KR20100099138A - 키나아제 활성 측정용 단백질 칩 - Google Patents

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임혜진
조용완
이윤석
강인철
이은경
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프로테오젠(주)
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Abstract

본 발명은 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩으로서, 단백질 중 양이온 작용기를 인식할 수 있는 캘릭스 크라운 유도체가 칩 기재 상에 고정되어 있고, 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질이 웰 안에 있는 상기 캘릭스 크라운 유도체에 다중이온인식 작용에 의해 고정되어 있는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩에 기질 단백질과 반응할 수 있는 키나아제 또는 포스파타제를 처리하는 단계; 및 b) 상기 처리에 의한 기질 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 적은 양의 시약으로도 칩 기재 상에서 키나아제 또는 포스파타제의 활성을 간편하게 동시 다량 분석할 수 있으므로 유용하다.

Description

키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩{PROTEIN CHIP FOR DETERMINING KINASE OR PHOSPHATASE ACTIVITY BACKGROUND OF THE INVENTION}
본 발명은 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩 및 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법에 관한 것이다.
단백질 칩과 DNA 칩으로 대표되는 바이오 칩은 유전자, DNA 조각 또는 특정 단백질 등을 기판 위에 미세배열(microarray)하여 이루어지는데, 이 칩들을 이용하여 생화학 물질에 대한 분석 실험을 하는 경우, 짧은 시간 내에 적은 양의 시료로 대량의 시료를 분석할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 단백질 칩에 대한 연구가 진단의학 및 신약탐색 분야 등에서 활발히 진행되고 있는데, 그 이유는 인간을 포함한 모든 생명체에서 일어나는 생화학적 활동이 근본적으로 DNA 정보에 의해 이루어지지만, 실제 질병의 발현은 DNA 보다 실제적으로 세포 내에서 특정 역할을 담당하는 단백질에서 일어나기 때문이다.
그러나, 여러 생체 내에 존재하는 효소들, 예를 들어 키나아제(Kinase), 포스파타제(Phosphatase), 가수분해효소, 산화환원효소 등에 대해서는 아직 칩 위에서 활성을 측정할 수 있는 방법이 상용화되어 있지 않은 상태이다.
더욱이, 키나아제는 기질 단백질의 특정 서열상의 타이로신, 세린, 쓰레오닌 잔기에 인산기를 공유결합시키는 효소로써, 키나아제의 활성 측정을 위해서는 여러 가지 다른 단백질 기질의 인산화 과정을 측정하여야 하며, 또한, 키나아제는 수적으로도 500여 가지가 넘는 다양성을 가지기 때문에, 칩 상에서의 활성을 측정하는데 문제가 있었다.
이에, 키나아제 등의 효소 활성 측정을 위한 여러 방법이 제시되고 있지만, 대부분 고가의 분석 및 활용 장비가 요구된다는 단점이 있다. 또한, 플레이트 기반 상에서의 효소 활성 측정 방법이 제시되고 있지만, 기질 단백질을 고정하는 처리과정이 복잡할 뿐 아니라 화학결합 과정에서 기질 단백질의 구조변화를 유발하여 활성을 잃게 되는 문제점이 있어, 특히 신약후보물질 스크리닝 시스템으로 사용하기에는 적합하지 않다는 문제점이 있다.
또한, 칩-기반 효소 활성 측정 시스템이 개발되지 못한 원인 중 하나는 일반적으로 효소활성 측정이 주로 수용액에서 이루어져 왔기 때문에 표면에 고정된 기질이나 인산화 특이항체를 이용하는 단백질칩에 있어서 기술적 돌파구를 찾지 못한데 그 이유가 있다.
기술적 과제
키나아제 등의 효소 활성 측정을 위한 여러 방안이 제시되고 있지만, 별도의 화학적 처리 과정 없이 기질 단백질을 고정시킨 단백질 칩을 이용하여, 칩 위에서 효소 활성을 측정하는 방법에 대해선 알려진 바가 없었다. 이는 기질 단백질의 구조나 화학적 변형 없이 기질 단백질을 기판에 고정시키는 방법에 대해 알려진 바가 거의 없었기 때문이다. 또한, 기질 단백질을 고정화시킨다 하더라도, 효소와 단백질 간의 반응에 의한 인산화 정도를 칩 위에서 직접 측정 가능한 지에 대해서도 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 캘릭스 크라운 유도체를 사용하여 기질 단백질을 웰온어칩 형태의 기판에 고정화시키는 경우, 효소의 기질 단백질을 별도의 화학적 처리과정 없이 직접 기판에 고정화시킬 수 있으며, 기질과 키나아제 또는 포스파타제 간의 반응에 의한 기질의 인산화 정도를 기판 위에서 측정할 수 있고, 효소 및 검출항체와 같은 고가의 시료를 미량(1ul) 사용하여도 고형기판 위에서 효소의 활성, 효소의 저해제를 간편하게 동시 다량 분석할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 이에 기초한 것이다.
기술적 해결방법
본 발명은, 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩으로서, 단백질 중 양이온 작용기를 인식할 수 있는 캘릭스 크라운 유도체가 칩 기재 상에 고정되어 있고, 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질이 웰 안에 있는 상기 캘릭스 크라운 유도체에 다중이온인식 작용에 의해 고정되어 있는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩에 기질 단백질과 반응할 수 있는 키나아제 또는 포스파타제를 처리하는 단계; 및 b) 상기 처리에 의한 기질 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 의하면, 단백질 칩 위에 고정된 기질에도 효소에 의한 인산화 또는 탈인산화가 성공적으로 도입될 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 칩 위에서 기질의 인산화를 검출할 수 있다(실시예 2 내지 실시예 8 참조).
본 발명에서 '캘릭스 크라운 유도체'는 단백질 표면의 아미노산 중 양이온 작용기, 바람직하게는 암모늄기를 인식할 수 있다.
캘릭스 크라운 유도체 한 분자당 한 개의 양이온이 결합되는데, 기질 단백질 한분자가 2개 이상의 캘릭스 크라운 유도체에 다중이온인식 작용에 의해 고정된다. 상기 캘릭스 크라운 유도체의 일례로 하기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]의 화합물을 사용할 수 있다.
화학식 1
Figure 112010034408576-PCT00001
상기 식에서 n은 1이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 서로 독립적으로 -CHO, -SH, 또는 -COOH이고, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸이거나; 또는
n은 1이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 및 R3은 각각 -CH2SH기이고, R2 및 R4는 각각 -H이며, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸이거나; 또는
n은 2이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 및 R3은 각각 -CH2SH기이고, R2 및 R4는 각각 -H이며, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸임.
화학식 2
Figure 112010034408576-PCT00002
상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 내지 R4 중 2개가 서로 결합하여 각각 -CH2-S-S-CH2- 기를 형성하는 것임.
본 발명은 캘릭스 크라운 유도체의 크라운 고리를 이용하여 단백질의 활성위치의 반대쪽에 다량 분포하는 암모늄기 등의 양이온을 인식하는 다중 이온인식에 의해 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질을 고정화하기 때문에 하기와 같은 농도, 활성, 배향성 문제를 해결할 수 있다.
본 발명에 따라 캘릭스 크라운 유도체를 이용하여 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질을 칩 기재 상에 고정화하면, 기존의 단백질 고정화 반응에서 사용되어 왔던 단백질 분자의 화학적인 처리나 융합단백질과 같은 유전공학적인 변환없이, 분자인식작용 중 하나인 다중이온 인식 작용에 의해 단백질을 고체 기재의 표면에 간단히 고정화시킬 수 있고, 칩 기재 상에 다른 단백질분자가 비특이성 고정화 반응에 의해 칩 기재 상의 빈자리에 고정화될 수 없을 만큼 기질 단백질 분자가 빽빽하게 들어차 있는 단백질의 단분자층을 제공할 수 있다.
상기와 같은 기질 단백질의 단분자층이 제조된다면 다음 측정에 영향을 미치지 않을 정도로 빈자리가 거의 존재하지 않기 때문에 종래 고정화 방법에서 발생했던 농도문제와 비특이성 고정화 반응에 대한 문제 등이 동시에 해결될 수 있다.
본 발명에서 기질 단백질은 기존의 고정화 반응 시 작용되는 화학결합력에 비해 상대적으로 약한 힘에 의해 고정화시키는 다중 이온 인식에 의해 고정화되기 때문에 표면에 끌리는 힘에 의한 기질로서의 역할 감소효과가 기존 방법에 비해 상대적으로 작게 나타난다.
또, 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질의 경우도, 암모늄기 등의 양이온이 가장 많이 분포하는 위치가 효소의 결합 및 인산화/탈인산화 부위의 반대편에 있기 때문에 배향성 문제도 적절한 수준에서 해결할 수 있다.
본 발명에 따라 캘릭스 크라운 유도체의 자기조립 단분자층 위에 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질을 고정하는 경우 추가적인 별도의 화학적 처리과정을 수행하지 않을 수 있으므로, 본 발명의 단백질 칩은 구조 및 활성이 유지된 기질 단백질이 고정될 수 있어 유용하다.
한편, 칩 기재는 유리, 용융 석영, 실리콘 웨이퍼, 플라스틱 등이 될 수 있으나, 바람직하게는 유리를 사용할 수 있다.
캘릭스 크라운 유도체가 고정된 칩 기재는 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
유리 슬라이드 등의 기판을 아민화(aminated)시키기 위해 상기 기판을 피라나(piranha) 용액(과산화수소: 진한 황산을 1:2∼3 정도의 비율로 섞은 혼합 용액)에 1시간 동안 담근 후, 물과 아세톤으로 세척하여 건조한다. CHCl3 등의 유기용매에 캘릭스 크라운 유도체 화합물을 1∼3mM 농도로 녹인 용액을 제조한 뒤, 상기 유리 슬라이드를 상기 용액에 4∼6시간 담근 후 꺼내어 이를 아세톤 용액 및 물로 각각 세척한 후 건조시킴으로써 제조할 수 있다. 이때, 캘릭스 크라운 유도체는 칩 기재 상에 균일한 분포로 빽빽하게 고정될 수 있고, 분자링커로서 작용하여 키나아제 또는 포스파타제와 반응하는 기질 단백질이 단백질칩 상에 고정될 수 있도록 할 수 있다.
