DE60111595T2

DE60111595T2 - Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen der Wesens als Therapeutika

Info

Publication number: DE60111595T2
Application number: DE60111595T
Authority: DE
Inventors: Brent R. Stockwell; Alexis Borisy; Michael A. Foley
Original assignee: CombinatoRx Inc
Current assignee: Zalicus Inc
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2021-07-06
Also published as: IL144049A0; PT1170591E; EP1170591B1; WO2002004946A2; KR20020065340A; EP1586900A2; JP3790447B2; WO2002004946A3; US20020019011A1; JP2002328124A; ATE298424T1; DE60111595D1; EP1586900A3; AU2001271841A1; CA2352515A1; DK1170591T3; SG148027A1; AR029581A1; MXPA01006914A; CA2352515C

Description

Viele Krankheitszustände sind mit einer Vielzahl phänotypischer Veränderungen verbunden. In dem klinischen Bereich war dies bereits seit langer Zeit offensichtlich, aber die jüngsten Fortschritte in der Genomik bestätigten diese Beobachtung auf molekularer Ebene. Das Erstellen von Expressionsprofilen von z. B. Krebszellen ergab Hunderte von Veränderungen der Genexpression, die durch vielfältige somatische Mutationen verursacht werden. Darüber hinaus entwickelten humane Zellen und Gewebe homöostatische Mechanismen, so dass sie oft sich wiederholende und selbstpuffernde Signalweiterleitungssysteme enthalten. Natürliche Signale, die eine Veränderung des zellulären Zustands verursachen, werden häufig nicht an ein einzelnes Ziel, sondern an eine richtige Kombination von Zielen gesandt. Folglich können moderate Veränderungen einer Vielzahl von Variablen einen hochspezifischen Effekt haben.
Im Gegensatz hierzu konzentrierten sich die pharmazeutischen, chemischen und biologischen Gesellschaften aus historischen und technischen Gründen auf einzelne, individuelle Moleküle, die biologische Wirkungen verursachen. Dieses historische Paradigma resultierte in der Identifizierung von kleinen organischen Molekülen, die spezifische Proteine beeinflussen, was wertvolle Reagenzien sowohl in der Biologie als auch Medizin bereitstellte. Diese Moleküle sind auch nützliche Sonden für die biologische Funktion von Proteinen, die therapeutische Relevanz haben könnten, und haben bereits ihre Wirkung bei der Aufklärung von Signaltransduktionswegen ausgeübt, indem sie als chemische Protein-Knockouts wirkten, wodurch ein Verlust der Proteinfunktion verursacht wurde. Zusätzlich können sie auch aufgrund der Wechselwirkung dieser kleinen Moleküle mit bestimmten biologischen Zielen und ihrer Fähigkeit, spezifische biologische Funktionen zu beeinflussen, als Kandidaten für die Entwicklung von Therapeutika dienen.
Da es unmöglich ist vorherzusagen, welche kleinen Moleküle mit einem biologischen Ziel wechselwirken, wurden intensive Bemühungen auf die Bildung einer großen Anzahl kleiner organischer Moleküle aufgewendet. Diese werden dann in so genannten „Bibliotheken" solcher Verbindungen mit dem Ziel der Bildung einer „vielfältigen Bibliothek" mit den geeigneten gewünschten Eigenschaften gesammelt. Eine solche vielfältige Bibliothek kann aus einer zuvor existierenden Sammlung kleiner Moleküle gebildet werden oder kann unter Verwendung von „kombinatorischer Chemie" gebildet werden. Diese Bibliotheken können mit sensitiven Screens verbunden werden, um aktive Moleküle zu identifizieren (Stockwell et al., Chem. Biol. 1999, 6, 71 – 83).
In vielen Fällen entwickelten Forscher vorausgewählte Bibliotheken, in welchen alle Mitglieder eine bestimmte Eigenschaft, wie z. B. die Fähigkeit, mit einem Zielprotein zu wechselwirken, oder ein charakteristisches Strukturmerkmal, das so konzipiert war, dass es einen bestimmten Aspekt einer Klasse natürlicher Verbindungen imitiert, teilen. Zum Beispiel wurde eine große Anzahl von Bibliotheken so konzipiert, dass ein oder mehrere Eigenschaften natürlicher Peptide imitiert werden. Solche „Peptid-imitierenden" Bibliotheken schließen Phthalimido-Bibliotheken (WO 97/22594), Thiophen-Bibliotheken (WO 87/40034) und Benzodiazepin-Bibliotheken (US-Patent Nr. 5,288,514) ein. Eine Bibliothek, die strukturelle Merkmale besitzt, die an natürliche Proteine erinnern, und die mit miniaturisierten Tests auf Zellbasis kompatibel ist, wurde bereits synthetisiert (Tan et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8565).
Der Prozess der modernen Wirkstoffentwicklung wurde größtenteils auf die Fähigkeit gegründet, Verbindungen schnell auf ihre Wirkungen auf biologische Prozesse zu testen. In der pharmazeutischen Industrie wurde die Aufmerksamkeit auf das Identifizieren von Verbindungen fokussiert, die die Wechselwirkung zwischen biologischen Molekülen blockieren, reduzieren oder sogar verstärken. Genauer gesagt kann die Wechselwirkung zwischen einem Rezeptor und seinem Proteinliganden in biologischen Systemen oft entweder direkt oder durch ein etwas stromabwärts gelegenes Ereignis in entweder einer schädlichen oder einer günstigen Wirkung auf dieses System, und folglich auf einen Patienten, für den eine Behandlung gesucht wird, resultieren. Folglich suchten Forscher lange Zeit Verbindungen, die solche Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen reduzieren, blockieren oder sogar verstärken.
Es wurden High-Throughput-Screeningsysteme entwickelt, um in der Praxis die Limitierungen des Durchsatzes für existierende biochemische und auf Zellen basierende Tests zu überwinden. Traditionelle Synthesen organischer Verbindungen und traditionelle biologische Tests benötigen ausreichend Zeit, Laborkapazität und Qualifikation. Das Screenen einer maximalen Anzahl von Verbindungen erfordert ein Reduzieren der Zeit und der Laboranforderungen, die mit jedem Screen verbunden sind.
High-Throughput-Screening von vielfältigen Sammlungen von Molekülen spielte folglich bei der Suche nach Leitverbindungen für die Entwicklung neuer Pharmazeutika eine zentrale Rolle. Die Eingabe in diese High-Throughput-Screens stellen Bibliotheken von Verbindungen dar, die aus bereits existierenden chemisch synthetisierten Molekülen (wie z. B. einer Bibliothek, die im Besitz einer pharmazeutischen Firma ist), natürlichen Produkten (wie z. B. mikrobiellen Fermentationsbrühen) und aus neuen Bibliotheken, die durch Techniken der kombinatorischen Chemie gebildet wurden (Tan et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8565), zusammengesetzt sind. Die Bibliotheken bestehen aus bis zu einer Million Verbindungen, was die Wahrscheinlichkeit für das Auffinden einer Verbindung mit den gewünschten Eigenschaften, um als ein Leitwirkstoffkandidat zu dienen, erhöht (Tan et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9073 – 9087).
Zur Stärkung des traditionellen Paradigmas der Wirkstoffentwicklung resultierte die kombinatorische Chemie in einem dramatischen Anstieg der Anzahl von Verbindungen, die für das Screenen verfügbar sind, und die Erforschung des humanen Genoms hat eine große Anzahl neuer molekularer Targets zum Screenen entdeckt. Diese neuen Targets können bei den Screens in einer Vielzahl von Arten, zur Suche nach Enzyminhibitoren, Rezeptoragonisten oder -antagonisten, verwendet werden. Das traditionelle Ziel ist das Auffinden von Verbindungen, die eine einzelne ausschlaggebende Wechselwirkung in einem biologischen System reduzieren, blockieren oder verstärken (Weber et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34, 2280 – 2282). Zusätzlich passen eine Anzahl von Wissenschaftlern Testsysteme auf Phänotypbasis an, bei denen das Screenen mit ganzen lebenden Zellen durchgeführt wird und das Auslesen des Screens irgendeine nachweisbare Eigenschaft der Zelle darstellt (Stockwell et al., Chem. Biol. 1999, 6, 71 – 83; Mayer et al., Science, 1999, 286, 971 – 974).
