KR100470825B1

KR100470825B1 - 치료제로서의 엔티티 조합의 동정 방법

Info

Publication number: KR100470825B1
Application number: KR10-2001-7011539A
Authority: KR
Inventors: 브렌트알. 스톡웰; 알렉시스 보리시; 마이클에이. 폴리
Original assignee: 콤비네이토릭스, 인코포레이티드
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2005-03-08
Also published as: BR0102781A; MXPA01006914A; WO2002004946A2; AR029581A1; US20020019011A1; IL144049A0; CN1452719A; JP2002328124A; DK1170591T3; NZ512821A; JP3790447B2; NZ524186A; US20060177877A1; WO2002004946A3; US20020019010A1; EP1170591B1; AU2001271841A1; IL144049A; EP1586900A2; EP1170591A2

Abstract

본 발명은 조합 배열(combinational array)을 사용하여 2-엔티티(2-entity) 또는 더 높은 차수의(higher order) 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝(screening)하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 엔티티들을 제공하는 단계, (b) 엔티티들의 조합 배열을 만드는 단계, (c) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체(moiety)들을 포함하는 시험 엘리먼트(test element)를 제공하는 단계, (d) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (e) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 및 (f) 상기 시험 엘리먼트의 특성에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계.

Description

치료제로서의 엔티티 조합의 동정 방법{METHODS FOR IDENTIFYING COMBINATIONS OF ENTITIES AS THERAPEUTICS}

본 발명은 조합 배열(combinational array)을 사용하여 2-엔티티(2-entity) 또는 더 높은 차수의(higher order) 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝(screening)하는 방법에 관한 것이다.

많은 질병 상태가 다수의 표현형 변화(phenotypic change)와 관련되어 있다. 이는 오랫동안 임상에서 분명했으나, 최근의 유전학 분야에서의 진보는 이러한 관찰 결과를 분자 수준에서 확인해주었다. 예를 들면, 암 세포의 발현 프로파일링(expression profiling)은 복합적인 신체 변이(multiple somatic mutation)에 의해 야기된 수백가지의 유전자 발현 변화를 밝혀내었다. 게다가, 인간 세포 및 조직은 항상성 기전(homeostatic mechanism)을 발전시켜온 결과, 종종 여분의 자가-완충 신호전달 시스템(self-buffering signaling system)을 보유한다. 세포 상태에 변화를 야기하는 자연발생적인 신호들은 종종 단일 표적이 아니라 표적들의 정확한 조합(combination)에 전달된다. 따라서, 다수의 변수들의 알맞은 변화는 매우 특수한 효과를 가질 수 있다.

이와 반대로, 역사적 및 기술적인 이유로 인하여, 제약학, 화학 및 생물학 커뮤니티들은 생물학적 효과를 유발하는 단일의 개별 분자에만 집중해 왔다. 이러한 역사적인 패러다임은 특정 단백질에 영향을 미치는 유기 소분자들(small organic molecules)의 동정(identification)으로 귀결되어, 생물학 및 의학 양자에 유용한 시약들을 제공하여 왔다. 치료상의 관련(therapeutic relevance)을 가지고 있을 수 있고, 화학적인 단백질 녹아웃제(knockout)로 작용하여 단백질 기능의 손실을 야기함으로써 신호 전달 경로를 규명하는데 효과적일 수 있는 이러한 분자들은 단백질의 생물학적 기능에 대한 프로브(probe)로서도 유용하다. 또한, 이러한 소분자들의 특정한 생물학적 표적들과의 상호작용 및 특이적인 생물학적 기능에 영향을 미치는 그들의 능력 때문에, 그들은 또한 치료제 개발을 위한 후보물질로 작용할 수 있다.

어떤 소분자가 생물학적 표적과 상호작용을 할 것인가를 예측하는 것이 불가능하기 때문에, 매우 많은 유기 소분자들을 생산하는데 방대한 노력이 집중되어 왔다. 이들은 이어서 적절한 원하는 특성을 갖는 "다양성 도서관(diverse library)"을 세우기 위해, 그러한 화합물들의 소위 "도서관(library)"으로 집합된다. 그러한 다양성 도서관은 기존의 소분자 콜렉션으로부터 세워지거나 또는 "조합 화학(combinatorial chemistry)"을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 도서관은 활성 분자를 동정하기 위한 감수성 스크리닝(sensitive screen)에 연계될 수 있다(Stockwell et al. Chem. Biol. 1999, 6, 71-83).

많은 경우에, 연구자들은 모든 구성원들이 표적 단백질과 상호작용하는 능력과 같은 특정한 특성을 공유하거나 또는 한 클래스의 천연 화합물들의 특정한 외관을 모방하도록 고안된 특징적인 구조적 특성을 공유하는 편향된 도서관(biased library)을 개발하여 왔다. 예를 들면, 다수의 도서관들이 천연 펩티드의 한 가지 이상의 특징을 모방하도록 고안되어 왔다. 그러한 "의사 펩티드(peptidomimetic)" 도서관은 프탈이미도(phthalimido) 도서관(WO 97/22594), 티오펜(thiophene) 도서관(WO 97/40043), 및 벤조디아제핀(benzodiazepine) 도서관(미국 특허 제 5,288,514호)을 포함한다. 천연 산물을 떠올리게 하는 구조적인 특징을 가지고 있으며 소형화된 세포-기초 검정(miniaturized cell-based assay)에 적합한 한 도서관이 합성되었다(Tan et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8565).

현재의 약물 발견 과정은 대체로 그들이 생물학적 과정에 미치는 영향에 대하여 화합물들을 신속하게 검정하는 능력에 기초한다. 제약 산업에 있어서, 생물학적 분자들 간의 상호작용을 차단하거나, 감소시키거나, 또는 심지어는 증강시키는 화합물들을 동정하는데 주의가 집중되어 왔다. 특히, 생물학적 시스템에 있어서, 수용체 및 그의 단백질 리간드 간의 상호작용은 흔히, 직접적으로 또는 몇몇 하류 이벤트(downstream event)를 통하여, 그 시스템에 그리고 결과적으로는 치료법을 찾고 있는 환자에게 불리하거나 또는 유리한 효과를 초래한다. 따라서, 연구자들은 오랫동안 그러한 수용체/리간드 상호작용을 감소시키거나, 차단하거나, 또는 심지어는 증강시키는 화합물들을 찾아왔다.

고처리량(high throughput)의 스크리닝 시스템이 기존의 생화학적 및 세포-기초 검정법의 처리량 상의 실제적인 제한을 극복하고자 고안되었다. 전통적인 유기 화합물 합성 및 전통적인 생물학적 검정은 상당한 시간, 노력, 및 기술을 요한다. 최대수의 화합물을 스크리닝하기 위해서는 각각의 스크리닝에 드는 시간 및 노력을 감소시키는 것이 필요하다.

이와 같이, 다양한 분자 콜렉션들의 고처리량 스크리닝은 새로운 약학적 제제의 개발을 위한 리드 화합물(lead compound) 검색에 있어서 중요한 역할을 해왔다. 이러한 고처리량 스크리닝에의 입력정보(inputs)는 기존의 화학적으로 합성된 분자들(제약 회사들의 소유물 도서관에 있는 것과 같은), 천연 산물들(미생물 발효 육즙과 같은) 및 조합 화학 기술에 의해 생산된 신규 도서관(Tan et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8565)으로부터 조립된 화합물 도서관이다. 상기 도서관은 최대 백만 개의 화합물들로 구성되며, 이는 리드 약물 후보물질로서 작용하는 원하는 특성을 가진 한 화합물을 발견할 가능성을 증가시켜준다(Tan et al. J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9073-9087).

약물 발견의 전통적인 패러다임을 향상시키면서, 조합 화학은 스크리닝에 이용가능한 화합물의 수를 극적으로 증가시켜 왔으며, 인간 게놈 연구는 다수의 새로운 스크리닝 표적 분자들을 발견해내었다. 스크리닝은 효소 저해제 또는 수용체 작동약(agonist) 또는 길항약(antagonist)의 검색시 다양한 방식으로 이러한 새로운 표적들을 사용할 수 있다. 전통적인 목표는 생물학적 시스템 내의 한 가지 결정적인 상호작용을 감소시키거나, 차단하거나 또는 증강시키는 화합물을 발견하는 것이다(Weber et al., Angew, Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34, 2280-2282). 또한, 많은 연구자들은 표현형-기초(phenotype-based) 검정 시스템을 채택하고 있는데, 그러한 시스템에서 스크리닝은 완전한 살아있는 세포 상에서 수행되며, 스크린의 판독(readout)은 그 세포의 어떤 탐지가능한 특성이다(Stockwell et al., Chem. Biol., 1999, 6, 71-83; Mayer et al., Science, 1999, 286, 971-974).

지금까지 개발된 고처리량 스크리닝 방법들은 제약 산업을 지배하는 "일약물 일표적(one-drug-one-target)" 패러다임에 근거하여 고안되어 왔다. 역사적인 이유로 인하여, 그리고 규제 사항(regulatory considerations) 및 감지된 위험 인자들 때문에, 현재의 약물 발견 과정은 주로 약물 후보로 작용할 한 활성 분자를 한번에 찾으려 한다. 임상의들은 오랫동안 "일약물 일표적" 접근법이 여러 질병을 치료하는데 충분치 않음을 인식해왔다. 그들은 동일한 상태를 치료하거나 또는 분명한 논리적인 연관을 가지고 있는 약제들의 몇 가지 자명한 조합을 시험해 왔다. 예를 들면, HIV 치료 및 화학요법에 있어서, 다수의 활성 제제들의 조합이 유행되어 왔다. 고금을 통하여 가장 유망한 약물 중의 하나는 폐경기 이후의 여성에서의 복합적인 변화를 치료하는데 사용되는 조합인 프레마린(Premarin)으로, 22개 이상의 중요한 개별 성분들로 구성되어 있다.

[발명의 요약]

본 발명자들은 생물학적 시스템을 교란하기 위한 강력하고 새로운 방법을 발명하였다. 이 방법은 화합물의 조합들, 즉 혼합물들 또는 비화학적으로 결합된 조합들의 고처리율 스크리닝을 체계적으로 수행하여, 생물학적 시스템 내에서 상승작용적으로(synergistically) 상호작용하는 조합을 발견할 것을 요한다. 본 발명의 방법은, 조합 내의 개개의 화합물이 이전에는 알려진 생물학적 효과를 가지고 있지 않았거나 또는 그 화합물 및 조합이 선험적으로 조합하여 사용될 만한 명백한 후보가 아니었던 경우에조차도, 예전에 알려지지 않은 치료 효과를 시현하는 효과적인 치료성 화합물 조합을 동정할 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 적어도 49개의 고유한 엔티티 조합들을 포함하는 적어도 7X7 조합 배열(combinational array) 내의 적어도 7개의 엔티티들을 사용하여 2-엔티티 또는 더 높은 차수(higher order)의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 엔티티들을 제공하는 단계, (b) 엔티티들의 조합 배열을 만드는 단계, (c) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체(moiety)들로 구성된 시험 엘리먼트(test element)를 제공하는 단계, (d) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (e) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 및 (f) 상기 시험 엘리먼트에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계.

두번째 관련 측면에서, 본 발명은 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 둘 이상의 엔티티들로 구성된 적어도 200개의 고유한 조합들의 배열을 만드는 단계, (b) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체들을 포함하는 시험 엘리먼트를 제공하는 단계, (c) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (d) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 및 (e) 상기 시험 엘리먼트에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계.

이러한 검정의 구성요소들은 첫번째 검정과 관련하여 상술한 바와 같이 변화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이 방법은 (a) 내지 (e) 단계를 적어도 2회 반복하는 단계 (f)를 포함하는데, 이때 (a) 단계에서의 적어도 200개의 조합들의 배열은 각 반복마다 상이하다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 배열은 적어도 400개 또는 1540개의 고유한 조합들을 포함한다. (f) 단계의 2회 반복이 행해지는 경우, 각 회는 이전 회로부터 10일 이내에 행해진다.

세번째 관련 측면에서, 본 발명은 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 둘 이상의 엔티티들로 구성된 적어도 49개의 고유한 조합들의 배열을 만드는 단계, (b) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체들을 포함하는 시험 엘리먼트를 제공하는 단계, (c) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (d) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, (e) 상기 시험 엘리먼트에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계, 및 (f) 상기 (a) 내지 (e) 단계를 매회 상이한 배열을 사용하여 1주일에 걸쳐 적어도 25회 반복하는 단계. 이러한 검정의 구성요소들은 전술한 검정에 대하여 상술한 바와 같이 변화될 수 있다.

