metal elements to metals.
  • arsenic, phosphorus, oxygen, halogen, antimony, tin, etc. produce hydrides, and carbon monoxide and carbon dioxide produce formaldehyde. It also undergoes addition, substitution, and hydrogen atom abstraction reactions with various organic compounds, and hydrogenates unsaturated organic compounds.
  • Hydrogen radicals are relatively stable as they are, but when they come into contact with metal surfaces, they release an extremely large amount of heat and return to normal molecules.
  • the detection method As the detection method, the pressure difference is used at high concentrations, and the discoloration of tungsten oxide is used at low concentrations.
  • these methods cannot be applied to the measurement of hydrogen radicals in water by the detection method when they are generated in gas.
  • Hydrogen radicals are water-soluble radio If detection and quantification can be performed by trapping with a trapping agent, the presence of hydrogen radicals in electrolytically reduced water can be proved, and research has been conducted with the aim of establishing detection and quantification methods.
  • ESR electron spin resonance device
  • the present invention provides a method for detecting hydrogen radicals present in water or an aqueous solution with high accuracy, and a method for quantitative analysis thereof.
  • the inventor should neutralize a large amount of water sample, react it with a radical trapping agent, sodium salt of 3,5-dibromo-1-trosobenzenesulfonic acid (DBNBS), and then concentrate it on a rotary evaporator. Tried.
  • a radical trapping agent sodium salt of 3,5-dibromo-1-trosobenzenesulfonic acid (DBNBS)
  • DBNBS 3,5-dibromo-1-trosobenzenesulfonic acid
  • the present invention is based on the above-mentioned findings, and uses 3,5-dibutose-mo- 4-etrosobenzenesulfonic acid sodium salt (DBNB S) as a radical trapping agent in electrolytic reduced water or the like to detect hydrogen radicals. And a quantitative analysis method.
  • DBNB S 3,5-dibutose-mo- 4-etrosobenzenesulfonic acid sodium salt
  • the present invention relates to a method for detecting hydrogen radicals in water or an aqueous solution, comprising adding a sodium salt of 3,5-dibromo-4,2-trosobenzenesnolephonic acid (hereinafter, referred to as DBN BS) to a sample, and adding the hydrogen radical to the sample.
  • DBN BS 3,5-dibromo-4,2-trosobenzenesnolephonic acid
  • electrolytically reduced water is suitably used as the water or the aqueous solution.
  • the coloring utilizes a coloring reaction in which sodium salt of 3,5-jibu-mouth 4-ethrosobenzenesulfonic acid (DBNBS) reacts with a hydrogen radical to form a DBNB Sazo compound.
  • the coloring is caused by absorption peaks at wavelengths of 425 to 450 nm.
  • the present invention is also a method for quantitatively analyzing hydrogen radicals in water or an aqueous solution, comprising the following steps (1) to (4).
  • the water or the aqueous solution is preferably concentrated so as to have a hydrogen radical concentration of 10 to 500 times.
  • the method for detecting hydrogen radicals utilizes light absorption characteristics based on the following reaction. Things. That is, the sodium salt of 3,5-dibromo_4-1-2trosobenzenesulfonic acid (DBNBS) reacts with hydrogen radicals to produce DBNBS azo compounds. Since the DBNB Sazo compound has an absorption peak at a wavelength of 425 to 450 nm, hydrogen radicals can be detected by its coloring. Equation A Equation B
  • DBNBS (Formula A) reacts with hydrogen radicals in water or an aqueous solution to form DBNBS— ⁇ ⁇ (Formula B), and two molecules of which react to form a dimer (Formula C) Generate After that, it is dehydrated under heating to produce DBNB S-azoxy compound (Formula D). One more oxygen is removed to form a stable DBNB Sazo compound (Formula E). By detecting the absorption at 425 to 450 nm derived from the DBNB Sazo compound, qualitative analysis of hydrogen radicals becomes possible.
  • DP PH is a stable free radical having specific absorption at a wavelength near 517 nm. DPPH reacts quantitatively with hydrogen radicals and the absorption around 517 nm disappears.
  • granular platinum black has a large surface area and converts gaseous hydrogen molecules into hydrogen radicals (atomic hydrogen) and retains them. For this reason, hydrogen radicals can be easily generated by blowing hydrogen gas in the presence of platinum black in a solution. Therefore, by injecting hydrogen gas into a DPPH aqueous solution of a predetermined concentration under certain conditions in the presence of platinum black, a calibration curve (A) showing the relationship between the injection time and the decrease in the absorbance of DPPH at 517 nm was obtained. Can be created.
  • a reducing substance known to react quantitatively for example, cysteine
  • DPPH cysteine
  • cysteine concentration and DPPH Create a calibration curve (B) showing the relationship with the decrease in absorbance at around 517 nm. Assuming that one mole of cysteine corresponds to one mole of hydrogen radical, calculate the concentration of hydrogen radical generated per hydrogen gas blowing time from the calibration curve (A).
  • DBNB S (Formula A) reacts with a hydrogen radical to undergo a dihydroxy intermediate of Formula B (DBNBS- ⁇ ⁇ ) and a dimer thereof (Formula C) to form a DBNB S azo compound (Formula A).
  • D is generated.
  • the specific absorption of the DBNB Sazo compound at around 450 nm is used for quantitative analysis.
  • hydrogen gas is blown in the presence of platinum black
  • the generation of hydrogen radicals is as described above.Therefore, by determining the relationship between the absorbance near 450 nm and the injection time of hydrogen gas, the calibration curves (A) and (B) were used.
  • a calibration curve (C) showing the relationship between the absorbance near 450 nm and the concentration of hydrogen radicals can be obtained.
  • DBN BS is added to the sample solution at a predetermined concentration
  • DBNB S reacts with hydrogen radicals to generate a DBNB S azo compound, and the absorbance around 450 nm is obtained. Is measured, and the hydrogen radical concentration is measured from the calibration curve (C).
  • electrolytically reduced water When electrolytically reduced water is used as a sample, it is preferable to use it after concentrating it 10 to 500 times.