Die Verfahren des High-Throughput-Screenings, die bisher entwickelt wurden, wurden auf Grundlage des „Ein-Wirkstoff-Ein-Target"-Paradigmas konzipiert, das die pharmazeutische Industrie dominiert. Aus historischen Gründen und aufgrund von regulatorischen Überlegungen und anerkannten Risikofaktoren orientiert sich der Prozess der modernen Wirkstoffentwicklung daran, jeweils ein aktives Molekül zu finden, das als Wirkstoffkandidat dienen soll. Kliniker haben seit langem erkannt, dass der „Ein-Wirkstoff-Ein-Target"-Ansatz zur Behandlung vieler Krankheiten nicht ausreichend ist. Sie testeten einige offensichtliche Kombinationen von Agenzien, die den gleichen Zustand behandeln oder die eine klare logische Verbindung haben. In der HIV-Therapie und Chemotherapie, zum Beispiel, sind Kombinationen einer Vielzahl aktiver Agenzien in Mode gekommen. Einer der vielversprechendsten Wirkstoffe aller Zeiten ist eine Kombination – Premarin, das verwendet wird, um die komplexen Veränderungen bei Frauen nach der Menopause zu behandeln, ist aus über 22 getrennten und wichtigen Bestandteilen zusammengesetzt. Als weiteres Beispiel offenbart WO 98/57174 die synergistischen Kombinationen von inhibitorischen Peptiden mit antimikrobiellen Verbindungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben ein leistungsstarkes neues Verfahren zur Störung biologischer Systeme erfunden. Dies bedingt das systematische Durchführen von High-Throughput-Screenings von Kombinationen von Verbindungen, d.h. Mischungen oder nicht chemisch gebundener Kombinationen, um Kombinationen zu entdecken, die in biologischen Systemen synergistisch wechselwirken. Die erfindungsgemäßen Verfahren können effektiv therapeutische Kombinationen von Verbindungen identifizieren, die zuvor unbekannte therapeutische Wirkungen zeigen, sogar dort, wo jede Verbindung der Kombination keine erkannte biologische Wirkung besaß, und sogar dort, wo die Verbindungen und die Kombination a priori keine offensichtlichen Kandidaten zur Verwendung in einer Kombination gewesen wären.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Kombinationen von Verbindungen zum Identifizieren von Kombinationen von Verbindungen bereit, die eine Wirkung hervorrufen, die von der Wirkung einer Verbindung der Kombination an sich verschieden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen von ganzen Zellen eines Ganz-Zell-Tests, (b) Inkontaktbringen der ganzen Zellen mit mindestens 100 Verbindungen unter Bedingungen, die sicherstellen, dass jedes Inkontaktbringen von Verbindung/ganzer Zelle von den anderen getrennt ist, und (c) Nachweisen oder Messen von Wirkungen, die durch die Verbindungen auf den ganzen Zellen entfaltet werden, wobei das Verfahren die zusätzlichen folgenden Schritte umfasst: (d) Auswählen von Verbindungen, die eine Veränderung der auf den ganzen Zellen entfalteten Wirkung im Vergleich zu der Wirkung auf die ganzen Zellen, die nicht mit den Verbindungen in Kontakt gebracht wurden, hervorrufen, (e) Bilden eines Arrays von mindestens 49 einzigartigen Kombinationen von Zweier-Einheiten oder von höherer Ordnung aus den identifizierten Verbindungen, (f) Inkontaktbringen des Arrays von Kombinationen von Verbindungen mit ganzen Zellen des Ganz-Zell-Tests unter Bedingungen, die sicherstellen, dass das Inkontaktbringen jeder Verbindungskombination-/ganzen Zelle von den anderen getrennt ist, (g) Nachweisen oder Messen einer Wirkung, die durch die Kombination von Verbindungen auf den ganzen Zellen von Schritt (f) entfaltet wird, und (h) Identifizieren von Kombinationen von Verbindungen, die eine Wirkung des Schritts (g) hervorrufen, die von der Wirkung einer Verbindung der Kombination an sich verschieden ist. In einem zweiten verwandten Aspekt schließt das Verfahren den Schritt des Bildens eines Arrays von mindestens 200 einzigartigen Kombinationen von zwei oder mehr Verbindungen ein. Die Bestandteile dieses Tests können wie oben beschrieben in Zusammenhang mit dem ersten Test verändert werden. In bevorzugten Ausführungsformen schließt dieses Verfahren weiterhin den Schritt des (i) mindestens zweifachen Wiederholens der Schritte (a) bis (h) ein, wobei in Schritt (a) das Array von mindestens 200 Kombinationen in jeder Wiederholung verschieden ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen schließt das Array mindestens 400 oder 1540 einzigartige Kombinationen ein. Wenn zwei Wiederholungen von Schritt (i) durchgeführt werden, treten diese vorzugsweise jeweils innerhalb von 10 Tagen auf.
In einem dritten verwandten Aspekt schließt das Verfahren die Schritte (a) bis (h) und (i) ein mindestens 25-faches Wiederholen der Schritte (a) bis (h) über eine einwöchige Dauer unter Verwendung eines unterschiedlichen Arrays in jeder Wiederholung ein. Die Bestandteile dieses Tests können wie oben für die zuvor beschriebenen Tests verändert werden.
In einem vierten verwandten Aspekt schließt das Verfahren die Schritte (a) bis (h) und (i) ein mindestens 100-faches Wiederholen der Schritte (a) bis (h) über eine einmonatige Dauer unter Verwendung eines unterschiedlichen Arrays in jeder Wiederholung ein. Die Bestandteile dieses Tests können wie oben für die zuvor beschriebenen Tests verändert werden.
In einem fünften Aspekt schließt das Verfahren die Schritte (a) bis (h) mit dem Bilden eines Arrays von mindestens 10.000 einzigartigen Kombinationen von Zweier-Einheiten oder von höherer Ordnung aus den identifizierten Verbindungen und (i) mindestens zweifaches Wiederholen der Schritte (a) bis (h) über eine Dauer von 10 Tagen oder weniger ein, wobei in Schritt (a) das Array von mindestens 10.000 einzigartigen Kombinationen von Zweier-Einheiten in den zwei oder mehr Wiederholungen verschieden ist.
In einem sechsten Aspekt ist die Wirkung von Schritt (c) vorzugsweise die gleiche wie die der ganzen Zellen von Schritt (g), aber es kann wünschenswert sein, in jedem Schritt eine unterschiedliche Wirkung zu verwenden.
