KR20070048660A

KR20070048660A - 물질의 상호작용 탐색 시스템

Info

Publication number: KR20070048660A
Application number: KR1020067027836A
Authority: KR
Inventors: 김태국; 원재준; 이용원
Original assignee: 씨지케이 주식회사
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2007-05-09
Also published as: WO2006009398A1; EP1771736A4; EP1771736A1; US20080242557A1; KR101232752B1; JP2008507269A

Abstract

본 발명은 생리활성물질과 같은 분자들의 상호작용을 탐색하는 방법, 및 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 표적 분자들을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 제1탐색물질과 제2탐색물질을 제공하며, 여기서 제1탐색물질은 외부로부터 인가되는 작용력에 의해 위치가 이동하는 이동반응물질 (localizer)과 결합하고 제2탐색물질은 표지물질 (label)과 결합한다. 따라서, 제1탐색물질과 제2탐색물질의 복합체는 외부로부터 인가되는 작용력의 세기를 변화시킴으로써 가역적으로 탐색될 수 있으며 이로써 표적 분자를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

물질의 상호작용 탐색 시스템{SYSTEM FOR DETECTING MOLECULAR INTERACTIONS}

본 발명은 in vitro 및 in vivo에서 상호작용을 분석하기 위한 물질 예를 들어, 생리활성물질들의 상호작용(interaction)을 실시간 역동적으로 탐색하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 in vitro 및 in vivo에서 상호작용을 분석하기 위한 물질, 예를 들어, 생리활성물질들의 상호작용을 탐색하고 목적하는 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 생리활성화합물(chemical compound)은 생체내에서 단백질, 핵산, 당 또는 지질 등을 포함한 생체물질과 결합하여 이들의 기능 또는 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 이러한 생리활성화합물은 유기체로부터 추출하거나 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어, 장기이식시 발생하는 면역거부반응을 경감시키기 위해 사용되는 "사이클로스포린 A"(Novartis AG) 및 "FK506"(Fujisawa)을 비롯하여 많은 항생물질들(antibiotics)이 미생물, 식물 또는 해양 생물로부터 분리되었다. 이와 같은 천연 또는 합성 생리활성화합물은 이것의 약리활성을 테스트 하고, 동물모델 및 사람 모델을 사용한 임상시험을 거쳐 하나의 신약으로 개발된다. 그러나, 천연 생리활성화합물들 중 많은 수가 그 구조의 복잡성, 정제 및 분리 기술의 한계 등의 이유로 산업적 대량 생산에 적합하지 않다. 따라서 유용한 생리활성화합물을 대량으로 생산하기 위한 방법으로서 조합화학(combinatorial chemicals) 및 새로운 유기합성법이 연구되었다(참고문헌: Schreiber, S., 2000, Target- oriented and diversity-oriented organic synthesis in drug discovery, Science 287, 1964-1969).

생체내의 단백질은 다른 단백질과 결합함에 의해 그 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 결합한다. 일반적으로 두 개의 단백질들 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 결합하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다. 따라서 신약개발분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용파트너인 "프레이"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다. 현재까지 질환과 관련하여 약 500개의 표적단백질이 밝혀졌고, 향후 수년내에 약 5,000개 이상까지 증가될 것으로 예상된다.

인간 게놈의 해석 이후, 생리활성물질이 세포내의 여러 대사 및 신호전달 과정에서 수행하는 역할에 대한 다양한 연구가 보다 급속도로 수행되었다. 화학유전체학(chemical genomics), 화학생물학(chemical biology) 및 화학단백질체학 (chemical proteomics) 등의 연구분야가 나타났고, 이들은 분석디자인(analysis design), 기능유전체학(functional genomics), 단백질체학(proteomics), 자동화공학(automatic engineering) 및 생물정보학(bioinformatics) 등 다양한 기술의 발달과 관계한다.

단백질들 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 in vitro 방법으로서, 전통적으로 생물화학적 방법 예를 들어, 교차결합(cross-linking), 방사성 표지 리간드 결합(radiolabeled ligand binding), X-선 크리스탈로그래피 및 친화크로마토그래피(affinity chromatography), 친화블롯팅(affinity blotting), 면역침전법(immunoprecipitation) 및 질량분석법(mass spectrometry) 등이 개발되어 이용되었다(참고문헌: E. M. Phizicky and S. Fields, Microbiol. Rev., 59: 94-123, 1995; A. R. Mendelsohn and R. Brent, Science, 284: 1948-1950, 1999).

그러나, 이들 방법은 많은 노력이 요구되는 단백질 생산 및 분리과정을 요구하고, in vitro 에서 수행되는 상호작용이므로 세포내 상호작용과 일치하는 정보를 제공하지 못한다는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 몇 가지 기능적 클로닝(functional cloning) 예컨대, 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid; Y2H), 이스트 트리-하이브리드(Y3H; 참고문헌: Licitra, E.J., and Liu, J.O., 1996, A three-hybrid system for detecting small ligand-protein receptor interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12817-12821), 드럭-웨스턴(drug-western; 참고문헌: Tanaka, H., Ohima, N., and Hidaka, H. 1999, Isolation of cDNAs encoding cellular drug-binding proteins using a novel expression cloning procedure: drug-western. Mol. Pharmacol. 55, 356-363), 파아지-디스플레이 클로닝(참고문헌: Sche, P.P., McKenzie, K.M., White, J.D., and Austin, D.J. 1999, Display cloning: functinal identification of natural product receptors using cDNA-phage display. Chem. Biol. 6, 707-716), 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET; 참고문헌: Moshinsky DJ, Ruslim L., Blake RA, Tang F., A widely applicable, high-throughput TR-FRET assay for the measurement of kinase autophosphorylation: VEGFR-2 as a prototype.J Biomol Screen. 2003 Aug;8(4):447-52) 및 mRNA 디스플레이 클로닝(참고문헌: McPherson, M., Yang, Y., Hammond, P.W., and Kreider, B.L., 2002, Drug receptor identification from multiple tissues using cellular-derived RNA display libraries. Chem. Biol. 9, 691-698) 등이 개발되었다.

그러나, 이들 중 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 시스템은 게놈의 크기가 크고 복잡할 경우, 결과에 대한 신뢰도가 낮고 해석의 곤란해지므로 이를 사람에 대해 적용하는 것이 곤란하다. 또한 단백질의 원래 세포 내 분포 위치에 따라 시스템을 선택하여야 하고, 양질의 라이브러리 확보의 문제 및 세포대사 및 성장에 따라 전사활성이 영향 받을 수 있으며, 하이브리드 단백질이 독성을 나타낼 수 있다.

한편 Y3H는 생리활성 화합물과 단백질과의 상호작용에 대한 탐색이 살아있는 세포 내에서 이루어진다는 점을 특징으로 한다. 그러나, Y3H 역시 Y2H와 마찬가지 로, 효모 세포와 같은 단순한 세포 내에서 수행되어야 하는 한계가 있고, 전장 막단백질(full-length membrane protein)의 분석에 적합하지 않으며, 효모의 내인성 단백질의 번역후수식(posttranslational modification) 또는 부가의 단백질 (accessory protein)이 필요한 생리활성화합물와 단백질간의 상호작용에는 적용하기 어렵다. 특히 효모 세포는 포유동물 세포와 비교하여 생리활성 화합물에 대해 유전적으로 보다 낮은 투과성을 갖는다는 문제가 있다.