  • a DBNB S preservation solution is added to 125 ml of electrolytic reduced water by adding 200 1 and the mixture is stirred, and then concentrated to dryness in a 60 ° C constant temperature bath using a rotary evaporator. This is concentrated and dried with lm l of ultrapure water (Milli Q water) to recover. Next, keep the solution in a 60 ° C constant temperature bath for about 1 hour, leave it on ice for 5 minutes, and centrifuge at 12,000 rpm, for example, to obtain a supernatant.
  • Milli Q water ultrapure water
  • FIG. 1 is a graph showing the absorption characteristics of a BNBS azo compound.
  • Figure 2 is a graph showing the relationship between the hydrogen gas injection time at 450 nm and the absorbance.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the electrolytic reduced water and the hydrogen radical reaction value.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of sodium salt and the hydrogen radical reaction value.
  • FIG. 5 is a chart showing the HPLC measurement results of the DBNBS non-heat-treated reaction product.
  • FIG. 6 is a chart showing an ultraviolet-visible absorption spectrum of a DBNBS non-heat-treated reaction product.
  • FIG. 7 is a chart showing the results of HPLC measurement of the reaction product of the DBNBS heat treatment.
  • FIG. 8 is a chart showing an ultraviolet-visible absorption spectrum of the reaction product of the DBNBS heat treatment.
  • FIG. 9 is a mass spectrum measurement chart of the reaction product of the DBNBS non-heating treatment.
  • FIG. 10 is a mass spectrum measurement chart of the reaction product of the DBNBS heat treatment.
  • FIG. 11 is an NMR spectrum measurement chart of the DBNBS non-heat-treated reaction product.
  • FIG. 12 is an NMR spectrum measurement chart of the DBNBS heat treatment reaction product.
  • FIG. 13 is a graph showing a calibration curve A.
  • FIG. 14 is a graph showing a calibration curve B.
  • FIG. 15 is a graph showing a calibration curve C. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • DBNB S was manufactured by Labotech Co., Ltd., platinum black was manufactured by Ishifuku Metal Mining Co., Ltd., and hydrogen gas was manufactured by Taiyo Sanso Co., Ltd.
  • DBNB S was dissolved in ultrapure water (Milli Q water) at a concentration of 12.5 mg / ml, stored at 4 ° C, and used up within 2 weeks.
  • the hydrogen gas becomes atomic hydrogen on the platinum surface. Therefore, hydrogen gas was blown at a blowing rate of 45 m 1 / min into 20 ml of a 2.5 mg / m 1 DBNBS solution containing 0.5 mg / ml of white gold and black. After 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, and 60 minutes, 200 1 each was collected, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was kept in a thermostat at 60 ° C for 1 hour. . As a control, a sample not injected with hydrogen gas was kept at 60 ° C for 1 hour.
  • the measurement of the difference spectrum is for detecting that the DBNBS has been changed to a new substance by the platinum black hydrogen treatment.
  • Platinum black only, hydrogen gas only, nitrogen gas only, and platinum black-nitrogen gas treatment were performed to determine whether DBNBS specifically reacts with hydrogen radicals generated by the platinum black hydrogen treatment.
  • Example 2 Detection of hydrogen radicals in electrolytically reduced water using DBNB S
  • the 0.01% NaC1 water was electrolytically reduced at a level 4 (5 A) with an electrolytic reduction water system TI-8000 manufactured by S-Trim Co., Ltd. to obtain electrolytic reduced water on the cathode side.
  • DBNB S stock solution was added to 125 ml of electrolytic reduced water with 200 ⁇ 1 kneaded, stirred, and then concentrated to dryness in a 60 ° C constant temperature bath using a rotary evaporator.
  • the concentrated solid was dissolved in ultrapure water (Milli Q water) of lm1 and collected. Next, the mixture was kept in a constant temperature bath at 60 ° C for 1 hour, allowed to stand on ice for 5 minutes, and centrifuged at 12,000 rpm to obtain a supernatant.
  • the DBNBS sample similarly performed with the above ultrapure water was subjected to calibration, and the DBNBS sample was scanned at a wavelength of 350 to 600 nm to obtain a difference spectrum.
  • Example 3 Relationship between concentration of electrolytically reduced water and hydrogen radical reaction value, and relationship between electrolysis intensity and hydrogen radical reaction value
  • Electrolytically reduced water was electrolytically reduced at level 4 (5 A) with an electrolytic reduced water system T 1-8000 manufactured by Nippon Trim Co. to obtain reduced water on the cathode side.
  • Fig. 4 shows the results of electrolytic reduction water obtained by changing the salt concentration (NaCl concentration) of the aqueous solution in order to create an aqueous solution in which the electrolysis strength is changed when electrolytically reduced water is obtained by electrolysis.
  • the hydrogen radical reaction value increased with the electrolytic strength (Na C 1 concentration). This means that more hydrogen radicals are generated by increasing the electrolytic strength.
  • DBNB S was manufactured by Labotec Co., Ltd.
  • platinum black powder M type was manufactured by Ishifuku Metal Mining Co., Ltd.
  • hydrogen gas was manufactured by Taiyo Sanso Co., Ltd.
  • the non-heat-treated reaction intermediate was separated from the HPL, and the azo compound separated by heat treatment was the same as that used in NMR and TOF-MASS analysis.
  • HPLC Waters 600E from Waters, mobile phase: Milli-Q3 ⁇ 4ter, flow rate: 5 ml / mi ⁇ , injection volume: 2000 ⁇ l, collected using a Waters717 autosampler, column: Waters Nova-Pak C18 19 ⁇ 30 Omm was used.
  • a Waters996 photodiode array detector from Waters was used as the detector, and data was acquired at 1.2 nm intervals in the wavelength range of 200-600 nm.
  • the analysis by the spectrum chromatography was performed using a Compaq V700 personal computer with a program created by Millennium 32 (Waters).
  • Voyager Perceptive, Biosystems
  • Voyager is a laser ionization time-of-flight mass spectrometer equipped with a nitrogen laser (337 nm) and an acceleration voltage of 20 kV. The acceleration voltage was set to 20 kV, and the flight mode was analyzed in the rare mode.
  • As a matrix 1.3 mg of 2- (4-hydroxy-monophenylazo) monobenzoic acid (HABA) (manufactured by Aldrich Chemical Co., Ltd.) was used in 50:50 water 'acetonitrile lm1' at an early stage. After 0.51 of the sample was applied to the sample slide and air-dried, the same amount of matrix solution was added to the sample slide, air-dried again, and introduced into the ion source.