Für alle diese Tests kann eine Anzahl von Aktivitäts-Ablesetechniken, einschließlich einem Cytoblot-Test, einem Reportergen-Test, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(FRET)-Test, einem fluoreszierenden Calcium-bindenden Indikatorfarbstoff, Fluoreszenzmikroskopie oder das Erstellen von Expressionsprofilen verwendet werden. Die Tests sind vorzugsweise automatisiert, wobei Robotersysteme und Platten mit 384 und 1536 Vertiefungen verwendet werden. Die Tests können auch so konstruiert sein, dass das gesamte oder Teile des Verfahrens unter Verwendung von Mikrofluid-Technik durchgeführt werden können. Alternativ können die Tests unter Verwendung eines ausgebildeten wissenschaftlichen Labors und eines effizienten Reihenverfahrens durchgeführt werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination zu testenden Verbindungen sind z. B. nicht polymere organische Verbindungen, insbesondere kleine Moleküle; Lipide; Kohlenhydrate; Peptide; anorganische Verbindungen; und Oligonukleotide, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle. Außerhalb des sichtbaren Bereichs, Mikrowellenstrahlung, Infrarotstrahlung oder ionisierende Strahlung. Die Verbindungen werden vorzugsweise in gereinigter Form verwendet, können aber auch als Bestandteile von Mischungen, z. B. als natürliche Produktextrakte bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann eine Untergruppe (eine oder mehrere Verbindungen) in gereinigter Form sein, wobei jede der Verbindungen in gereinigter Form eingesetzt wird. Vorzugsweise findet jedes Inkontaktbringen von Verbindung/ganzer Zelle in einem Volumen von weniger als 200 μl, weiter bevorzugt weniger als 100 μl, und am meisten bevorzugt von weniger als 50 μl oder sogar 25 μl statt. Unter bestimmten Umständen können Volumina von so wenig wie 10 μl oder sogar 500 nl oder weniger eingesetzt werden. Darüber hinaus sind die Verbindungen vorzugsweise in einem Volumen von weniger als 100 μl, weiter bevorzugt weniger als 1 μl und am meisten bevorzugt weniger als 100 nl oder sogar 50 nl. Der Fachmann wird erkennen, dass kleinere Volumina (z. B. 10 nl oder sogar 1 nl) verwendet werden können.
Vorzugsweise sind die ganzen Zellen z. B. humane Zellen, transformierte Zellen oder nicht-transformierte Zellen, wie z. B. Neurone, Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Herzzellen, Skelettmuskelzellen, Gliazellen, embryonale Stammzellen, hematopoetische Stammzellen, Mastzellen, Adipocyten, Protozoen, Bakterienzellen, Hefezellen, neuronale Stammzellen und Immunzellen einschließlich T-Zellen und B-Zellen, Cluster von Zellen, Gewebe, Tiere und rekonstituierte zellfreie Medien.
Die durch die gewünschte Kombination gezeigten Wirkungen auf die ganze Zelle sind vorzugsweise synergistische Wirkungen auf eine Eigenschaft der Zelle, wie z. B. ein Anstieg oder Abfall der DNA-Synthese. Alternativ kann die Kombination von additiver Natur sein, aber weniger Nebenwirkungen besitzen, oder eine Funktionseinheit kann eine negative und nützliche Wirkung auf eine andere Verbindung ausüben, z. B. eine, die der Toxizität einer anderen Verbindung entgegenwirkt.
Die Verbindungen können mit der ganzen Zelle in jeder Reihenfolge in Kontakt gebracht werden, d.h. eine Verbindung kann zu der ganzen Zelle zugefügt werden, gefolgt von der Zugabe einer zweiten Verbindung oder alternativ können die zwei Verbindungen vor deren Inkontaktbringen mit der Zelle kombiniert werden.
Die erfindungsgemäßen High-Throughput-Verfahren stellen schnelle und wirkungsvolle Alternativen zu traditionellen Verfahren der Wirkstoffentwicklung dar, die von der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden. Mit der Erfindung können bisher unbekannte und therapeutisch potente Kombinationen von z. B. kleinen Molekülen identifiziert werden, von denen einige neu synthetisiert sein können und einige bekannte von der US-amerikanischen Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (FDA) zugelassene Wirkstoffe sein können. Wenn die wirksamen Kombinationen vollständig aus 2, 3, 4 oder mehr Wirkstoffen bestehen, die alle bereits von der FDA zugelassen sind, hat die neue Kombination den weiteren Vorteil, dass sie leicht durch das FDA-Zulassungsverfahren gebracht werden kann.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich werden.
Definitionen
„Kombinatorische Chemie-Bibliothek": Wie hierin verwendet ist eine „kombinatorische Chemie-Bibliothek" eine Vielzahl von komplexen Molekülen, vorzugsweise abgeleitet von natürlichen Produkten, die aus veränderbaren Gerüststrukturen synthetisiert werden, indem verschiedene Reaktanten in jedem Stadium der Diversifikation der Gerüststruktur eingesetzt werden.
„Vielfältige Bibliothek": Wie hierin verwendet ist eine „vielfältige Bibliothek" eine Vielzahl von komplexen Molekülen, die aus einer beliebigen einer Vielzahl möglicher Quellen zusammengesetzt ist, einschließlich bereits existierender chemisch synthetisierter Moleküle (z. B. aus einer Bibliothek, die im Besitz eines Pharmazieunternehmens ist), natürlichen Produkten (wie z. B. mikrobiellen Fermentationsbrühen) und neuen Bibliotheken, die durch Techniken der kombinatorischen Chemie hergestellt wurden.
„Veränderbare Gerüststruktur": Wie hierin verwendet, ist eine „veränderbare Gerüststruktur" eine Verbindung, die aus einer Leitstruktur synthetisiert wird, die latente oder aktive Funktionalitäten enthält, die in der Lage sind, mit synthetischen Reagenzien zu reagieren, um mindestens eine neue Funktionalität zu bilden. Wie hierin verwendet, ist eine „latente Funktionalität" eine, die vorhanden, aber zeitweise inaktiv ist. Nach Freisetzung mit einem Aktivatorreagens wird die latente Funktionalität aktiv und so für weitere Diversifikation verfügbar.
„Testelement": Wie hierin verwendet ist ein „Testelement" eine ganze Zelle, die mit der Kombination von Verbindungen in Kontakt gebracht wird und die dann im Hinblick auf die Wirkungen der Verbindungen beobachtet wird. Eine ganze Zelle schließt vorzugsweise zwei oder mehr biologische Komponenten im Inneren der Zelle ein.
„Aufdrucken von Verbindungen": Wie hierein verwendet, bezieht sich das „Aufdrucken von Verbindungen" auf die Applikation der Verbindungen auf eine Oberfläche (z. B. Glas) unter Verwendung eines hochpräzisen Roboters, wie z. B. der, der beim cDNA-Microarraying verwendet wird (J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7967 – 7968). Die Verbindungstupfen können im Durchmesser 200 Microns oder kleiner sein und die Verbindungen können entweder kovalent gebunden oder an der Oberfläche über elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen adhärent sein.
„Mikrofluid-Technik": Wie hierin verwendet sind „Mikrofluid-Technik"-Vorrichtungen Strukturen mit Kanälen, die durch jedes beliebige Verfahren der Fotolithographie hergestellt werden, einschließlich konventioneller Fotolithographie (z. B. Caliper Technologies, Mountain View, CA; http:/www.calipertech.com) oder unkonventioneller Verfahren (wie z. B. Weichlithographie, beschrieben z. B. in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 550 – 575).
„Tintenstrahl": Wie hierin verwendet bezieht sich „Tintenstrahl"-Technologie sowohl auf Thermotintenstrahl- als auch auf piezoelektrische Sprühtechnologien zur Übertragung kleiner Volumina von Flüssigkeiten.
„Kleine Moleküle": Wie hierin verwendet bezieht sich „kleine Moleküle" auf eine organische Verbindung, die entweder im Labor synthetisiert wurde oder in der Natur gefunden wird. Typischerweise ist ein kleines Molekül dadurch gekennzeichnet, dass es einige Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthält und ein Molekulargewicht von weniger als 1500 g/Mol besitzt, obwohl diese Charakterisierung nicht als einschränkend im Sinne der vorliegenden Erfindung gedacht ist. Beispiele von „kleinen Molekülen", die in der Natur vorkommen, schließen ein, ohne darauf begrenzt zu sein, Taxol, Dynemicin und Rapamycin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein konzeptionelles Diagramm, das zeigt, wie zwei verschiedene Reagenzien im Inneren einer Zelle synergistisch reagieren könnten, wobei die Reagenzien an verschiedene Ziele in der gleichen Zelle binden.