네번째 관련 측면에서, 본 발명은 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 둘 이상의 엔티티들로 구성된 적어도 49개의 고유한 조합들의 배열을 만드는 단계, (b) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체들을 포함하는 시험 엘리먼트를 제공하는 단계, (c) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (d) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 및 (e) 상기 시험 엘리먼트에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계, 및 (f) 상기 (a) 내지 (e) 단계를 매회 상이한 배열을 사용하여 1달에 걸쳐 적어도 100회 반복하는 단계. 이러한 검정의 구성요소들은 전술한 검정에서와 같이 변화될 수 있다.

다섯번째 관련 측면에서, 본 발명은 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 일군의 엔티티들로부터 적어도 10,000개의 고유한 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들의 배열을 만드는 단계, (b) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체들을 포함하는 시험 엘리먼트를 제공하는 단계, (c) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (d) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, (e) 상기 시험 엘리먼트의 특성에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계, 및 (f) 상기 (a) 내지 (e) 단계를 10일 이하의 기간에 걸쳐 적어도 2회 반복하는 단계로서, 이때 (a) 단계에서의 적어도 10,000개의 2-엔티티 조합들의 배열이 2회 이상의 반복에서 매회 상이한 단계.

여섯번째 관련 측면에서, 본 발명은 엔티티들의 조합들을 생물학적 활성에 대하여 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 하나 이상의 별개의 생물학적 단위체들을 포함하는 시험 엘리먼트를 제공하는 단계, (b) 적어도 100개의 엔티티들을 각각의 엔티티/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (c) 상기 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, (d) 상기 엔티티들과 접촉되지 않은 시험 엘리먼트의 특성과 비교하여 특성에 변화를 유발하는 엔티티들을 선별하는 단계, (e) 상기 동정된 엔티티들로부터 적어도 49개의 고유한 2-엔티티 또는 더 높은 차수의 조합들의 배열을 만드는 단계, (f) 상기 엔티티들의 조합 배열을 각각의 엔티티 조합/시험 엘리먼트의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 상기 시험 엘리먼트와 접촉시키는 단계, (g) 상기 (f) 단계의 시험 엘리먼트의 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 및 (h) 상기 (g) 단계에서의 특성에 그 조합의 한 엔티티 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 엔티티들의 조합을 동정하는 단계. 바람직하게, 상기 (a) 단계의 시험 엘리먼트는 상기 (f) 단계의 시험 엘리먼트와 동일하나, 각 단계마다 상이한 시험 엘리먼트를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다(예를 들면, (a) 단계에서는 배양 세포를 사용하고, (f) 단계에서는 완전한 동물을 사용한다). 마찬가지로, (c) 단계에서의 특성은 바람직하게 (g) 단계에서의 특성과 동일하나, 각 단계마다 상이한 특성을 사용하는 것이 바람직할 수도 있다.

모든 검정의 경우에, 싸이토블랏 검정, 리포터 유전자 검정, 형광 공명 에너지 전이(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 검정, 형광 칼슘-결합 지시자 염료(fluorescent calcium-binding indicator dye), 형광 현미경 또는 발현 프로파일링을 포함하는, 다수의 활성 판독 기술이 사용될 수 있다. 바람직하게, 검정은 로봇식 시스템과 384 및 1536 웰 플레이트를 사용하여 자동화 된다. 검정은 또한 일부 또는 전체 과정이 마이크로플루이딕스(microfluidics)를 사용하여 수행되도록 구성될 수 있다. 이와 달리, 검정은 과학연구에 종사하는 숙련된 노동자 및 효율적인 라인 공정(line process)을 사용하여 수행될 수도 있다.

본 발명에 따라 조합하여 시험될 바람직한 엔티티들은 화합물(예: 비중합성 유기 화합물, 특히 소분자; 지질; 탄수화물; 펩티드; 무기 화합물; 및 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드), 이온(예: 금속 이온), 및 방사(예: 가시광선, 가시 영역외 광선, 극초단파 방사, 적외선 방사, 또는 x-선 및 감마선과 같은 이온화 방사)이다. 조합하여 시험될 엔티티들이 화합물인 경우, 그들은 바람직하게는 정제된 형태로 사용되나, 예를 들면 천연 산물 추출물(natural product extract)과 같이 혼합물의 성분으로서 제공될 수도 있다. 예를 들어, 부분집합(1종 이상의 화합물들)이 정제된 형태로 존재할 수 있으면, 각각의 화합물들이 정제된 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게, 각각의 엔티티/시험 엘리먼트 접촉은 200uL 이하, 보다 바람직하게 100uL 이하, 가장 바람직하게 50uL 이하 또는 심지어는 25uL 이하의 부피 내에서 이루어진다. 어떤 경우에는, 10uL 또는 심지어는 500nL 이하의 작은 부피가 사용될 수도 있다. 아울러, 화합물의 부피는 바람직하게 100uL 이하, 보다 바람직하게 1uL 이하, 그리고 가장 바람직하게 100nL 이하 또는 심지어는 50nL 이하이다. 당업계의 숙련가는 더 작은 부피(예를 들면, 10nL 또는 심지어는 1nL)가 사용될 수도 있음을 인식할 것이다.

바람직한 시험 엘리먼트는 뉴런, 섬유아세포, 평활근 세포, 심장 세포, 골격근 세포, 글리아 세포(glial cell), 배간 세포(embryonic stem cell), 조혈간 세포(hemtopoeitic stem cell), 비만세포, 지방세포, 원생동물, 박테리아 세포, 효모 세포, 신경간 세포(neuron stem cell), 및 T 세포와 B 세포를 포함하는 면역 세포와 같은 완전한 세포(예를 들면, 형질변환된 세포 또는 비형질변환된 세포), 세포 덩어리(cluster of cells), 조직, 동물, 및 재구성된 무세포 배지(reconstituted cell-free media)이다; 어떤 경우에는, 시험 엘리먼트는 단백질 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 생물학적으로 관련된 단일 분자로 구성된다.

원하는 조합이 시험 엘리먼트에 미치는 효과는 바람직하게, DNA 합성의 증가 또는 감소와 같은 시험 엘리먼트의 특성에 대한 상승작용적인 효과이다. 이와 달리, 조합은 사실상 부가적이지만 더 적은 부작용을 가질 수 있거나, 또는 예를 들면 다른 화합물의 독성을 중화시키는 화합물처럼 한 엔티티가 다른 엔티티에게 반대되는 유용한 효과를 미칠 수 있다.

엔티티들은 임의의 순서로 시험 엘리먼트와 접촉될 수 있다. 즉, 한 엔티티를 시험 엘리먼트에 첨가한 다음 두번째 엔티티를 첨가하거나, 또는 두 엔티티들을 시험 엘리먼트와 접촉시키기 이전에 미리 조합할 수 있다.

본 발명의 고처리량 스크리닝 방법은 제약 산업에 사용되는 전통적인 약물 발견 방법의 신속하고 강력한 대안을 제공한다. 본 발명은, 예를 들면 그들 중의 일부는 새로 합성된 것이고 일부는 공지된 FDA-승인 약물인 소분자들로 구성된 이전에 알려지지 않은 치료적으로 강력한 조합을 동정할 수 있다. 효과적인 조합이 전적으로 모두 이미 FDA 승인된 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 약물들로 구성된 경우, 새로운 조합은 FDA 승인 과정을 쉽게 통과하는 추가적인 장점을 가진다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 후술하는 설명 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.

정의

"조합 화학 도서관(combinatorial chemistry library)": 본원에서 사용될 때, "조합 화학 도서관"이란, 바람직하게는 비계 구조물(scaffold structure)의 다양화(diversification) 단계마다 상이한 반응물들을 사용함으로써 가변성 비계 구조물로부터 합성된, 천연 산물을 떠올리게 하는 다수의 복합 분자들(complex molecules)이다.

"다양성 도서관(diverse library)": 본원에서 사용될 때, "다양성 도서관"이란, 기존의 화학적으로 합성된 분자들(제약 회사의 소유물 도서관에 있는 것과 같은), 천연 산물들(미생물 발효 육즙과 같은) 및 조합 화학 기술에 의해 제조된 신규한 도서관을 포함하는 다수의 잠재적인 원료들(multilple potential sources) 중 임의의 것으로부터 집합된 다수의 복합 분자들이다.

"가변성 비계 구조물(diversifiable scaffold structure)": 본원에서 사용될 때, "가변성 비계 구조물"이란, 합성 시약과 더 반응시켜 적어도 하나의 새로운 기능을 생성할 수 있는 잠재적인 또는 활성적인 기능을 보유한, 주형 구조물(template structure)로부터 합성된 화합물이다. 본원에서 사용될 때, "잠재적인 기능(latent functionality)"이란 존재하나 일시적으로 불활성인 기능이다. 활성화제에 의해 해방되면, 잠재적인 기능이 활성을 띠게 되어 추가적인 다양화에 이용가능하다.

"시험 엘리먼트(test element)": 본원에서 사용될 때, "시험 엘리먼트"란, 엔티티들의 조합이 접촉된 후 그 엔티티들의 효과가 관찰되는 시스템이다. 바람직하게, 시험 엘리먼트는 세포 내의 둘 이상의 생물학적 단위체들을 포함한다.

"화합물 인쇄(compound printing)": 본원에서 사용될 때, "화합물 인쇄"란, cDNA 미세배열(microarraying)에 사용되는 것과 같은 고정밀도 로봇을 사용하여 화합물을 표면(예: 유리)에 적용하는 것이다(J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7967-7968). 화합물 반점(spot)은 직경이 250 마이크론 또는 그 이하일 수 있으며, 화합물은 정전기적 또는 혐수성 상호작용을 통해 상기 표면에 공유결합되거나 또는 부착될 수 있다.

"마이크로플루이딕스(microfluidics)": 본원에서 사용될 때, "마이크로플루이딕스" 장치란, 통상적인 광리소그라피(예: Caliper Technologies, Mountain View, CA; http://www.calipertech.com) 및 비통상적인 방법(예를 들어 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 550-575에 기술되어 있는 연질 광리소그라피와 같은)을 포함하는 광리소그라피 방법들 중 임의의 것에 의해 제조된, 채널을 가진 구조물(channeled structure)이다.

"잉크젯(ink-jet)": 본원에서 사용될 때, "잉크젯" 기술이란, 열적(thermal) 잉크젯은 물론 적은 부피의 액체 운반용 압전식 분무(piezoelectric spray) 기술을 의미한다.

"소분자(small molecule)": 본원에서 사용될 때, "소분자"란 실험실에서 합성되거나 또는 자연계에서 발견된 유기 화합물이다. 전형적으로, 소분자는 몇 개의 탄소-탄소 결합을 보유하고 1500g/몰 이하의 분자량을 가진다는 점에서 특성화되나, 이러한 특성화가 본 발명의 목적으로 제한하는 것으로 의도되어서는 안된다. 자연계에서 발생하는 "소분자"의 예는 택솔(taxol), 다이네마이신(dynemicin) 및 라파마이신(rapamycin)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 두 가지 상이한 시약들이 어떻게 한 세포 내에서 상승작용적으로(synergistically) 작용할 수 있는가를 보여주는 개념적인 개략도로, 여기서 상기 시약들은 동일 세포내의 상이한 표적들에 결합한다.

도 2는 두 가지 상이한 시약들이 어떻게 한 유기체(organism) 내에서 상승작용적으로 작용할 수 있는가를 보여주는 개념적인 개략도로, 여기서 상기 시약들은 상이한 세포들 또는 조직들 내의 표적에 결합한다.

도 3은 본원에 기술된 종류의 조합 스크리닝(combinatorial screen)에서 얻을 수 있는 실험 데이터의 예이다. 5개의 상이한 384 웰 플레이트들로부터의 결과가 도시되어 있다. 결과는 플레이트 형식으로 도시되어 있으며, 여기서 16개의 행(row)은 A부터 P까지 표시되어 있고, 24개의 열(column)은 1부터 24까지 표시되어 있다. 활성 수준이 각 웰에 숫자로 도시되어 있는데, 여기서 1은 기초 활성(효과 없음)을 나타내고, 5는 활성 조합이 발견됨을 나타낸다.

도 4는 현재 상업적으로 입수가능한 기술을 사용하여 조합 스크리닝을 수행하는 방법의 개략도이다.

본 발명은 그들의 고유한 조합에만 존재하는 분자들의 효과를 동정하기 위해 적절한 생물학적 검정법을 사용하는 고처리량 스크리닝 시스템 내에 2-, 3-, 4 및 더 높은 차수의 조합으로 개개의 분자들의 도서관들을 조합하는 방법을 제공한다. 그러한 조합들은 이어서 추가적인 생물학적 시스템을 탐지하고 연구하는데 사용되거나, 직접적인 생물학적 용도를 가지거나, 또는 신규한 인간 치료법 또는 인간에서의 다른 용도를 위한 활성 분자로서 작용할 수 있다. 이러한 조합들은 또한 동물 또는 식물을 포함하는 특수한 농산물의 성장, 번식, 숙성, 또는 다른 특질을 증진시키는데에도 유용할 수 있다. 그들은 화장품, 향수, 식품 보존제, 또는 영양 보충제를 생산하는데 유용할 수도 있다. 이와 같이, 본 발명은 화합물 조합들에 대한 고처리율 스크리닝을 체계적으로 수행하여 생물학적 시스템 내에서 향상된 특성을 갖는 조합들을 발견하기 위한 강력한 방법을 제공한다.