한편, 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩으로서, 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질이 웰 안에 있는 상기 캘릭스 크라운 유도체에 의해 고정되어 있는 단백질 칩은 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
캘릭스 크라운 유도체가 고정된 칩 기재 상에 0.1 내지 5 mm의 평균직경을 갖는 웰형성-구멍이 배열된 점착성 테이프를 부착시킨다. 상기와 같이 점착성 테이프를 붙이면, 웰의 크기를 일정하게 하고 각 웰 사이에서의 시료의 혼합을 방지할 수 있으며, 배후 형광 노이즈를 감소시키고, 미량의 시료를 사용함으로 인해 생기는 실험적 오차를 최소화하여 정량 분석에 있어서 정확성을 기할 수 있다.
이어서, 기질 단백질은 기질 희석 완충 용액에 일정 농도(수nmole 내지 수μmole)로 희석시킨 뒤, 희석된 기질 단백질 수용액을 각 단백질 칩의 웰에 0.1 내지 5 ul 씩 점적하고 기질 단백질 수용액이 건조되어 단백질이 변성되지 않도록 70％ 내지 90％의 습도 하에 배양하여 고정시킴으로써, 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩을 형성할 수 있다. 또한, 각 웰에서 기질 단백질의 농도를 동일 또는 상이하게 조절할 수 있다.
이때, 기질 단백질은 인산화된 것을 사용할 수 있다. 또는, 인산화된 단백질을 기질 단백질로 사용하되, 본 발명에 의한 단백질 칩에 키나아제를 가하기 전, 단백질 칩에 고정되어 있는 기질 단백질을 탈인산화시킬 수 있다.
본 발명에서 '웰온어칩(Well-on-a-Chip)'은 '웰칩'으로도 표기한다.
본 발명에서 '기질 단백질'은 단백질뿐만 아니라 펩티드를 포함한다. 기질 펩티드는 특정 키나아제에 의해 인산화되는 서열을 포함하는 한 분자량의 제한을 없다. 바람직하게는 정제된 기질 단백질 자체를 사용한다.
본 발명에서 '키나아제'는 MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1), Aurora kinase A, Aurora kinase B, Akt kinase, Cdk1/cyclin B kinase(Cyclin dependent kinase1), Cdk2/cyclin A kinase(Cyclin dependent kinase2), IKKα, IKKβ(IkBα kinase-α/β), MEK1(Mitogen-activated or extracellular signal-regulated protein kinase1), ZAP-70(Zeta chain-associated protein-70), FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1), GSK3α(Glycogen synthase kinase-3α/β), JAK3(Janus kinase 3), Abl kinase(Abelson tyrosine kinase), JNK1(c-Jun N-terminal Kinase 1), JNK2(c-Jun N-terminal kinase 2) 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며, 다른 종류의 키나아제를 포함한다.
본 발명에서 '포스파타제'는 λPP(Bacteriophage λ protein phosphatase), PP2A(Protein Phosphatase 2A), PP1(Protein Phosphatase 1), PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B) 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며, 다른 종류의 포스파타제를 포함한다.
본 발명에서 '키나아제의 기질 단백질'은 MBP(Myelin basic protein), 히스톤 H3, FKHR(FOXO1a, Forkhead box O1a), 히스톤 H1, IkBαα(Inhibitor-kappa-B alpha, NFκBIα(Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor-alpha)), MAPK2(Mitogen-activated protein kinase 2), LAT1(Linker for activation of T cell-1), PLCγ-1(Phospho-lipase C gamma-1), GS(Glycogen Synthase), STAT3(signal transducers and activators of transcription 3), Crk(V-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog (avian)-like protein), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), c-Jun(cellular Jun)등에서 선택하여 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며, 키나아제와 반응할 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 '포스파타제의 기질 단백질'은 GS(Glycogen Synthase), IR(Insulin Receptor) 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며, 포스파타제와 반응할 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질로는 인산화된 것, 즉 이미 활성화되어 있는 상태의 기질도 사용할 수 있다. 대장균이나 기타 여러 발현 시스템에 의해 발현시켜 정제한 기질을 이용할 때, 숙주의 생리적 활성 또는 정제과정에서 기질이 인산화되어 있는 경우가 많다. 또한, 상용되는 기질을 구입하여 사용시, 키나아제의 기질 자체가 하위 신호전달 과정에 있는 또 다른 키나아제일 경우가 있으므로 이미 인산화된 경우가 많아 이를 이용할 경우, 키나아제와의 작용에 의해 나타나는 신호강도가 약하게 나타나는 문제점이 있다. 따라서, 이미 인산화된 기질을 탈인산화시키는 과정이 필요한데, 본 발명에서는 키나아제의 효소 활성을 측정함에 있어서, 기질 단백질을 단백질 칩 기판에 고정화한 후, 키나아제와 기질을 반응시키기 전, 특정 탈인산화효소를 처리하여 기질에 부착한 인산기를 제거할 수 있다. 따라서, 키나아제 활성의 신호강도를 높일 수 있다. 한편, 본 발명에 의한 단백질 칩에서는 탈인산화효소에 의한 단백질 칩 위에서의 탈인산화가 가능할 뿐 아니라, 다시 키나아제에 의해서 재인산화 하는 것도 가능하다(실시예 6 참조).
본 발명에서 'MAP Kinase(Mitogen-activated protein kinase)'는 여러 신호전달 경로의 가장 하위에 있는 키나아제로써 MAP Kinase 신호전달 경로는 3개 이상의 키나아제들로 구성되고 다음 단계의 키나아제를 인산화시켜 활성화시키는 방법으로 외부 자극을 세포 내로 전달하며 또한, 많은 경우 스스로 인산화되어 자극을 증폭시키기도 한다. 이러한 여러 신호전달 경로의 가장 하위에 있는 키나아제가 MAP kinase인데, MEK1/2에 의해 특정 아미노산(Threonine/tyrosine) 잔기가 이중으로 인산화되어 활성화되면 P-X-S/T-P의 특정 아미노산 서열을 갖는 많은 단백질(세포 골격 단백질, 번역 조절인자, 전사 조절인자, Rsk 단백질 등)들을 인산화시켜 궁극적으로 핵 내로 신호가 전달되어 전사 조절인자 등을 활성화시키고 세포 내 다른 표적 단백질들을 인산화시켜 세포의 성장, 분화 및 생리활성을 유도한다. 이러한 MAP kinase 신호전달계는 모든 진핵 생물체 및 원핵 생물체의 모든 조직에 걸쳐 진화적으로 보존되어 있으므로, 특이적으로 MAP kinase 경로를 억제하는 저해제들의 개발은 신호전달계 연구를 위한 시약뿐만 아니라 MAP kinase 경로의 이상으로 야기되는 암, 세포분화 이상, 류마티스성 관절염 등을 억제하는 의약품으로 개발될 수 있어 그 응용 및 부가가치가 매우 높다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서는 MAP Kinase1에 대한 효소 활성 측정용 단백질칩을 만들기 위해 MAPK1의 효소 활성 실험에서 주로 사용되는 MBP(Myelin basic protein)를 기질로 이용하여 시험해 보았다.
본 발명에서 'Aurora kinase'는 진핵세포의 유사분열 시 중심체(Centrosome)의 복제, 유사분열의 양극성 방추사의 형성, 방추사에 의한 염색체의 적도상 정렬, 방추사 검문소의 정확도 감시기능을 하는 키나아제로써, 초파리와 효모에서 중심체와 염색체 분열의 이상을 보이는 유전적 돌연변이의 탐색을 통하여 발견되었다. 포유류에서는 Aurora A, B, C 세가지 이성질체가 존재하는데, 이들은 공통적으로 C-말단에 키나아제 도메인을 가지고 있고, 서로 비슷한 단백질 구조를 보인다. 이들 이성질체들은 구조적인 유사성에도 불구하고 각각 세포 내 위치가 다르며 서로 다른 기능을 나타내는데, 이들 유전자는 암의 발생 및 진행과 관련이 있다고 보고된 염색체의 특정 부분에 위치하고 있으며 특히 Aurora A는 유방암, 대장암, 난소암, 췌장암 등 여러 종류의 암 조직에서 과발현되어 있다고 보고되어 발암 유전자로의 가능성이 오래 전에 제시되었다. 실제로 세포에서 인위적으로 과발현시킬 경우 중심체의 증가, 비정상정인 염색체수(Aneuploid), 염색체의 불안정성을 유발함으로써 악성 종양으로의 형질전환을 유도함이 보고되어, 암을 유발할 수 있는 발암유전자로 증명되었다.
이렇게 Aurora kinase가 발암유전자로 기능한다는 사실에 근거하여 최근 Aurora kinase 활성을 억제하기 위해 키나아제 도메인에 있는 ATP가 결합하는 부위에 대한 경쟁적 저해제를 사용하여 인산화 기능을 선별적으로 억제할 수 있는 ZM447439, VX-680, Hesperadin등의 저분자 저해제가 개발되었으며 최근 임상 실험을 통하여 암세포의 진행억제에 효과적이라고 보고되었다. 이들 저해제는 Aurora kinase의 ATP 결합 부위에 끼어들어 히스톤 H3의 Ser10의 인산화를 공통적으로 차단한다. 하지만 세포주기의 진행을 방해하지는 못하기 때문에 항유사분열 화합물은 아닌 것으로 보고되었다. 즉, Aurora kinase 저해제는 염색체 정렬과 분리에 영향은 미치지만 유사분열의 지연이나 정체를 유발하지는 않는다. 다만, 유사분열을 마친 세포는 세포사멸로 이르게 된다. 따라서 이러한 발암유전자로서의 Aurora kinase 활성을 억제하는 물질은 새로운 항암 치료제로 기대할 수 있기 때문에 본 발명의 일 실시예에서 Aurora Kinase의 대표적인 타깃 기질로 알려진 히스톤 H3를 기질로 하여 실험하였다.
위의 두 가지 타깃 외에도 전사인자인 FKHR을 기질로 한 발암 유전자중의 하나인 Akt의 활성, 히스톤 H3와 더불어 뉴클레오좀을 형성하는 히스톤 H1을 기질로 한 세포주기 조절효소인 Cdk1, 2의 활성, NF-κB 신호전달과정에서 핵심 역할을 하는 Iκ-Bα를 기질로 한 IKKα, β의 활성, 상기한 MAPK 신호전달의 상위 신호전달 요소로 MAPK2를 기질로 한 MEK1의 활성, T-림파구의 신호전달에 있어서 중요한 작용을 하는 LAT를 기질로 한 ZAP-70의 활성, 수용체 신호전달 과정에 있어서 핵심적인 작용을 하는 PLCγ-1에 대한 FGFR1의 활성 등 여러 효소와 기질의 쌍을 기질 단백질과 반응 키나아제로서 사용할 수 있다. 또한, 시중에 판매되고 있는 기질과 키나아제를 이용했기 때문에 기질의 상태에 따라 결과가 달라지는 실시예의 경우로 Glycogen synthase를 기질로 한 GSK3의 활성을 시험해 볼 수 있다.