2 ist ein konzeptionelles Diagramm, das zeigt, wie zwei verschiedene Reagenzien im Inneren eines Organismus synergistisch reagieren könnten, wobei die Reagenzien an Ziele in verschiedenen Zellen oder Geweben binden.
3 ist ein Beispiel von experimentellen Daten, die man in einem kombinatorischen Screen von der hierin beschriebenen Art erhalten würde. Die Ergebnisse aus fünf verschiedenen Platten mit 384 Vertiefungen sind gezeigt. Die Ergebnisse sind im Plattenformat gezeigt, wobei 16 Reihen mit A bis P markiert sind und 24 Spalten mit 1 bis 24 markiert sind. Das Aktivitätsniveau ist in jeder Vertiefung als eine Zahl gezeigt, wobei 1 die Grundaktivität (keine Wirkung) bedeutet, und 5 bedeutet, dass eine aktive Kombination gefunden wurde.
4 ist ein Diagramm eines Verfahrens zum Durchführen eines kombinatorischen Screenings unter Verwendung von gegenwärtig kommerziell erhältlicher Technologie.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Kombinieren von Bibliotheken individueller Moleküle in Kombinationen von Zweier-, Dreier-, Vierer-Einheiten oder von höherer Ordnung in einem High-Throughput-Screening-System unter Verwendung relevanter biologischer Tests zum Identifizieren der Effekte der Moleküle bereit, die nur in ihren einzigartigen Kombinationen vorhanden sind. Solche Kombinationen können dann verwendet werden, um zusätzliche biologische Systeme damit zu sondieren und zu studieren, können eine direkte biologische Verwendung haben und können als aktive Moleküle für neue humane Therapeutika oder andere Verwendungen beim Menschen dienen. Diese Kombinationen können auch zur Förderung des Wachstums, der Fertilität, der Reifung oder anderer Eigenschaften in spezifischen landwirtschaftlichen Produkten, einschließlich Tieren oder Pflanzen, verwendbar sein. Sie können auch verwendbar sein bei der Bildung kosmetischer Produkte, Düfte, Lebensmittelkonservierung oder Nahrungsmittelzusätzen. Folglich stellt die Erfindung wirkungsvolle Verfahren zum systematischen Durchführen von High-Throughput-Screenings von Kombinationen von Verbindungen bereit, um Kombinationen mit verbesserten Eigenschaften in biologischen Systemen zu entdecken.
Wir postulieren, dass Pharmazeutika, die mit komplexen Systemen, wie z. B. humanen Zellen oder Geweben wechselwirken, wahrscheinlich am wirksamsten sind, wenn sie mehrere aktive Agenzien enthalten, die mit mehreren molekularen Zielen wechselwirken. Dieses Verständnis darüber, wie Pharmazeutika arbeiten, bildet eine der Grundlagen für unsere neue Strategie darüber, wie sie konzeptioniert und entwickelt werden sollten. Dieser neue Ansatz verspricht dramatische Verbesserungen bei vielen existierenden Behandlungen zu erzielen und effektive Therapien für gegenwärtig schwer behandelbare Krankheiten bereitzustellen, insbesondere Krankheiten, die moderate Veränderungen vieler Variablen benötigen.
Das gegenwärtig dominierende Paradigma der pharmazeutischen Industrie ist eines, in welchem ein Wirkstoff gegen ein Ziel entwickelt wird. Unser Ansatz verwendet unser Verständnis der multivariablen Designerfordernisse als das Kernstück von Rahmenbedingungen für die systematische Entwicklung einer neuen Generation von Pharmazeutika.
In Kombination zu testende Verbindungen
Wie oben erwähnt, kann eine große Vielzahl von Verbindungen in Kombination gemäß der vorliegenden Erfindung getestet werden. Diese werden nun ausführlicher diskutiert.
Die gängige Klasse von Verbindungen, die erfindungsgemäß gescreent werden, sind kleine organische Moleküle. Die Verbindungen können synthetisch oder natürlich vorkommend sein (z. B. Prostaglandine, Lectine, natürlich vorkommende sekundäre Metabolite, Hormone, usw.). Große Bibliotheken solcher Moleküle, in gereinigter Form, sind bei pharmazeutischen Unternehmen, chemischen Unternehmen und in wissenschaftlichen Laboren erhältlich; solche Bibliotheken können auch unter Verwendung bekannter Techniken der kombinatorischen Chemie synthetisiert werden. Die Verbindungen können oder können auch nicht bekannte biologische Aktivität besitzen. Die Verbindungen und kombinatorischen Bibliotheken der Verbindung können aus veränderbaren Gerüsten, an die feste Träger gebunden sind, synthetisiert werden, z. B. Verbindungen und Bibliotheken, die aus einem veränderbaren Gerüst hergestellt sind, das aus einer Epoxyol-Matrize auf Shikimi-Säure-Basis oder aus dem auf Pyrimidin basierenden Template Isonicotinamid synthetisiert sein. Zusätzlich zu kleinen organischen Molekülen schließen andere Moleküle, die in Kombination gemäß der vorliegenden Verwendung gescreent werden können, Biopolymere, einschließlich Oligonukleotide (DNA und RNA); Polypeptide (Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Liganden, Strukturproteine, mutierte Analoga humaner Proteine und Peptidhormone); Lipide; Kohlenhydrate und Polysaccharide ein. Anorganische Moleküle können ebenfalls gescreent werden, wie auch potenziell biologisch aktive Ionen, wie zum Beispiel Metallionen, z. B. Kupfer-, Eisen-, Silber-, Zink-, Magnesium-, Mangan-, Calcium- und Goldionen.
Testelemente
Die biologischen Tests, die zum Nachweis der Wirkungen von Kombinationen verwendet werden, werden in den meisten Fällen aus mehreren Komponenten zusammengesetzt sein. In den Tests ist das Testelement eine Zelle, insbesondere wenn der Test ein Test auf Phänotypbasis ist. So ein Ganz-Zell-Test stellt einen kompletten Satz komplexer molekularer Wechselwirkungen bereit, die wahrscheinlich die Grundlage für die Wirksamkeit einer multivariablen therapeutischen Verbindung bilden. Andere Tests setzen für das multivariable kombinatorische Screening biologische Systeme höherer Ordnung ein wie z. B. Cluster ganzer Zellen, Gewebe und Tiermodelle.
Jeder biologische Test, der als Test für einzelne Komponenten einsetzbar ist, kann leicht an das kombinatorische Screening der vorliegenden Erfindung angepasst werden. Testmessungen können z. B. einschließen: Transport einer Verbindung über die Zellmembran, elektrisches Potenzial, Aktionspotenzialbildung, Zellproliferation, Zelltod, Zellspezifizierung, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Genexpression oder Proteinspiegel (gemessen, z. B. durch Nachweis von mRNA, Protein oder einem Reportergen), enzymatische Aktivität, Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Translokation eines Proteins in den Zellkern (oder andere Veränderungen in der Proteinlokalisierung), Fähigkeit, einem Pathogen zu widerstehen (z. B. einem Virus oder einem Bakterium) und Fähigkeit, eine Immunantwort zu produzieren. In einem Test mit einem Gesamtorganismus kann das Verhalten des Tieres als ein Reporter dienen.