그 밖에 생물정보학적 방법을 사용하여 단백질들간의 상호작용을 예측하는 생물정보학적 방법이 개발되었다. 이 방법은 데이터베이스화된 게놈 서열정보에 기초하여 계통 분류적 또는 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 통해 단백질들간의 상호작용을 예측하는 방법이다. 또한, 구조유전체학(structural genomics), 분자 핑거프린트 (molecular fingerprint) 및 다양한 클러스터 분석 방법 등은 비교적 최근에 개발된 것으로서 버츄얼 스크리닝(virtual screening) 방법이다.

이와 같이, 단백질들 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 많은 방법이 제안되었으나 보다 더 효과적이고 조작이 용이한 방법에 대한 요구는 지속되고 있다.

또한, 표적단백질과의 상호작용을 이용하여 생리활성 화합물을 탐색하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 예를 들어, 생화학적방법으로서, 딩 등 (Ding, S. et al.)은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 퓨린계 분자(purine-like molecules)의 라이브러리를 스크리닝 하여 P19 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 화합물을 검출하였다 (참고문헌: Ding, S., T.Y.H., Brinker, A., Peters, E.C., Hur, W., Gray, N.S., and Schultz, P.G. 2003, Synthetic small molecules that control stem cell fate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 7632-7637).

그러나, 이 방법은 친화력이 매우 높아야만 탐색에 적용할 수 있다는 단점이 있으며, 표적단백질이 다량 존재하여야 효과적인 검출이 가능하다. 또한 대부분의 생리활성화합물은 소수성(hydrophobic)으로서 수용성 환경에서 목적하는 표적 분자와 경쟁적으로 표적단백질과 결합하므로, 생리활성 화합물를 고정화시킨 아가로스(agarose) 또는 다른 지지체에 검출대상의 추출물을 통과시키는 경우, 단백질은 특이적 결합파트너 뿐만 아니라 비특이적 결합파트너와도 결합을 형성한다. 따라서 이 방법의 경우 친화력이 낮은 결합분자를 제거하기 위한 세척 단계가 필수적으로 요구된다.

이와 같은 생화학적 방법의 단점을 극복하기 위해 유전적 방법이 제안되었다. 쟁 등(Zheng et al.)은 이형접합체(heterozygote) 및 숙주에서 증가된 약물 감수성을 탐색하기 위해 이스트 트리-하이브리드 시스템을 이용하였다. 이러한 유전적 방법의 가장 큰 장점은 표현형과 유전형 사이의 강력한 연관성이다. 즉, 이 시스템을 이용한 탐색 결과 발견되는 하나의 히트는 표적단백질에 대한 유전자의 클론을 직접적으로 제공한다(참고문헌: Jaeger, S., Eriani, G., and Martin, F. 2004, Results and prospects of the yeast three-hybrid system. FEBS Lett. 566, 7-12). 이 시스템에서는 신규 표적단백질 후보가 다가 단백질 복합체의 일부로서 융합되어 이용될 수 있다. 그러나, 이 시스템은 이스트에 한정되어 이용되어야 한 다는 단점이 있다.

화학유전학은 유전자 돌연변이(mutations)가 세포에 미치는 영향을 나타내기 위해 생리활성 화합물 이용하는 것으로서, 화합물군 또는 조합 라이브러리(combinatorial library)로부터 목적하는 활성화합물을 동정한다(참고문헌: Schreiber, S.L. 2003, The small molecule approach to biology. Chem. ＆ Eng. 1199 News 81, 51-61; Crews, C.M., and Splittgerber, U. 1999, chemical genetics: exploring and controlling cellular processes with chemical probes. Trends Biochem. Sci. 24, 317-320). 이 방법은 통상 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 목적하는 표현형을 탐색하기 위해 유전자 조작된 세포와 함께 수백 내지 수천 개의 화합물을 배열함에 의해 수행된다(참고문헌: Clemons, P.A., Koehler, A.N., Wager, B.K., Springs, T.G., Spring, D.R., King, R.W., Schreiber, S.L., and Foley, M.A. 2001, A one-bead, one-stock solution approach to chemical genetics: part 2. Chem. Biol. 6, 71-83). 예를 들어, 목적하는 결과가 특정 유전자 또는 유전자군의 발현을 유발시키는 것일 경우, 세포는 녹색형광단백질(GFP) 또는 다른 상용 마아커(marker)의 발현을 유발하는 관련된 프로모터(promoter)가 삽입된 리포터 구성물을 포함한다. 그러나, 이 방법 역시 다음과 같은 두 가지의 커다란 문제점이 있는 것으로 밝혀졌다: 첫째, 화학유전학은 미량의 nM 단위에서 작용하는 생리활성 화합물를 탐색하기에 적합하지 않다. 둘째, 이 방법은 전형적으로는 수십만 개 물질에 대한 스크리닝을 통해 불과 몇 개의 활성물질을 찾아낼 수 있다.

상기한 바와 같이, 단백질들 사이의 상호작용을 탐색하거나 단백질과 생리활성 화합물 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 종래기술은, 대부분 in vitro 에서 수행되거나 효모 또는 박테리아 등 제한된 세포 내에서만 수행 될 수 있으며, 유전자 조작 및 발현의 과정을 거쳐야 하므로 DNA의 크기에 제한되고, 그 밖에 다른 매개변수로 인한 높은 위양성률(false positive hit)로 인하여 검출된 결과의 신뢰도가 떨어진다.

이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점들을 극복하고, in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서 생리활성물질들의 상호작용을 실시간 역동적으로 탐색하기 위해 연구한 결과, 자기장에 의해 이동할 수 있는 자성을 나타내는 물질 또는 자성물질을 포함하는 입자(magnetic-material/-particle)에 생리활성물질을 결합시키고, 탐색을 위한 표지물질이 결합된 다른 생리활성물질을 세포 내로 도입한 다음, 세포에 자기장을 인가하고 자기장 하에서 이동된 표지의 위치를 측정하여 이들 생리활성물질들 사이의 결합여부를 탐색, 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

기술적 과제

일반적으로 본 발명은 in vivo 즉, 세포내, 조직내 또는 생체내 및 in vitro 즉 세포밖에서 상호작용을 분석하고자 하는 물질들(molecules) 예를 들어, 생리활성물질들 사이의 상호작용을 실시간으로 탐색하고 표적물질을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 본 발명은 in vitro 및 in vivo 에서 특정 생리활성물질인 "제1탐색물질"과 탐색 및 검출 대상의 생리활성물질인 "제2탐색물질" 사이의 상호작용을 직접적으로 탐색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 in vitro 및 in vivo 에서 "제1탐색물질"과 "제2탐색물질"의 상호작용을 직접적으로 탐색하고 목적하는 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 in vitro 및 in vivo 에서 "제1탐색물질"과 "제2탐색물질"의 상호작용을 직접적으로 탐색하기 위한 키트(kit) 또는 칩 (chip)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 "제1탐색물질"과 "제2탐색물질"의 상호작용을 억제(blocking) 또는 저해(inhibiting)하거나 촉진(activating) 또는 유도(inducing)시키기 위한 표적물질을 탐색하고 목적하는 표적물질을 검출하는 방법으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 in vitro 및 in vivo 에서 세포의 형태 또는 기능 변화를 관찰하여 "제1탐색물질"과 "제2탐색물질"의 상호작용을 간접적으로 탐색하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 방법에 대한 개략도를 나타낸다.