본 발명자들은 인간 세포 또는 조직과 같은 복합 시스템과 상호작용하는 의약들은 그들이 다수의 표적 분자들과 상호작용하는 다수의 활성 제제들을 함유할 때 가장 효과적이기 쉽다고 가정한다. 의약이 작용하는 방식에 대한 이러한 이해는 그들이 어떻게 고안되고 개발되어야 하는가에 대한 본 발명자들의 새로운 전략을 위한 근거들 중의 하나를 형성한다. 이러한 새로운 접근법은 많은 기존의 치료법에서 극적인 향상을 이룰 것과 현재 치료가 어려운 질병들, 특히 다수의 변수의 알맞은 변화를 요구하는 질병들의 효과적인 치료를 제공할 것을 약속한다.

제약 산업에서 현재 우세한 패러다임은 한 가지 표적에 대하여 한 가지 약물이 설계된다는 것이다. 본 발명자들의 접근법은 다변가능한 설계 요구(multivariable design requirements)를 신세대 의약의 체계적인 개발을 위한 뼈대의 중심물로서 이해하는데 기초한 것이다.

조합하여 시험될 엔티티들

상술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 매우 다양한 엔티티들이 조합하여 시험될 수 있다. 이들을 보다 상세하게 설명한다.

화합물 및 이온

본 발명에 따라 스크리닝되는 우세한 클래스의 화합물은 유기 소분자들이다. 화합물들은 합성된 것이거나 또는 자연발생적인 것(예를 들면, 프로스타글란딘, 렉틴, 자연발생적인 2차 대사물질, 호르몬 등)일 수 있다. 그러한 분자들로 구성된 정제된 형태의 거대한 도서관은 제약 회사, 화학 회사, 및 대학 연구소로부터 입수가능하다; 그러한 도서관은 또한 공지된 조합 화학 기술(combinatorial chemistry techniques)을 사용하여 합성될 수도 있다. 화합물들은 알려진 생물학적 활성을 가지고 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 본 발명의 화합물들 및 조합 도서관들(combinatorial libraries)은 다변가능한 고형 지지체 결합 비계(solid support bound scaffold), 예를 들면 시키미산계 에폭시올 주형으로부터 합성되거나 또는 피리딘계 주형 이소니코틴아마이드로부터 합성된 가변성 비계로부터 생성된 화합물들 및 도서관들로부터 합성될 수 있다. 유기 소분자들 이외에도, 본 발명에 따라 조합하여 스크리닝될 수 있는 다른 분자들은 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA)를 포함하는 생중합체; 폴리펩티드(항체, 효소, 수용체, 리간드, 구조 단백질, 인간 단백질의 변이 유사체, 및 펩티드 호르몬); 지질; 탄수화물; 및 다당류를 포함한다. 금속 이온, 예를 들면 구리, 철, 은, 아연, 마그네슘, 망간, 칼슘 및 금 이온과 같이 잠재적으로 생물학적으로 활성인 이온들은 물론 무기 분자들 역시 스크리닝될 수 있다.

다른 엔티티들

생물학적 시스템에 잠재적으로 영향을 주는 다른 비화학적 엔티티들 역시 상술한 바와 같이 다른 비화학적 엔티티들 또는 화학적 엔티티들과 조합하여 본 발명에 따라 스크리닝될 수 있다. 스크리닝될 수 있는 비화학적 엔티티들은 광선(가시광선 영역 및 가시광선외 영역, 예를 들면 적외선 및 자외선); x-선 및 감마선과 같은 이온화 방사(ionizing radiation); 고압(hyperbaric pressure), 증가 또는 감소된 온도 또는 pH; 산소, 질소, 이산화탄소 등과 같은 기체 물질들; 및 임의의 진동수의 음파 진동(소리)을 포함한다.

시험 엘리먼트

조합의 효능을 발견하는데 사용되는 생물학적 검정법들은 대부분의 경우 다수의 구성요소들로 구성될 것이다. 어떤 검정법에서, 특히 그 검정법이 표현형-기초 검정법인 경우, 시험 엘리먼트는 완전한 세포(whole cell)이다. 그러한 완전한 세포 검정법은 다변가능한 치료성 화합물들의 효험의 기초를 이룸직한 복합적인 분자 상호작용의 완전한 세트를 제공한다. 다른 검정법들은, 원하는 복합 시스템들 중 다수를 함유하며 검정될 있음직한 조합 효과(combinatorial effect)에 기초한 어떤 리포터 효과를 포함할 수도 있는, 재구성된 무세포 배지(reconstituted, cell free medium)를 사용한다. 다른 검정법들은 다변가능한 조합 스크리닝을 위해 세포 덩어리, 조직 및 동물 모델과 같은 더 높은 수준의 생물학적 시스템들을 사용한다.

개개의 화합물들의 검정에 유용한 임의의 생물학적 검정법이 본 발명의 조합 스크리닝에 용이하게 적용될 수 있다. 검정 측정은 예를 들면, 화합물의 세포막 횡단 수송, 전기 전위, 활동 전위 생성, 세포 증식, 세포 사멸, 세포 특정화(specification), 세포 분화, 세포 이동, 유전자 발현 또는 단백질 수준(예를 들면, mRNA, 단백질, 또는 리포터 유전자를 검출함으로써 측정된), 효소 활성, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 단백질의 세포 핵 내로의 전치[translocation](또는 단백질 배치에 있어서의 다른 변화), 병원체(예를 들면, 바이러스 또는 박테리아)에 저항하는 능력, 및 면역반응을 생성하는 능력을 포함할 수 있다. 완전한 유기체(whole organism) 검정에 있어서는, 동물 행태가 리포터로 작용한다.

일 실시예에 있어서, 검정은 비파괴적 검정(예를 들면, 화합물의 효능 측정이 세포에 해를 주지 않고 이루어질 수 있는 세포-기초 검정)이다. 그러한 검정법은 웰마다 다양한 농도의 다수의 조합들 상에서 검정이 수행되는 것을 가능케 한다. 예를 들면, 화합물 A가 한 웰에 점증하는 농도로 첨가되고 측정은 화합물의 매 첨가 이후에 이루어진다. 화합물 A의 원하는 농도에 도달하면(원하는 검정 반응 또는 그 화합물의 공지된 특성(예를 들면, 독성, 용해도)에 근거하여 결정된), 화합물 B가 점증하는 농도로 첨가되며 이때 매 첨가 이후에 검정 측정이 이루어진다. 이러한 과정이 단일 웰에서 수회 반복될 수 있으며, 이는 수백, 수천, 또는 심지어 수백만의 검정이 단일 플레이트에서 수행되는 것을 가능케 한다.

조합의 가능한 부작용을 동정하기 위해 비교 검정을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 종양 세포를 사멸시키거나 또는 증식을 감소시키는 능력에 대해 스크리닝되는 화합물들의 조합들은 그와 동시에 그들이 정상적인 비종양 세포에 미치는 영향에 대하여 스크리닝될 수 있다. 종양 세포 상에서 원하는 활성을 시현하고 정상 세포에는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 화합물들의 조합이 바람직한 조합이다. 정상 세포에 원치 않는 영향을 미치는 것으로 보이는 조합들은 덜 바람직하다. 그러나, 이러한 후자의 조합들(또는 유사한 구조를 갖는 화합물들의 조합들)은 다른 농도에서는 효과적일 수 있으며, 추가 연구에서 반드시 배제되어야 하는 것은 아니다.

단백질, 탄수화물 및 지질과 같은 복합 생분자들(complex biomolecules)을 함유하는 무세포 배지는 공지의 방법에 의해, 예를 들면, 포유동물, 개구리, 효모, 또는 박테리아 세포를 용해시켜 완전한 세포 용해질을 제공하거나 또는 그러한 세포 용해질로부터 특정 분획을 정제함으로써, 또는 상업적으로 입수가능한 토끼 망상적혈구 용해질(시험관내 전사 및/또는 해독 반응을 수행하기 위해 통상적으로 사용되는)을 사용함으로써, 또는 포유동물, 효모, 또는 박테리아 세포로부터 기저 세포(underlying cell)의 용해없이 배양 상등액을 회수함으로써 제조된다.

싸이토블랏 검정

활성을 검출하기 위한 한 가지 방법은 싸이토블랏 검정(cytoblot assay)이다. 이 방법에서는 세포를 검정 플레이트의 웰에 접종한다. 상기 세포는 바람직하게는 착생하는(adherent) 세포이어서, 웰의 바닥에 붙어서 성장한다. 화합물들이 상술한 방법을 사용하여 첨가된다. 예를 들면, 싸이토블랏은 BrdU 삽입(incorporation)을 측정함으로써 증식을 탐지하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 세포는 정해진 기간(예를 들면, 4 내지 72시간) 동안 인큐베이션된다. 이어서 배지를, 예를 들면 로봇식 액체 이송 장치(robotic liquid transfer device), 또는 16 또는 8 채널 원드(wand)를 사용하여 흡인(aspiration)한다. 세포를 70% 에탄올 및 인산완충식염수(PBS)를 4℃에서 1시간 동안 첨가하여 고정한다. 고정제를 제거한 다음, 세포를 PBS로 1회 세척한다. PBS 세척 후, 0.5% Tween 20이 함유된 2N HCl을 각 웰에 20분간 첨가한다. HCl을 10%(v/v) 2N NaOH를 함유하는 항크스액(HBSS: Hank's balanced salt solution)으로 중화시킨다. 이 용액을 제거하고, 세포를 HBSS로 2회 세척한 다음, 0.5% 우혈청 알부민(BSA) 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 1회 세척한다. 세척 용액을 제거한 다음, 항-BrdU 항체로서 0.5% 우혈청 알부민(BSA) 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 내의 마우스 항-BrdU 항체 0.5ug/ml을 첨가한다. 이 항체 용액은 또한 마우스 Ig 항체(예를 들면, 마우스 항-BrdU 항체)를 인식하는 2차 항체를 함유한다(1:2000 희석비로); 이러한 2차 항체는 양고추냉이 과산화효소(HRP: horseradish peroxidase)에 결합되어 있다. 한 시간 동안 인큐베이션한 후, 항체 용액을 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 2차 PBS 세척 후에, HRP 기질(루미놀, 과산화수소, 및 파라요오드페놀과 같은 인핸서를 함유하는)을 각 웰에 첨가한다. 이어서, 필름에 노출시키거나(필름 한 장을 플레이트 위에 올려놓음으로써), 또는 표준 조건(예를 들면, 웰 당 0.3초간 노출)을 사용하는 루미노미터(luminometer) 또는 발광 플레이트 판독기(luminescence plate reader)를 사용하여 각 웰로부터의 발광량을 판독함으로써 각 웰내의 빛의 양을 측정한다. 각 웰로부터의 광 출력(light output)은 그 웰에서 일어난 DNA 합성량을 나타낸다. 제제들의 바람직한 조합은 대조군에 비하여 광 출력이 증가하거나 감소된 것이다. 예를 들면, 광 출력을 감소시키는 조합은 DNA 합성률을 감소시킬 수 있으며, 따라서 종양 세포의 증식을 저해하거나 방지하는데 효과적일 수 있다. 이와 달리, 광 출력의 증가는 DNA 합성의 증가를 나타낸다. 예를 들면, 1차 세포(primary cell)를 예를 들면 200 X 1 조합 배열(여기서 한 고정된 성분이 DNA 합성을 차단하며, 따라서 세포에 독성 효과를 갖는다)에 사용할 수 있다. 이러한 배열을 사용하여, 상기 첫번째 화합물의 이러한 독성 효과를 방지하는 두번째 시약을 스크리닝할 수 있다. 다양한 면역결핍 질환에서, 면역세포는 동종(allo-) 또는 자가(auto-) 항원에 반응하여 증식하지 않는다. 배양된 면역세포 및 상술한 방법을 사용하여, 면역세포의 증식을 증진시키는 시약들의 조합을 스크리닝할 수 있다. 이와 달리, 자가면역 억제제를 스크리닝할 수도 있다. 이러한 예에서는, 한 가지 종류의 면역세포 집단(말초 혈구들로부터 분리된 B-세포 또는 T-세포)이 동종(allo-) 또는 자가(auto-) 항원에 의해 자극된다. 동종 항원에는 반응하지 않으나 자가 항원에 반응하는 증식을 특이적으로 저해하는 화합물들의 조합은 자가면역 치료제 후보로 유용하다.