  • HABA 2- (4-hydroxy-monophenylazo) monobenzoic acid
  • the unheated D BNBS reactant having an absorption at 280 nm obtained in the above HP LC measurement was measured using mass spectrometry (MALD I-TOF-MS).
  • the heat-treated DBNBS reactant having absorption at 450 nm obtained in the above HP LC measurement was measured using a mass spectrum (MALD I-TOF-MS).
  • FIG. 11 shows the results of measuring the BNBS reaction product using 1H-NMR.
  • Figure 11 shows the spectrum of the unheated DBNB S reactant with absorption at 280 nm, acetylated.
  • the acetic anhydride used for acetylation which was similarly collected by HPLC analysis, was measured.
  • the presence of a methyl group at a chemical shift of 2.0 ppm showed that the sample was not heated. This indicates that the hydroxyl group of the DBNB S reactant and acetic anhydride reacted directly.
  • FIG. 12 shows the results of measurement of the heat-treated DBNBS reactant having an absorption at 450 nm obtained by the above HP LC measurement, using 1H-NMR.
  • the proton and chemical shifts of the heat-treated DBNB S reactant with absorption at 450 nm are 6.8, 6 to 6.8 p pm and the signals at 6.7575 ppm and 6.634 ppm are split into one more symmetric signal to the left and right. This indicates that the proton at the meta position became asymmetric with the formation of the azo group, and further coupling occurred between the protons.
  • FIG. 13 was obtained as a graph (calibration curve A) showing the relationship between the decrease in absorbance and the blowing time.
  • FIG. 14 is obtained as a graph of the calibration curve B.
  • the electrolytic reduced water was adjusted to pH 7.0, and samples of level 1 to level 4 were prepared depending on the production conditions.
  • an aqueous solution containing NaOH was introduced into each of the cathode chamber and the P-electrolyte chamber separated by a diaphragm, and electricity was supplied between the cathode and the anode, and the NaOH aqueous solution was electrolyzed. Decomposed and obtained in the cathode chamber.
  • the redox potential (ORP) and pH are shown in Table 1.
  • Ultrapure water (Milli Q water) was used as a control.
  • the absorbance of the sample at a frequency of 450 nm was measured.
  • three samples were measured for the same sample, and the average value was obtained.
  • Table 1 shows the measurement results of the absorbance.
  • the colored substance produced as a result of the reaction between the electrolytically reduced water and DBNBS may be the same substance as the DBNBS azo compound generated when hydrogen gas is blown in the presence of platinum black. It was identified from the elution position and the ultraviolet-visible absorption spectrum.
  • the average absorbance at 450 nm of the Milli Q aqueous solution of DBNB S used as a control was subtracted from the absorbance of the sample at each level at 450 nm, and the hydrogen radical concentration was calculated from the difference in absorbance using the calibration curve (C). I asked.