도 2는 녹색형광 염료인 FITC로 코팅된 나노입자를 세포내로 도입한 후 외부에서 자기장을 인가하여, FITC로 코팅된 나노입자의 위치가 변화되는 것을 관찰한 공초점현미경 사진이다.

도 3은 EGFP를 발현하는 세포들(녹색)과 비교해서 FKBP12-RFP 융합단백질을 발현하는 세포들(적색)의 외부 인가된 자기장 하에서의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 4는 FKBP12-RFP 융합단백질과 이것의 약제학적 결합파트너인 FK506-MNPs간의 상호작용의 결과 세포(적색 화살표로 표시)에 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 결합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 5는 mRFP-Caspase3를 발현하는 세포들(적색 화살표로 표시)의 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 6은 IκBα 단백질과 RelA 단백질의 상호작용의 결과, 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서 IκBα 단백질과 RelA 단백질 복합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 7은 anti-phospho-IκBα 항체를 이용하여 인산화된 IκBα 단백질을 검출한 결과, 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 anti-phospho- IκBα 항체-IκBα 단백질 복합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 8은 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 UAS 올리고뉴클레오티드와 GAL4 단백질 복합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 9는 miRNA인 let-7b와 이에 결합하는 mRNA인 lin-28의 상호작용에 따른 복합체 형성과 그 위치 이동을 나타내는 개념도이다.

도 10은 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 miRNA와 mRNA 복합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 11은 외부 인가된 자기장의 가역적인 변동하에서의 베타-CD와 MBP 단백질 복합체의 위치 이동을 나타내는 공초점현미경 사진이다.

도 12는 마이크로어레이된 세포내에서 결합 파트너 단백질을 검증하는 실험의 개념도이다.

도 13은 IκBα-mRFP, IκBα-ECFP-FKBP12, EYFP-RelA 및 mRFP-βTrCP 융합단백질의 모식도이다.

도 14는 TNF-α 처리 후 인산화된 IκBα-mRFP가 anti-phospho-IκBα(Ser32) 항체에 의해 나노입자와 결합하는 것을 보여주는 모식도이다.

도 15는 도 14의 모식도와 같이 TNF-α 처리 후 형성된 나노입자 복합체(nano-particle complex)가 외부 인가된 자기장에 의하여 위치 변화하는 것을 관찰한 공초점현미경 사진이다.

도 16은 도 13에 설명된 융합단백질들이 TNF-α 처리 후 나노입자 복합체를 형성하는 것을 보여주는 모식도이다.

도 17은 도 16의 모식도와 같이 형성된 나노입자 복합체가 외부 인가된 자기장에 의하여 위치변화하는 것을 관찰한 공초점현미경 사진이다.

도 18은 발현 라이브러리를 제조하기 위한 레트로바이러스 구성체를 나타낸다.

도 19는 표적물질의 동정을 위해 사용된 FK506과 FK506-비오틴 (biotin)의 화학구조를 나타낸다.

도 20은 외부 인가된 자기장 하에서 특이적으로 이동된 EGFP와 융합된 단백 질을 나타내는 공초점현미경 사진이다. 발현 라이브러리중에서 특이한 융합된 단백질은 FK506의 표적인 FKBP12 및 FKBP52임을 확인했다.

도 21은 CGK1026의 화학구조를 나타낸다.

도 22는 CGK1026에 의한 HDAC 단백질의 활성저해를 확인한 결과이다.

도 23은 FK506의 처리에 의하여 Biotin-FK506과 FKBP12의 결합이 경쟁적으로 저해되는 것을 보여주는 공초점현미경 사진이다.

도 24는 ATM 인산화효소와 CGK606의 상호작용 억제제의 탐색 결과, 워트마닌(WT)에 의한 저해 결과를 보여주는 공초점현미경 사진이다.

발명의 실시를 위한 형태

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 2개의 구성물 (constructs)을 디자인하였다. 구체적으로, 외부로부터 인가되는 작용력 (externally applied driving force)에 따라 위치가 변화되는 이동반응물질 (localizer)을 제공하고 이 물질에 분석하고자 하는 하나 이상의 "제1탐색물질" 예를 들어, 생리활성물질을 직접 또는 링커 등을 사용하여 간접적으로 결합시킨 제1구성물을 제작하였다. 제1구성물의 이동반응물질과 분석하고자 하는 탐색물질은 직접적으로 융합된 하나의 구성물로 제공될 수 있다. 또한 제1구성물은 분석하고자 하는 탐색물질을 인식할 수 있는 탐침(probe)이 융합된 이동반응물질과 분석하고자 하는 하나 이상의 탐색물질이 간접적으로 결합된 두 개 이상의 구성물로 제공될 수 있다. 제2구성물은 탐색이 가능하도록, 하나 이상의 표지물질(label)이 결합된 1개 또는 수개의 제2탐색물질 예를 들어, 생리활성물질을 포함한다.