기타 다른 활성 검출방법

상술한 싸이토블랏 검정법은 BrdU 이외의 항원 검출에 쉽게 적합화될 수 있다. 아울러, 세포 내의 다양한 해독후 변형(post-translational modification)을 탐지할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레올린(nucleolin) 또는 히스톤 H3의 인산화 형태에 대한 항체는 세포 주기의 M(유사분열)기에 있는 세포들을 검출하는데 유용하다. 따라서, 싸이토블랏 검정에서 인산화된 뉴클레올린 또는 히스톤 H3의 증가를 초래하는 화합물들의 조합은 M기의 세포들을 저지하며 항암제로서의 가능성이 있는 조합일 것이다. 또한, 싸이토블랏 검정을, 예를 들면 아세틸화된 히스톤 H4를 특이적으로 인식하는 항원을 사용하여 히스톤 H4의 아세틸화 증가를 검출하는데 사용할 수도 있을 것이다. 히스톤 H4의 과아세틸화의 증가를 초래하는 화합물들 또는 화합물들의 조합 역시 항암제일 수 있다.

상술한 예들에서, 그 과정은 배지를 제거하고 고정제(PBS 또는 트리스-완충 식염수 내의 70% 에탄올 또는 4% 포름알데히드)를 첨가한다는 점에서 변형될 수 있다. 이어서, 고정제를 제거하고 투과화제[permeabilization agent](예를 들면, Tween 20, triton X-100, 또는 메탄올)를 첨가함으로써 세포 막이 투과화된다. 막 투과화제를 제거한 다음, 세포를 PBS 또는 Tris-완충 식염수로 세척하고, 1차 항체를 첨가한다. 이러한 다른 싸이토블랏 구현예를 사용하는 경우, 일반적으로 산 변성 단계는 없다.

리포터 유전자 검정

시험 엘리먼트의 특성 측정은 리포터 유전자를 사용하여 수행될 수도 있다. 이러한 방법은 일단 피실험물(예를 들면, 안정하게 형질감염된 세포계)이 준비되면, 검정이 수행되기 쉬우며, 예를 들면 싸이토블랏 검정보다 더 적은 시간을 요한다는 장점을 제공한다. 리포터 유전자는, 비색, 형광, 발광, 또는 효소적 특성 때문에 용이하게 검출될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 리포터 인자(element), 및 그 리포터 유전자의 발현에 특이성을 부여하는 인핸서/프로모터 인자를 포함한다. 리포터 인자는, 제한 없이, 루시페라아제, 베타 락탐아제, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제(CAT), 베타 갈락토시다아제, 및 알칼리 포스파타아제를 포함한다. 인핸서/프로모터 인자는, 예를 들면, NFAT, p53, TGF-베타, 또는 그에 반응하는 프로모터/인핸서가 공지되어 있는 기타 다른 신호전달 경로 또는 자극에 반응하는 것들을 포함한다.

NFκB

상업적으로 입수가능한 리포터 유전자는 pNFκB, 즉 NFκB가 활성화될 때 광을 발하는 루시페라아제 리포터 유전자(Stratagene, La Jolla, CA)이다. 이 리포터 유전자는 안정하게 또는 일시적으로 관심있는 세포계(즉, A549 인간 폐암 세포) 내로 형질감염될 수 있다. 안정하게 형질감염된 세포계를 제조하기 위해, pNFκB 플라스미드 DNA를 G418 내성 플라스미드 및 형질감염제(예를 들면, 리포펙타민, Life Technologies, Inc., Rockville, MD)와 혼합한 후, A549 또는 다른 세포들이 약 40% 컨플루언시(confluency)로 부착되어 있는 10cm 페트리 디쉬에 첨가한다. DNA/리포펙타민을 함유한 플레이트를 5% CO₂와 함께 37℃에서 4-16시간 동안 인큐베이션한다. 배지를 제거한 후, 세포를 무혈청 배지(serum-free medium)로 2회 세척한 다음, 10% 우혈청(FBS)이 함유된 배지를 첨가한다. G418을 모의(mock) 형질감염(즉, G418-내성 플라스미드가 없는 형질감염)에서 모든 세포를 사멸시키는데 충분한 도스(약 700ug/mL)로 첨가한다. 세포를 매 3일마다 배지를 교체하면서 37℃에서 5% CO₂와 함께 2주일 동안 인큐베이션한다. 안정하게 형질감염된 클론들은 2주후 쯤에 작은 콜로니로 성장해 있을 것이다; 이러한 클론들을 링-클로닝(ring-cloning)으로 분리하여 개별적으로 번식시킨다. G418-내성 클론들은 일시적으로 형질감염된 NFκB가 있거나 또는 없는 세포 용해질로부터의 광 출력을 측정함으로써 관심있는 리포터 유전자에 대해 스크리닝된다. 일단 안정하게 형질감염된 pNFκB를 가진 클론이 동정되면, 그 세포들을 검정 플레이트에 도말하여 스크리닝에 사용한다.

일시적인 형질감염 검정의 경우에는, pNFκB 플라스미드 DNA를 형질감염제와 함께 혼합한 다음, 예를 들면 약 70% 컨플루언시로 A549 세포가 부착되어 있는 10cm 페트리 디쉬에 첨가한다. DNA/리포펙타민을 함유한 플레이트를 5% CO₂와 함께 37℃에서 4-16시간 동안 인큐베이션한다. 배지를 제거한 후, 세포를 무혈청 배지로 2회 세척한 다음, 10% FBS를 함유한 배지를 첨가한다. 세포를 37℃에서 5% CO₂와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 스크리닝을 위해 검정 플레이트에 도말한다.

리포터 유전자는, 제한 없이 바이러스 또는 레트로바이러스 감염, 바이오리스틱 주입(biolistic injection), 및 벌거벗은(naked) DNA의 세포 흡수를 포함하는 다른 기술을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 당업계의 숙련가는 검정될 세포 내로 리포터 유전자를 도입하는 임의의 방법이 본원에 기술된 스크리닝 방법에 적합함을 인식할 것이다.

일단 리포터 유전자를 가진 세포들이 이용가능하게 되면, 그들을 피펫, 멀티채널(multichannel) 피펫, 384웰 멀티드롭 플레이트필러(384 well Multidrop platefiller; Labsystems, Franklin, MA), 또는 다른 액체 취급 장치를 사용하여 검정 플레이트에 접종한다. 여러가지 방법들 중 한 방법으로 화합물들을 첨가하여 조합을 형성한다. 4-72 시간 후에, 배지를 제거한 다음 세포를 HBSS로 2회 세척하고, 용해 완충액을 첨가한다(Stockwell et al., J. Amer. Chem. Soc., 1999, 121:10662-10663). 그런 다음, ATP/루시페린을 첨가하고, 플레이트 판독기(platereader) 또는 루미노미터(예를 들면, LJL BioSystems Inc., Analyst AD, Sunnyvale, CA) 상에서 발광을 측정한다.

형광 공명 에너지 전이 검정

다른 실시예에서는, 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy transfer)가 관심있는 두 단백질들의 상호작용을 탐지하고 측정하는데 사용된다. 이러한 실시예에서, 제 1 및 제 2 단백질들은 각각 표준 분자생물학적 방법을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)과 융합된다. 두 융합단백질들을 암호하는 DNA 컨스트럭트들(constructs)은 상술한 형질감염 기술 또는 다른 필적할 만한 방법을 사용하여 포유동물 세포, 효모, 벌레, 또는 다른 세포 또는 유기체 내에서 동시발현(co-expression) 된다. 화합물들의 조합들을 첨가한다. 플레이트를 플레이트 판독기 위에 놓고, 다음과 같이 형광을 측정한다. 공여자 형광단[donor fluorophore](즉, BFP)을 여기시키고, 수용체 형광단[acceptor fluorophore](즉, GFP)의 방사(emission)를 측정한다. 두 단백질들의 증가된 인접성은 수용체 형광단에 의한 방사의 증가를 초래한다. 이와 같이, 관심있는 두 단백질들을 서로 인접하게 하는 화합물 조합이 수용체 형광단의 형광 증가에 의해 동정된다.

예를 들면, Smad2 및 Smad4를 함유한 발현 벡터들이 수득된다. GFP에 대한 cDNA를 Smad2의 5' 말단에 융합시키고, BFP에 대한 cDNA를 Smad4의 5' 말단에 융합시킨다. 이러한 발현 벡터들을 포유동물 세포 내로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시키고, 세포를 화합물 조합들로 처리한 다음, 플레이트에 BFP만을 여기시키는 광을 조사한다. GFP의 형광(예를 들면, 512nm 광)을 측정하여, 이 파장에서의 광 방사를 증가시킨 화합물 조합들을 동정한다. 그러한 조합들은 Smad2와 Smad4가 인접하게 하며, TGF-베타 신호전달을 활성화시킬 수도 있으며, 따라서 암 화학요법 점막염(mucositis) 및 자가면역 질환의 치료에 유용할 수 있다.

형광 칼슘 지시자 염료

시험 엘리먼트의 특성 변화의 또다른 판독법은, fluo-3(Molecular Probes, Eugene, WA; http://www.molecularprobes.com), fura-2, 및 indo-1과 같은 형광 칼슘 지시자 염료(fluorescent calcium indicator dye)를 사용한다. Fluo-3은 Ca²⁺에 결합되지 않은 한 근본적으로 비형광이며, Ca²⁺로 포화시 약 0.14의 양자수득률(quantum yield)을 시현한다. 따라서, fluo-3의 완전한 아세톡시메틸 에스터 유도체(fluo-3 AM) 역시 비형광이다. Ca²⁺이 결합된 fluo-3의 녹색 형광 방사(~ 525nm)는 통상 형광체에 대해 고안된 광학 필터 세트(FITC)를 사용하여 검출된다. 제조자에 따르면, fluo-3은 최소한 100배의 Ca²⁺-의존성 형광 증가를 시현한다.

세포를 웰에 접종한 다음, 제조자의 지시에 따라 fluo-3을 세포에 첨가하고, 화합물들을 첨가한 다음, 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. 형광의 증가를 초래하는(그러나 그 자신이 형광은 아닌) 화합물 조합들은 이와 같이 세포내 칼슘 농도의 증가를 초래한다.

형광 현미경 검사

또다른 검정은 화합물 조합과 접촉된 세포 내의 형광 수준 또는 배치(localization) 상의 변화를 검출하기 위해 통상의 형광 현미경 검사법을 사용한다. 일 실시예에 있어서, GFT로 표지된 Smad2를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포계가 사용된다. 세포를 접종한 후, 화합물들을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 자동화 단계가 있는 형광 현미경을 사용하여 각 웰 내의 세포들의 영상(image)을 관찰한다. 표지된 단백질의 배치 변화를 초래하는 화합물 조합들이 동정된다. 예를 들면, GFT-Smad2를 핵외로부터 핵내로 전치시키는 조합들이 이러한 방식으로 동정될 수 있다. 이러한 조합들은 TGF-베타 신호전달을 활성화시킬 수 있으며, 따라서 암, 자가면역 질환 및 점막염을 치료하는데 유용할 수 있다.

cDNA 배열(cDNA Arrays)을 사용한 발현 프로파일링

함께 시험 엘리먼트에서 변화를 유발하는 화합물들을 검출하기 위한 또다른 검정법은 발현 프로파일링(expression profiling)이다. 이러한 실시예에서는, 세포를 접종한 후, 화합물 조합들을 첨가한고, 세포를 2-24 시간 동안 인큐베이션한다. 폴리 A RNA를 표준방법을 사용하여 각 웰로부터 수확하였다. 역전사 중에 형광 염료(예를 들면, Cy3-dUTP)가 삽입되는 것을 제외하고는 표준방법을 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사하였다. Cy3-표지된 cDNA를 처리되지 않은 세포로부터의 Cy5-표지된 cDNA와 혼합하고, DNA 마이크로어레이(예를 들면, 본원에 참고자료로 첨부된 Nature Genet. Suppl. 21, Jan 1999에서 리뷰된, Affymetrix, Santa Clara, CA 또는 Incyte, Palo Alto, CA로부터 상업적으로 입수가능한 DNA 마이크로어레이)에 혼성화하였다. 상기 마이크로어레이의 각 점(spot)에서의 Cy3 및 Cy5 형광의 상대적인 수준은 각 유전자의 발현에 변화가 있었는지를 나타낸다. 이 방법은 유전자 발현에 원하는 변화, 예를 들면 병적인 유전자 발현 프로파일을 건강한 프로파일로 역전시키는 것과 같은 변화를 유발하는 조합들을 동정하기 위해 사용된다. 이와 달리, 인슐린과 같은 주어진 신호전달 분자(signaling molecule)에 의해 야기되는 발현 프로파일이 결정되며, 인슐린 프로파일이 나타나게 함으로써 그들이 인슐린 효과를 모방함을 암시하는 화합물 조합들이 발견된다.