  • the concentration of hydrogen reduced in the 125 times concentrated electrolytically reduced water is in the range of 7 to 34 ⁇ ⁇ ( ⁇ mo 1/1) at the level of 1 to 4.

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Description

明細書 水素ラジカルの検出方法及び定量分析方法 技術分野
本発明は、 水、 特に電解還元水または水溶液中の水素ラジカルの検出方法、 及 び水素ラジカルの濃度を定量分析する方法に関する。 背景技術
従来、 水酸化ナトリゥム等の電解質溶液を電気分解して陰極室で得られる、 い わゆる電解還元水は、 体内で活性酸素消去活性及び D N A切断抑制活性を有する とされている。 これは電解還元水に含まれる活性水素の還元性によるものとされ ている。
そして、 電解還元水等に含まれる水素ラジカルの濃度が体内での活性酸素消去 活性に影響する為、 水素ラジカルの検出方法とともにその定量分析方法の確立が 要請されている。
ここで活性水素とは紫外線照射や放電などの方法によつて化学反応を起こしゃ すくなった水素ラジカルのことであり、 金属に酸を作用させたときや、 電気分解 のときに陰極側から発生する水素も反応性の高い水素ラジカルである。 活性水素 はアルカリ金属塩から金属を遊離させ、 各種金属元素の酸化物、 硫化物などを容 易に還元して金属とする。 またヒ素、 燐、 酸素、 ハロゲン、 アンチモン、 スズな どとは水素化物を、 一酸化炭素及び二酸化炭素とはホルムアルデヒドを作る。 ま た種々の有機ィヒ合物と付加、 置換、 水素原子引き抜き反応を生じ、 不飽和有機化 合物には水素付加をする。 水素ラジカルはそのままでは比較的安定であるが、 金 属表面に触れると極めて多量の熱を放出して通常の分子に戻る。
2 H■→H2+ 4 3 5 k J /m o 1
その検出方法としては高濃度の場合は圧力差から、 微量の場合は酸化タングス テンの変色などが利用されている。 しかしこれらは気体中で発生した際の検出方 法で水中の水素ラジカルの測定に応用できない。 水素ラジカルは水溶性のラジカ ルトラップ剤でトラップして検出及び定量ができれば電解還元水中に水素ラジカ ルの存在を証明できるので検出法及ぴ定量法の確立を目指して研究が進められて いた。
そこで電子スピン共鳴装置 （ESR) を用いて水試料のみや水溶性のラジカル トラップ剤 5， 5—ジメチルー 1—ピロリン一 N—ォキシド （DMPO) と水溶 液試料と反応させ、 ESRスぺクトルを測定したが水素ラジカルのスぺクトルは 認、められなかった。
またフェントン試薬で水酸化ラジカルを発生させて水溶液試料の還元力による 水酸ィ匕ラジカルの減少を E S Rスぺクトルで確認することを試みたが明確な差が 認められなかった。 これらのことから電解還元水中の水素ラジカルの濃度が低い ために検出感度が低い方法では検出が困難と考えられた。 発明の開示
本発明は水または水溶液に存在する水素ラジカルを高精度で検出する方法及ぴ その定量分析方法を提供する。 発明者は大量の水試料を中和し、 ラジカルトラッ プ剤である 3, 5—ジブロモ一 4一-トロソベンゼンスルフォン酸のナトリゥム 塩 （DBNB S) と反応させた後、 ロータリーエバポレーターで濃縮することを 試みた。 その結果活性酸素消去活性の認められた電解還元水試料においては橙色 の着色が認められた。 しかし超純水 （Milli Q水） や他のミネラルウォーターや 水道水では着色が認められなかった。 このことは DBNB Sが電解還元水中の活 性水素と反応し新たに着色物質を作るからではないかと考えられた。 この現象を 利用し、 水溶液中の水素ラジカルを高精度で検出できると考え、 水素ラジカルの 検出法及び定量分析法の開発を行なった。 本発明は上記知見に基くもので、 電解 還元水等にラジカルトラップ剤として 3, 5—ジブ口モー 4一エトロソベンゼン スルフォン酸のナトリウム塩 （DBNB S) を使用して、 水素ラジカルの検出、 及び定量分析方法を提供する。
本発明は水または水溶液中の水素ラジカルの検出方法であって、 試料に 3， 5 一ジブロモ _ 4一二トロソベンゼンスノレフォン酸のナトリウム塩 （以下、 DBN BSという） を添加し、 これが水素ラジカルとの反応することにより DBNBS ァゾ化合物を生成し、 その吸収特性に基く着色によって水素ラジカルを検出する 方法である。
ここで前記水、 または水溶液は電解還元水が好適に用いられる。
また前記着色は 3, 5—ジブ口モー 4ーェトロソベンゼンスルフォン酸のナト リウム塩 （DBNBS) が水素ラジカルと反応し、 DBNB Sァゾ化合物を生成 する着色反応を利用する。 そして、 着色は波長が 425〜450 nmの吸収ピー クに起因する。
本発明は、 また次の （1) 〜 （4) の工程よりなる水または水溶液中の水素ラ ジカルの定量分析方法である。
(1) 51 7 nm近傍に吸収を有する 1 , 1ージフエニル一 2—ピクリルヒド ラジル （以下、 DPPHという） の溶液に、 白金黒存在下で一定の速度で水素ガ スを吹込み、 517 nm近傍の吸光度の減少と水素ガスの吹込み時間との相関の グラフを求める （検量線 Aの作成） 。
(2) システィンと DP PHを反応させ、 DPPHの 517 nm近傍における 吸光度の減少とシスティン濃度との相関のグラフを求める （検量線 Bの作成） 。 なお、 ここでシスティンにかえてァスコルビン酸などの還元剤を用いることがで 含る。
(3) 3， 5_ジブロモ一 4—ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩 (DBNB S) の溶液に前記 （1) と同一条件で白金黒存在下で一定の速度で水 素ガスを一定の時間吹込んだ後、 450 nm近傍の吸光度を測定し、 その吸光度 の値と検量線 A及び検量線 Bより算出した水素ガスの吹込み時間あたりの水素ラ ジカル発生濃度との相関のグラフを求める （検量線 Cの作成） 。
(4) 試料に 3， 5—ジブ口モー 4一^トロソベンゼンスルフォン酸のナトリ ゥム塩 （DBNBS) を添加し、 450 nm近傍の吸光度を測定し、 その吸光度 の値から前記検量線 Cを用いて水素ラジカルの濃度を読み取る。
ここで水または水溶液は 10〜500倍の水素ラジカル濃度になるように濃縮 されることが好ましい。
以下、 本発明の実施の形態に基づき説明する。
本発明で水素ラジカルの検出方法は次に示す反応に基く光吸収特性を利用する ものである。 即ち、 3， 5—ジブロモ _4一二トロソベンゼンスルフォン酸のナ トリウム塩 （DBNB S) が水素ラジカルと反応し、 DBNBSァゾ化合物を生 成する。 そして DBNB Sァゾ化合物は波長が 425〜450 nmの吸収ピーク を有するため、 その着色によって水素ラジカルを検出できる。 式 A 式 B