또한, 본 발명의 키나아제 활성 측정용 단백질 칩을 이용하여, MAPK1에 의해 인산화되는 MBP, Aurora kinase A에 의해 인산화되는 H3, Aurora kinase B에 의해 인산화되는 히스톤 H3, Akt kinase에 의해 인산화되는 FKHR, Cdk1/cyclin B kinase에 의해 인산화되는 히스톤 H1, Cdk2/cyclin A kinase에 의해 인산화되는 히스톤 H1, IKKβ에 의해 인산화되는Ik-Bα, IKKα에 의해 인산화되는 Ik-Bα, MEK1에 의해 인산화되는 MAPK2, ZAP-70에 의해 인산화되는 LAT1, FGFR1에 의해 인산화되는 PLCγ-1, GSK3α에 의해 인산화되는 GS, JAK3에 의해 인산화되는 STAT3, Abl kinase에 의해 인산화되는 Crk, JNK1에 의해 인산화되는 Bcl-2, JNK2에 의해 인산화되는 c-Jun, PTP1B에 의해 탈인산화되는 IR 등의 반응 특이성을 확인할 수 있다(실시예 2 내지 실시예 7 참조).
본 발명에 따라 캘릭스 크라운 유도체가 칩 기재 상에 고정되어 있고 키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질이 웰 안에 있는 상기 캘릭스 크라운 유도체에 의해 고정되어 있는 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩을 키나아제 또는 포스파타제로 처리하고, 상기 처리에 의한 기질 단백질의 인산화 및 탈인산화 정도를 측정하여, 상기 키나아제 또는 포스파타제의 활성을 측정할 수 있다.
이때, 키나아제 처리는 키나아제 희석 완충용액과 ATP/Mg 용액을 혼합한 키나아제 반응용액을 각 웰에 점적함으로써 기질 단백질과 반응하도록 수행할 수 있다. 키나아제는 기질 단백질과 반응하면 기질 단백질을 인산화시킨다.
한편, 포스파타제의 기질은 활성화된 상태로 인산화된 기질을 이용하거나 ATP/Mg 용액과 혼합하여 자가 인산화를 유도한 후 각 웰에 점적함으로써 인산화된 기질을 고정하며, 포스파타제를 첨가하여 탈인산화를 유도할 수 있다.
이어서, 상기 처리에 의한 기질 단백질의 인산화 정도를 측정하는 방법의 일례는, 인산화된 기질에 특이적으로 결합할 수 있는 인산화 특이 항체를 이용하여 기질 단백질의 인산화 정도를 측정할 수 있다. 그리고, 결합된 인산화 특이 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 표지물질이 표지된 2차 항체를 사용하여 반응시키고, 이들 여러 효소 및 항체에 의한 일련의 반응을 최종적으로 마이크로 어레이 형광 스캐너를 이용해서 단백질칩 표면의 형광 분포 및 세기를 분석함으로써 기판 위에서의 키나아제 또는 포스파타제 효소 활성 측정을 할 수 있다. 이때, 인산화 특이 항체는 일정 농도로 희석하여 각 웰에 점적하고, 표지물질이 표지된 2차 항체를 적정 농도로 희석하여 각 웰에 점적하여 배양한 후, 단백질 칩 표면의 표지 물질(예컨대 형광 분포 등)을 분석함으로써 키나아제 또는 포스파타제 효소 활성을 측정할 수 있다. 상기 2차 항체에 표지되는 표지물질로는 형광체, 효소, 방사능물질, 미세입자, 색소 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에 따른 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩을 키나아제 또는 포스파타제로 처리하기 이전에, 키나아제 또는 포스파타제에 대한 저해제 후보물질을 첨가하는 단계를 더욱 포함하면, 상기 기질 단백질과 키나아제 또는 포스파타제 간의 반응저해 정도를 대조군과 비교함으로써, 상기 키나아제 또는 포스파타제의 저해제를 스크리닝할 수 있다.
키나아제의 효소 반응 활성을 저해할 수 있는 물질을 스크리닝하기 위하여 양성 대조군으로서는 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine를 사용할 수 있다. 키나아제와 기질 단백질 간의 반응 저해 효과를, 양성대조군에 의한 저해 효과와 비교함으로써, 각 효소에 특이적인 저해제를 손쉽게 확인할 수 있다(실시예 2-9, 2-10 등 참조).
상기와 같이, 본 발명에 의한 키나아제 또는 포스파타제 저해제 탐색방법은, 이제까지 기존의 실험실에서 주로 사용하던 방사능을 이용한 방법보다 안전하고 간편하게 이용될 수 있기 때문에 상기 방법은 연구용으로도 많이 이용될 수 있을 뿐 아니라, 단백질 칩 위에서의 효소 활성 측정을 가능하게 함으로써 특정 효소에 대한 특이적인 저해제를 경제적이고 효율적으로 스크리닝하기 위한 초고속 스크리닝 시스템 개발에도 널리 응용될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩은 저해제 탐색하는 방법과 유사한 방법으로 상기 효소의 활성화제를 탐색하는데에도 사용할 수 있으므로, 활성화제를 탐색하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다.
유리한 효과
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 질환과 밀접하게 연관된 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩에 관한 것으로, 종래에는 효소 활성을 칩 위에서 측정함이 어려웠으나 본 발명에 의한 단백질 칩에 의하면 효소 활성 반응을 칩 위에서 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한, 적은 시료를 사용하여, 여러 키나아제 또는 포스파타제에 대한 특이적인 저해제를 탐색할 수 있는 장점이 있는바, 신약개발에 있어서 기술의 새로운 패러다임을 구축해 선도적 역할을 할 것으로 기대된다.
도 1a는 웰칩의 구조와 웹칩 수준에서의 전체적인 실험 방법을 나타낸 것이다.
도 1b는 단백질 기질의 분자수준에서 본 실험 과정의 전체적인 모식도이다.
도 2는 MBP 기질에 대한 MAPK1 효소반응의 특이성을 확인한 결과이다.
도 3은 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 있어서 MAPK1의 적정 농도를 확인한 반응 결과 그래프이다.
도 4는 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 있어서 MBP 기질의 적정 농도를 확인한 반응 결과 그래프이다.
도 5는 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 있어서 인산화 특이 항체의 농도를 확인한 반응 결과 그래프이다.
도 6은 MBP 기질 농도에 대한 MAPK1의 적정 반응 시간을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 대한 인산화 특이 항체의 반응을 시간 별로 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 있어서 ATP의 적정 농도를 확인한 반응 결과 그래프이다.
도 9는 MBP 기질에 대한 MAPK1의 효소반응에 있어서 2차 항체의 농도에 따른 효소 반응을 나타내는 그래프이다.
도 10은 MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1)에 특이적인 저해제(ERK inhibitor II)의 농도에 대한 인산화 반응의 저해효과 및 ATP 농도에 따른 반응 저해효과를 형광의 이미지를 수치로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 11a, 도 11b는 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase A 효소반응의 특이성과 인산화 항체의 반응 특이성을 형광 스캔 이미지로 나타낸 것이다.
도 12는 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase A의 효소반응에 있어서 Aurora kinase A의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 13은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase A의 효소반응에 있어서 히스톤 H3의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 14는 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase A의 효소반응에 있어서 인산화 특이 항체의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 15는 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase A의 효소반응에 있어서 ATP의 적정 농도 확인을 위한 반응 결과 그래프이다.
도 16a, 도 16b은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B 효소반응의 특이성 및 인산화 특이항체의 특이성을 확인한 결과이다.
도 17은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B의 효소반응에 있어서 Aurora kinase B의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 18은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B의 효소반응에 있어서 히스톤 H3의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 19는 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B의 효소반응에 있어서 인산화 특이 항체의 적정 농도 확인을 위한 실험의 반응 결과이다.
도 20은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B의 효소반응에 있어서 Aurora kinase B의 적정 반응 시간 확인을 위해 기질 농도에 대한 효소의 반응 시간 별로 확인한 결과 그래프이다.
도 21은 히스톤 H3 기질에 대한 Aurora kinase B의 효소반응에 있어서 ATP의 적정 농도 확인을 위한 반응 결과 그래프이다.
도 22는 탈인산화된 GS 기질에 대한 GSK3α와 GSK3αβ의 적정 농도를 확인한 반응 결과 그래프이다.
도 23은 GS 기질에 대해 탈인산화 반응과 인산화반응을 3회 반복한 결과 그래프이다.
도 24는 인슐린 수용체 기질의 ATP 처리에 따른 인산화 반응을 확인한 결과 그래프이다.
도 25는 인산화된 기질에 대한 PTP1B 포스파타제 농도에 따른 탈인산화 반응을 확인한 결과 그래프이다.
도 26은 인슐린 수용체 기질에 대한 PTP1B 포스파타제의 탈인산화 반응에 있어서 기질의 적정 농도를 확인한 결과 그래프이다.
도 27은 Aurora kinase A에 대한 저해제 탐색 결과를 나타내는 형광 스캔 이
이하, 본 발명을 일 실시예에 따라 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1] 단백질 칩의 제조
[도 1-b]에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 단백질 칩을 이용한 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정에 공통적으로 적용되는 방법은 다음과 같다.
먼저, 화학식 1의 화합물(n은 1, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CHO이고 R5 및 R6은 -메틸임)로 표시되는 캘릭스 크라운 유도체가 고정되어 있는 유리 기판을 준비하였다.
1.5mm크기의 구멍이 일률적으로 배열된 점착성 테이프를 상기 캘릭스 크라운 유도체가 고정되어 있는 유리 기판 상에 붙여 웰칩을 제조하였다.