완전한 유기체(Whole Organisms)

본원에 기술된 스크리닝 검정법에 적합한 또다른 생물학적 검정법(bioassay)은 완전한 동물을 사용하는 것이다. 일 실시예에서, 선충류(nematode) 씨. 엘레강스(C. elegans)를 개개의 웰에 놓은 다음(바람직하게는 웰 당 한 마리 이상의 선충류), 그 유기체의 특성 변화를 탐지함으로써 화합물의 활성이 발견된다. 예를 들면, 선충류는 생활 주기(life cycle)의 특정 단계에서 또는 다우어 상태(dauer state)에서 녹색 형광 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 자동화된 현미경 장치가 각 웰의 선충류의 상을 잡아 녹색 형광 단백질의 양을 측정하거나, 또는 특정 화합물 조합에 의해 야기된 벌레의 형태학적 변화를 발견하는데 사용된다.

또 다른 완전한 동물 검정법은 피부 표면에 또는 그 근처에 종양을 가지고 있는 누드 마우스(nude mouse)와 같은 큰 동물을 사용하는 것이다. 화합물 조합은 피부에 문질러 바름으로써 피부 속으로 침투하여 종양에 도달하는 DMSO 내의 혼합물일 수 있다. 이와 달리, 화합물을 정맥내로, 근육내로, 또는 경구로 투여할 수도 있다. 활성을 검출하기 위한 다른 완전한 유기체 방법은 규정된 배지 내에서 발생하는 수정된 개구리(Xenopus) 난자로부터 유래된 작은 올챙이, 기관이 규정된 배지 내에서 일정 기간 동안 배양될 수 있는 기관형적 배양물(organotypic culture)(마우스 또는 다른 동물로부터의 이식편), 및 다양한 동물의 알(수정되거나 되지 않은)을 사용하는 것을 포함한다. 또다른 검정법은 두 지점(spring) 간에 이완되는 심장 조직 또는 근육 조직의 긴장을 측정한다; 수축을 조절할 수 있는 화합물 조합은 그러한 지점 상에서의 긴장을 증가 또는 감소시킬 것이다.

화합물의 표지

몇몇 검정법들이 조합된 엔티티들중 어느 것도 표지하지 않고 수행될 수 있을 지라도, 어떤 구현예에서는 그 조합이 시험 엘리먼트에 미치는 영향을 검출 또는 측정할 수 있도록 조합된 엔티티들 중의 하나 또는 그 이상이 표지된다. 공지된 다양한 표지들 중의 임의의 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 비오틴-스트렙트애비딘 상호작용 또는 헥사히스티딘으로 표지된 단백질을 활용하는 단백질 친화 크로마토그래피에 관한 생화학에서 널리 사용되어온 기술들을 사용할 수 있다(Janknect et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:8972; Wilcheck et al., Methods in Enzymology, Wilcheck, M.; Bayer, E.A. Eds. Academic Press Inc., San Diego, 1990, pp. 123-129).

분자들의 조합

본 발명의 방법은 기존의 로봇식 장치, 96-웰, 384-웰, 1536-웰 또는 그 밖의 고밀도 스톡 플레이트(high density stock plate), 및 96-웰, 384웰- 또는 1536-웰 또는 그 밖의 고밀도 검정 플레이트(high density assay plate)를 사용할 수 있으며, 이들을 사용하여 주당 최대 150,000가지 이상의 화합물들을 스크리닝하는 것이 가능하다. 이 기술의 자동화가 본 발명에 따라 분자 조합들을 스크리닝하는데 적합화 될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 공정을 최소화하기 위해 통상의 광리소그라피에 의해 제조되거나 또는 비통상적인 방법(연질 광리소그라피 또는 근거리음장(near-field) 광학 리소그라피와 같은)에 의해 제조된 마이크로플루이딕스 시스템(microfluidics system)을 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 방법은 잉크젯 인쇄(ink-jet printing) 또는 화합물 인쇄(compound printing) 기술을 사용할 수도 있다. 게다가, 본 발명의 방법은 로봇식 장치와 동일한 결과 및 처리량을 달성하기 위해 숙련된 기술자의 노동력을 사용할 수도 있다. 화합물 조합은 시험 엘리먼트와 접촉하기 이전에 제조되거나, 또는 시험 엘리먼트의 존재하에 제자리(in situ)에서 제조될 수 있다. 이하에서 이러한 도말(plating) 방법들을 더 상세하게 설명한다.

수동 도말(Manual Plating)

화합물을 수동으로 도말(즉, 시험될 세포에 첨가)할 수 있다. 일 실시예에서, 정제된 화학 화합물들을 수동으로 조합한 다음, 7X7 조합 배열로 시험한다. 화합물들(이 경우에는 7가지 화합물들이 포함된)은 스톡 플레이트 내에 있다. 화합물들을 검정 플레이트(assay plate)에서 조합한다. 조작자는 스톡 플레이트의 한 웰에 있는 제 1 화합물(또는 다수의 화합물들)을 검정 플레이트의 한 행(row)에 도말한 다음, 그 검정 플레이트의 한 열(column)에 도말한다. 이것을 스톡 플레이트의 두 번째 웰에 있는 제 2 화합물을 가지고 반복하는데, 이때 제 1 화합물이 도말된 행과 열로부터 한 행 위에 그리고 한 열 위에 도말한다. 이러한 과정을 전체 조합 세트가 도말될 때까지 반복한다.

로봇식 도말(Robotic Plating)

조합 배열을 형성하기 위해 화합물을 웰에 첨가하는 여러가지 방법들이 있으며, 당업계의 숙련가는 후술하는 예들이 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하지 않음을 인식할 것이다.

로봇식 도말의 일례에서는 로봇식 액체 이송 장치가 사용된다. 이송 장치는, 예를 들면 Beckman Coulter(Fullerton, CA), Tecan(Research Triangle Park, NC) 또는 Zymark(Hopkinton, MA)로부터 상업적으로 입수가능하다. 로봇식 장치는 첫번째 화합물 세트의 특정 부피를 주어진 행(row)의 각 웰에 도말하므로, 행 1이 동일한 화합물을 보유하고 행 2가 동일한 화합물을 보유하는 식으로 동일 행은 동일 화합물을 보유하게 된다. 이어서, 액체 이송 장치는 열(column)을 따라 동일한 화합물 세트를 도말하여 각 열마다 동일 화합물을 수용하게 된다(상이한 열은 상이한 화합물을 보유한다). 이송 장치는 작은 부피(예를 들면, 1nL)를 이송하기에 적합하게 될 수 있다.

효율적인 이송을 위한 또다른 방법은 잉크젯 인쇄 기술을 활용하는 것이다(Gordon et al., J. Med. Chem. 1994, 13:1385-1401; Lemmo et al., Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:615-617). 잉크젯 프린터기가 시험 화합물들이 들어 있는 여러개의 용기로부터 화합물을 빨아들인다; 공급웰(source well)로부터의 각 화합물이 각 화합물을 위한 개개의 행 및 열의 표면에 인쇄 또는 주입된다. 상술한 바와 같이, 다음 화합물이 다음 행 및 다음 열에 인쇄되며, 전체 격자(grid)에 화합물 조합들이 도말될 때까지 이 과정이 반복된다.

검정 플레이트에 화합물을 첨가하기 위한 또다른 방법은 DNA를 점적하기 위해 스탠포드 대학의 패트릭 브라운(Patrick Brown)에 의해 개발된 미세배열 점적기(microarray spotter)를 사용하는 것이다. 이 장치는 8-깃촉펜(eight-quill pen) 인쇄 헤드, 및 스톡 플레이트에 잠겨있으며 매 행을 따라 인쇄되는 8 선형 깃촉헤드(quillhead)를 사용한다. 이어서, 상기 플레이트를 90도 회전시키거나 또는 인쇄 헤드를 90도 회전시킨다; 그런 다음, 인쇄 헤드가 열을 따라 인쇄한다. 인쇄 헤드의 크기를, 예를 들면 2, 4 또는 16 인쇄 헤드를 사용하여 표준 384 웰 프레이트에 맞게 변화시킬 수 있으며, 더 높은 밀도의 플레이트의 경우에는 더 많은 수의 인쇄 헤드를 사용하여 인쇄 헤드의 크기를 변화시킬 수 있다.

검정 플레이트에 화합물을 첨가하기 위한 또다른 방법은 Hydra(Robbins Scientific, Sunnyvale, CA)라고 불리우는 상업적으로 입수가능한 장치를 사용하는 것인데, 이 장치는 화합물의 표준 스톡 플레이트로부터 알려진 부피를 점적할 수 있는 384개의 분리된 시린지(syringe)들을 구비하고 있다.

시험 화합물을 도말하기 위한 대체 방법은 Caliper Technologies(Mountain View, CA)로부터 입수가능한 것과 같은 마이크로플루이딕스 시스템을 사용하는 것으로, 이러한 조합을 생성할 배열을 형성하는데 그 시스템을 직접 적용하는 것이다. 이 경우, 마이크로 규모의 조합 배열은 화합물 용액들을 매트릭스 상의 교차점에 분산하기 위한 모세관 흐름(capillary flow)을 사용하여 형성된다.

대체 도말 방법

당업계의 숙련가는 임의의 플레이트 형태가 본 발명의 스크리닝 방법에 적용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 16X16 정방형 플레이트는 16X24 플레이트 내의 384웰 대신에 256개의 웰을 가진다. 이는 액체가 오로지 행을 따라서 또는 열을 따라서만 첨가되는 임의의 액체 첨가 장치를 사용하는 것을 허용하는데, 그 이유는 정방형 플레이트를 단순히 90도 회전시킴으로써 다른 방향으로도 첨가할 수 있기 때문이다. 또한, 사용된 미소정방형(microsquare) 플레이트가 임의의 기존 플레이트 액체 취급 장치에 들어맞도록 이러한 디자인에 표준 96웰 또는 384웰 마이크로타이터 플레이트의 치수 또는 족문(footprint)을 갖는 정방형 플레이트 홀더를 도입할 수 있다.

조합하여 시험될 화합물 또는 엘리먼트를 제공하기 위한 또다른 방법은 그들을 액체 형태보다는 오히려 고체 형태로, 예를 들면 소량의 건조 분말로 제공하는 것이다. 즉, 두 가지 건조 성분들(또는 한 가지 습윤 성분과 한 가지 건조 성분)을 혼합한 다음, 그 조합을 배지(조합된 엔티티들이 가용성인) 내의 세포에 첨가하는 것이 가능하다. 고형 화합물에는 상이한 화합물이 첨가된, 조합 합성으로부터의 비드가 포함된다. 예를 들면, 비드 피커를 사용하여 비드를 첨가할 수 있다. 일 실시예에서, 비드는 자성이며 자석을 사용하여 첨가된다.

본 발명의 로봇식 응용의 고처리량 검정에서, 각 웰은 공간적으로 독립적으로 어드레스로 끄집어낼 수 있어야 하며, 바람직하게는 스톡 플레이트로부터 각 화합물을 대량(최대 100uL) 및 소량(최하 1nL)으로 취하는 것이 가능하다. 본 발명의 조합 스크리닝 검정을 수행하기 위한 예시적인 로봇식 플랫폼을 이하에서 설명한다.

2 스테이션 로봇식 플랫폼(2 station robotic platform)이 형성된다. 제 1 스테이션은 VWR(cat#62409-608)로부터 구입가능한 것과 같은 핀 이송 장치(pin trasfer device)가 부착된 단순한 XYZ 로봇식 팔을 가지고 있다. 스톡 플레이트 및 검정 플레이트가 스테이션으로 들어가면, 로봇식 팔이 핀들을 스톡 플레이트에 담갔다가 이 핀들을 검정 플레이트로 옮김으로써, 핀 크기에 따라 1-1000nL를 운반한다(가장 전형적으로는 50nL가 운반된다). 상이한 핀 장치들은 본 실시예에서 상술한 바와 같이 상이한 화합물 조합들을 운반하는 것을 허용한다. 로봇의 제 2 스테이션은 단일 화합물의 스톡 웰로부터 대량(최대 10uL)을 취하여 소량을 검정 플레이트의 각 웰에 분배할 수 있는 압전식 디스펜서(piezoelectric dispensor)이다. 예를 들면, Ivek Digispense 2000 시스템(http://www.ivek.com/digi2000.html)이 10nL의 해상도(resolution)를 가지고 있으며, 이러한 목적에 충분하다.

비화합물 조합 시약

전체 플레이트에 걸쳐 있는 조합 시약(combination reagent)이 화합물이 아니라면(즉, 어떤 형태의 방사라면), 세포 및 첨가된 화합물(들)을 함유하는 플레이트를 그 방사원(radiation source)에 통과시킴으로써 조합 형성을 완성할 수 있다. 다른 형태의 비화합물 조합 시약은, 예를 들면 고압(hyperbaric pressure) 및 열을 포함한다.