Figure imgf000006_0001
反応式で示すと、 DBNBS (式 A) は水又は水溶液中の水素ラジカルと反応 して、 DBNBS— Η · (式 B) となり、 その 2分子が反応して二量体 （式 C) を生成する。 その後加熱下で脱水して DBNB Sァゾキシ化合物 （式 D) が生成 する。 更に 1個の酸素がとれて安定な DBNB Sァゾ化合物 （式 E) が生成する。 この DBNB Sァゾ化合物に由来する 425〜450 nmの吸収を検出すること により、 水素ラジカルの定性分析が可能となる。 上記式 A〜式 Eの一連の反応は 発明者によって初めて見出された新規な反応であるが、 ニトロベンゼン及びニト 口ソベンゼンの還元反応によりァゾキシベンゼン及びァゾベンゼンを生じる類似 の反応カ矢卩られて ヽる。 (A. Streitwieser, Jr. &C. H. Heathcock： Introduction to Organic Chemistry, pp960— 965, Macmi丄丄 an Publishing co. , Inc. , New York (1976)) 。 ァゾキシベンゼンとァゾベンゼンは酸化還元反応により相互に変 換されうる。
次に水又は水溶液中の水素ラジカルの定量分析は次の方法による。
DP PHは 5 17 nm近傍の波長に特異吸収を有する安定なフリーラジカルで ある。 DPPHは水素ラジカルと定量的に反応し、 51 7 nm近傍の吸収が消失 する。 一方、 粒状白金黒は大きな表面積を有し、 ガス状の水素分子を水素ラジカ ル （原子状水素） に変換してそれを保持する。 そのため溶液中で白金黒の存在下 で水素ガスを吹込むことにより、 容易に水素ラジカルを発生させることができる。 そこで白金黒存在下で一定条件で所定濃度の D P P H水溶液に水素ガスを吹込む ことにより、 その吹込み時間と DP PHの 51 7 nmでの吸光度の減少との関係 を示す検量線 （A) が作成できる。
次に、 水素ガスの吹き込み時間あたりの水素ラジカルの発生濃度を算出する為 に、 定量的に反応することが知られている還元性物質、 例えばシスティンと、 D PPHを反応させ、 システィン濃度と DPPHの 517 nm近傍における吸光度 の減少との関係を示す検量線 （B) を作成する。 1モルのシスティンが 1モルの 水素ラジカルに相当すると仮定して、 検量線 (A) から水素ガスの吹き込み時間 あたりに発生した水素ラジカル濃度を算出する。
一方、 前述の如く DBNB S (式 A) は水素ラジカルと反応して、 式 Bのジヒ ドロキシ中間体 （DBNBS—Η · ) 及びその二量体 （式 C) を経て DBNB S ァゾ化合物 （式 D) を生成する。 そして DBNB Sァゾ化合物の 450 nm近傍 における特異吸収を定量分析に使用する。 白金黒存在下で水素ガスを吹き込むと 水素ラジカルが発生することは前述のとおりであり、 したがって、 450 nm近 傍の吸光度と水素ガスの吹込み時間の関係を求めることにより、 検量線 (A) 及 び検量線 (B) を用いて 450 nm近傍の吸光度と水素ラジカルの濃度の関係を 示す検量線 (C) を求めることができる。
そこで試料中の水素ラジカル濃度を求めるには、 試料溶液に所定濃度の DBN B Sを添加し、 DBNB Sと水素ラジカルを反応させ DBNB Sァゾ化合物を生 成させた後、 その 450 nm近傍の吸光度を測定し、 前記検量線 （C) から水素 ラジカル濃度を測定する。
試料として電解還元水を用いる場合、 これを 10〜500倍に濃縮して使用す ることが好ましい。 例えば電解還元水 1 25m lに DBNB S保存液を 200 1添力 Pし、 攪抨した後、 ロータリエバポレーターで 60°Cの恒温槽にて濃縮乾固 する。 これを lm lの超純水 （Milli Q水） で濃縮乾固物を溶解して回収する。 次に 60 °C恒温槽にて約 1時間保温し、 氷上に 5分間静置し例えば 1 2， 000 r pmで遠心分離して上清を得る。. 図面の簡単な説明
図 1は、 BNBSァゾ化合物の吸収特性を示すグラフである。
図 2は、 450 nmにおける水素ガス吹き込み時間と吸光度の関係を示すグラ フである。
図 3は、 電解還元水と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。
図 4は、 塩ィ匕ナトリゥム濃度と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。 図 5は、 D B NB S非加熱処理反応物の HP L C測定結果を示すチャートであ る。
図 6は、 DBNB S非加熱処理反応物の紫外可視吸収スぺクトルを示すチヤ一 トである。
図 7は、 DBNB S加熱処理反応物の H P L C測定結果を示すチヤ一トである。 図 8は、 DBNB S加熱処理反応物の紫外可視吸収スぺクトルを示すチヤ一ト である。
図 9は、 DBNB S非加熱処理反応物のマススぺクトル測定チャートである。 図 10は、 DBNB S加熱処理反応物のマススぺクトル測定チャートである。 図 1 1は、 DBNB S非加熱処理反応物の NMRスぺク トル測定チャートであ る。
図 12は、 DBNB S加熱処理反応物の NMRスぺクトル測定チャートである。 図 13は、 検量線 Aを示すグラフである。
図 14は、 検量線 Bを示すグラフである。
図 1 5は、 検量線 Cを示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ： DBNB Sを用いた白金黒一水素による水素ラジカル発生の検出 1— 1 試薬
DBNB Sはラボテック （株） 製を、 白金黒は石福金属鉱業 （株） 製を、 水素 ガスは大洋サンソ (株） 製を使用した。 DBNB Sは超純水 （Milli Q水） に 1 2. 5mg/m 1の濃度で溶解し 4°Cに保存し、 2週間以内に使い切るようにし た。
1-2 白金黒一水素による水素ラジカル発生
水素ガスは白金表面上で原子状の水素になる。 そこで 0. O lmgZm lの白 金黒を含む 2. 5 m g /m 1の D B N B S溶液 20 m 1に 45 m 1 /m i nの吹 き込み速度で水素ガスを吹きこんだ。 5分、 10分、 15分、 30分、 45分、 60分後にそれぞれ 200 1ずつ回収し 12, 000 r p m、 5分間遠心分離 後、 上清を 60 °Cの恒温槽にて 1時間保温した。 コントロールとしては水素ガス を吹き込ませなかったものを 60°Cで 1時間保温処理した。
1-3 水素ラジカルの検出