기질 희석 완충용액에 일정 농도로 희석된 기질 단백질 수용액을 파이펫을 이용하여 각 웰마다 1ul씩 점적하고 습도가 70％이상으로 충분히 유지되는 배양기에서 하루 정도 배양하였다. 고정되지 않은 여분의 기질을 제거하기 위해 웰칩을 세척 완충용액에 담가 20분간 쉐이커에서 세척한 다음 블로킹 완충용액에 담가 1시간 동안 블로킹을 하였다. 다시 세척용액으로 20분간 세척하여 블로킹 용액을 제거한 다음 증류수로 헹구고, 압축 질소가스를 이용하여 웰칩을 건조시켰다. 일정량의 효소를 함유하는 키나아제 또는 포스파타제 희석 완충용액과, 선택적으로 ATP/Mg 용액을 혼합한, 키나아제 또는 포스파타제 반응용액에 첨가하여 각 웰당 1ul씩 점적하고, 70 ％ 이상으로 습도가 유지되는 30℃ 배양기에서 일정 시간 동안 배양하였다. 효소 반응이 끝나면 웰칩을 꺼내 세척용액에 담가 20분간 세척하였다. 다시 질소가스를 이용하여 웰칩을 건조시킨 후 인산화 특이 항체를 일정 농도로 희석하여 각 웰당 1ul씩 점적하고 배양기에서 30분간 배양하였다. 배양이 끝나면 세척용액을 이용하여 20분간 세척하고 질소가스로 건조시켰다. 인산화 특이항체의 유래 동물(쥐, 토끼, 양, 염소 등)에 따라 항체의 Fc부분을 특이적으로 인지하고 형광물질로 표지된 2차 항체를 적정 농도로 희석하여 각 웰당 1ul씩 점적하고 배양기에서 30분간 배양하였다. 세척용액으로 20분간 세척한 후 건조시키고 웰을 떼어낸 다음 마이크로어레이 스캐너(GenePix 4000B, Axon Instruments, USA)를 이용하여 칩 표면의 형광 분포를 스캔하여 결과를 분석하였다(도 1a).
하기의 실시예는 상기 실험방법으로 실시하되, 그 외 구체적으로 표기되지 않은 농도 및 시간 등은 최적의 조건을 찾기 위해 여러 가지 방법으로 수행되었다. 한편, 본 발명의 실시예에서 사용한 모든 효소, 기질, 인산화 특이항체, 2차 항체 및 완충용액은 현재 상용화되고 있는 제품을 구입하여 사용하였다. 아래 표 1은 실시예에서 사용된 각 기질과 효소, 및 이에 맞는 인산화특이항체를 정리한 것이다.
표 1
Figure 112010034408576-PCT00003
위의 표 1 외에도 아래의 인산화 특이 항체(
Figure 112010034408576-PCT00004
)를 사용하였으며, 인산화 특이항체의 Fc 부분에 결합하는 2차 항체(▶) 또한 아래에 나열된 것을 사용하였다.
Figure 112010034408576-PCT00005
Rabbit Anti-phospho-Ser Ab(Zymed, 61-8100)
Figure 112010034408576-PCT00006
Rabbit Anti-phospho-Thr Ab(Zymed, 71-8200)
Figure 112010034408576-PCT00007
Rabbit Anti-phosphorylated protein Ab(Zymed, 61-8300)
Figure 112010034408576-PCT00008
Anti-phospho Ser Ab ＃1∼＃4 (CalBiochem, 525282)
Figure 112010034408576-PCT00009
Mouse Anti-phospho Ser Ab-TAMRA(Anaspec, 29535)
Figure 112010034408576-PCT00010
Rabbit Anti-phospho Ser28 Histone H3 Ab(Upstate, 07-145)
Figure 112010034408576-PCT00011
Rabbit Anti-Histone H3, CT, pan clone A3S(Upstate, 05-928)
▶ Cy5-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate(Zymed, 81-6516)
▶ Cy5-Goat Anti-Rabbit IgG Conjugate(Zymed, 81-6116)
▶ Alexa 633-Goat Anti-Mouse IgM Conjugate(Molecular Probes, A21046)
효소 반응을 위한 완충용액(표 2의 Kinase assay buffer)과 ATP/Mg 용액(표 2의 5x ATP/Mg stock solution) 또한, 모두 Upstate(USA)에서 상용화되는 제품을 구입해서 사용하였다.
완충용액 중 위에 열거한 상용의 완충용액을 제외한 다른 완충용액은(표 2의 기질희석용액, 블로킹 용액, 세척용액, 항체 희석 용액) 동종 업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 완충용액으로서 연구실에서 제조하여 사용하였다. 그리고, [실시예 2-9], [실시예 3-6], [실시예 4-7]에서 이용된 Staurosporine은 Sigma(USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
표 2
Figure 112010034408576-PCT00012
[실시예 2] MBP-MAPK1의 반응 확인
[실시예 2-1] 반응 특이성의 확인
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 MAPK1에 의해 인산화되는 MBP의 반응 특이성을 확인하기 위해, 웰마다 각각 다른 조건으로 시험해보았다. 기질인 MBP는 기질희석 완충용액에 100 ug/ml 로 희석하였고, 효소 반응은 5x kinase assay buffer와 5x ATP/Mg용액을 각각 1x 로 희석되도록 증류수에 섞은 다음 효소를 20ng/ul 농도가 되도록 희석하여 1ul씩 각 웰에 점적하였다. 인산화 특이항체는 10 ug/ml 농도로 항체 희석 완충용액에 희석하였고, 2차 항체 역시 항체 희석 용액에 2 ug/ml 농도로 희석하여 1ul씩 웰에 점적하였다. 즉, 같은 완충용액 조건에서 효소의 유무, 인산화 특이항체의 유무, 2차 항체의 유무에 대해 확인한 결과, 도 2의 형광 스캔 이미지의 결과를 얻었다. 마이크로어레이 스캐너에 의한 형광 스캔이미지는 직관적으로 구별하기 쉽도록 형광의 세기에 따라 무지개색으로 환산하여 보여진다. 즉, 형광의 세기가 높은 순서대로 흰색-빨강-주황-노랑-연두-초록-파랑-남색-검정으로 나타내었다. 그리고, GenePix 프로그램 자체에 들어있는 분석 소프트웨어를 이용해 형광 세기를 수치로 환산한 결과 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서만 형광 세기가 확인되었고, 각 음성 대조군에 비해 약 50배 이상의 형광세기 차이를 보이는 결과를 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 모든 반응이 이루어진 열에서만 특이 반응이 검출된 것을 알 수 있으며, 이로부터 본 발명에 따라 단백질 칩 위에 고정된 기질에도 효소에 의한 인산화가 성공적으로 도입이 될 수 있을 뿐만 아니라 단백질 칩 위에서 효소에 의한 기질의 인산화를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이후 실시예를 통해 보다 정확한 농도조건과 시간 조건을 찾기 위한 실험을 수행하였고, 또한, 본 발명이 MBP-MAPK1 실험에 국한되지 않고 다른 기질과 효소에서도 적용될 수 있음을 증명하였다.
[실시예 2-2] 효소의 농도에 따른 반응성의 차이
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 효소 활성을 측정함에 있어서, 반응에 적당한 효소농도를 확인하기 위해 각 웰칩의 열에 따라 효소인 MAPK1의 농도를 단계적으로 희석하여 효소반응을 유도하였다.
먼저, 기질 희석 완충용액(표 5 참조)에 100 ug/ml 농도로 기질을 희석하여 웰에 1ul씩 점적하여, chip에 고정하고 BSA 블로킹을 하였다. 그리고 효소를 각각 농도별로 효소 희석용액 및 ATP 용액에 단계적으로 희석하여 1ul씩 점적하여, 웰칩 상에 고정된 기질의 인산화를 유도하였다. 배양 후, 항체 희석 용액에 10 ug/ml로 인산화 특이 항체를 희석하여 모든 웰에 1ul씩 점적하였다. 최종적으로 2 ug/ml로 항체 희석용액에 희석한 2차 항체를 1ul씩 점적하고, 배양한 후, 세척하여 마이크로어레이 스캐너에서 형광이미지로 결과를 확인하였다.
도 3은 MAPK1 효소의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로, 농도가 증가됨에 따라 반응성이 비례적으로 증가되며 10 ng/ul의 농도에서 포화됨을 알 수 있었다. 따라서, 이후의 실시예에서 효소의 농도는 10 ng/ul로 맞추어 실험하였다.
[실시예 2-3] 기질의 농도에 따른 반응성의 확인
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 효소 활성을 측정함에 있어서, 반응에 적당한 기질의 농도를 확인하기 위하여, 각 웰칩의 열에 따라 기질인 MBP의 농도를 단계적으로 희석하여 효소반응을 유도하였다.
먼저, 기질 희석 완충용액에 기질을 농도별로 단계적으로 희석하여, 각 웰에 1ul씩 점적하여 chip에 고정하고 BSA 블로킹을 하였다. 그리고, 효소를 10 ng/ul로 효소 희석 반응 용액 및 ATP 용액에 희석하여 1ul씩 점적하여, 웰칩 상에 고정된 기질의 인산화를 유도하였다. 배양 후, 10 ug/ml로 희석한 인산화 특이 항체를 모든 웰에 1ul씩 점적하였다. 최종적으로 2 ug/ml로 항체 희석용액에 희석한 2차 항체를 1ul씩 점적하고, 배양이 끝나면 세척한 뒤 마이크로어레이 스캐너에서 형광이미지로 결과를 확인하였다.
도 4는 기질인 MBP의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로 농도가 증가됨에 따라 반응성이 비례적으로 증가되며 500 ug/ml 정도에서 포화되는 것으로 보이지만, kinase(-)에서 비록 형광 세기값은 1000이하이긴 하지만 약간의 비특이적 반응이 보이기 때문에 기질의 농도는 100 ∼ 250 ug/ml인 것이 적당하다는 것을 확인하였다.
[실시예 2-4] 인산화특이항체의 농도에 따른 반응성의 확인
MAPK1에 의해 인산화된 MBP를 확인하기 위해 사용된 인산화 특이 항체의 적정 사용 농도를 알아보기 위하여 다른 조건이 동일한 상태에서 인산화 특이 항체의 농도만을 변화시켜 기질의 인산기 탐지 능력을 비교해 보았다. 기질인 MBP를 웰칩에 고정하고 ATP가 포함된 효소 반응 용액에 MAPK1을 10 ng/ul 농도로 희석하고 1ul씩 점적하여 고정된 기질에 인산화를 유도한 후, 인산화 특이 항체의 농도를 100 ug/ml부터 단계적으로 희석하여 반응을 시켰다. 세척, 건조를 한 후 2차 항체를 점적하고, 마이크로어레이 스캐너를 이용해 결과를 확인하였다. 그 결과 도 5와 같이, 항체의 농도에 비례해서 형광의 세기가 증가되며, 도 4의 결과와 같은 비특이적 반응은 전혀 없었으며, 약 10 ug/ml 농도 이상에서 포화됨을 확인할 수 있었다.