어떤 비화합물 시약들은 화합물의 첨가와 유사한 방식으로 변화될 수 있다. 예를 들면, pH를 바꾸기 위해, 상이한 양의 염기 또는 산을 웰에 첨가할 수 있다. 유사하게, 화합물 첨가에 적용가능한 임의의 방법을 사용하여 이온을 첨가할 수 있다.

도서관 크기

작은 화학 도서관(<1000 화합물들)의 경우, 모든 이원성 조합들(최대 오십만개의 조합들) 및 삼원성 조합들(최대 수억개의 조합들)이 본원에 기술된 장치를 사용하여 시험될 수 있다.

조합의 위력은 다변가능한 치료제(multivariable therapeutics)를 동정하는데 효과적인 도서관을 신속하게 생성한다. 다변가능한 치료제 도서관의 규모는 통상적으로 이용가능한 모든 다양성(diverse) 또는 비다양성(non-diverse) 도서관과 급속히 경쟁하여 그 이상으로 팽창한다. 쌍 방식으로(pair-wise) 조합된 200가지 화합물들로 구성된 도서관은 19,900 조합들로 구성된 다변가능한 치료제 도서관을 생성하며, 이의 규모는 세포 분열에 영향을 미치는 신규 화합물들을 동정하기 위해 최근에 사용되는 천연 산물 도서관보다 더 큰 것이다(Mayer et al., Science, 1999, 286, 971-974). 3원 방식으로(3-way) 조합된 300가지 화합물들로 구성된 도서관은 다변가능한 치료제 도서관용의 4백5십만개의 상이한 엔티티 조합들을 생성하는데, 이의 규모는 현재 생성된 가장 큰 조합 화학 도서관(combinatorial chemistry library)보다 더 큰 것이며 잠재적으로 더 큰 다양성을 가지고 있다.

활성 등급 순위 스크리닝(Activity Rank-Order Screen)

다양성 도서관(diverse library)은 표준 방법론을 사용하여 개별적으로 초기에 시험될 수 있다. 화합물들을 생물학적 검정법으로 스크리닝하고 활성에 따라 등급을 매긴다. 이어서, 도서관 내에서 가장 활성이 큰 화합물들(예를 들면, 검정될 조합 공간의 양에 따라, 상위 20개의 화합물 또는 상위 1000개의 활성 화합물)을 쌍 방식(pair-wise) 조합 및 3원 방식(3-way) 조합으로 시험한다. 원하는 경우, 이들 조합을 활성에 따라 다시 등급을 매긴 후, 원하는 수의 효능 조합이 동정될 때까지 4원 방식(4-way) 조합, 5원 방식(5-way) 조합 등에 대해 이 과정을 반복한다.

유전적 알고리즘

유전적 알고리즘(genetic algorithm)의 사용은 단일 제제 그 자신과는 구별되는 원하는 생물학적 활성을 가진 제제들의 조합을 동정하기 위한 또다른 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 각 단일 제제들은 고유 바코드(unique barcode)를 부여받는데, 이 바코드는 일련의 숫자, 문자 또는 다른 기호일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 바코드는 2진(binary) 코드(0과 1로 구성된)이다. 제한된 수(N, "집단 크기(population size)")의 쌍 방식 조합들이 가능한 쌍 방식 조합들로 구성된 전체 풀(pool)로부터 선별되고(무작위로 또는 어떤 다른 특질에 근거하여), 이들 조합 각각의 활성이 결정된다. 그 집단 중에서 X 개의 가장 활성이 큰 구성원들이 선별된다(여기서 X는 N보다 작다). (i) 복제[replication](원래의 조합이 단순히 재선별된다), (ii) 변이[mutation](바코드의 한 비트가 다른 수치로 변화된다), 및 (iii) 재조합[recombination](두개의 바코드를 중간 지점에서 각각 분할한 후 대향하는 말단(apposing ends)을 연결하여 두 개의 새로운 혼성 바코드를 만든다)을 포함하는 일련의 연산자를 사용하여 N개의 새로운 조합들이 상기 X 개의 활성 조합들로부터 형성된다. 이러한 선별, 증폭, 변이, 및 재조합 과정을 수 싸이클 반복하며, 각 싸이클의 종료시점에 각 제제 조합의 활성을 측정한다. 이는 매우 효과적인 제제 조합의 발견을 여전히 허용하면서 제한된 수의 조합들을 시험하는 방법을 제공한다.

유전적 알고리즘의 파라미터들을 최적화하기 위한 방법은 다음과 같다: N가지 제제들의 C가지 조합들을 연구를 위해 선별한다. (N!)/((N-C)!(C!)) 조합의 전체 세트의 각 구성원들의 활성을 측정한다. 더 나아가, 모든 하위 조합들 역시 측정할 수 있다. 이러한 전체 활성 데이터 세트를 사용하면, 더 이상의 "습식(wet)" 작업을 하지 않고 다양한 알고리즘 또는 단일 알고리즘의 다양한 순열(permutation)의 성공률 및 효능을 평가하는 것이 가능하다. 즉, 활성 조합을 발견하기 위한 모든 전략들이 "in silico"에서 비교될 수 있으며, 그들의 상대적인 효능이 비교될 수 있다.

스톡 용액

두 가지 유형의 스톡 용액들이 보존된다. 각 화합물은 두 가지 스톡 형태로 보존된다. 첫번째 스톡 용액 형태는 4mM의 최종농도로 디메틸술폭시드(DMSO) 100uL에 용해된 화합물로 구성되며, 384 웰 폴리프로필렌 플레이트(Matrix Technologies)에 보관된다. 두번째 스톡 용액은 4mM의 최종농도로 DMSO 1500uL에 용해된 화합물로 구성되며, 디프(deep)-웰 96 웰 폴리프로필렌 플레이트에 보관된다. 각 유형의 플레이트의 다수의 사본(copy)을 만든다. 스톡 플레이트의 한 사본은 일상적인 사용을 위해 -20℃에 보관하고, 백업(backup) 사본들은 장기 저장을 위해 -80℃에 보관한다.

검정 플레이트

세 가지 유형의 검정 플레이트들이 사용된다. 상술한 핀 이송 장치 내의 핀들의 크기는 각 칫수의 검정 플레이트에 맞게 조절된다.

1) 시판되는 384 웰 플레이트(예를 들면, NalgeNunc 뚜껑이 있는 세포배양-처리된 멸균된 백색 불투명 폴리스티렌 플레이트, cat# 164610)

2) 시판되는 1536 웰 플레이트(예를 들면, Greiner 또는 Corning)

3) 주문제작된 1536 또는 6144 웰 플레이트(폴리디메틸실록산으로 만들어진, Dow Corning) 및 델란 주형(delran mold), 및 옴니 트레이(Omni tray)

화합물 첨가 관리 프로그램

마이크로소프트 비쥬얼 베이직(Microsoft Visual Basic) 또는 프로그래밍 언어가 통상의 프로그래밍 기술을 사용하여 상술한 장치들을 조작하기 위한 소프트웨어를 만드는데 사용된다. 상기 소프트웨어는 그 장치가 스톡 플레이트 또는 검정 플레이트의 바코드를 판독하고, 검정 데크(assay deck) 상의 플레이트의 위치를 추적한 후, 올바른 화합물의 적정량을 올바른 검정 웰로 옮기는 것을 허용한다. 이와 같이 스크리닝될 모든 조합들은 미리 결정 또는 선별되고, 장치는 자동화된 방식으로 조합 스크리닝을 수행하므로, 특정 플레이트는 검정 데크 위로 옮기고 특정 플레이트는 검정 데크로부터 인큐베이터로 옮기는 것과 같은 간단한 조작 단계만이 요구된다.

바코드 판독기 및 인쇄기

각 플레이트에 고유의 표식 숫자(unique identification number)를 매기고 라벨에 바코드를 인쇄한 다음 그 라벨을 검정 플레이트 또는 스톡 플레이트 상에 붙이기 위해, 표준 기술을 사용하는 바코드 인쇄기를 사용한다. 소프트웨어가 각 검정 플레이트 및 스톡 플레이트의 각 웰 내의 각 화합물의 정체를 기록한다. 검정 데크에 연결된 바코드 판독기가 검정 데크 내로 들어갔다가 빠져나오면서 각 플레이트를 스캐닝한다.

후술하는 실시예들은 설명을 위해 제공된 것일 뿐, 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 의도되어서는 안된다.

실시예 1

도 1은 두 가지 시약들이 어떻게 한 세포 내에서 상승작용적으로 작용할 수 있는가를 보여주는 개념적인 개략도로, 여기서 상기 시약들은 동일 세포내의 상이한 표적들에 결합한다. 본 도면에서, 화합물 A(10) 및 화합물 B(12)는 포유동물 세포의 원형질막(14)을 횡단하여 시토졸 영역 내로 자유롭게 확산된다. 화합물 A는 키나아제인 단백질 X(16)에 결합하여 이 키나아제의 활성을 저해한다. 키나아제 X는 보통 전사인자 Y(18)에 인산기를 부가함으로써 전사인자 Y를 불활성화 시킨다. 일단 화합물 A가 키나아제 X를 저해하면, 전사인자 Y가 활성화된 후 핵 내로 전치되어 인슐린과 같은 치료 유전자의 인핸서 영역 내의 DNA에 단단히 결합한다. 그러나, 전사인자 Y는 제 2의 전사인자 Z(20)가 없으면 인슐린의 발현을 활성화시킬 수 없다. 하지만, 본 도면에서는, 화합물 B가 전사인자 Z에 결합하여 이 전사인자의 자가저해성 루프(autoinhibitory loop)를 제거함으로써 전사인자 Z가 핵내로 전치되어 전사인자 Y에 결합하게 한다. Y 및 Z는 단독으로는 못하나 함께 치료 유전자인 인슐린의 발현을 활성화시킨다.

도 2는 두 가지 시약들이 어떻게 한 유기체 내에서 상승작용적으로 작용할 수 있는가를 보여주는 개념적인 개략도로, 여기서 상기 시약들은 상이한 세포들 또는 조직들 내의 표적에 결합한다. 본 도면에서 화합물 A(50)는 췌장(54)의 베타 섬 세포(52) 내로 확산된다. 화합물 A는 인슐린(56)을 암호하는 치료 유전자가 이들 세포 내에서 발현되도록 한다. 그러나, 인슐린은 지방 조직내의 표적 지방세포(adipocyte) 상에 인슐린 수용체가 없으면 효과가 없다. 한편, 화합물 B는 지방 조직(60) 내의 지방 세포(58) 내로 확산되어, 이들 세포에서 인슐린 수용체 (62)의 발현을 개시시킨다. A 및 B는 단독으로는 못하나 함께 이 개체에서 인슐린 활성이 복원되는 것을 가능케 한다.

도 3은 본 발명자들이 본원에 기술한 종류의 조합 스크리닝에서 얻을 수 있는 실험 데이터의 예이다. 5개의 상이한 384 웰 플레이트들로부터의 결과가 도시되어 있다. 결과는 플레이트 형식으로 도시되어 있으며, 여기서 16개의 행(row)은 A부터 P까지 표시되어 있고, 24개의 열(column)은 1부터 24까지 표시되어 있다. 활성 수준이 각 웰에 숫자로 도시되어 있는데, 여기서 1은 기초 활성(효능 없음)을 나타내고, 5는 활성 조합을 나타낸다. 플레이트 1은 A549 인간 폐암 세포에서의 세포주기 저지 활성에 대한 브로모데옥시우리딘 싸이토블랏 검정에서 4ug/mL의 농도로 시험하였을 때의 화합물 1-384의 활성을 보여준다. 플레이트 2는 동일한 검정에서 2ug/mL의 농도로 시험하였을 때의 화합물 1-384의 활성을 보여준다. 플레이트 3은 동일한 검정에서 4ug/mL의 농도로 시험하였을 때의 화합물 385-768의 활성을 보여준다. 플레이트 4는 동일한 검정에서 2ug/mL의 농도로 시험하였을 때의 화합물 385-768의 활성을 보여준다. 플레이트 1-4에서 화합물 중의 어느 것도 활성을 시현하지 않았음에 주목하라. 플레이트 5는 2ug/mL의 농도로 시험하였을 때의 화합물 1-768의 384개 쌍 방식 조합들의 활성을 보여준다(즉, 화합물 1-384 및 화합물 385-768 양자를 검정 플레이트에 각 화합물의 농도가 2ug/mL이 되게 첨가하여 384개의 상이한 무작위 쌍 방식 조합들을 생성한다). 웰 A1이 활성을 시현함에 주목하라. 이것은 화합물 1(화합물 1-384를 함유한 플레이트의 웰 A1에 있는)이 그 자체로는 활성이 없고, 화합물 385(화합물 385-768을 함유한 플레이트의 웰 A1에 있는)도 그 자체로는 활성이 없지만, 화합물 1과 385가 함께 상승작용하여 활성 조합을 형성함을 의미한다.