反応後のコントロールの D BNB S水溶液をキヤリプレーシヨンし、 DBNB S自身の吸光度を 0とし、 各 DBNB S試料の 350〜600 nmの波長をスキ ヤンし差スぺクトルを得た。 この差スぺクトルの測定は白金黒一水素処理によつ て DBNB Sが新たな物質に変化したことを検出するためである。 また白金黒一 水素処理によつて生成する水素ラジカルに D B N B Sが特異的に反応するかを調 ベるために白金黒のみ、 水素ガスのみ、 窒素ガスのみ、 白金黒一窒素ガス処理し
7 訂正された用紙 （規則 91) た試料も行なった。
白金黒一水素反応によって得られた DBNB Sァゾ化合物の試料の吸収スぺク トルは図 1 (P t— H2) に示す如く、 425 nmから 450 nmにピークを持 つなだらかな可視吸収スぺクトルを示した。 それらの試料はオレンジ色に着色し ていた。 このことは白金黒一水素処理によって DBNB Sが新たなオレンジ色の 着色物質である DBNB Sァゾ化合物に変化したことを示す。 そしてそのピーク の高さは図 2に示される如く、 吹き込んだ水素ガス量に依存して增加していき、 45分間吹き込みにおいて最大となり、 その後は減少した。
また白金黒一水素反応特異性を調べるために行なつた白金黒のみ、 水素ガスの み、 窒素ガスのみ、 白金黒一窒素ガス処理した試料では全く着色が認められず、 紫外部吸収においても波形に変化が認められなかった。 水素ラジカルと反応して 得られたものの吸収スぺク トルの 450 nmにおける吸光値を水素ラジカル反応 値 （AH値） とした。
実施例 2 ： DBNB Sを用いた電解還元水中の水素ラジカルの検出
2-1 試薬
実施例 1と同じものを用いた。
2-2 電解還元水
0. 01 %N a C 1水を S本トリム社製の電解還元水装置 T I— 8000でレ ベル 4 (5 A) で電解還元し、 陰極側の電解還元水を得た。
2— 3 水素ラジカルの検出
電解還元水 125m lに DBNB S保存液を 200 ^ 1添カ卩し、 攪拌した後、 ロータリエバポレーターで 60°Cの恒温槽にて濃縮乾固した。 lm 1の超純水 (Milli Q水） で濃縮乾固物を溶解し、 回収した。 次に 60°C恒温槽にて 1時間 保温し、 氷上に 5分間静置し、 1 2, 000 r pmで遠心分離し、 上、清を得た。 コントロールとして上記超純水で同様に行なった D B NB S試料をキヤリブレー シヨンし、 DBNB S試料の 350〜600 n mの波長をスキャンして差スぺク トルを得た。
実施例 1で求めた吸収スぺクトルと同様のスぺクトルが電解還元水において認 められ （図 1 ：電解還元水） 、 電解還元水中に水素ラジカルが存在することが確 認された。
実施例 3 ： 電解還元水の濃度と水素ラジカル反応値の関係及び電解強度と水 素ラジカル反応値の関係
電解還元水の濃度と水素ラジカル量の相関関係があるかどうかを試験した。 電 解還元水を超純水 （Milli Q水） で希釈して、 それぞれ試料の水素ラジカル反応 値を測定した。 また電解強度と水素ラジカル反応値との関係を調べるために N a C 1濃度が 0. 0001 %から 0. 01 %までの水を用意し、 それぞれを電解還 元した水の活性水素反応を測定した。 電解還元水は日本トリム社製の電解還元水 装置 T 1 -8000でレベル 4 ( 5 A) で電解還元し、 陰極側の還元水を得た。 電解還元水の％体積が 25、 50、 75、 100 %の水を希釈により作成し、 水素ラジカル反応値を測定したところ、 図 3に示す如く電解還元水の濃度ととも に水素ラジカル反応値が上昇していたので、 この測定系は電解還元水の試料にお いても定量性があることが明らかとなった。 また電気分解で電解還元水を得る際 の電解強度を変化させた水溶液を作成するために、 水溶液の塩濃度 （Na C l濃 度） を変えて得られた電解還元水においては図 4に示す如く、 電解強度 （Na C 1濃度） とともに水素ラジカル反応値も上昇した。 このことは電解強度を強くす ることによって水素ラジカルも多く発生することを意味する。
実施例 4 ： 水素ラジカルと D B N B Sとの反応過程の解析
4- 1 試料
DBNB Sはラボテック （株） 製、 白金黒粉末 Mタイプは石福金属鉱業 （株） 、 水素ガスは大洋サンソ （株） 製のものをそれぞれ用いた。
4-2 DBNBSの反応
0. 0 lmgZm 1の白金黒を含む 2. 5 m g /m 1の D B N B S溶液 20 m 1に 45 m 1 Zm i nの吹き込み速度で水素ガスを 1時間吹き込み、 加熱処理し ないものと、 60でで 1時間加熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを 分析試料に用いた。
4-3 分析試科の調整
(1) 高速液体クロマトグラム （HPLC) 分析試料
分析試料をそれぞれ 0. 45 /mのフィルタで濾過し、 その 2000 /x lを用 いた。
(2) NMR、 T〇F— MAS S分析における分析試料
HPLCより、 分離した非加熱処理である反応中間体は、 無水酢酸 （和光純薬 (株） 製） を用いァセチル化し安定化させたものを用い、 加熱処理により分離さ れたァゾ化合物は、 再度 HPLC分取することにより分離度を完全なものにして 用いた。
( 3 ) 微量元素分析における分析試料
非加熱処理の反応中間体は HP Lじより分離したもの用い、 加熱処理により分 離されたァゾ化合物は NMR、 TOF— MAS S分析と同様のものを用いた。
4-4 機器測定条件
( 1 ) H P L Cは Waters社の Waters600E、 移動相は Milli- Q¾ter、 流速は 5m l /m i ιι、 注入量は、 Waters717 のオートサンプラーで採取した 2000 μ 1、 カラムは Waters社製 Nova- Pak C 18 1 9 X 30 Ommを用いた。 ま た検出器には Waters社の Waters996フォトダイォードアレイ検出器を用い 20 0-600 n mの波長領域において 1. 2 n m間隔でデータを取込んだ。 スぺク トノレクロマトグラムによる解析は、 コンパック V 700パーソナルコンピュータ を用いミレニアム 32 (Waters社） で作成したプログラムで行なつた。
(2) TO F— MAS S分析計は、 Voyager (パーセプティブ、 バイオシス テム社） を使用した。 Voyager は、 窒素レーザ （337 nm) を搭載した、 加速 電圧 20 kVのレーザイオン化飛行時間型質量分析装置である。 加速電圧は、 2 0 k Vを使用し、 飛行モードはリユアモードで分析を行なった。 マトリックスは、 2— (4—ヒドロキシ一フエニルァゾ） 一安息香酸 （HABA) (アルドリッチ ケミカル社製） 1. 3m gを、 50 ： 50水 'ァセトニトリノレ lm 1に溶角早し使 用した。 試料スライドに 0. 5 1の試料を塗布して自然乾燥した後、 同量のマ トリックス溶液を添カ卩し、 再度自然乾燥してイオン源に導入した。