결론적으로 인산화 특이 항체는 10 ug/ml 농도에서 최적의 결과가 나타나기 때문에, 차후의 실시예에서 10 ug/ml의 농도로 실험을 진행하였다.
[실시예 2-5] 효소의 반응 시간에 따른 반응성의 확인
기질 농도에 대한 효소의 적정 반응 시간을 확인하기 위하여(즉, Vmax, Km 값을 구하기 위하여), 9개의 웰칩을 준비하여 각각의 웰칩에 각 행마다 동일한 농도의 기질 MBP를 점적하여 고정화 시키고, 블로킹과 세척, 건조를 한 후 각 웰칩마다 일정량(10ng)의 효소를 반응시간만 다르게 하여 인산화를 유도하였다. 또한, 각 웰칩마다 한 개의 열씩 효소반응을 시키지 않은 음성 대조군을 두어 효소 반응에 의한 인산화 반응인지 확인하였고, 실험 결과를 분석할 때 결과값 처리에 이용하였다. 각각의 칩마다 배양 시간이 끝나면 세척, 건조, 및 인산화 특이 항체를 점적하고 다시 세척, 건조 후 2차 항체를 점적하고, 마지막으로 세척 및 건조를 거쳐 형광 스캐너를 이용하여 형광 이미지를 스캐닝하여, 이를 다시 수치로 환산하여 농도별로 그래프를 그려서 확인하였다.
도 6을 통해, 기질 농도에 따라 포화되는 시간이 달라짐을 알 수 있었고, 기질의 농도가 높을수록 빠른 시간 내에 반응이 완결되는 것을 확인할 수 있었다. 단적인 예로 실시예 2-3에서 확인된 기질 농도 100 ug/ml으로 실험한 경우, 약 30분 정도에 모두 포화되었으나, 그보다 농도가 높은 경우에는 20분 이내에 모두 포화되었고, 그보다 농도가 낮은 경우에는 60분 이내에 포화가 되긴 하였으나, 반응의 형광 세기가 낮아서 정확한 값을 산출하기가 곤란한 것을 알 수 있었다. 즉, 효소의 반응 시간은 기질의 농도에 따라 달라지지만 30 ∼ 60분 정도가 적당한 시간임을 확인할 수 있다.
한편, 이 그래프를 이용하여 초기 속도를 계산하고 그 값과 기질 농도를 이용하여 Michaelis-Menten 방정식에 대입하여 보았으나, Km 값은 얻어지지 않았다. 이는 기질이 단백질 칩 표면에 고정된 상태이기 때문에 기존의 수용액 상태에서 유도된 효소 반응 속도론에는 맞지 않기 때문인 것으로 유추할 수 있다.
[실시예 2-6] 인산화 특이 항체의 반응 시간에 따른 반응성의 확인
인산화 특이 항체의 반응시간을 0분에서 두 시간까지 변화를 주어 시험해 보았다. 각 웰당 다른 조건들은 모두 동일하고, 두 열씩 효소의 유/무만 차이가 있을 뿐이므로 기질고정화와 효소 반응을 통해 인산화가 된 열과 인산화 되지 않은 열로 구분된 상태에서 인산화 특이 항체의 반응 시간을 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분으로 하여 각각의 웰마다 배양 시간의 차이를 두어 점적하였다. 인산화 특이 항체에 대한 2차 항체를 2 ug/ml 농도로 1ul씩 점적한 다음 마이크로어레이 스캐너를 이용해 형광의 패턴을 분석하였다.
도 7에서와 같이, 15분 이내에 빠른 반응을 보이다가 15분 후부터는 완만한 경사를 이루며 비례적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 즉, 인산화 특이항체의 반응 시간이 오래될수록 형광세기는 증가하지만, 그 증가 효과가 미미하므로 30분 이상 정도면 충분히 반응함을 확인할 수 있었다. 이후 실시예에서도 인산화 특이 항체의 반응시간은 30분으로 맞추어 실험하였다.
[실시예 2-7] ATP의 농도에 따른 반응성의 확인
키나아제 반응에 있어서 기질에 인산기를 도입하기 위해, 또 다른 기질인 ATP 농도 변화에 따른 효소의 활성 변화를 측정해보았다. 기질인 MBP를 웰칩에 고정하고 MAPK1을 이용해서 효소반응을 도입할 때 효소 반응용액에 같이 포함되는 ATP의 양을 조절하여 최종 농도가 0, 10, 50, 100, 300 uM이 되도록 맞추어 1시간 동안 배양하였다. 세척 후 각 기질에 맞는 인산화 특이 항체 10 ug/ml 용액을 1 ul 점적하여 반응시킨 다음 다시 세척, 2차 항체 점적을 통해 최종 반응을 확인하였다.
다른 조건들이 모두 동일한 상황에서 ATP의 농도만 달리하여 반응성을 확인한 결과, 도 8에서와 같이 50과 100 uM에서 최대값을 나타내다가 300 uM로 더 많아질 경우에는 오히려 반응성이 약간 감소되는 경향을 확인할 수 있었다. ATP/Mg 완충용액은 시중에 판매되고 있는 제품을 구입하여 실험하였는데, 기존의 다른 방법들에서 사용하는 농도인 100 uM 농도가 가장 적당한 값임을 재확인할 수 있었으며, ATP가 없는 경우에는 MAPK1가 똑같은 조건으로 존재함에도 불구하고 반응이 전혀 나타나지 않음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명을 증명하기 위해 실험한 모든 실시예들의 결과로서 나타나는 형광 이미지가 키나아제에 의한 효소반응임을 확인할 수 있었다.
[실시예 2-8] 2차 항체의 농도에 따른 반응성의 확인
2차 항체의 농도만 달리하여 효소 반응을 확인한 결과, 도 9와 같이 1:50과 1:100으로 희석하였을 때 최대값을 보이며, 농도가 낮아질수록 형광 세기도 함께 감소됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 1:100의 농도로 희석해서 사용하는 것이 가장 적당함을 알 수 있었다.
[실시예 2-9] 저해제(Staurosporine)에 의한 저해 효과 확인
상기의 여러 실시예를 통해 실험 조건을 최적화하였고, 이렇게 얻어진 최적의 효소 반응 조건을 이용하여 저해 물질을 스크리닝하기 위해, 양성 대조군으로는 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine을 이용하여 실험해 보았다.
실시예 1에 따라 제조된 웰칩에 고정된 기질이 효소에 의해 인산화 될 때, 효소 반응 용액에 Staurosporine을 첨가한 상태에서 점적하고 배양하여, 기질의 인산화에 대한 저해효과가 있는지를 시험하였다. 먼저 웰칩에 기질을 고정하고, 세척, 블로킹, 세척, 건조한 후 효소를 점적할 때 효소반응 용액에 ATP 및 DMSO에 녹인 Staurosporine을 100 uM부터 단계적으로 감소되도록 용액을 제조하여, 효소를 첨가하고 각 웰칩에 점적하였다. DMSO의 최종 함유량은 모든 웰에 동일하게 10％가 되도록 조절하였고 마지막 웰에만 DMSO 대신 증류수를 첨가하여 음성 대조군으로 이용하였다. 습도가 유지된 30℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하여 효소 반응을 시킨 후, 꺼내서 20분간 세척, 건조한 다음 인산화 특이 항체 10 ug/ml를 1 ul씩 점적하고 30분간 배양, 세척, 건조한 다음, 2차 항체를 1 ul씩 점적하였다. 최종적으로 마이크로어레이 스캐너를 이용해서 형광 이미지로 결과를 도출하였다.
표 3
Figure 112010034408576-PCT00013
상기 표 3은 형광 이미지로부터 결과값을 계산하여 Staurosporine 농도에 대한 인산화 정도를 수치로 나타낸 표이다. Staurosporine의 농도가 높아질수록 효소의 인산화 반응이 약간씩 저해됨을 알 수 있었고, 정량적으로 나타내면 IC50값은 31uM 정도로 다소 높은 농도에서 얻어졌다. 즉, Staurosporine에 의한 효소의 저해 효과가 MAPK1에서는 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 2-10] 특이적인 저해제(ERK inhibitor II)에 의한 저해 효과 확인
상기의 [실시예 2-9]에서 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine 을 이용해서 확인한 결과를 바탕으로, MAPK1(ERK1)을 특이적으로 저해한다고 알려진 저해제를 이용하여 실험해 보았다.
상세 실험 방법은 상기 [실시예 2-9]와 동일한 방법으로 수행하였고 Staurosporine 대신 Merck 사에서 구입한 ERK inhibitor II(Cat. No. 328007, negative control: 328008)를 첨가하여 저해효과를 관찰하였다. 상기 저해제의 음성대조군(negative control, 328008)은 저분자 저해제 구조 중 하나의 곁가지인 아민기(-NH2)가 수산기(-OH)로 치환된 구조를 가지며 100 uM 이상의 IC50값을 갖는 물질이다.
도 10은 형광의 이미지를 수치로 환산하여 저해제의 농도에 대한 인산화 반응의 저해 효과를 그래프로 나타낸 결과이다. 그래프에서 보는 바와 같이 ATP 농도를 10 uM로 사용했을 경우 저해제의 농도가 높아질수록 형광의 상대적인 세기가 감소되며, IC50값은 약 4 uM 정도로 얻어짐을 알 수 있었고, 음성 대조군에서는 제품정보에 나와 있는 내용과 같이 100 uM에서도 저해 효과가 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다.
[실시예 3] 히스톤 H3-Aurora kinase A의 반응확인
[실시예 3-1] 반응 특이성의 확인
Aurora kinase A에 의해 인산화되는 히스톤 H3의 반응 특이성을 확인하기 위하여 웰마다 각각 조건을 달리하여 시험해보았다. 기질인 히스톤 H3을 기질희석 완충용액에 100 ug/ml로 희석하고, 5x kinase assay buffer와 5x ATP/Mg용액을 각각 1x 로 희석되도록 증류수에 섞은 다음, 효소를 10ng/ul 농도가 되도록 희석하여 1ul씩 각 웰에 점적하여 효소 반응을 시켰다. 인산화 특이 항체로는 ① Anti-phospho Ser-10 히스톤 H3 Ab와 ② Anti-phospho Ser-28 히스톤 H3 Ab 두 종류를 10 ug/ml 농도로 항체 희석 완충용액에 희석하고, 2차 항체 또한 항체 희석 용액에 1:100의 농도로 희석하여 1ul씩 웰에 점적하였다. 즉, 같은 완충용액 조건에서 기질의 유무, 효소의 유무에 대해 확인한 결과, 도 11a의 형광 스캔 이미지로 결과가 얻어졌고 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서만 형광 세기가 확인되었다, 또한, 인산화 항체 두 종류 중 Ser-10에 대한 인산화 항체가 Ser-28에 대한 항체보다 특이적인 반응을 보이는 것으로 보아 기존에 알려진 바와 같이 Aurora kinase에 의한 히스톤 H3의 인산화가 10번-Ser 위치에서 일어남을 직접적으로 확인할 수 있었다.