제2구성물의 표지물질과 분석하고자 하는 생리활성물질은 직접적으로 융합된 하나의 구성물로 제공될 수 있다. 또한 제2구성물은 분석하고자 하는 생리활성물질을 인식할 수 있는 탐침(probe)이 융합된 표지물질과 분석하고자 하는 하나 이상의 생리활성물질이 간접적으로 결합된 두 개 이상의 구성물로 제공될 수 있다. 상기 제1구성물 및 제2구성물을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 상호작용(interaction)할 수 있는 위치로 접근시킨 후, 외부로부터 작용력을 인가하고 위치 또는 움직임이 변화된 표지를 간단한 장치로 측정함으로써 상호작용에 의해 형성된 복합체(complex)를 실시간 역동적으로 탐색할 수 있다. 또한, 외부 작용력 인가 후 세포의 형태 또는 기능의 변화를 측정하여 상호작용을 간접적으로 탐색할 수 있다. 본 발명에서, 제1탐색물질이 "베이트(bait)"가 되는 경우 제2탐색물질은 "프레이(prey)"로, 제2탐색물질이 "베이트"가 되는 경우, 제1탐색물질은 "프레이"로 이용될 수 있다. 본 발명에서 표지의 위치 또는 움직임 변화는 현미경을 포함한 광학적 방법, 스캐너(scanner), 방사성 표지 감지 수단, FP 리더(fluorescence polarization reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, 형광검출기, 발광검출기 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 물질의 상호작용 탐색 방법은, i) 외부 작용력(externally applied driving force)에 따라 위치 이동하는 이동반응물질(localizer)과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물 (construct)을 제공하는 단계; ii) 탐색을 위한 표지물질(label)이 결합된 제2탐색물질을 포함하는 제2구성물을 제공하는 단계; iii) 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 상기 제1구성물과 제2구성물을 상호작용이 가능한 위치로 접근시키는 단계; 및 iv) 외부 작용력을 인가하고 위치 또는 움직임이 변화된 표지를 측정하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에서 표적물질의 검출 방법은, i) 외부 작용력에 따라 위치 이동하는 이동반응물질과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물을 제공하는 단계; ii) 탐색을 위한 표지물질(label)이 결합된 제2탐색물질을 포함하는 제2구성물을 제공하는 단계; iii) 동일한 장 또는 계에서 상기 제1구성물과 제2구성물을 상호작용이 가능한 위치로 접근시키는 단계; iv) 외부 작용력을 인가하고 위치 또는 움직임이 변화된 표지를 측정하는 단계; 및 v) 제2구성물에 포함된 물질을 분리하고 동정하는 단계를 포함한다. 표적물질의 검출은 공지의 방법 예를 들어, RT-PCR, 게놈 DNA에 대한 PCR 또는 질량분석(Mass Spectroscopy)에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 3개의 구성물을 제조하여 물질의 상호작용을 탐색하고 표적물질을 검출할 수 있다. 구체적으로, i) 외부 작용력에 따라 위치 이동하는 이동반응물질과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물을 제공하는 단계; ii) 표지물질(label)이 결합된 제2탐색물질을 포함하는 제2구성물을 제공하는 단계; iii) 탐색을 위한 물질을 포함하는 제3구성물을 제공하는 단계; iv) 동일한 장 또는 계에서 상기 제1구성물, 제2구성물과 제3구성물을 상호작용이 가능한 위치로 접근시키는 단계; 및 v) 외부 작용력을 인가하고 위치 또는 움직임이 변화된 표지를 측정하는 단계를 포함하는 물질의 상호작용을 탐색하는 단계; 및 vi) 제3구성물에 포함된 물질을 분리하고 동정하는 단계를 포함한다. 표적물질의 검출은 공지의 방법 예를 들 어, RT-PCR, 게놈 DNA에 대한 PCR 또는 질량분석(Mass Spectroscopy)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 제1구성물, 제2구성물 또는 제3구성물을 구성하는 탐색하고자 하는 대상 물질은 라이브러리(library) 형태로 제공될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 외부로부터 인가되는 작용력으로서 자기력(magnetic force)을 이용하였다. 제1구성물을 구성하는 이동반응물질로서, 자성물질을 포함하는 나노입자(nano-particle), 바람직하게는 5 nm 내지 2,000 nm 크기의 물질을 제공하고 상기 이동반응물질에 특정 물질, 예를 들어 생리활성물질을 결합 또는 코팅하여 이용한다. 이동반응물질은 2개 이상의 특정 물질과 결합하거나 이들 물질로 코팅되어 제공될 수 있다. 제2구성물은 제1구성물 중의 생리활성물질과 상호작용 하는 파트너로서 탐색을 위한 표지가 부착된 다른 생리활성물질을 제조하여 이용한다. 상기 제1구성물과 제2구성물을 동일한 세포 내로 도입하고 외부로부터 자기장을 인가한 후 자기장 하에서 이동된 표지를 측정함으로써 목적하는 표적물질을 실시간으로 탐색한다. 또한, 자기장의 세기를 변화시킴에 의해 보다 역동적인 탐색을 수행할 수 있으며, 자기장의 세기를 변화시키는 동안 위치 변화하거나 변화하지 않는 물질을 음성 또는 양성 대조구로 이용하여 비교 탐색할 수 있다.

다른 일 구체 예에서, 본 발명은 i) 특정한 생리활성화합물을 자성입자에 코팅하여 제공하는 단계, ii) 단계 i)의 코팅된 자성입자를 표지물질이 결합된 단백질을 포함하는 세포 내로 전달하는 단계; iii) 단계 ii)의 세포에 대해 자기장을 인가하여 세포 내 자성입자를 이동시키는 단계, iv) 표지의 위치 또는 움직임을 측 정하는 단계, 및 v) 표지가 위치 또는 움직임 변화를 보인 세포에서 표지가 부착된 표적물질을 검출, 규명하는 단계를 포함한다.

본 발명을 in vivo에서 수행하는 경우,진핵세포, 원핵세포, 포유동물의 생체내, 조직내 및 세포내, 식물의 생체내, 조직내 및 세포내에서 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly) 또는 개구리(Frog)의 세포내, 조직내 또는 생체내에서도 수행될 수 있다. 본 발명에서 제1구성물 및 제2구성물은 세포전달성 펩타이드 (transducible peptide 또는 fusogenic peptide), 지질 유전자 전달체 (lipid 또는 liposome) 또는 이들의 결합체를 이용하거나, 제1구성물 및 제2구성물을 Opti-MEM 배지에서 세포와 배양하거나, 일렉트로포레이션 (electroporation) 또는 마그네토펙션(magnetofection) 등 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 세포내로 전달될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법을 세포 내에서 수행하는 경우, 배양플레이트(culture plate/dish) 또는 마이크로어레이(microarray)된 살아있는 세포 내에서 수행할 수 있다.

본 발명에서 외부로부터 인가되는 작용력은 제1구성물에 포함되는 이동반응물질의 물리적, 화학적, 생물학적 및 정전기적 특성을 포함하는 특성에 따라 적절하게 선택 가능하다. 예를 들어, 옵티칼 트위져 (optical tweezer) 등을 포함하는 광학기구를 사용하여 외부 작용력을 인가할 수 있다.

본 발명에서 "생리활성물질"은 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질 (lipid), 비타민, 화합물(chemical compound 등)과 이들을 구성하는 요소 등을 비롯하여 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질을 포함한다.

본 발명에서 "베이트(bait)"는 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 생리활성물질을 의미한다.

본 발명에서 "프레이(prey)"는 상기 "베이트"의 상호작용 파트너로서 탐색 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 생리활성물질을 의미한다.

본 발명에서 "표적물질"이란 "베이트"와 상호작용하는 "프레이" 또는 "베이트"와 "프레이" 물질의 상호작용을 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하거나 억제(blocking) 또는 저해(inhibiting)하는 규명하고자 하는 모든 물질을 의미한다.

본 발명에서 "이동반응물질"(localizer)이란 외부로부터 인가되는 작용력(externally applied driving force)에 반응하여 위치 이동하는 물질을 의미한다.

본 발명에서 외부로부터 인가되는 "작용력"은 전기력, 전자기력, 자기력 및 중력을 포함하여 제1구성물 중의 상기 정의된 이동반응물질의 위치변화를 가져올 수 있는 모든 종류의 힘(force)을 말한다.