실시예 2

일반적 방법

도 4는 현재 상업적으로 입수가능한 기술을 사용하여 조합 스크리닝을 수행하는 방법의 개략도이다. A549 인간 폐암 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, cat# CCL185)로부터 구입되며, 10% FBS, 100유닛/mL 페니실린 G 나트륨, 100ug/mL 스트렙토마이신 설페이트, 및 2mM 글루타메이트가 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(GibcoBRL, Rockville, MD)(이하, 10% 배지라 함) 내에서 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양된다. 4천개의 세포들이 Multidrop 384 액체 디스펜서(110)(Labsystems Microplate Instrumentation Division, Franklin, MA)를 사용하여 백색의 불투명한 384 웰 플레이트(100)(Nalge Nunc International, Rochester, NY)의 각 웰에 접종된다. 세포들은 10%-FBS 함유 배지 40uL 내에 접종된다.

5% CO₂, 37℃ 조건에서 16시간이 지난 후, 10% 배지내의 관심있는 화합물의 50uM 스톡 10uL를 각 웰에 첨가하고, 전체 웰 부피를 40uL로 맞추어 이 화합물의 최종 농도가 10uM가 되게 한다. 이렇게 하기 이전에, 또는 그 직후에, 또는 수시간 또는 수일 후에, 핀 어레이(130) 상의 작은 핀들을 스톡 플레이트(140 또는 150)의 각 웰에 담갔다가 검정 플레이트(100)의 각 웰에 담금으로써 두번째 화합물 세트가 첨가된다. Matrix Technologies Pin Transfer 장치(130)(384 또는 96 핀)면 충분할 것이다(cat# 350500130 또는 350510203). 이러한 2 단계 과정은 여러가지 쌍 방식 조합으로 한 특정 화합물을 다수의 다른 화합물들에 대하여 시험해 보는 것을 가능케 한다. 신규한 특성이 그 조합에 의해 달성되었는지 여부를 확인하기 위해, 핀에 의해 운반된(pin-transferred) 화합물 세트가 원래의 화합물(모든 웰에 존재하는 상기 한 특정 화합물)의 부재하에 시험되는 플레이트도 가지는 것이 필요하다.

또한, 다른 방법이 시험 엘리먼트와 접촉하기 위한 화합물 조합들을 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상술한 바와 같이 한가지 화합물을 쌍 방식 조합들 전체에 걸쳐 고정하는 대신에, 한 세트의 화합물들을 그 세트의 모든 쌍 방식 조합들이 달성되는 방식으로 핀 운반(pin transfer)하는 것이 가능하다. 16가지 화합물들로 구성된 한 세트를 스톡 플레이트(140)로부터 384웰 검정 플레이트(100)의 16개 행으로 옮긴다. 이어서, 동일한 세트의 16가지 화합물들을 동일 검정 플레이트의 16개 열로 옮김으로써, 상이한 쌍 방식 조합들을 함유한 256 웰 매트릭스를 제공한다.

전술한 각 실시예(또는 유사 버전)에서, 일단 원하는 화합물들이 모두 첨가되면, A549 세포 및 화합물을 함유한 검정 플레이트를 인큐베이터(120) 내에서 5% CO₂와 함께 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 10uL BrdU를 Multidrop 384(110)를 사용하여 배지내의 50uM 스톡(PBS pH 7.4 내의 10mM 스톡으로부터 제조된)으로부터 10uM BrdU의 최종농도로 첨가한다. 세포를 인큐베이터(120) 내에서 5% CO₂와 함께 37℃에서 12-16 시간 동안 더 인큐베이션한다. 흡인시 사용된 가정용 진공원(house vacuum source)에 부착된 24-채널 원드(V&P Scientific)를 사용하여 각 웰로부터 상등액을 제거한다. 세포를 차가운(4℃) 70% 에탄올/30% PBS 50uL로 고정한 다음, 얼음에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 90uL의 차가운(4℃) PBS로 세척한 다음, 2M HCl/0.5% Tween20/ddH₂O를 25uL 첨가한다. 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션 한 다음, 90uL의 10% 2M NaOH/90% 항크스액(HBSS, GibcoBRL)으로 세척하고, 90uL의 HBSS로 2회 세척한 다음, 75uL의 PBSTB(PBS, 0.1% Tween 20(Sigma), 0.5% 우혈청 알부민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))로 1회 세척하였다. 그런 다음, 마우스 항-BrdU 항체(스톡의 1:1000 희석액, BD Biosciences-PharMingen, San Diego, CA) 0.5ug/mL 및 PBSTB 내의 HRP에 콘쥬게이트된 항-마우스 Ig 항체(Amersham Pharmacia bitech Inc., Piscataway, NJ)의 1:2000 희석액을 함유하는 항체 용액 20uL를 첨가하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 90uL PBS로 2회 세척하고, 각 웰에 20uL HRP 기질 용액을 첨가하였다. HRP 기질 용액은 Amersham ECL 검출 킷트에 들어 있는 용액 1과 2를 동일 부피로 혼합함으로써 얻어진다. 플레이트를 LJL Biosystems Inc.(Sunnyvale, CA) Analyst AD 플레이트 판독기(160) 내에 놓은 다음, 0.3초 동안 각 웰 내의 발광을 측정하였다. 이어서, 조합들의 활성을 원래 농도와 원래 농도의 N 배 농도에서의 단일 제제 단독의 활성과 비교하였는데, 여기서 N은 스크리닝에서 발견된 활성 화합물들의 수와 동일하다. 만일 조합이 원래 농도와 원래 농도의 N 배 농도에서의 각각의 단일 제제 단독의 활성보다 더 큰 활성을 시현한다면, 상승작용 효과가 관찰된다. 상승작용이 관찰되지 않는 경우에조차, 조합은 그 조합을 구성하는 개개의 구성요소에 비하여 유리한 잇점(예를 들면, 감소된 부작용)을 지니고 있을 수 있다.

전술한 방법은 3원 방식(3-way) 조합을 시험할 수 있도록, 첫번째 단계에서 두 가지 상이한 화합물들이 첨가되도록 쉽게 변형될 수 있다. 마찬가지로, 4원 방식(4-way) 조합을 시험할 수 있도록 세 가지 화합물들이 첨가될 수도 있다. 그러한 접근법을 사용하여, 더 높은 차수의 화합물 조합들이 시험된다.

증식(proliferation)을 저해하는 화합물 조합의 동정을 후술한다. 이 기술은 설명을 위한 것으로 어떤 식으로든 본 발명을 제한해서는 안된다.

7가지 화합물들을 단독으로, 그리고 21개의 가능한 쌍 방식 조합으로 BrdU 싸이토블랏 검정법(하기 참조)에 의해 그들이 세포 주기 진행에 미치는 영향에 관하여 시험하였다. 7가지 화합물들(포도필로톡신(podophylotoxin), 파클리탁셀(paclitaxel), 퀸아크린(quinacrine), 베프리딜(bepridil), 디피리다몰(dipyridamole), 프로메타진(promethazine), 및 아그로클라빈(agroclavine); 각각은 Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MO)로부터 구입되었음)을 1g 유리 바이알 내에 무게를 재어넣은 다음, 디메틸술폭시드에 용해시켜 4mg/mL 스톡 용액들을 제조하였다. 6천개의 A549 폐암 세포들을 NalgeNunc의 384-웰 백색 불투명 세포배양-처리 플레이트(cat# 164610)의 각 웰 내의 10% 배지(모두 Life Technologies로부터 구입한 10% 우태아 혈청, 100 유닛/mL 페니실린 G 나트륨, 100ug/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 2mM 글루타민이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium) 30uL에 접종하였다. 각 화합물들을 최종 검정 농도(최종 검정 농도는 0.25% DMSO, 240nM 포도필로톡신, 60nM 파클리탁셀, 420nM 퀸아크린, 25uM 베프리딜, 400nM 디피리다몰, 25uM 프로메타진, 840nM 아그로칼빈 이었음)의 4배로 10% 배지 내에 희석하였다. 배지 내의 각 화합물의 4X 스톡 15uL를 8X8 정방형 플레이트(8줄은 오로지 비히클 DMSO만을 함유하는)의 한 행 및 한 열에 첨가하여, 7가지 화합물들의 모든 가능한 2원 조합은 물론 단일 제제 단독이 시험되도록 하였다. 세포를 5% CO₂, 37℃ 조건에서 46시간 동안 인큐베이션하였다. BrdU를 10% 배지 내의 50uM Brdu 용액을 15uL 첨가함으로써 최종농도가 10uM가 되도록 첨가하였다. 세포를 5% CO₂, 37℃ 조건에서 밤새 인큐베이션하였다.

16시간 후에 배지를 각 웰로부터 가정용 진공원에 부착된 24 채널 원드(V & P Scientific)를 사용하여 흡인하였다. 70% 에탄올/30% 인산완충식염수(4℃) 15uL를 뒤이은 모든 액체 첨가 단계에서 사용된 Multidrop 384 플레이트 필러(Labsystems)를 사용하여 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 웰 내의 액체를 흡인하고, 0.5% Tween 20이 함유된 2M HCl 25uL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 2M NaOH 25uL를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰 내의 액체를 흡인한 후, 웰을 항크스액 75uL로 2회 세척하였다. 웰을 다시 75uL의 PBSTB(0.5% 우혈청 알부민 및 0.1% Tween 20이 함유된 인산완충식염수)로 세척하였다. 0.5ug/mL 항-BrdU 항체(PharMingen) 및 항-마우스 Ig-HRP(Amersham)의 1:2000 희석액을 함유하는 항체 용액 20uL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항체 용액과 함께 인큐베이션한 다음, 항체 용액을 흡인하여 버리고, 각 웰을 인산완충식염수로 1회 세척하였다. 마지막으로, ECL 검출 시약(Amersham ECL 검출 시약의 용액 1과 용액 2의 등량 혼합물) 20uL를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 발광을 LJL Analyst 플레이트 판독기를 사용하여 웰 당 0.2초의 적분시간(integration time)으로 판독하였다. 상기 실험을 두 개의 플레이트에서 반복하였으며, 각 쌍 방식 조합을 총 16개의 모사 실험(replicate expriment)에서 시험하였다. 표에 나타낸 데이터는 각 화합물 조합의 평균 항증식 활성을 나타낸다. 5개의 통계학적으로 의미있는(p < 0.001) 조합들이 강조되어 있다. 모든 활성은 아무런 처리도 받지 않은 세포를 함유하는 일군의 웰에 대하여 표준화된다. 따라서, 1이라는 값은 불활성 물질을 나타내고, 1을 초과하는 값은 어떤 수준의 항증식 활성을 나타낸다.

상기 도표는 개별 성분들의 항증식 활성과 구분되는 항증식 활성을 보유한 기존의 FDA-승인 약물들의 5가지 조합을 보여준다. 포도필로톡신 및 파클리탁셀은 둘 다 유사분열시 세포를 저지하는 미세소관 안정화제(microtubule stabilizer) 이고, 디피리다몰은 항-혈소판제(anti-platelet agent)이며, 베프리딜은 칼슘 채널 차단제이고, 프로메타진은 H1 히스타민 수용체 길항약인 동시에 CNS 안정제(depressant) 및 항 콜린작용제(anticholinergic agent)로도 사용된다. 디피리다몰은 일반적으로, 특히 파클리탁셀 및 포도필로톡신의 독성 부작용과 비교하여, 인체용 치료제로서 비교적 높은 안전성 프로파일(safety profile)을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 검정에서, 디피리다몰은 인간 폐암 세포에 대한 파클리탁셀 및 포도필로톡신의 항증식 효과를 향상시킨다. 또한, 베프리딜은 포도필로톡신의 효과를 향상시키나, 파클리탁셀의 효과는 저해한다. 이러한 결과는 이전에는 예측되지 못했으며, 약물들간의 예상치 못한 상호작용을 관찰하기 위한 경험적인 고처리량 조합 시험의 중요성을 강조하는 것이다. 예를 들면, 베프리딜 및 프로메타진은 둘 다 통상의 치료 조치에서는 항증식제로서 사용되지 않지만, 연합하여 폐암 세포의 증식을 강력하게 저해한다.