그리고, 도 11b에서는 각종 전사 후 과정(메틸화, 인산화, 아세틸화 등)을 겪는 히스톤 단백질들에 대해, 전사 후 과정 유무에 관계없이 결합할 수 있는 Anti-pan-히스톤 H3 Ab를 양성 대조군으로 사용하였다. 형광 이미지 결과를 비교해보면, Anti-pan-히스톤 H3 Ab를 이용한 아래쪽의 행에서는 aurora kinase의 효소 유무에 관계없이 형광 세기가 높게 얻어지는 반면, Anti-phospho Ser-10 H3 Ab를 이용한 위쪽의 행에서는 정확히 Aurora kinase가 들어간 웰에서만 형광세기가 나타나는 것을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, 모든 조건이 충족된 웰에서만 원하는 특이적 반응에 의한 결과를 얻을 수 있는 것임을 알 수 있었으며, 반대로 모든 조건을 충족시킨 상태에서 나타나는 형광 이미지는, 단백질칩 상에 고정된 기질에 원하는 효소반응이 일어나서, 인산화항체가 인산화된 부위에 결합이 되고, 2차 항체 에 의해 확인이 되어 형광 이미지가 나타났다는 것을 알 수 있었다.
이후의 실시예를 통해 보다 정확한 농도조건과 시간 조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다.
[실시예 3-2] 효소의 농도에 따른 반응성의 차이
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 효소 활성 측정을 실험할 때 반응에 적당한 효소농도를 확인하기 위해 웰칩의 각 열에, 효소인 Aurora kinase A의 농도를 단계적으로 희석하여 점적하여 효소반응을 유도하였다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-2]와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 12는 Aurora kinase A의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로, 농도가 증가됨에 따라 반응성이 비례적으로 증가되며, 0.23 uM(∼ 10 ng/ul) 정도에서 포화됨을 알 수 있었다. 따라서, 이후의 실시예에서 효소의 농도는 10 ng/ul로 맞추어 실험하였다.
[실시예 3-3] 기질의 농도에 따른 반응성의 확인
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 효소 활성을 측정함에 있어서, 반응에 적당한 기질의 농도를 확인하기 위하여, 웰칩에 기질인 히스톤 H3의 농도를 단계적으로 희석하여 고정 시킨 후 효소반응을 유도하였다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-3]과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 13의 결과는 히스톤 H3의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로 농도가 증가됨에 따라 지속적으로 비례해서 증가되며 가능하면 높은 농도로 사용하는 것이 좋지만 5.8 uM(∼ 100 ug/ml) 농도에서도 의미있는 결과를 보이기 때문에 100ug/ml 정도로 사용하는 것이 적당한 농도임을 확인할 수 있었다.
[실시예 3-4] 인산화특이항체의 농도에 따른 반응성의 확인
Aurora kinase A에 의해 인산화되는 히스톤 H3를 확인하기 위해 사용되는 인산화 특이 항체의 적정 사용 농도를 알아보기 위하여 인산화 특이 항체의 농도만을 변화시켜, 기질에 유도된 인산기의 탐지 능력을 비교해 보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-4]와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과 도 14에서 보는 바와 같이, 항체의 농도에 비례해서 형광의 세기가 증가되며 50 ug/ml 농도에서 포화됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 10ug/ml에서도 음성대조군에 비해 충분한 형광 세기 차를 보이기 때문에 차후 실시예에서는 10ug/ml의 농도로 실험을 진행하였다.
[실시예 3-5] ATP의 농도에 따른 반응성의 확인
키나아제 반응에 있어서 기질에 인산기를 도입하기 위한 또 다른 기질인 ATP 농도 변화에 따른 효소의 활성 변화를 측정해보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-7]과 동일한 방법으로 수행하였다.
ATP의 농도만 달리하고 다른 조건은 동일한 상태에서 반응성을 확인해본 결과, 50 uM 이상에서 포화됨을 확인할 수 있었다(도 16).
[실시예 3-6] 저해제(Staurosporine)에 의한 저해 효과 확인
상기의 여러 실시예를 통해 실험 조건들을 최적화하였고, 이렇게 얻어진 최적의 효소 반응 조건을 저해할 수 있는 물질을 스크리닝하기 위해 양성 대조군으로는 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine을 이용하여 실험해 보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-9]와 동일한 방법으로 수행하였다.
표 4
Figure 112010034408576-PCT00014
상기 표 4는 형광 이미지로부터 결과값을 계산하여 Staurosporine 농도에 대한 인산화 정도를 수치로 나타낸 것이다. 상기 표에서 알 수 있듯이, Staurosporine의 농도가 높아질수록 효소의 인산화 반응이 저해됨을 알 수 있었으며, 정량적으로 나타내면 IC50값은 [실시예 2-9]에서의 MBP-MAPK1이 31uM, 히스톤 H3-Aurora A가 1.3uM 정도로 얻어짐을 확인할 수 있었다. 즉, Staurosporine에 의한 효소의 저해 효과가 MAPK1보다 Aurora A에 대해 더 크다는 점을 알 수 있었다.
[실시예 4] 히스톤 H3-Aurora kinase B의 반응확인
[실시예 4-1] 반응 특이성의 확인
Aurora kinase B에 의해 인산화되는 히스톤 H3의 반응 특이성을 확인하기 위해 웰마다 각각 다른 조건으로 시험해보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 3-1]과 동일한 방법으로 수행하였으며 다만, 각각의 기질 유무, 효소의 유무, 인산화항체의 유무 등의 조건을 다르게 하였다.
기질인 히스톤 H3는 기질희석 완충용액에 100 ug/ml 로 희석하였고, 효소 반응은 5x kinase assay buffer와 5x ATP/Mg용액을 각각 1x 로 증류수에 섞어 희석한 다음, 효소를 10ng/ul 농도가 되도록 희석하여 1ul씩 각 웰에 점적하였다. 인산화 특이 항체로는 Anti-phospho Ser-10 히스톤 H3 Ab와 Anti-phospho Ser-28 히스톤 H3 Ab 두 종류를 10 ug/ml 농도로 항체 희석 완충용액에 희석하였고, 2차 항체 역시 항체 희석 용액에 1:100의 농도로 희석하여 1ul씩 웰에 점적하였다. 즉, 같은 완충용액 조건에서 기질의 유무, 효소의 유무에 대해 확인한 결과, 도 16a의 형광 스캔 이미지로 결과가 얻어졌고 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서만 형광 세기가 확인되었다. 또한, 인산화 항체 두 종류 중 Ser-10에 대한 인산화항체가 Ser-28에 대한 항체보다 특이적인 반응을 보이는 것으로 보아 기존에 알려진 대로 Aurora kinase에 의한 히스톤 H3의 인산화가 10번-Ser 위치에서 일어남을 직접적으로 확인할 수 있었다.
또한, 도 16b에서는 각종 전사 후 과정(메틸화, 인산화, 아세틸화 등)을 겪는 히스톤 단백질들에 대해, 이러한 전사 후 과정 유무에 관계없이 결합 가능한 Anti-pan-히스톤 H3 Ab를 이용하여 양성 대조군으로 확인하였다. 형광 이미지 결과를 비교해보면 Anti-pan-히스톤 H3 Ab를 이용한 아래쪽의 행에서는 aurora kinase B의 유무에 관계없이 형광 세기가 높게 얻어지는 반면, Anti-phospho Ser-10 H3 Ab를 이용한 위쪽의 행에서는 정확히 Aurora kinase B가 들어간 웰에서만 형광세기가 나타난다는 결과를 얻을 수 있었다. 결국, Aurora A와 B의 실험 결과는 약간의 방법상의 차이만 있을 뿐 거의 동일한 결과를 보이고 있음을 확인하였다.
이후의 실시예를 통해 보다 정확한 농도조건과 시간 조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다.
[실시예 4-2] 효소의 농도에 따른 반응성의 차이
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 효소 활성 측정을 실험할 때, 반응에 적당한 효소농도를 확인하기 위하여 웰칩의 각 열에 따라 효소인 Aurora kinase B의 농도를 단계적으로 희석하여 효소반응을 유도하였다. 실험 방법은 상기의 [실시예 2-2]와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 17의 결과는 Aurora kinase B의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로 농도가 증가됨에 따라 비례적으로 증가되며 5 ng/ul 정도에서 포화됨을 보이기 때문에 이후의 실시예에서 효소의 농도는 5 ng/ul로 맞추어 실험하였다.
[실시예 4-3] 기질의 농도에 따른 반응성의 확인
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 단백질칩 위에서 효소 활성을 측정할 때, 반응에 적당한 기질의 농도를 확인하기 위해 웰칩의 각 열에 따라 기질인 히스톤 H3의 농도를 단계적으로 희석하여 효소반응을 유도하였다. 실험 방법은 상 기 [실시예 2-3]과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 18의 결과는 히스톤 H3의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로 농도가 증가됨에 따라 지속적으로 비례해서 증가되며 5 ug/ml이상에서 포화됨을 보이기 때문에 이후의 실시예에서 기질의 농도는 5 ug/ml로 사용하였다.
[실시예 4-4] 인산화특이항체의 농도에 따른 반응성의 확인
Aurora kinase B에 의해 인산화된 히스톤 H3를 확인하기 위해 사용된 인산화 특이 항체의 적정 사용 농도를 알아보기 위하여 다른 조건이 동일한 상태에서 인산화 특이 항체의 농도만을 변화시켜 인산기의 탐지 능력을 비교해 보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-4]와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 19에서와 같이, 항체의 농도에 비례해서 형광의 세기가 증가되며 50 ug/ml 농도 이상에서는 포화되지만 10 ug/ml로 사용하여도 결과에 큰 영향을 미치지 않으므로, 이후 모든 실시예에서 10 ug/ml의 농도로 실험을 진행하였다.