(3) NMRは、 400MHz NMR (J EOL JNM-GS 400 NMRシステムスぺクトロメータ） を使用し、 1H— NMR測定を行なった。 溶 媒として、 ジメチルスルフオキサイド （DMSO) (和光純薬 （株） 製） 及びデ ユートリウムォキシド （D20) (アルドリッチケミカル社製） を使用した。 4-5 解析結果
(A) 高速液体クロマトグラム （HPLC) 測定結果
( i ) 分析試料 （ 1 )
0. 0 lmg/m 1の白金を含む 2. 5 m g /m 1の D B N B S溶液 20 m 1 に 45m 1 Zm i nの吹き込み速度で水素ガスを 1時間吹き込み、 0. 45 μπι のフィルタで濾過し、 その 2000 μ 1をフォトダイオードアレイ検出器付き Η PL。用いて、 非加熱処理の試料を測定した。 その測定結果を図 5に示す。 図 5 において非加熱処理の D B N B S反応物の保持時間約 9. 0分に認められるピー クは図 6にその紫外可視吸収スぺク トルを示したように、 220 nmに吸収ピー クを示し、 450 nmには吸収を示さなかった。 これは式 Cに示される二量体に 相当すると推定ざれた。
(ii) 分析試料 (2)
0. 01 mg/m 1の白金を含む 2. 5 m g /m 1の D B N B S溶液 20 m 1 に 45 m 1 Zm i nの通気速度で水素ガスを 1時間吹き込み、 60°Cで 1時間加 熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを 0. 45 ^ mのフィルタで濾過 し、 その 200 Ομ 1をフォトダイオードアレイ検出器付き HP LC用いて、 カロ 熱処理の試料を測定した。 測定結果を図 7に示す。 図 7において加熱処理の DB N B S反応物の保持時間 8. 5分に認められるピークは図 8にその紫外可視吸収 スぺクトルに示したように、 320 nm及び 450 n mに吸収ピークが認められ、 既知のァゾベンゼンに類似した紫外線吸収スペク トルを示した。 これは式 Eで示 される DBNB Sァゾ化合物に相当する。
(B) マススペク トル （MALD I— TOF—MS) の測定結果
( i ) 分析試料 （ 1 )
上記 HP LC測定において得られた、 280 nmに吸収を有する非加熱処理 D BNBS反応物を、 マススペク トル （MALD I—TOF—MS) を用いて測定 した。
ァセチルイ匕した 280 nmに吸収を持つ非加熱処理の DBNB S反応物のマス スペク トルは図 9に示す如く m/z 675. 449にイオンピークが示され、 こ れは中間体 （式 C) より B r及び Naが 1つ脱離し、 式 Cの中間体のヒドロキシ ル基が 1っァセチル化したものと一致した。
(ii) 分析試料 （2)
上記 HP LC測定において得られた 450 nmに吸収を有する加熱処理 DBN B S反応物をマススペク トル （MALD I— TOF—MS) を用いて測定した。
450 nmに吸収を有する加熱処理の DBNB S反応物のマススぺクトルが図
10に示す如く m/z 656. 329にイオンピークが示され、 N aが 2つ脱離 した DBNB Sァゾ化合物 （式 E) と一致した。
(C) NMR測定結果
( i ) 分析試料 （ 1 )
上記 HP LC測定において得られた、 280 nmに吸収を有する非加熱処理 D
BNB S反応物を、 1H— NMRを用いて測定した結果を図 1 1に示す。 図 1 1 からァセチル化した 280 nmに吸収を有する非加熱処理 DBNB S反応物のス ぺクトルが示されている。 コントロールとしてァセチル化に用いた無水酢酸を同 様に H P L C分取により採取したものを測定した。 コント口ールの無水酢酸のメ チル基が 2. 5 p pmにシグナルを示したのに比較して、 ケミカルシフト 2. 0 p pmにメチル基の存在が示されたことにより、 非加熱処理 DBNB S反応物の ヒドロキシル基と無水酢酸が直接反応が生じたことを示している。
(ϋ) 分析試料 (2)
上記 HP L C測定において得られた、 450 nmに吸収を有する加熱処理 D B NB S反応物を、 1H— NMRを用いて測定した結果を図 1 2に示す。 DBNB S力 8. 0 p pmに 1本のシグナルを示したのに比較して、 450 nmに吸収を 有する加熱処理の DBNB S反応物のプロトン、 ケミカルシフトは 6., 6〜6. 8 p pmであり、 6. 7575 p pm及び 6. 634 p p mのシグナルは左右に さらに 1本づつの対称なシグナルに分裂している。 これはァゾ基の形成にともな つて、 メタ位のプロトンが非対称となり、 さらにプロトン間にカップリングが生 じたことを示している。
(D) 微量元素分析結果
( i ) 分析試料 （ 1 )
上記 HP LC測定において得られた、 220 nmに吸収ピークを有する非加熱 処理 DBNBS反応物を、 微量元素分析した。 炭素含量 1 9. 93% (計算値 1 9. 35°/。） 、 水素含量 1. 6 1 % (計算値 1. 61%) 、 窒素含量 3. 76% (計算値 3. 76 %) となつた。 これは中間体の 3水和物より、 N aが 2つ脱離 したものと一致する。
(ii) 分析試料 （2)
上記 H PLC測定において得られた、 450 nmに吸収を有する加熱処理 DB NBS反応物を、 微量元素分析した。
炭素含量 21. 53% (計算値 21. 43 %) 、 水素含量 1. 73% (計算値 1. 79%) 、 窒素含量 3. 84% (計算値 4. 17%) となった。 これは DBNB Sァゾ化合物の 4水和物より、 B r及び N aが 1つずつ脱離したものと一致する。 実施例 5 ： 水素ラジカルの定量分析
5- 1 検量線 Aの作成 （ 1 , 1—ジフエ二ルー 2—ピクリルヒ ドラジル （D PPH) と水素ガス吹込み時間との関係）
0. 1Mの酢酸緩衝液 （pH5. 5) 1. 96m 1にエタノール及び 0. 5m Mの DPPH 'エタノール溶液 lm 1と 1. 0 m g Zm 1の白金黒'酢酸緩衝液 0. 05m 1を加えて全量を 5m 1とし、 45 m 1 Zm i nの速度で水素ガスを 吹込み、 一定の時間ごとに 200 の試料を採取し、 D P PHの特異吸収である 5 1 7 nmの吸光度を測定し、 吸光度の減少と吹込み時間の関係を示すグラフ (検量線 A) として図 1 3を得た。
5 - 2 検量線 Bの作成
' 0〜： L 00； uMのシスティンと D P PHを反応させ、 D P PHの 517 nm近 傍における吸光度の減少と、 システィン濃度との相関のグラフを求めた。 検量線 Bのグラフとして図 14を得た。