기타 구현예

상기 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허들은 본원에 참고자료로 첨부된다. 상술한 본 발명의 방법 및 장치들의 다양한 개량 및 변형이 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 연관하여 기술되었을지라도, 청구된 본 발명이 그러한 특정 구현예로 부당하게 제한되어서는 않됨을 이해하여야 한다. 게다가, 약물 전달 분야 및 관련 분야의 숙련가에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위한 기술된 양태들의 다양한 개량은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims

다음의 단계들을 포함하는, 동물에 대한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방식으로 생존 세포의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 2 또는 그 이상의 화합물들의 목적 조합을 검출하는 방법:

(a) 7개 이상의 서로 상이한 화합물들의 49개 이상의 조합들을 제공하는 단계;

(b) 각각의 고유한 조합을 각각의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 시험관내 (in vitro)에서 생존 시험 세포 (living test cell)와 접촉시키는 단계;

(c) 각 조합의 시험 세포에 대한 효과의 표시로서 시험 세포들의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계,

(d) 치료 효능의 가능성을 나타내는, 시험 세포의 생물학적 특성에 영향을 미치는 조합을 동정하는 단계; 및

(e) 상기 방법 수행 중 어느 때라도, 단계 (d)에서 동정된 조합 중의 각 화합물을 상기 생존한 시험 세포와 접촉시킨 후 상기 시험 세포에 대한 각 화합물의 효과의 표시로서 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 여기서 상기 조합의 시험 세포에 대한 생물학적 효과가 각 화합물의 상기 시험 세포의 생물학적 효과에 대한 각각의 효과 보다 양적 및 질적으로 뛰어나다면 상기 단계 (d)에서 동정된 조합이 목적으로 하는 조합인 단계.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 상기 화합물들의 조합들을 상기 시험 세포와 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 싸이토블랏 검정(cytoblot assay)에 의해 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 리포터 유전자 검정(reporter gene assay)에 의해 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 형광 공명 에너지 전이 검정(fluorescence resonance energy transfer assay)에 의해 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 형광 칼슘-결합 지시자 염료(fluorescent calcium-binding indicator dye)의 검출에 의해 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 형광 현미경(fluorescence microscopy)을 사용하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 단계 (c)가 발현 프로파일링(expression profiling)을 사용하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포가 암세포, 면역세포, 뉴런 및 섬유아세포, 세균 세포, 및 진균 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 로봇식 시스템 (robotics system)을 사용하여 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 마이크로플루이딕스(microfluidics)를 사용하여 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 잉크젯 프린터(ink-jet printer) 기술을 사용하여 수행되는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 화합물들이 비중합성 유기 화합물 (non-polymeric organic compounds), 지질, 탄수화물, 펩티드, 무기 화합물 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 화합물들 중의 적어도 하나가 정제된 형태로 사용되는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 화합물 각각이 정제된 형태로 사용되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화합물들이 혼합물의 성분으로서 제공되는 화합물인 방법.
제 22항에 있어서, 상기 혼합물이 천연 산물 추출물 (natural product extracts)인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 효과가 상승작용 효과 (synergistic effect)인 방법.
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다음의 단계들을 포함하는, 동물에 대한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방식으로 생존 세포의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 2 또는 그 이상의 화합물의 조합을 검출하는 방법:

(a) 7개 이상의 서로 상이한 화합물들의 200개 이상의 고유한 조합들을 제공하는 단계;

(b) 각각의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 시험관내 (in vitro)에서, 각각의 고유한 조합을 생존 시험 세포 (living test cell)와 접촉시키는 단계;

(c) 각 조합의 시험 세포에 대한 효과의 표시로서 시험 세포들의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계,

(d) 치료 효능의 가능성을 나타내는, 시험 세포의 생물학적 특성에 영향을 미치는 조합을 동정하는 단계; 및

(e) 상기 방법 수행 중 어느 때라도, 단계 (d)에서 동정된 조합 중의 각 화합물을 상기 생존한 시험 세포와 접촉시킨 후, 시험 세포에 대한 각 화합물의 효과의 표시로서 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 여기서 상기 조합의 시험 세포에 대한 생물학적 효과가 각 화합물의 상기 시험 세포의 생물학적 효과에 대한 각각의 효과 보다 양적 및 질적으로 뛰어나다면 상기 단계 (d)에서 동정된 조합이 목적으로 하는 조합인 단계.
제 28항에 있어서, 상기 단계 (b)가 상기 화합물들을 상기 시험 세포와 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 방법이 상기 단계 (a) 내지 (e)를 2회 이상 반복하는 (f) 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 (b) 단계에서의 적어도 200개의 조합들이 매회 반복시마다 상이한 방법.
제 30항에 있어서, 상기 (f) 단계의 2회 이상의 반복이 서로 10일 이내에 수행되는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 접촉 단계 (b)가 화합물들의 400개 이상의 2 또는 그 이상의 화합물들의 고유한 조합들을 시험세포와 개별적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 접촉 단계 (b)가 화합물들의 1540개 이상의 2 또는 그 이상의 화합물들의 고유한 조합들을 시험세포와 개별적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
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제 28항에 있어서, 상기 화합물들이 비중합성 유기 화합물, 지질, 탄수화물, 펩티드, 무기 화합물 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
삭제
제 28항에 있어서, 상기 화합물들 중의 적어도 하나가 정제된 형태로 사용되는 화합물인 방법.
제 28항에 있어서, 상기 화합물 각각이 정제된 형태로 사용되는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 화합물들이 혼합물의 성분들로서 제공되는 화합물인 방법.
제 39항에 있어서, 상기 혼합물이 천연 산물 추출물인 방법.
제 28항에 있어서, 상기 효과가 상승작용적인 효과인 방법.
제 28항에 있어서, 상기 단계 (b)가 로봇식 시스템을 사용하여 수행되는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 단계 (b)가 마이크로플루이딕스(microfluidics)를 사용하여 수행되는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 단계 (b)가 잉크젯 프린터(ink-jet printer) 기술을 사용하여 수행되는 방법.
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다음의 단계들을 포함하는, 동물에 대한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방식으로 생존 세포의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 2 또는 그 이상의 화합물들의 조합을 검출하는 방법:

(a) 7개 이상의 서로 상이한 화합물들의 49개 이상의 조합들을 제공하는 단계;

(b) 각각의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 시험관내 (in vitro)에서, 각각의 고유한 조합을 생존 시험 세포 (living test cell)와 접촉시키는 단계;

(c) 각 조합의 시험 세포에 대한 효과의 표시로서 시험 세포들의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계,

(d) 치료 효능의 가능성을 나타내는, 시험 세포의 생물학적 특성에 영향을 미치는 조합을 동정하는 단계;

(e) 상기 방법 수행 중 어느 때라도, 단계 (d)에서 동정된 조합 중의 각 화합물을 상기 생존한 시험 세포와 접촉시킨 후 시험 세포에 대한 각 화합물의 효과의 표시로서 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 여기서 상기 조합의 시험 세포에 대한 생물학적 효과가 각 화합물의 상기 시험 세포의 생물학적 효과에 대한 각각의 효과 보다 양적 및 질적으로 뛰어나다면 상기 단계 (d)에서 동정된 조합이 목적으로 하는 조합인 단계; 및

(f) 상기 (a) 내지 (e) 단계를 매회 반복시마다 상이한 조합을 사용하여 1주일 이상의 기간에 걸쳐 적어도 25회 반복하는 단계.
제 48항에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (e)가 매회 상이한 배열을 사용하여 30일 이상의 기간에 걸쳐 적어도 100회 반복되는 방법.
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제 48항에 있어서, 상기 화합물들이 비중합성 유기 화합물, 지질, 탄수화물, 펩티드, 무기 화합물 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
삭제
제 48항에 있어서, 상기 화합물들이 정제된 형태로 사용되는 화합물인 방법.
제 48항에 있어서, 상기 화합물들이 혼합물의 성분으로서 제공되는 화합물인 방법.
제 54항에 있어서, 상기 혼합물이 천연 산물 추출물인 방법.
제 48항에 있어서, 상기 효과가 상승작용적인(synergistic) 효과인 방법.
제 48항에 있어서, 상기 단계 (b)가 로봇식 시스템을 사용하여 수행되는 방법.
제 48항에 있어서, 상기 단계 (b)가 마이크로플루이딕스(microfluidics)를 사용하여 수행되는 방법.
제 48항에 있어서, 상기 단계 (b)가 잉크젯 프린터(ink-jet printer) 기술을 사용하여 수행되는 방법.
다음의 단계들을 포함하는, 동물에 대한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방식으로 생존 세포의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 2 또는 그 이상의 화합물들의 조합을 검출하는 방법:

(a) 7개 이상의 서로 상이한 화합물들의 10,000개 이상의 조합들을 제공하는 단계;

(b) 각각의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 시험관내 (in vitro)에서, 각각의 고유한 조합을 생존 시험 세포 (living test cell)와 접촉시키는 단계;

(c) 각 조합의 시험 세포에 대한 효과의 표시로서 시험 세포들의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계,

(d) 치료 효능의 가능성을 나타내는, 시험 세포의 생물학적 특성에 영향을 미치는 조합을 동정하는 단계;

(e) 상기 방법 수행 중 어느 때라도, 단계 (d)에서 동정된 조합 중의 각 화합물을 상기 생존한 시험 세포와 접촉시킨 후 시험 세포에 대한 각 화합물의 효과의 표시로서 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계, 여기서 상기 조합의 시험 세포에 대한 생물학적 효과가 각 화합물의 상기 시험 세포의 생물학적 효과에 대한 각각의 효과 보다 양적 및 질적으로 뛰어나다면 상기 단계 (d)에서 동정된 조합이 목적으로 하는 조합인 단계; 및

(f) 상기 (a) 내지 (e) 단계를 10일 이상의 기간에 걸쳐 2회 이상 반복하는 단계로서, 상기 (a) 단계에서의 7개 이상의 서로 상이한 화합물들의 10,000개 이상의 고유한 조합을 제공하는 단계가 2회 이상의 반복시 매회 상이한 단계.
다음의 단계들을 포함하는, 동물에 대한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방식으로 생존 세포의 생물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 2 또는 그 이상의 화합물들의 조합을 검출하는 방법:

(a) 각각의 화합물/시험 세포의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서 시험관 내에서, 100개 이상의 화합물들을 생존한 시험 세포와 접촉시키는 단계,

(b) 상기 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계,

(c) 상기 화합물들과 접촉되지 않은 시험 세포의 생물학적 특성과 비교하여 특성에 변화를 유발하는 화합물들을 선별하는 단계,

(d) 각각의 접촉이 다른 것들로부터 격리되는 조건하에서, 선별된 화합물들의 49개 이상의 고유한 2-화합물 또는 그 이상의 화합물들의 고유한 조합을 생존 시험 세포와 접촉시키는 단계;

(e) 상기 단계 (d)의 상기 시험 세포의 생물학적 특성을 검출 또는 측정하는 단계; 및

(f) 상기 단계 (d)에서의 특성에 그 조합의 한 화합물 단독의 효과와는 상이한 효과를 미치는 화합물들의 조합을 동정하는 단계로서, 상기 동정된 화합물의 조합이 동물에서의 잠재적인 치료 효용을 갖는 단계.
제 61항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시험 세포가 상기 (d) 단계의 시험 세포와 동일한 방법.
제 61항에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 생물학적 특성이 상기 (d) 단계에서의 생물학적 특성과 동일한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화합물들 중 하나 이상이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 64항에 있어서, 상기 분자가 FDA-승인 약물인 방법.
제 64항에 있어서, 상기 화합물들 각각이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 66항에 있어서, 상기 각각의 화합물이 FDA-승인 약물인 방법.
제 1항에 있어서, 생물학적 활성에 대해 스크리닝되는 상기 각각의 조합이 2-화합물 조합인 방법.
제 1항에 있어서, 생물학적 활성에 대해 스크리닝되는 상기 각각의 조합이 3-화합물 조합인 방법.
제 28항에 있어서, 상기 화합물들 중 하나 이상이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 70항에 있어서, 상기 분자가 FDA-승인 약물인 방법.
제 70항에 있어서, 상기 화합물들 각각이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 72항에 있어서, 상기 소형 화합물들이 FDA-승인 약물인 방법.
제 28항에 있어서, 생물학적 활성에 대해 스크리닝되는 상기 각각의 조합이 2-화합물 조합인 방법.
제 28항에 있어서, 생물학적 활성에 대해 스크리닝되는 상기 각각의 조합이 3-화합물 조합인 방법.
제 48항에 있어서, 상기 화합물들 중 하나 이상이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 76항에 있어서, 상기 분자가 FDA-승인 약물인 방법.
제 76항에 있어서, 상기 화합물들 각각이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 78항에 있어서, 상기 화합물들이 FDA-승인 약물인 방법.
제 60항에 있어서, 상기 화합물들 중 하나 이상이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 80항에 있어서, 상기 분자가 FDA-승인 약물인 방법.
제 80항에 있어서, 상기 화합물들 각각이 1500 g/mole 미만의 분자량을 갖는 분자인 방법.
제 82항에 있어서, 상기 화합물들이 FDA-승인 약물인 방법.
제 61항에 있어서, 상기 화합물들중 적어도 하나가 FDA-승인 약물인 방법.
제 61항에 있어서, 상기 화합물들 각각이 FDA-승인 약물인 방법.
제 61항에 있어서, 스크리닝되는 각각의 조합이 2-화합물 조합인 방법.