[실시예 4-5] 효소의 반응 시간에 따른 반응성의 확인
농도별로 고정된 기질에 대해 효소의 최적 반응시간을 구하기 위한 실험을 수행하였다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-5]와 동일하게 하였다.
도 20에서와 같이, 시간이 경과함에 따라 기질의 인산화되는 정도가 비례해서 나타나고 있다. 도 6의 MBP-MAPK1의 경우와는 다르게 기질의 농도에 의한 영향은 거의 보이지 않으며 약 60분 정도에 포화되는 것을 볼 수 있는데, 이것은 판매되고 있는 기질의 농도가 MBP인 경우에는 mg/ml단위로 충분히 높기 때문에 높은 농도까지 관찰할 수 있었지만, 이번 실시예에서의 히스톤 H3는 최대로 높일 수 있는 농도가 250 ug/ml이기 때문에 웰 안에 최대로 결합이 가능한 기질의 양에 비해 가해준 기질의 양이 포화되지 않아서 나타나는 현상으로 해석할 수 있다.
[실시예 4-6] ATP의 농도에 따른 반응성의 확인
키나아제 반응에 있어서 기질에 인산기를 도입하기 위해, 또 다른 기질인 ATP 농도 변화에 따른 효소의 활성 변화를 측정해보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-7]과 동일한 방법으로 수행하였다.
다른 조건은 모두 동일하게 하고, ATP의 농도만 달리하여 반응성을 확인해본 결과, 도 21에서와 같이, ATP의 농도가 증가할수록 반응성이 비례적으로 증가되다가 100 uM에서 최대값을 나타내고 300 uM로 더 많아질 경우에는 오히려 약간 감소가 되는 경향을 확인할 수 있었다.
[실시예 4-7] 저해제(Staurosporine)에 의한 저해 효과 확인
상기의 여러 실시예를 통해 실험 조건들을 최적화하였고, 이렇게 얻어진 최적의 효소 반응 조건을 저해할 수 있는 물질을 스크리닝하기 위해 양성 대조군으로서, 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine을 이용하여 실험해 보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 2-9]와 동일한 방법으로 수행하였다.
표 5
Figure 112010034408576-PCT00015
상기 표 5는 형광 이미지로부터 결과값을 계산하여 Staurosporine 농도에 대한 인산화 정도를 수치로 나타낸 것이다. Staurosporine의 농도가 높아질수록 효소의 인산화 반응이 저해됨을 알 수 있고 상기의 실시예와 비교해서 정량적으로 나타내면 IC50값은 78 nM로 얻어져서, MBP-MAPK1이 31uM, 히스톤 H3-Aurora A가 1.3uM 보다 훨씬 낮은 농도에서 저해하고 있다는 것을 나타낸다.
이 실시예의 결과를 응용하면 여러 라이브러리로부터 효소 반응을 저해하는 물질을 스크리닝하는 것이 충분히 가능할 것으로 예상된다.
[실시예 5] 다른 기질과 키나아제의 반응 특이성의 확인
각각의 특정 키나아제에 의해 인산화되는 특정 기질들의 반응 특이성을 확인하기 위해, 웰마다 조건을 달리하여 시험해보았다. 실험 방법은 상기 [실시예 4-1]과 동일한 방법으로 수행하였다.
동일한 조건에서 기질의 유무, 효소의 유무, 인산화 특이항체의 유무별로 확인한 결과, 아래 표 6과 같은 형광 세기값으로 결과가 얻어졌고 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서만 형광 세기가 높게 얻어졌다.
표 6
Figure 112010034408576-PCT00016
Cdk1,2에 의해 인산화되는 히스톤 H1의 경우 상기의 다른 실시예와 다르게, 음성 대조군에서도 6000이상의 높은 형광세기 값이 얻어졌지만, 양성 대조군과의 유의차가 10배정도 나타나기 때문에 추후 실험상의 문제는 없었다.
특히, IKKβ에 의해 인산화되는 Iκ-Bα의 경우 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서 음성대조군에 비해 300배 이상 높은 형광세기가 얻어졌다.
ZAP-70에 의해 인산화되는 LAT1를 비롯한 대부분의 기질-키나아제의 반응 특이성은 음성대조군에 비해 10배 이상 높은 형광 세기 값이 얻어졌다.
이들 모든 기질-키나아제 실험에서도 상기 실시예 2내지 4와 같이 보다 정확한 농도조건을 찾기 위하여 각각의 농도별 실험을 수행하였지만, 상기 결과와 비슷한 결과를 보였다.
[실시예 6] GS-Phosphatase-GSK3α/β의 반응확인
기질 단백질을 실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩에 고정한 후, 키나아제에 의한 인산화반응을 하기 전, 먼저 특정 탈인산화효소(phosphatase)로 처리함으로써 사전에 기질에 부착한 인산기를 제거하여 키나아제활성의 신호강도를 높일 수 있도록 하였다.
본 실시예에서는 글리코겐 합성효소(Glycogen Synthase, GS)를 기질로 GSK3의 활성을 측정할 경우 나타나는 문제점과 해결 방안에 대한 결과를 나타내었다.
[실시예 6-1] GSK3α/β의 반응 특이성 확인
GSK3α에 의해 인산화되는 GS의 반응 특이성을 확인하기 위해 웰 마다 각각 조건을 달리하여 시험하였다. 상세한 실험 방법은 상기 [실시예 2-1]과 동일하게 수행하였다.
동일한 조건에서 효소의 유무, 인산화 특이항체의 유무별로 확인한 결과, 아래 표 7 (GSK3α) 및 표 8 (GSK3β)와 같은 형광 세기 값이 얻어졌고, 모든 조건이 충족된 첫 번째 웰에서 음성대조군에 비해 60배 정도로 높은 형광 세기 값이 얻어졌는데, 키나아제가 들어가지 않은 세 번째 웰에서도 음성대조군에 비해 40배 정도로 높은 형광 세기 값이 나타났다.
표 7
Figure 112010034408576-PCT00017
표 8
Figure 112010034408576-PCT00018
즉, GSK3 키나아제의 첨가로 인해 야기된 기질의 인산화는, 키나아제를 첨가하지 않은 웰에 비해 약 1.5배 정도의 약한 차이만을 보이고 있었다. 이것은 기질인 GS가 이미 인산화 되어 있기 때문에 인산화 특이 항체가 상기 기질에 결합된 것으로 결론지을 수 있다.
[실시예 6-2] GS의 탈인산화 및 인산화 반응 확인
상기 실시예[6-1]에서 확인한 바와 같이 이미 인산화되어 있는 기질 GS를 탈인산화시키기 위하여 탈인산가수분해효소(Protein Phosphatase 2A, PP2A)를 처리하였다. 실험 방법은 상기 [실시예 6-1]과 동일하게 수행하였고 다만, 키나아제 대신 phosphatase를 처리하였으며, 반응 완충용액도 표 2에 나타난 바와 같이 각 phosphatase에 맞는 완충용액을 이용하였다. 또한, 탈인산화 반응이 끝난 다음, 동일한 조건으로 키나아제를 처리함으로써 인산화를 다시 유도하였다.
동일한 조건에서 탈인산효소의 유무 및 키나아제의 유무에 따른 결과를 확인한 결과, 아래의 표 9 (GSK3α) 및 표 10 (GSK3β)과 같은 형광 세기 값이 얻어졌다.
표 9
Figure 112010034408576-PCT00019
표 10
Figure 112010034408576-PCT00020
탈인산화효소와 키나아제가 모두 처리되지 않은 첫 번째 웰에서는 기질 자체의 인산화 정도가 나타났으며(표 9:11745, 표 10:13730), 탈인산화효소만 처리한 세번째 웰에서는 2.5배 정도 감소된 결과가 나타났다(표 9:4670, 표 10:5365). 그리고, 탈인산화시킨 다음 다시 키나아제에 의해 인산화를 시킨 네 번째 웰에서는(표 9:27548, 표 10:34169) 탈인산화 시키지 않은 기질에 인산화를 시킨 두 번째 웰(표 9:26526, 표 10:34257)과 거의 비슷한 정도의 결과를 나타냈다. 즉, 이 결과로부터 첫 번째 웰에서의 형광세기만큼 인산화되어 있는 기질을 탈인산화시키면, 세 번째 웰의 형광세기만큼 감소되었다가 다시 키나아제에 의해 네 번째 웰의 형광세기만큼 증가됨을 알 수 있었다. 이를 통해, 탈인산효소에 의해 탈인산화되는 위치와 키나아제에 의해 인산화되는 아미노산 잔기의 위치가 같다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 6-3] 탈인산화된 기질에 대한 키나아제의 농도에 따른 인산화 반응의 확인
탈인산화된 기질에 대한 키나아제의 활성을 측정할 때, 반응에 적당한 효소 농도를 확인하기 위하여, 각 웰칩에 기질인 GS를 고정하고 λPP를 처리함으로써 기질의 탈인산화반응을 유도한 뒤, 각 열에 따라 효소인 GSK3α 및 β의 농도를 단계적으로 희석하여 점적하여 효소반응을 유도하였다. 상세한 실험 방법은 상기 [실시예 2-2, 6-2]와 동일하게 수행하였다.
도 22는 탈인산화된 기질 GS에 대한 GSK3α 및 β의 농도에 따른 반응성을 나타낸 것으로, 키나아제가 0일 때의 형광 세기는 λPP 처리에 의해 탈인산화된 기질의 인산화된 정도를 나타내며, 이러한 기질에 키나아제를 농도별로 처리함으로써 농도가 높아짐에 따라 비례적으로 인산화되는 정도가 증가되는 경향을 볼 수 있다.
[실시예 6-4] 탈인산화 반응과 인산화반응의 반복
상기 [실시예 6-2]의 결과를 확인하기 위한 실험으로, PP2A 보다 탈인산화 활성이 높은 λPP를 이용하여 탈인산화시킨 다음, GSK3α/β를 처리하여 인산화시키고 다시 λPP를 이용하여 탈인산화시키는 과정을 3회 반복하여 실험해보았다. 도 23의 결과는 GSK3α에 의한 결과이다. 오차의 편차범위 내에서 동일한 형광 세기만큼 탈인산화-인산화 반응이 반복되는 결과를 보여주고 있다.