5-3 検量線 Cの作成 （3, 5—ジブ口モー 4一エトロソベンゼンスルフォ ン酸のナトリウム塩ァゾ化合物 （DBNBSァゾ化合物） の吸光度と水素ラジカ ノレ濃度の関係）
0. 0 lmg/m 1の白金を含む 2. 5 m g /m 1の D B N B S溶液 5 m 1に 45m l /m i nの速度で水素ガスを吹込み、 DBNB Sと水素ラジカルを反応 させながら、 一定の時間ごとに 200 1の試料を採取し、 60 °Cで 1時間加温 後、 D^NB Sと水素ラジカルの反応生成物である DBNB Sァゾ化合物の特異 吸収である 450 nmの吸光度を測定し図 15に示す検量線 Cを作成した。
5-4 試料中の水素ラジカル濃度の測定
( 1 ) 試料調製
電解還元水を p H 7. 0に調製し、 その製造条件によりレベル 1〜レべノレ 4の 試料を調製した。 ここで電解還元水は隔膜で隔てられた陰極室と P易極室のそれぞ れに N a OHを含む水溶液を導入し、 陰極と陽極の間に通電し、 前記 N a OH水 溶液を電気分解し、 前記陰極室で得られたものである。 これらの酸化還元電位 (ORP) 及び pHを表 1に示す。 対照例として超純水 （Milli Q水） を用いた。 1 25 m 1の Milli Q水、 レベル 1〜 4の電解還元水のそれぞれに D BNB S ストック溶液 （12. 5πι§ Ίη 1 ) を 200 μ 1加えて、 125倍に減圧濃縮 した。 Milli Q水 lm 1で濃縮後のナス型フラスコの内壁を洗い、 しばらく静置 し溶液を回収した。 回収後の溶液を 60°C湯浴中 （遮光） で加熱し、 その後氷中 で冷却し反応を停止した。 回転速度 1 2000 r pmで 5分間、 遠心分離して上 澄を採取した。
( 2 ) 吸光度の測定
上記試料の周波数 450 nmの吸光度を測定した。 測定は同じ試料について、 それぞれ三個の試料を用いて測定し、 その平均値を求めた。 吸光度の測定結果を 表 1に示す。 HPLCを用いた分析の結果、 電解還元水と D B N B Sとの反応の 結果、 生じた着色物質は、 白金黒存在下で水素ガスを吹き込んだ際に生成する D B N B Sァゾ化合物と同一物質であることが、 溶出位置及び紫外線可視吸収スぺ クトルから同定された。
( 3 ) 水素ラジカル濃度の測定
コントロールとして用いた DBNB Sの Milli Q水溶液の 450 nmでの平均 吸光度 0. 0358を各レベルの試料の吸光度を差し引き、 その差の吸光度の値 から、 検量線 (C) を用いて、 水素ラジカル濃度を求めた。 なお 125倍に濃縮 した電解還元水は水素ラジカル濃度がレベル 1〜4で 7〜34 ^Μ (^mo 1/ 1) の範囲である。 Mill レベル レベル レベル レベル
： Q 1 2 3 4
pn 0. ΟΔ Q 97 Q ΟΛ
V. Ο' 丄 U
酸化還元電位 1
ORP (mV) 1
吸光度 (平均） 0. 03
(4oUnra 0. 0927 0. 1037 0. 0975 0. 1462
58
吸光度の差
(Miir. Qを基準にして） 0. 0569 0. 0679 0. 0617 0· 1104
(125倍濃縮液）
水素ラジカノレ濃度（ M) 17 11 8 34
今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって制限的なも のではないと考えられるべきである。 本発明の範囲は上記した説明ではなくて特 許請求の範囲によって示され、 特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべ ての変更が含まれることが意図される。 産業上の利用分野
上述の水素ラジカルの検出方法及び定量分析方法を採用すれば、 水もしくは水 溶液中での水素ラジカルの微量の存在が検出できるとともに、 その濃度も正確に 測定することが可能となる。 特にこの分析手法を採用することで、 電解還元水に おける水素ラジカルの濃度を容易かつ正確に定量することが可能となる。 したが つてこの分析手法を用いることにより医療分野、 食品分野、 飲料分野等の各種製 品の用途に適用でき、 それらの用途に応じた水素ラジカル （活1生水素） の濃度を 調整した電解還元水を製造できる。 さらに水素吸蔵合金の性能評価にも利用でき る。

Claims

請求の範囲
1. 水、 または水溶液中の水素ラジカルの検出方法であって、 試料に 3, 5—ジ プロモー 4一二トロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩 （DBNBS) を添 加し、 その試料の着色による水素ラジカルの検出方法。
2. 水、 または水溶液は電解還元水である請求項 1記載の水素ラジカルの検出方 法。
3. 着色は 3， 5—ジブ口モー 4 トロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム 塩 （DBNBS) が水素ラジカルと反応して生成する DBNB Sァゾ化合物の吸 収ピークによるものである請求項 1記載の水素ラジカルの検出方法。
4. 波長が 425〜450 nmの吸収ピークを検出することを特徴とする請求項 1記載の水素ラジカルの検出方法。
5. 次の （1) 〜 （4) の工程よりなる水または水溶液中の水素ラジカルの定量 分析方法。
(1) 51 7 nm近傍に吸収を有する 1， 1—ジフエ二ルー 2—ピクリルヒド ラジル （DPPH) の溶液に、 白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込み、 51 7 nm近傍の吸光度の減少と水素ガスの吹込み時間との相関のグラフを求め る （検量線 Aの作成） 。
(2) システィンと DP PHを反応させ、 DP PHの 51 7 nm近傍における 吸光度の減少とシスティン濃度との相関のグラフを求める （検量線 Bの作成） 。
(3) 3， 5—ジブ口モー 4 _二ト口ソベンゼンスルフォン酸のナトリゥム塩 (DBNBS) の溶液に前記 （1) と同一条件で白金黒存在下で一定の速度で水 素ガスを一定の時間吹込んだ後、 45◦ nm近傍の吸光度を測定し、 その吸光度 の値と検量線 A及び検量線 Bより算出した水素ガスの吹込み時間あたりの水素ラ ジカル発生濃度との相関のグラフを求める （検量線 Cの作成） 。
(4) 試料に 3， 5 _ジブロモ— 4—ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリ ゥム塩 （DBNBS) を添カ卩し、 450 nm近傍の吸光度を測定し、 その吸光度 の値から前記検量線 Cを用いて水素ラジカルの濃度を読み取る。
6. 水または水溶液は 10〜500倍に濃縮されている請求項 5記載の定量分析 方法。
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