본 발명에서 제2구성물을 구성하고 탐색에 이용되는 표지물질은 그 자체로서 형광을 나타내거나 제1구성물 또는 다른 물질과의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material) 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광염료들과 GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질 및 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif) 또는 형광을 내는 나노입자이거나, 그 자체로서 발광을 내거 나 제1구성물 또는 다른 물질과의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등 및 방사성표지(radioactive label), 예를 들어, ³²P, ³⁵S, ³H 및 ¹⁴C 등을 포함하여 일반적으로 사용 가능한 표지를 모두 포함한다.

본 발명에서, 생리활성물질과 이동반응물질간의 결합 또는 생리활성물질과 표지물질간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함하며, 생리활성물질은 이동반응물질 또는 표지물질의 표면에 코팅되어 이용될 수 있다.

본 발명에서, 제1구성물 또는 제2구성물을 구성하고 탐색에 이용되는 탐침(probe)은 생리활성물질과 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적으로 결합하여 탐색물질과 위치조절인자 또는 생리활성물질과 표지물질을 직접 또는 간접적으로 결합시킬 수 있는 물질들 예를 들어, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 모두 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1

형광염료인 FITC로 코팅된 나노입자를 이용한 세포내 위치변화 확인

스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그넥틱 나노입자(50 nm; 스트렙타비딘 나노입자)를 FITC-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 반응시켜, 수퍼파라마그네틱 나노입자(MNPs)를 FITC로 코팅한 FITC-MNP-TATHA2 복합체를 수득하였다. TATHA2 펩타이드는 종래기술에 따라 합성하고(참고문헌: Wadia, et al., Nat Med. 10:310-315 (2004)), N-말단부를 비오틴으로 표지했다. 음성대조구로는 외부 인가된 자기장에 의해 위치 변화를 일으키지 않는 나노입자인 QD565를 TATHA2-비오틴과 반응시켜 QD565-TATHA2 복합체를 수득하였다. 미리 배양된 헬라 세포(HeLa cell, ATCC로부터 구입)를 혈청을 함유하지 않는 DMEM으로 세척한 후, Opti-MEM(Invitrogen) 배지에 FITC-MNP-TATHA2 복합체와 QD565-TATHA2 복합체를 각각 혼합한 용액을 세포에 처리하여, 세포를 37℃로 고정된 CO₂ 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하여, FITC-MNP-TATHA2 및 QD565-TATHA2 복합체를 헬라 세포 내로 도입했다. 세포를 공초점현미경의 초점 플레이트 위로 옮기고 바닥면에 시판중인 영구자석 또는 전자석으로 자기력을 인가했다.

공초점현미경의 초점 플레이트를 조절하고 세포 바닥면으로 이동된 나노입자의 형광을 관찰하였다(도2). FITC-MNP-TATHA2가 도입된 세포에서만 외부 자기장에 의해 FITC-MNP-TATHA2 복합체가 위치 이동하는 것이 확인되었으며, 음성대조구 (negative control)로 사용한 QD565-TATHA2가 도입된 세포에서는 자기장에 의한 위치변화가 보이지 않았다.

실시예 2

다양한 생리활성물질들 간의 세포내 상호작용 탐색

1) 형광단백질과의 융합단백질과 생리활성 저분자화합물이 코팅된 나노입자를 이용한 세포내 상호작용 탐색: 스트렙타비딘 나노입자를 FK506-비오틴와 반응시켜, 수퍼파라마그네틱 나노입자(MNPs)를 생리활성저분자(FK506)로 코팅하였다(MNP-FK506). EGFP 단백질과 FKBP-RFP 융합 단백질을 발현하는 헬라 세포(HeLa cell)를 혈청을 함유하지 않는 DMEM으로 세척한 후, 세포를 37℃로 고정된 CO 인큐베이터에서 12시간 동안 MNP-FK506과 Opti-MEM(Invitrogen)을 혼합한 배지에서 배양하여, MNP-FK506을 헬라 세포 내로 도입 했다. 세포를 공초점현미경의 초점 플레이트 위로 옮기고 바닥면에 영구자석 또는 전자석으로 자기력을 인가했다.

공초점현미경의 초점 플레이트를 조절하고 세포 바닥면으로 이동된 형광단백질을 관찰하였다(도 3). FKBP12-RFP 융합단백질을 발현하는 세포들(적색)만이 외부 자기장에 의해 위치 이동하며, 음성대조구(negative control)로 사용한 EGFP를 발현하는 세포들(녹색)의 경우 자기장에 의한 위치변화를 보이지 않았다.

2) FK506과 이것의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FKBP12(FK506 binding protein 12)의 세포내 상호작용의 검증: 스트렙타비딘 나노입자를 FK506-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 FK506-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 반응용액을 전자석 혹은 영구자 석을 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 RFP와 융합된 FKBP12(FKBP-RFP) 또는 EGFP를 발현시키는 플라스미드를 각기 도입한 후 이 세포들을 떼어 섞은 후 배양기에서 함께 배양하였다. 다음 이들 세포에 상기 제조한 FK506-MNPs 복합체를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장(M. F., Magnetic Field)을 외부로부터 인가하였다.

공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다. 도 4의 사진에서 RFP와 융합된 FKBP12를 발현하는 세포들(적색 화살표로 표시)만이 외부 자기장에 의해 위치 이동하며, 음성 대조구로 사용한 EGFP를 발현하는 세포들(녹색 화살표로 표시)의 경우 자기장에 의한 위치변화를 보이지 않았다.

3) 케스페이즈-3 억제제(caspase-3 inhibitor) 펩타이드와 이것의 결합파트너인 케스페이즈-3의 세포내 상호작용의 검증: 스트렙타비딘 나노입자를 케스페이즈-3 억제제 Ⅱ[caspase-3 inhibitorⅡ(DEVD)]-비오틴 컨쥬게이트(biotin conjugate; CALBIOCHEM) 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 DEVD-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 mRFP와 융합된 케스페이즈-3(mRFP-Caspase3) 또는 EGFP를 발현시키는 플라스미드를 각기 도입한 후 이 세포들을 떼어 섞은 후 배양기에서 함께 배양하였다. 다음 이들 세포에 상기 제조한 DEVD-MNPs를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다.

공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다. 도 5의 사진에서 mRFP-Caspase3를 발현하는 세포들(적색 화살표로 표시)만이 외부 자기장에 의해 위치 이동하며, 음성 대조구(negative control)로 사용한 EGFP를 발현하는 세포들(녹색 화살표로 표시)의 경우 자기장에 의한 위치변화를 보이지 않았다.

4) IκBα단백질과 이것의 결합파트너인 RelA 단백질의 세포내 상호작용의 검증: 스트렙타비딘 나노입자를 FK506-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 FK506-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다.

헬라 세포에 ECFP 및 FKBP12와 융합된 IκBα(IκBα-ECFP-FKBP12) 및 EYFP와 융합된 RelA(EYFP-RelA)를 발현시키는 플라스미드를 함께 도입한 후 이들 세포에 상기 제조한 FK506-MNPs를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다. 도 6의 사진에서 보는 바와 같이 외부 인가된 자기장에 의하여 IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질과 EYFP-RelA 융합단백질이 외부 인가된 자기장에 의하여 위치 이동하였다.