[실시예 7] IR-PTP1B의 반응 확인
실시예 1에 따라 제조된 단백질 칩 상에서 다른 포스파타제에 대한 실험으로 IR(인슐린 수용체)를 기질로 하여 PTP1B의 활성을 확인해보았다.
[실시예 7-1] 인슐린 수용체 기질의 ATP 처리에 따른 인산화 반응의 확인
PTP1B 포스파타제에 의한 탈인산화 반응을 유도하기 전, 인슐린 수용체 기질의 인산화를 유도하기 위해 기질을 농도별로 단백질 칩에 고정한 후, 먼저 표2에 나타낸 kinase assay buffer-1과 ATP/Mg buffer를 1x 수용액으로 희석하고 20 mM MnCl이 되도록 첨가해서 기질의 인산화를 유도하였다. 그 후 기질의 타이로신 잔기 (Tyr1158/Tyr1162/Tyr1163)를 인지할 수 있는 anti-phospho-IR (Tyr1158/Tyr1162/Tyr1163) 항체를 이용하여 1시간 동안 반응시키고, 위 항체를 인지할 수 있는 anti-rabbit IgG-Cy5 형광 항체를 이용하여 타이로신 잔기의 인산화 반응 정도를 확인하였다.
도 24는 동일한 기질 농도 조건에서 ATP 처리 유무에 따른 기질의 인산화 정도를 비교한 결과를 나타내며 ATP 처리시 높은 인산화 반응이 유도되었으며, 기질 농도는 20 ng/ul 기질 처리시에 가장 높은 인산화가 유도되었다.
즉, ATP 처리시 인슐린 수용체 기질의 자동 인산화 반응 (autophosphorylation)에 따라 타이로신 잔기의 인산화가 유도됨을 알 수 있다.
[실시예 7-2] 인산화된 기질에 대한 PTP1B 포스파타제 농도에 따른 탈인산화 반응의 확인
수용액 상에서 ATP를 처리하여 기질의 타이로신 인산화를 먼저 유도한 후 기질을 단백질 칩에 고정하였다. 그 후 PTP1B 포스파타제 농도에 따른 탈인산화 정도를 확인하기 위하여 포스파타제 농도를 10 ∼ 0.2 ng/ul로 처리하여 1시간 동안 반응하였다. 그런 다음 상기 [실시예 7-1]과 동일한 방법으로 타이로신 잔기를 인지할 수 있는 phospho 항체 및 anti-rabbit IgG-Cy5 형광 항체를 처리하여 PTP1B 포스파타제 농도에 따른 타이로신 잔기의 탈인산화 반응의 확인하였다.
도 25에서 보는 바와 같이 포스파타제 농도가 높을수록 인산화된 기질의 탈 인산화를 더 잘 유도하였으며, 포스파타제를 처리하지 않은 조건에서는 탈인산화를 유도하지 않았다. 또한 비교를 위해 실험한 ATP와 포스파타제를 처리하지 않은 조건의 경우 기질의 인산화가 일어나지 않음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
즉, ATP 처리에 의해 유도된 기질의 타이로신 인산화가 PTP1B 포스파타제에 의해서 탈인산화 반응이 일어남을 알 수 있다.
[실시예 7-3] 기질 농도에 따른 탈인산화 반응의 확인
기질을 농도별로 하여 상기 [실시예 7-2]과 동일한 방법으로 인산화를 유도한 후 단백질 칩에 고정하였다. PTP1B 포스파타제 5 ng/ul 농도로 처리한 후, 상기 [실시예 7-1]과 동일한 방법으로 타이로신 잔기를 인지할 수 있는 phospho 항체 및 anti-rabbit IgG-Cy5 형광 항체를 처리하여 탈인산화 반응을 확인하였다.
도 26에 나타난 바와 같이 기질의 농도가 높을수록 ATP에 의한 인산화 반응이 강하게 일어남을 확인하였고, 역시 포스파타제 처리시 탈인산화 반응 유도에 의해 모든 기질 농도 조건에서 형광 강도가 낮아짐을 확인하였다.
[실시예 8] 키나아제의 저해제 탐색
상기 [실시예 3-1] 내지 [실시예 3-6]의 결과를 통해 최적화된 실험 조건을 이용하여 Aurora kinase A에 대한 저해 활성을 갖는 물질을 스크리닝하였다. 양성 대조군으로는[실시예 3-6]에서 확인한 결과로서, 키나아제의 저해제로 널리 사용되는 Staurosporine을 이용하여 실험해 보았다.
웰칩에 고정된 기질이 효소에 의해 인산화 될 때, 효소 반응 용액에 Staurosporine 및 라이브러리 물질을 한가지씩 첨가한 상태에서 점적하고 배양하 여, 기질의 인산화에 대한 저해효과가 있는지를 시험하였다. 라이브러리 물질은 에탄올 및 물 추출 생약 시료 약 800개를 한국 생명공학연구원 한국식물추출물은행으로부터 분양받아 실험을 수행하였다. 각 라이브러리는 50 ug/ml 농도로 희석하여 실험하였다. 상세한 실험 방법은 상기 [실시예 2-9]와 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 수행 결과, 생약 추출물 라이브러리 스크리닝 수행 결과 중 26개에 대한 저해활성을 확인할 수 있었다(도 27 참조). 결과를 살펴보면, 1, 2, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 26번 샘플이 Aurora kinase A에 대해 가장 높은 저해활성을 보이고 있으며 3, 8, 13, 14, 15, 16은 상대적으로 약한 저해를 보이는 결과를 나타내며, 나머지 샘플들은 전혀 영향을 미치지 못하는 결과를 보이고 있다.
상기의 결과를 활용하면, 수천 내지 수만 개에 이르는 여러 가지 라이브러리 중에서 특정 기질과 키나아제의 활성을 저해하는 저해제를 탐색할 수 있다.

Claims (17)

  1. 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩으로서,
    단백질 중 양이온 작용기를 인식할 수 있는 캘릭스 크라운 유도체(Calix crown derivatives)가 칩 기재 상에 고정되어 있고,
    키나아제 또는 포스파타제의 기질 단백질이 웰 안에 있는 상기 캘릭스 크라운 유도체에 다중이온인식 작용에 의해 고정되어 있는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양이온 작용기는 암모늄기를 포함하는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기질 단백질은 융합단백질 형태가 아니면서 별도의 링커 연결 없이 캘릭스 크라운 유도체에 직접 고정된 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  4. 제1항에 있어서, 칩 기재 상에 상기 캘릭스 크라운 유도체를 균일한 분포로 고정시키고, 그 위에 0.1 내지 5 mm의 평균직경을 갖는 웰형성-구멍이 배열된 점착성 테이프를 부착시켜 웰온어칩(Well-on-a-Chip)형태의 단백질 칩을 형성한 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  5. 제1항에 있어서, 기질 단백질 함유 완충용액을 각 웰마다 0.1 내지 5 ㎕씩 점적하고 70％ 내지 90％의 습도 하에 배양한 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  6. 제1항에 있어서, 웰 안에서 기질 단백질이 수용액 상의 키나아제 또는 포스파타제와 반응할 수 있는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  7. 제6항에 있어서, 기질 단백질과 키나아제 또는 포스파타제를 반응시킨 후, 웰 안에서 직접 기질 단백질의 인산화 정도를 측정하여 키나아제 또는 포스파타제 활성을 측정할 수 있는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 캘릭스 크라운 유도체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2에 의해 표현되는 화합물인 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
    [화학식 1]
    Figure 112010034408576-PCT00021
    상기 식에서 n은 1이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 서로 독립적으로 -CHO, -SH, 또는 -COOH이고, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸이거나; 또는 n은 1이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 및 R3은 각각 -CH2SH기이고, R2 및 R4는 각각 -H이며, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, 프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸이거나; 또는 n은 2이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 및 R3은 각각 -CH2SH기이고, R2 및 R4는 각각 -H이며, R5 및 R6은 각각 서로 독립적으로 -H, -메틸, -에틸, 프로필, -이소프로필, 또는 -이소부틸임.
    [화학식 2]
    Figure 112010034408576-PCT00022
    상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH2SH기이거나, 또는 R1 내지 R4 중 2개가 서로 결합하여 각각 -CH2-S-S-CH2- 기를 형성하는 것임.
  9. 제1항에 있어서, 상기 기질 단백질은 Myelin basic protein, 히스톤 H3, Forkhead box O1a, 히스톤 H1, Inhibitor-kappa-B alpha, Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor-alpha, Mitogen-activated protein kinase 2, Linker for activation of T cell-1, Phospho-lipase C gamma-1, Glycogen Synthase, Signal Transducers and Activators of Transcription 3, V-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog (avian)-like protein, B-cell lymphoma 2, c-Jun, 및 Insulin Receptor로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  10. 제1항에 있어서, 상기 기질 단백질은 인산화된 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  11. 제1항에 있어서, 상기 키나아제는 MAPK1, Aurora kinase A, Aurora kinase B, Akt kinase, Cdk1/cyclin B kinase, Cdk2/cyclin A kinase, IKKβ, IKKα, MEK1, ZAP-70, FGFR1, GSK3α, GSK3β, Janus kinase 3, Abl kinase, JNK1(c-Jun N-terminal Kinase 1) 및 JNK2(c-Jun N-terminal kinase 2)로 구성된 군에서 선택되고, 포스파타제는 Bacteriophage λ protein phosphatase, Protein Phosphatase 2A, Protein Phosphatase 1 및 Protein Tyrosine Phosphatase 1B로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩.
  12. a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정용 단백질 칩에 기질 단백질과 반응할 수 있는 키나아제 또는 포스파타제를 처리하는 단계; 및
    b) 상기 처리에 의한 기질 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 a)단계에서 상기 키나아제를 단백질 칩에 가하기 전, 단백질 칩 내 고정된 기질 단백질을 탈인산화시키는 단계를 더욱 포함하는 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 a)단계에서 상기 포스파타제를 단백질 칩에 가하기 전, 단백질 칩 내 고정된 기질 단백질을 인산화시키는 단계를 더욱 포함하는 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 b) 단계는 인산화 특이 항체 및 표시물질로 표지된 2차 항체를 이용하여 수행되는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표시물질은 형광체, 효소, 방사능물질, 미세입자 및 색소로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 a) 단계 이전에, 키나아제 또는 포스파타제에 대한 저해제 후보물질을 첨가하는 단계를 더욱 포함하여, 상기 키나아제 또는 포스파타제의 저해제를 스크리닝하는 것이 특징인 키나아제 또는 포스파타제 활성 측정 방법.
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