In einem Beispiel ist der Test ein nicht-destruktiver Test (z. B. ein Test auf Zellbasis, in welchem eine Messung der Wirkung einer Verbindung erhalten werden kann ohne die Zellen zu schädigen). Solch ein Test erlaubt es, Tests mit mehreren Konzentrationen von mehreren Kombinationen pro Vertiefung durchzuführen. Zum Beispiel wird Verbindung A in ansteigenden Konzentrationen zu einer Vertiefung zugefügt und eine Messung nach jeder Zugabe der Verbindung durchgeführt. Wenn eine gewünschte Konzentration einer Verbindung A erreicht wird (bestimmt auf Grundlage einer gewünschten Testantwort oder bekannter Eigenschaften (z. B. Toxizität, Löslichkeit) der Verbindung), wird Verbindung B in ansteigenden Konzentrationen zugegeben, wobei eine Testmessung nach jeder Zugabe durchgeführt wird. Dieses Verfahren kann viele Male in einer einzigen Vertiefung wiederholt werden, was es erlaubt, Hunderte, Tausende oder sogar Millionen von Tests in einer einzelnen Platte durchzuführen.
Es kann wünschenswert sein, einen Vergleichstest durchzuführen, um mögliche Nebenwirkungen der Kombinationen zu identifizieren. Zum Beispiel können Kombinationen von Verbindungen, die auf ihre Fähigkeit zur Abtötung oder zur Verringerung der Proliferation von Tumorzellen gescreent werden, gleichzeitig auf ihre Wirkung auf normale, Nicht-Tumorzellen gescreent werden. Kombinationen von Verbindungen, die die gewünschte Aktivität auf Tumorzellen zeigen, und die eine geringe oder keine Wirkung auf normale Zellen besitzen, sind bevorzugte Kombinationen. Kombinationen, die eine nicht erwünschte Wirkung auf normale Zellen zu haben scheinen, sind weniger bevorzugt. Diese letztgenannten Kombinationen (oder Kombinationen von Verbindungen mit ähnlichen Strukturen) können allerdings bei unterschiedlichen Konzentrationen wirksam sein und sollten nicht notwendigerweise von zusätzlichen Untersuchungen ausgeschlossen werden.
Cytoblot-Test
Ein Verfahren zum Nachweisen der Aktivität ist der Cytoblot-Test. Bei diesem Verfahren werden Zellen in Vertiefungen einer Testplatte ausgesät. Die Zellen sind vorzugsweise adhärente Zellen, so dass sie sich auf dem Boden der Vertiefung anlagern und dort wachsen. Die Verbindungen werden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zugefügt. Zum Beispiel kann der Cytoblot durchgeführt werden, um die Proliferation durch Messung der Inkorporation von BrdU nachzuweisen. In diesem Beispiel werden die Zellen für eine gegebene Zeitdauer (z. B. 4 bis 72 Stunden) inkubiert. Das Medium wird dann unter Verwendung z. B. einer automatischen Flüssigkeitsübertragungsvorrichtung oder eines 16- oder 8-Kanal-Stabs angesaugt. Die Zellen werden durch Zugabe von 70 % Ethanol und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 °C für 1 Stunde fixiert. Das Fixativ wird entfernt und die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen mit PBS wird 2 N HCl mit 0,5 % Tween 20 zu jeder Vertiefung für 20 Minuten zugegeben. Die HCl wird dann mit einer Lösung von „Hank's balanced salt solution" (HBSS), enthaltend 10 Vol.-% 2 N NaOH neutralisiert. Diese Lösung wird entfernt, die Zellen zweimal mit HBSS und dann einmal mit PBS enthaltend 0,5 % bovines Serumalbumin (BSA) und 0,1 % Tween 20 gewaschen. Die Waschlösung wird entfernt und der Antikörper gegen BrdU wird als 0,5 μg/ml Maus-Anti-BrdU-Antikörper in PBS, enthaltend 0,5 % bovines Serumalbumin (BSA) und 0,1 % Tween 20 zugefügt. Diese Antikörperlösung enthält auch einen Zweitantikörper (in einer Verdünnung von 1 : 2000), der den Maus-Ig-Antikörper (z. B. den Maus-Anti-BrdU-Antikörper) erkennt; dieser Zweitantikörper ist an das Enzym Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase; HRP) konjugiert. Nach einer Stunde der Inkubation wird die Antikörperlösung entfernt und die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen. Nach dem zweiten PBS-Waschschritt wird das HRP-Substrat (das Luminol, Wasserstoffperoxid und einen Verstärker wie z. B. para-Iodphenol enthält) zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Menge an Licht in jeder Vertiefung wird dann unter Verwendung von entweder Belichtung eines Films (durch Platzieren eines Filmstücks auf der Platte) oder durch Auslesen der Lumineszenzmenge aus jeder Vertiefung unter Verwendung eines Luminometers oder eines Lumineszenz-Plattenauslesegeräts bei Standardbedingungen (z. B. 0,3 Sekunden Belichtung pro Vertiefung) nachgewiesen. Die Menge an Lichtausbeute pro Vertiefung zeigt die Menge der DNA-Synthese an, die in jeder Vertiefung auftritt. Eine wünschenswerte Kombination von Agenzien ist eine, in welcher es entweder im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte oder erniedrigte Lichtausbeute gibt. Zum Beispiel würde eine Kombination, die die Lichtausbeute erniedrigt, die Geschwindigkeit der DNA-Synthese erniedrigen und so zur Verhinderung oder Vorbeugung der Proliferation der Tumorzellen wirksam sein. Alternativ stellt eine Erhöhung der Lichtausbeute einer Erhöhung der DNA-Synthese dar. Zum Beispiel könnte man primäre Zellen in z. B. einem kombinatorischen 200 × 1 Array, in welchem eine festgesetzte Komponente die DNA-Synthese blockieren würde und folglich einen toxischen Effekt auf die Zellen hätte, verwenden. Unter Verwendung dieses Arrays könnte man nach einem zweiten Reagens screenen, das diesem toxischen Effekt der ersten Komponente vorbeugen würde. In einer Vielzahl von Immunschwäche-Krankheiten proliferieren Immunzellen in Antwort auf entweder ein Allo- oder ein Auto-Antigen nicht. Unter Verwendung kultivierter Immunzellen und des obigen Verfahrens kann man auf Kombinationen von Reagenzien screenen, die die Proliferation von Immunzellen fördern. Alternativ kann man auf autoimmun-suppressive Agenzien screenen. In diesem Beispiel wird eine Population eines Typs von Immunzellen (eine B-Zelle oder eine T-Zelle, die aus periphären Blutzellen isoliert worden war) entweder mit einem Allo- oder einem Auto-Antigen stimuliert. Kombinationen von Verbindungen, die spezifisch die Proliferation als Antwort auf Auto-Antigene, aber nicht auf Allo-Antigene, inhibieren, sind als Kandidaten für Autoimmuntherapeutika nützlich.
Andere Verfahren zum Nachweis von Aktivität
Der obige Cytoblot-Test wird leicht an den Nachweis von Antigenen, die nicht BrdU sind, angepasst. Darüber hinaus kann man eine Vielzahl von posttranslationalen Modifikationen innerhalb von Zellen nachweisen. Zum Beispiel ist ein Antikörper gegen die phosphorylierte Version von Nukleolin oder Histon H3 zum Nachweis von Zellen nützlich, die in der M-(Mitose)-Phase des Zellzyklus sind. Kombinationen von Verbindungen, die einen Anstieg an phosphoryliertem Nukleolin oder Histon H3 in dem Cytoblot-Test verursachen, würden daher Kombinationen sein, die Zellen in der M-Phase festhalten, und sind mögliche Antitumormittel. Man könnte auch einen Cytoblot-Test verwenden, um Anstiege in der Acetylierung von z. B. Histon H4 unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch acetyliertes Histon H4 erkennt, nachzuweisen. Verbindungen oder Kombinationen von Verbindungen, die eine Erhöhung der Hyperacetlyierung von Histon H4 verursachen, könnten auch Antitumormittel sein.