5) IκBα 단백질과 이것에 대한 항체인 anti-phospho-IκBα 항체의 세포내 상호작용의 검증: 스트렙타비딘 나노입자를 anti-phospho-IκBα-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 anti-phospho-IκBα- MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 mRFP와 융합된 IκBα(IκBα-mRFP) 를 발현시키는 플라스미드를 도입한 후 이들 세포에 상기 제조한 anti-phospho-IκBα-MNPs 를 도입한 후, TNF-α를 5분간 처리한 후 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 7).

6) GAL4 단백질과 GAL4 단백질의 결합부위를 갖는 올리고뉴클레오티드(UAS)의 세포내 상호작용의 검증: 효모의 전사활성인자인 GAL4 단백질이 결합할 수 있는 DNA 염기서열인 UAS (서열번호: 1)를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 비오틴-CCGAGTTTCTAGACGGAG(UAS-비오틴)를 합성하였다. 스트렙타비딘 나노입자를 UAS-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 UAS-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 EGFP와 융합된 GAL4(GAL4-EGFP)를 발현시키는 플라스미드를 도입한 후 이들 세포에 상기 제조한 UAS-MNPs를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 8).

7) miRNA와 mRNA의 세포내 상호작용의 검증: miRNA와 그 세포 내 표적인 mRNA의 상호작용을 검증하기 위하여, lin-28 mRNA에 결합하는 let-7b miRNA(서열번 호: 2)를 선택하였다(도 9). let-7b miRNA는 UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-비오틴의 구조로 합성하였고(let-7b-비오틴), lin-28 mRNA (서열번호: 3)를 표지하기위하여, FITC-CCCTATAGTGAGTCGTATTA(FITC-lin28p)를 합성하였다. 스트렙타비딘 나노입자를 let-7b-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 let7b-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 lin-28 mRNA를 발현시키는 플라스미드를 도입한 후 이들 세포에 상기 제조한 let7b-MNPs와 FITC-lin28p를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 10).

8) 베타-사이클로덱스트린과 MBP 단백질의 세포내 상호작용의 검증: 베타-사이클로덱스트린(Sigma)은 EZ-Link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation kit(Pierce)를 이용하여 비오틴화(βCD-비오틴)하였다. 스트렙타비딘 나노입자를 βCD-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 βCD-MNPs 복합체를 수득하였다. 결합하지 않은 리간드를 제거하기 위해 복합체를 영구자성체를 사용하여 정제하였다. 헬라 세포에 EGFP와 융합된 MBP(MBP-GFP)를 발현시키는 플라스미드를 도입한 후 이들 세포에 상기 제조한 βCD-MNPs를 도입한 후, 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 11).

실시예 3

마이크로어레이된 세포내에서 결합 파트너 단백질의 검증

1,000 여개의 인간 유래 완전장 ORFs(open reading frames) 유전자는 인간유전체기능연구사업단으로부터 분양받았다. 1,000 여개의 유전자를 대장균 세포에서 증식시킨 후, 플라스미드 DNA를 추출하고, 동물 세포에서 유전자 발현을 시키기 위하여, pcDNA-GFP-DEST 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. pcDNA-GFP-DEST 벡터에 삽입된 유전자는 목적 단백질의 C-말단에 GFP 단백질이 융합된 융합단백질을 만들게 된다. 마이크로어레이된 세포는 종래의 기술에 따라 제작하고[참고 문헌: Ziauddin and Sabatini, Nature 411: 107-110(2001)], 융합된 GFP 형광단백질의 발현으로 검증하였다. 마이크로어레이된 세포에 상기 실시예 6에서와 같은 방법으로 수득한 FK506-MNPs를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 도입한 후 영구자성체 또는 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다. 양성 클론들에 대한 RT-PCR 및 mRNA의 서열분석으로 양성 클론들이 FK506의 약제학적으로 관련된 표적인 FKBP12 임을 확인했다(도 12).

실시예 4

세로 신호 전달(signal transduction)에 의한 단백질의 번역후 수식 및 단백질 복합체의 변화 검증

세포 신호 전달에 따른 단백질의 번역후 수식과 단백질 복합체의 변화를 세포내에서 검증하기 위하여 TNF-α/IκBα 신호 전달계를 선택하였다. IκBα는 NF- κB 단백질인 RelA/p65, p50, c-Rel 등과 복합체를 이루어 다양한 신호를 조절한다. 세포에 TNF-α를 처리하면, IκB kinase(IKK)의 활성이 증가되어 IκBα의 32번째 세린(serine)과 36번째 세린이 인산화되고, 그 결과 IκBα와 βTrCP 단백질의 결합이 일어나게 된다[참고 문헌: Brown, et al., Science 267: 1485, (1995)]. 이와 같이 TNF-α처리에 의한 IκBα의 인산화와 IκBα-βTrCP 복합체 형성을 검증하기 위하여 다음과 같은 발현 구성물을 제작하였다(도 13). IκBα 유전자와 mRFP 유전자를 융합시킨 발현 벡터를 제작하여 IκBα-mRFP 융합단백질이 발현되도록 하였다. 또한, IκBα 유전자와 ECFP 유전자 및 FKBP12 유전자를 융합시킨 발현 벡터를 제작하여 IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질이 발현되도록 하였다.

EYFP-RelA 융합단백질은 EYFP 유전자와 RelA 유전자가 융합된 발현 벡터를 제작하여 세포 내에서 발현시켰다. mRFP-βTrCP 융합단백질 역시, 각각의 유전자를 융합시킨 발현 벡터를 제작하여 사용하였다. Anti-phospho-IκBα 항체(Cell Signaling Technology)는 EZ-Link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation kit(Pierce)를 이용하여 비오틴화하였고, 웨스턴 블롯으로 검증하였다.

1) 세포 신호 전달에 의한 단백질 인산화의 검증: 스트렙타비딘 나노입자와 비오틴-SS-FITC, 비오틴-TATHA2 및 비오틴-anti-phopho-IκBα(Ser32) 항체를 4℃에서 1시간 동안 혼합하여 IκBα(Ser32)-MNPs 복합체를 수득하였다.

IκBα-mRFP 발현 벡터가 도입된 HeLa 세포에 IκBα(Ser32)-MNPs 복합체를 실시예 1과 같은 방법으로 도입시킨 후, 10 ng/ml의 TNF-α를 5분간 처리하고, 공초점레이저현미경을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 14와 15). IKK 저해제인 SC-514는 1 mM 농도로 처리하였다. TNF-α 처리에 의하여 인산화된 IκBα는 IκBα(Ser32)-MNPs 복합체와 결합하여 외부 인가된 자기력에 의해 위치 이동되는 것을 확인하였고, IKK 저해제인 SC-514를 처리하면 IκBα의 인산화가 이루어지지 않아, 위치 이동이 일어나지 않는 것을 검증하였다.

2) 신호 전달에 의한 단백질 복합체의 형성을 확인하기 위하여 다음 실험을 수행하였다. HeLa 세포에 IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질 발현 벡터, EYFP-RelA 융합단백질 발현 벡터 및 mRFP-βTrCP 융합단백질 발현 벡터를 동시에 형질전환하고, FK506-MNPs 복합체를 실시예 1과 동일한 방법으로 수득하여 세포에 도입하였다. 10 ng/ml의 TNF-α를 5분간 처리하고, 공초점레이저현미경을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다(도 16과 17). 신호 전달과 무관하게 복합체를 이루는 IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질과 EYFP-RelA 융합단백질은 외부 인가된 자기력에 의한 위치 이동을 일으킨 반면, 신호 전달에 의해 인산화된 IκBα와 결합하는 mRFP-βTrCP 융합단백질은 TNF-α를 처리한 경우에만 위치 이동하였다. IKK 저해제인 SC-514는 IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질과 EYFP-RelA 융합단백질의 결합은 방해하지 못하고, IκBα-ECFP-FKBP12 융합단백질과 mRFP-βTrCP 융합단백질의 결합만을 저해하였다.

실시예 5

유전체수준의 cDNA 발현라이브러리로부터 생리활성물질과 결합파트너 단백질들과의 세포내 상호작용의 스크리닝, 탐색 및 검증

1) 유전체수준의 cDNA 발현라이브러리로부터 FK506와 그 결합파트너 단백질들과의 세포내 상호작용의 스크리닝, 탐색 및 검증: 발현 라이브러리의 제조를 위한 레트로바이러스 구성체를 제작하였다. 도 18에 도시된 구조의 pBabe-puro 벡터를 골격(backbone)으로 사용하였다 [참고문헌: Morgenstern, et al., Nucleic Acids Res. 18:3587-3596 (1990)]. 구성된 레트로바이러스에서는 5' LTR로부터 전사되어 EGFP 융합단백질과 mRFP를 모두 포함하는 바이시스트로닉(bicistronic) mRNA가 발현된다. 프레임을 3가지로 달리하여 삽입체(insert)가 EGFP에 대해 최대한 인프레임(in-frame)으로 들어갈 수 있도록 하였다(도 18). EGFP의 3' 또는 5' 말단으로의 무작위 cDNA 융합을 종래기술에 따라 수행했다 (참고문헌: Escobar, et al., Plant Cell 15:1507-1523 (2003)). 도 19에 도시된 바와 같은 구조의 FK506-비오틴(biotin)을 종래기술에 따라 합성하고(참고문헌: McPherson, et al., Chem Biol. 9:691-698 (2002)), MALDIMS를 사용하여 검증했다. 스트렙타비딘 나노입자를 FK506-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 FK506-MNPs 복합체를 수득하였다. 주르캐트 세포(Jurkat cells)로부터 EGFP-융합 단백질 발현 라이브러리를 종래기술에 따라 제조하였다[참고문헌: Escobar, et al., Plant Cell 15:1507-1523 (2003)]. 미국 스텐포드 대학교의 G. P. Nolan로부터 제공받은 페키징 세포주(Phoenix-ampho)를 레트로바이러스 발현 라이브러리로 형질전환시켜 감염성 레트로바이러스를 제조하였다. 형질전환 후 48시간째에 형질전환시킨 패키징 세포로부터 상등액을 수집하고 0.45 mm 필터(Millipore)로 여과한 후, 헬라 세포의 감염에 이용하였다. 헬라 세포를 4 mg/ml 폴리브렌을 첨가한 바이러스 상등액 으로 감염시켰다. 2일 후 감염된 세포에 퓨로마이신(puromycin; 1 mg/ml)을 주입하고 3일 동안 선택 배양하였다. 다음 이들 세포에 상기 제조한 FK506-MNPs를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 도입한 후 영구자성체 혹은 전자석을 이용하여 자기장을 외부로부터 인가하였다. 공초점레이저현미경을 사용하여 자기장 하에서 및 자기장을 인가하지 않은 상태에서 살아있는 세포의 공초점 영상을 촬영했다. EGFP와 동시 발현된 mRFP를 위양성(false positive) 신호로서 동시에 모니터링 하였다. 도 20의 사진에서 화살표는 양성 클론들을 의미한다. 상기 양성 클론들에 대한 RT-PCR 및 mRNA의 서열분석으로 양성 클론들이 FK506의 약제학적으로 관련된 표적인 FKBP12 및 FKBP52임을 확인했다. 양성 클론에 대한 RT-PCR 및 서열분석을 종래기술에 따라 수행했다(참고문헌: Escobar, et al., Plant Cell 15:1507-1523 (2003)).

2) 유전체수준의 cDNA 발현라이브러리로부터 CGK1026과 그 결합파트너 단백질들과의 세포내 상호작용의 스크리닝, 탐색 및 검증: CGK1026은 인간의 텔로머라아제 활성을 증진시키는 생리활성물질로 밝혀졌다(도 21; 참고 문헌: Won, et al., PNAS, 101: 11328-11333 (2004)). CGK1026과 결합하는 세포 내 단백질을 스크리닝하기 위하여, GCK1026-비오틴 유도체를 제작하였다. 스트렙타비딘 나노입자를 CGK1026-비오틴 및 TATHA2-비오틴과 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시켜 CGK1026-MNPs 복합체를 수득하였다. 실시예 5의 1)에서와 같은 방법으로 레트로바이러스 발현 라이브러를 이용하여, CGK1026과 결합하는 단백질이 HDAC임을 확인하였고, 기존에 알려진 HDAC 저해제인 TSA와 비교하여 유사한 정도로 HDAC 활성을 저해하는 것을 확인하였다(도 22; 참고 문헌: Won, et al., PNAS, 101: 11328-11333 (2004)).

실시예 6

상호작용 억제제 및 촉진제의 약제학적 탐색(drug screening)

1) 상호작용 촉진제의 탐색: 실시예 4의 1)과 같은 방법으로 IκBα-mRFP 융합단백질 발현 벡터와 IκBα(Ser32)-MNPs 복합체를 HeLa 세포에 도입한 후, 다양한 화합물과 성장 촉진 인자들을 처리하고, 외부 자기력을 인가하여 IκBα-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 공초점현미경으로 관찰하였다. 세포에 처리한 생리활성물질 중 TNF-α, IL-2, LPS, Fas 등 만이 외부 자기력에 의한 IκBα-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 일으키는 것을 확인하였다(도 15 및 도 17).

2) FK506에 의한 상호작용 억제: FK506-MNPs 복합체와 FKBP12-mRFP 발현 벡터를 실시예 3과 동일한 방법으로 세포에 도입한 후, 다양한 화합물을 처리하여 FKBP12-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 관찰하였다. 처리된 화합물 중 FK506만이 경쟁적으로 FKBP12-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 저해하는 것을 확인하였다(도 23).