In den vorangegangenen Beispielen kann die Vorgehensweise so verändert werden, dass das Medium entfernt und ein Fixierungsmittel (70 % Ethanol oder 4 % Formaldehyd in PBS oder Tris-gepufferter Salzlösung) zugefügt wird. Die Membran der Zellen wird dann durch Entfernen des Fixierungsmittels und Zugabe eines Permeabilisierungsmittels (z. B. Tween 20, Triton X-100 oder Methanol) permeabilisiert. Das Mittel zur Permeabilisierung der Membran wird entfernt, die Zellen werden dann mit PBS oder Tris-gepufferter Salzlösung gewaschen und dann wird der Erstantikörper zugegeben. Üblicherweise gibt es keinen sauren Denaturierungsschritt unter Verwendung dieser anderen Cytoblot-Ausführungsformen.
Reportergen-Tests
Die Messungen einer Eigenschaft des Testelements können unter Verwendung eines Reportergens durchgeführt werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass der Test leichter durchzuführen ist und weniger Zeit benötigt als z. B. der Cytoblot-Test, nachdem die Reagenzien (z. B. eine stabil transfizierte Zelllinie) hergestellt wurden. Reportergene schließen ein Reporterelement, das ein Polypeptid kodiert, das leicht aufgrund einer colorimetrischen, fluoreszierenden, lumineszenten oder enzymatischen Eigenschaft nachzuweisen ist, und ein Enhancer/Promotor-Element ein, das der Expression des Reportergens eine Spezifität verleiht. Reporterelemente schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Luciferase, beta-Lactamase, grün fluoreszierendes Protein, blau fluoreszierendes Protein, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), beta-Galactosidase und alkaline Phosphatase. Enhancer/Promotor-Elemente schließen z. B. jene, die für NFAT, p53, TGF-beta responsiv sind, oder jeden beliebigen anderen Signaltransduktionsweg oder Stimulus, für den ein responsiver Promotor/Enhancer bekannt ist, ein.
NFkB
Ein kommerziell erhältliches Reportergen ist pNFkB, ein Luciferase-Reportergen, das Licht produziert, wenn NFkB aktiviert wird (Stratagene, La Jolla, CA). Dieses Reportergen kann in eine interessierende Zelllinie (d.h. A549 humane Lungenkarzinomzellen) entweder stabil oder transient transfiziert werden. Um eine stabil transfizierte Zelllinie zu bilden, wird die pNFkB-Plasmid-DNA mit einem G418-Resistenzplasmid und einem Transfektionsreagens (z. B. Lipofectamin, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) gemischt und dann zu einer 10-cm-Petrischale, die A549 oder andere Zellen angeheftet an die Schale mit ungefähr 40 % Konfluenz enthält, zugefügt. Die Platte mit DNA/Lipofectamin wird für 4 bis 16 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Das Medium wird entfernt, die Zellen werden zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und dann wird das Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) zugefügt. G418 wird dann mit einer Dosis (ungefähr 700 μg/ml), die gerade ausreicht, um alle Zellen in einer Scheintransfektion (d.h. eine Transfektion ohne ein G418 Resistenzplasmid) zu töten, zugefügt. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 2 Wochen mit Mediumwechsel alle 3 Tage inkubiert. Stabil transfizierte Klone werden als kleine Kolonien am Ende von 2 Wochen gewachsen sein. Diese Klone werden dann durch Ringklonierung getrennt und getrennt vermehrt. G418-resistente Klone werden dann auf das interessierende Reportergen durch Messen der Lichtausbeute aus den Zelllysaten mit oder ohne vorhandenem transient transfiziertem NFkB gescreent. Sobald ein Klon mit stabil transfiziertem pNFkB identifiziert wurde, wird er zum Screenen durch Ausplattieren der Zellen in der Testplatte verwendet.
Für einen transienten Transfektionstest wird die NFkB-Plasmid-DNA mit einem Transfektionsreagens gemischt, zu einer 10-cm-Petrischale hinzugefügt, die z. B. A549-Zellen enthält, die an der Schale mit ungefähr 70 % Konfluenz angeheftet sind. Die Schale mit DNA/Lipofectamin wird für 4 bis 16 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Das Medium wird entfernt, die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und dann wird Medium mit 10 % FBS zugefügt. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden inkubiert und dann zum Screenen in Testplatten ausplattiert.
Das Reportergen kann unter Verwendung anderer Techniken in die Zellen eingeführt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, virale oder retrovirale Infektion, bolusartige Injektionen und zelluläre Aufnahme von nackter DNA. Der Fachmann wird erkennen, dass jedes Verfahren zum Einführen eines Reportergens in die zu testenden Zellen mit den Screeningverfahren, die hierin beschrieben sind, kompatibel ist.
Nachdem die Zellen mit dem Reportergen verfügbar sind, werden sie in Testplatten (96 Vertiefungen, 384 Vertiefungen, usw.) mit einer Pipette, einer Multikanalpipette, einem Multidrop-Plattenbefüllgerät für 384 Vertiefungen (Labsystems, Franklin, MA) oder einer anderen Vorrichtung zum Umgehen mit Flüssigkeit ausgesät. Nach 4 bis 72 Stunden wird das Medium entfernt, die Zellen zweimal mit HBSS gewaschen, ein Lysepuffer zugefügt (siehe Stockwell et al., J. Amer. Chem. Soc. 1999, 121: 10662 – 10663), ATP/Luciferin zugefügt und die Lumineszenz auf einem Plattenlesegerät oder einem Luminometer (z. B. LJL BioSystems Inc., Analyst AD, Sunnyvale, CA) gemessen.
Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungs-Tests
In einem anderen Beispiel wird der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) verwendet, um die Wechselwirkung zweier interessierender Proteine nachzuweisen und zu messen. In diesem Beispiel werden das erste und das zweite Protein mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP) bzw. blauem Fluoreszenzprotein (BFP) unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren fusioniert. Die DNA-Konstrukte, die die beiden Fusionsproteine kodieren, werden in Säugerzellen, Hefe, Würmern oder einer anderen Zelle oder einem anderen Organismus unter Verwendung der oben beschriebenen Transfektionstechniken oder anderer vergleichbarer Verfahren coexprimiert. Kombinationen von Verbindungen werden zugefügt. Die Platte wird auf ein Plattenlesegerät gestellt und die Fluoreszenz wie folgt gemessen. Das Donorfluorophor (d.h. BFP) wird angeregt und die Emission des Akzeptorfluorophors (d.h. GFP) gemessen. Die größere Nähe der zwei Proteine wird in einem Anstieg der Emission des Akzeptorfluorophors resultieren. Folglich wird durch einen Anstieg der Fluoreszenz des Akzeptorfluorophors eine Kombination von Verbindungen identifiziert, die bewirkt, dass zwei interessierende Proteine nahe beieinander sind.
Zum Beispiel werden Expressionsvektoren, die Smad2 und Smad4 enthalten, erhalten. Die cDNA für GFP wird an das 5'-Ende von Smad2 fusioniert und die cDNA für BFP an das 5'-Ende von Smad4 fusioniert. Diese Expressionsvektoren werden in Säugerzellen stabil oder transient transfiziert, die Zellen werden mit einer Kombination von Verbindungen behandelt und die Platte mit Licht, das BFP, aber nicht GFP, anregt, bestrahlt. Die Fluoreszenz von GFP (z. B. Licht von 512 nm) wird gemessen, und Kombinationen von Verbindungen, die einen Anstieg der Lichtemission bei dieser Wellenlänge verursachen, werden identifiziert. Solche Kombinationen bewirken, dass sich Smad2 und Smad4 nahe beieinander aufhalten, und könnten den TGF-beta-Signalweg aktivieren und daher nützlich bei der Behandlung von Krebs-Chemotherapie, Mucositis und Autoimmunkrankheiten sein.
Fluoreszierende Calcium-Indikator-Farbstoffe
Ein weiteres Ablesen einer Veränderung einer Eigenschaft eines Testelements benutzt fluoreszierende Calcium-Indikator-Farbstoffe, wie z. B. Fluo-3 (Molecular Probes, Eugene WA; http://www.molecularprobes.com), Fura-2 und Indo-1. Fluo-3 ist im Wesentlichen nicht fluoreszierend, wenn es nicht an Ca²⁺ gebunden ist, und zeigt eine Quantenausbeute bei sättigendem Ca²⁺ von ungefähr 0,14. Das intakte Acetoxymethylester-Derviat von Fluo-3 AM (Fluo 3-AM) ist daher ebenfalls nicht fluoreszierend. Die grün fluoreszierende Emission (ungefähr 525 nm) von Ca²⁺-gebundenem Fluo-3 wird für gewöhnlich unter Verwendung eines Satzes optischer Filter, die für Fluoreszein (FITC) entwickelt wurden, nachgewiesen. Gemäß dem Hersteller zeigt Fluo-3 eine mindestens 100fache Ca²⁺-abhängige Fluoreszenzverstärkung.
Zellen werden in Vertiefungen ausgesät, Fluo-3 nach den Anweisungen des Herstellers zugefügt, Zusammensetzungen zugefügt und die Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenauslesegeräts gemessen. Kombinationen von Verbindungen, die in einem Anstieg der Fluoreszenz resultieren (aber selbst nicht fluoreszierend sind), verursachen folglich einen Anstieg der Konzentration von intrazellulärem Calcium.
Fluoreszenzmikroskopie
Ein weiterer Test verwendet konventionelle Fluoreszenzmikroskopie, um eine Veränderung des Niveaus oder der Lokalisation der Fluoreszenz in Zellen, die mit Kombinationen von Verbindungen in Kontakt gebracht wurden nachzuweisen. In einem Beispiel wird eine stabil transfizierte Zelllinie verwendet, die ein Smad2 mit GFP-Tag exprimiert. Die Zellen werden ausgesät, die Verbindungen hinzugefügt und für eine Stunde inkubiert und ein Fluoreszenzmikroskop mit einem automatisierten Tisch verwendet, um die Zellen in jeder Vertiefung abzubilden. Kombinationen von Verbindungen, die eine Veränderung der Lokalisation des Proteins mit Tag verursachen, werden identifiziert. Zum Beispiel können auf diese Weise Kombinationen identifiziert werden, die GFP-Smad2 veranlassen, von außerhalb des Kerns ins Innere des Kerns zu translozieren. Diese Kombinationen können durch die TGF-beta-Signalwege aktiviert werden und folglich zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und Mucositis eingesetzt werden.
Erstellen von Expressionsprofilen mit cDNA-Arrays
Ein weiterer Test zum Nachweis von Verbindungen, die zusammen eine Veränderung eines Testelements herstellen, ist das Erstellen von Expressionsprofilen. In diesem Beispiel werden Zellen ausgesät, Kombinationen von Verbindungen zugefügt und die Zellen für 2 bis 24 Stunden inkubiert. PolyA-RNA wird unter Verwendung von Standardverfahren aus jeder Vertiefung geerntet. Die RNA wird unter Verwendung von Standardverfahren revers in cDNA transkribiert, mit der Ausnahme, dass ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Cy3-dUTP) während der reversen Transkription eingebaut wird. Die Cy3-markierte cDNA wird mit Cy5-markierter cDNA aus unbehandelten Zellen gemischt und an ein DNA-Mikroarray (z. B. ein DNA-Mikroarray, das von Affymetrix, Santa Clara, CA oder Incyte, Palo Alto, CA erhältlich ist und in Nature Genet. Ergänzungsband 21, Jan. 1999 (hiermit durch Bezugnahme aufgenommen) in einem Übersichtsartikel dargestellt wurde) hybridisiert. Das relative Niveau von Cy3- und Cy5-Fluoreszenz an jedem Punkt in dem Mikroarray zeigt, ob es eine Veränderung der Expression eines jeden Gens gab. Das Verfahren wird verwendet, um Kombinationen zu identifizieren, die eine gewünschte Veränderung der Genexpression verursachen, wie z. B. die Rückkehr von einem Genexpressionsprofil einer Krankheit zu einem gesunden Profil. Alternativ wird das Expressionsprofil, das von einem gegebenen Signalmolekül, wie z. B. Insulin, verursacht wird, bestimmt und Kombinationen von Verbindungen gefunden, die das Auftreten eines Insulinprofils bewirken, was anzeigt, dass diese Kombinationen die Wirkungen von Insulin imitieren.
Ganze Organismen
Ein weiterer Bioassay, der mit den hierin beschriebenen Screeningtests kompatibel ist, benutzt vollständige Tiere. In einem Experiment wird der Nematode C. elegans in einzelne Vertiefungen gesetzt (vorzugsweise mit mehr als einem Nematoden pro Vertiefung) und die Aktivität der Verbindungen durch Nachweis einer Veränderung einer Eigenschaft des Organismus nachgewiesen. Zum Beispiel kann der Nematode so technisch verändert sein, dass er in einem bestimmten Stadium des Lebenszyklus oder nur während des „Dauerzustands" grün fluoreszierendes Protein exprimiert. Ein automatisiertes Mikroskopsystem wird verwendet, um die Nematoden in jeder Vertiefung sichtbar zu machen und das grün fluoreszierende Protein zu messen oder morphologische Veränderungen in den Würmern nachzuweisen, die durch bestimmte Kombinationen von Verbindungen verursacht werden.
Ein weiterer Test mit ganzen Tieren verwendet große Tiere, wie z. B. Nacktmäuse, die auf oder nahe der Hautoberfläche Tumore haben. Die Kombinationen von Verbindungen können Mischungen in DMSO sein, die in die Haut gerieben werden, durch die Haut penetrieren und den Tumor erreichen. Alternativ können die Verbindungen intravenös, intramuskulär oder oral verabreicht werden. Andere Verfahren mit ganzen Tieren zum Nachweisen der Aktivität könnten die Verwendung kleiner Kaulquappen, die von fertilisierten Xenopus-Oocyten stammen, die sich in einem definierten Medium entwickeln, organtypische Kulturen (Explanate aus Mäusen oder anderen Tieren), in denen das Organ für eine Zeitdauer in einem definierten Medium kultiviert werden kann, und Eiern (fertilisiert oder nicht fertilisiert) aus einer Vielzahl von Tieren einschließen. Andere Tests messen die Spannung des Herzgewebes oder Muskelgewebes, das zwischen zwei Federn gespannt wird; Kombinationen von Verbindungen, die die Kontraktion modulieren, würden in einer erhöhten oder erniedrigten Spannung auf diese Federn resultieren.
Markierung von Verbindungen
Obwohl einige Tests durchgeführt werden können, ohne dass die kombinierten Einheiten markiert sind, sind in einigen Ausführungsformen eine oder mehr der kombinierten Einheiten markiert, so dass die Wirkung der Kombination auf das Testelement nachgewiesen oder gemessen werden kann. Jeder einer Vielzahl von bekannten Markern kann verwendet werden, z. B. die Techniken, die weit verbreitet in der Biochemie zur Proteinaffinitätschromatographie verwendet wurden, die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen oder Proteine mit Hexahistidin-Tag verwenden (Janknect et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88: 8972; Wilcheck et al. Methods in Enzymology, Wilcheck, M; Bayer, E. A. Hrsg., Academic Press Inc. San Diego, 1990; S. 123 – 129).