3) 상호작용 억제제의 탐색: CGK606은 ATM (ataxia telangiectasia) 인산화효소의 저해제로 탐색되었다. 스트렙타비딘 나노입자를 CGK606 및 TATHA2로 코팅하여 CGK606-MNPs 복합체를수득하였다. ATM-mRFP 융합단백질을 발현하는 벡터를 헬라 세포에 도입한 후, CGK606-MNPs를 앞에서와 동일한 방법으로 세포 내에 도입하였다. 여러 가지 생리활성 저분자화합물을 처리한 후, 외부 자기력을 인가하여 ATM-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 공초점현미경으로 관찰하였다. 세포에 처리한 생리 활성물질 중 워트마닌(wortmannin)만이 음성대조구와 비교하여, 외부 자기력에 의한 ATM-mRFP 융합단백질의 위치 이동을 억제하는 것을 확인하였다(도 24).

이와 같이, 본 발명에 따르면 외부로부터 인가되는 작용력에 따라 위치 변화하는 이동반응물질과 생리활성물질의 제1구성물과 탐색을 위한 표지가 부착된 다른 생리활성물질을 포함하는 제2구성물을 동일 작용계 (system) 또는 장(field)에서 반응시킴에 의해 상호작용에 의해 형성된 결합체(complex)를 위치 변화된 표지로부터 실시간으로 직접 탐색할 수 있다. 또한, 결합체의 위치 변화는 외부 작용력의 세기에 따라 역동적으로 측정할 수 있어 가역적(reversible)이다. 따라서, 본 발명은 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색 및 검출하고자 하는 표적물질의 크기에 제한 없이 세포를 파괴하지 않고 in vitro 및 in vivo 에서 효과적으로 수행할 수 있으므로, 신약개발을 위한 표적단백질 및 신약후보물질의 탐색 및 검출 뿐만 아니라 기존의 약물을 개량하거나 새로운 약제학적 용도를 발견하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

i) 외부 작용력(externally applied driving force)에 따라 위치가 이동하는 이동반응물질(localizer)과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물을 제공하는 단계;

ii) 탐색을 위한 표지물질(label)이 결합된 제2탐색물질을 포함하는 제2구성물을 제공하는 단계;

iii) 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 상기 제1구성물과 제2구성물을 상호작용이 가능한 위치로 접근시키는 단계; 및

iv) 외부 작용력을 인가하고 위치(location) 또는 움직임(motion)이 변화된 표지를 측정하여 물질의 상호작용을 탐색하는 단계를 포함하고, 물질의 상호작용에 따른 세포의 형태 또는 기능 변화를 탐색하는 단계를 포함하거나 포함하지 않는, 물질의 상호작용을 탐색하는 방법.
제 1항에 있어서, 물질이 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 생리활성물질이 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound) 및 이들을 구성하는 요소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 외부작용력이 자기장 임을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 자기장이 전자기장 또는 영구자기장임을 특징으로 하는 방법.
제 4항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장의 세기를 변동시키면서 가역적(reversible)으로 탐색함을 특징으로 하는 방법.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 이동반응물질이 자성물질(magnetic material)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 자성물질을 지닌 이동반응물질의 입자크기가 5 nm 내지 2,000 nm 임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 표지물질이 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 형광성 또는 발광성 물질이 그 자체로서 형광 또는 발광을 나타내거나, 제1구성물의 특정 물질 또는 다른 물질과의 결합함에 의해 형광성 또 는 발광성을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 형광성 물질이 형광염료 및 테트라시스테인 형광성 모티브 (tetracystein motif) 또는 GFP, YFP, CFP 및 RFP를 포함하는 형광단백질 또는 형광을 내는 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1구성물에서 이동반응물질이 2개 이상의 특정 물질과 직접 또는 간접적으로 결합되거나 코팅 됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1구성물에서 이동반응물질과 제1탐색물질의 결합이 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결함임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2구성물에서 표지물질(label)이 제2탐색물질과 직접 또는 간접적으로 결합되거나 코팅 됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2구성물에서 표지물질과 제2탐색물질의 결합이 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결함임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1구성물 또는 제2구성물에서 이동반응물질 또는 표지물질과 탐색물질의 결합에 항체(antibody)을 비롯한 생리활성물질 및 이들을 구성하는 요소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 토대로 한 탐침(probe)을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii) 제1구성물과 제2구성물의 반응이 in vivo 에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서, 세포가 진핵세포 또는 원핵세포임을 특징으로 하는 방법.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 전달이 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 또는 fusogenic peptide), 지질유전자 전달체 (lipid 또는 liposome) 또는 이들의 결합체, 일렉트로포레이션(electroporation), Opti-MEM 배지에서 세포와 배양함, 또는 자기장 하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 물질의 상호작용이 배양프레이트(culture plate/dish) 또는 마이크로어레이(microarray)된 살아있는 세포 내에 서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii) 제1구성물과 제2구성물의 반응이 in vitro 에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 4항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 자기장의 세기를 변동시킬 때 위치 변화하거나 변화하지 않는 물질을 음성 또는 양성 대조구로서 비교 탐색함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1구성물 또는 제2구성물의 물질이 라이브러리(library)로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 물질의 상호작용을 탐색한 후, 제2구성물에 포함된 물질을 분리하고 동정하는 단계를 추가로 포함하여 표적물질을 검출하는 방법.
제 24항에 있어서, 제1구성물 또는 제2구성물의 물질이 라이브러리(library)로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
i) 외부 작용력(externally applied driving force)에 따라 위치 이동하는 이동반응물질(localizer)과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물을 제공하는 단계;

ii) 표지물질(label)이 결합된 제2탐색물질을 포함하는 제2구성물을 제공하는 단계;

iii) 탐색을 위한 물질을 포함하는 제3구성물을 제공하는 단계;

iv) 동일된 장(field) 또는 계(system)에서 상기 제1구성물, 제2구성물과 제3구성물을 상호작용이 가능한 위치로 접근시키는 단계;

v) 외부 작용력을 인가하고 위치(location) 또는 움직임(motion)이 변화된 표지를 측정하여 물질의 상호작용을 탐색하는 단계를 포함하고, 물질의 상호작용에 따른 세포의 형태 또는 기능 변화를 탐색하는 단계를 포함하거나 포함하지 않는, 물질의 상호작용을 탐색하는 단계: 및

vi) 제3구성물에 포함된 물질을 분리하고 동정하는 단계를 포함하여 표적물질을 검출하는 방법.
제 26항에 있어서, 제1구성물, 제2구성물 또는 제3구성물의 물질이 라이브러리(library)로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
외부 작용력(externally applied driving force)에 따라 위치 이동하는 이동반응물질(localizer)과 제1탐색물질을 결합시킨 제1구성물(constructs), 또는 탐색을 위한 표지(label)가 부착된 제2탐색물질 포함하는 제2구성물을 함유하는 동일하거나 다른 세포가 마이크로어레이 되고, 상기 세포에 제2구성물 또는 제1구성물을 가하여 제1구성물과 제2구성물의 상호작용을 탐색하기 위한 칩(chip).