Kombinieren der Moleküle
Die erfindungsgemäßen Verfahren können bereits existierende Robotersysteme, Stockplatten mit 96 Vertiefungen, 384 Vertiefungen, 1536 Vertiefungen oder in anderer Dichte und Testplatten mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen oder anderer Dichte einsetzen, mit denen es möglich ist, bis zu 150.000 Verbindungen oder mehr pro Woche zu screenen. Die Automatisierung dieser Technologie kann gemäß der vorliegenden Erfindung angepasst werden, um Kombinationen von Molekülen zu screenen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch Systeme mit Mikrofluid-Technik verwenden, die entweder durch konventionelle Photolithographie oder durch unübliche Verfahren (wie z. B. Weich-Lithographie oder optische Nahfeld-Lithographie) hergestellt wurden, um das Verfahren zu miniaturisieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch Tintenstrahldruck-Technologien oder Technologien mit zusammengesetztem Druck einsetzen. Zusätzlich kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Arbeit ausgebildeter Techniker eingesetzt werden, um die gleichen Resultate und den gleichen Durchsatz wie automatische Systeme zu erzielen. Die Kombinationen von Verbindungen können vor dem Inkontaktbringen mit dem Testelement hergestellt werden oder sie können in situ in Gegenwart des Testelements sein. Diese Plattierungsverfahren sind unten genauer beschrieben.
Manuelles Platieren
Verbindungen können manuell ausplattiert werden (d. h. zu den zu testenden Zellen zugegeben werden). In einem Beispiel werden gereinigte chemische Verbindungen in einem kombinatorischen 7 × 7 Array manuell kombiniert und getestet. Die Verbindungen, die in diesem Fall sieben Verbindungen einschließen, sind in einer Stockplatte. Die Verbindungen werden in eine Testplatte kombiniert. Der Experimentator plattiert eine erste Verbindung (oder eine Vielzahl von Verbindungen) aus einer Vertiefung der Stockplatte in eine Reihe der Testplatte und plattiert dann eine Spalte in der Testplatte. Dieses wird mit einer zweiten Vertiefung aus der Stockplatte wiederholt, wobei das Plattieren in der Testplatte eine Reihe über und eine Spalte neben jenen erfolgt, in welche die erste Verbindung plattiert wurde. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis der vollständige Satz von Kombinationen ausplattiert wurde.
Automatisches Ausplattieren
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren zum Zufügen von Verbindungen zu Vertiefungen, um kombinatorische Arrays zu bilden und der Fachmann wird erkennen, dass die folgenden Beispiele nur der Veranschaulichung dienen und in keiner Weise begrenzend sind.
In einem Beispiel des automatischen Ausplattierens wird ein automatisches Transfersystem für Flüssigkeiten verwendet. Transfersysteme sind kommerziell erhältlich von z. B. Beckman Coulter (Fullerton, CA), Tecan (Research Triangle Park, NC) oder Zymark (Hopkinton, MA). Das automatische System plattiert spezifische Volumina des ersten Satzes von Verbindungen in jede Vertiefung in einer gegebenen Reihe, so dass Reihe 1 die gleiche Verbindung beinhalten wird, Reihe 2 die gleiche Verbindung beinhalten wird, usw. Dann plattiert das Transfergerät für Flüssigkeiten den gleichen Satz von Verbindungen entlang der Spalten, so dass jede Spalte die gleiche Verbindung erhalten wird (obwohl verschiedene Spalten verschiedene Verbindungen beinhalten werden). Die Transfersysteme können an das Übertragen kleiner Volumina (z. B. 1 nl) angepasst werden.
Andere Verfahren zur effektiven Übertragung verwenden Tintenstrahldruck-Technologie (Gordon et al., J. Med. Chem. 1994, 13: 1385 – 1401; Lemmo et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9: 615 – 617). Tintenstrahldrucker zeichnen mit einer Vielzahl von Gefäßen, die Testverbindungen enthalten; jede Verbindung aus einer Quelle wird ausgedruckt und auf die Oberfläche in jeder einzelnen Reihe und Spalte für jede Verbindung eingespritzt. Wie oben beschrieben, wird die nächste Verbindung auf die nächste Reihe und die nächste Spalte ausgedruckt und dies wird wiederholt bis das gesamte Gitter mit Kombinationen von Verbindungen ausplattiert ist.
Noch ein weiteres Verfahren zum Zufügen von Verbindungen zu einer Testplatte verwendet einen Mikroarray-Spotter wie den, der von Patrick Brown bei der Stanford University zum punktförmigen Auftragen von DNA entwickelt wurde. Dieses Gerät verwendet einen Druckkopf mit acht Federn (engl. quills) und acht lineare Federköpfe, die in eine Stockplatte getaucht werden und entlang jeder Reihe drucken. Anschließend wird entweder die Platte um 90° gedreht oder der Druckkopf um 90° gedreht; der Druckkopf druckt dann entlang der Spalte. Man könnte die Größe des Druckkopfs unter Verwendung von z. B. zwei, vier oder sechzehn Druckköpfen für Standardplatten mit 384 Vertiefungen oder Platten höherer Ordnung für höhere Dichte variieren.
Noch ein weiteres Verfahren zum Zufügen von Verbindungen zu einer Testplatte verwendet ein kommerziell erhältliches Instrument namens Hydra (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA), das mit 384 getrennten Spritzen ausgestattet sein kann, die in der Lage sind, ein bekanntes Volumen aus einer Standardstockplatte von Verbindungen abzugeben.
Ein alternatives Verfahren zum Ausplattieren von Testverbindungen verwendet Systeme mit Mikrofluid-Technik wie z. B. jene, die von Caliper Technologies (Mountain View, CA) kommerziell erhältlich sind, und das direkte Anwenden dieses Systems, um ein Array zu bilden, das diese Kombination schaffen würde. In diesem Fall werden Arrays von Kombinationen im Mikromaßstab unter Verwendung von Kapillarfluss geschaffen, um die Lösungen mit der Verbindung auf die Schnittpunkte auf der Matrix zu verteilen.
Alternative Ausplattierungsverfahren
Der Fachmann wird erkennen, dass jede Plattenkonfiguration an die erfindungsgemäßen Screeningverfahren angepasst werden kann. Zum Beispiel würde eine quadratische 16 × 16 Platte 256 Vertiefungen anstelle der 384 Vertiefungen in einer 16 × 24 Platte haben. Dies würde es einem erlauben, jedes Zugabesystem für Flüssigkeiten, in welchem die Flüssigkeit nur entlang der Reihen oder nur entlang der Spalten zugegeben wird, anzupassen, da man einfach die quadratische Platte um 90° dreht und die Zugabe in die andere Richtung erlaubt. Man würde auch in dieses Konzept einen quadratischen Plattenhalter integrieren, der die Abmessungen oder Abdrücke einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen oder 384 Vertiefungen hätte, so dass die angepasste quadratische Mikroplatte in ein existierendes Plattenbearbeitungssystem für Flüssigkeiten passt.
Ein weiteres Verfahren zum Bereitstellen von Verbindungen oder Elementen, die in Kombination zu testen sind, besteht darin, sie in fester Form statt in flüssiger Form z. B. als geringe Menge trockenen Pulvers bereitzustellen. So können zwei trockene Komponenten (oder eine feuchte und eine trockene Komponente) gemischt werden und dann die Kombination zu den Zellen im Medium, in welchem die kombinierten Einheiten löslich sind, zugegeben werden. Die festen Komponenten schließen Kügelchen aus einer kombinatorischen Synthese ein, auf denen eine unterschiedliche Verbindung hinzugefügt ist. Zum Beispiel können die Kügelchen mit einem Kügelchen-Picker zugegeben werden. In einem Beispiel sind die Kügelchen magnetisch und werden unter Verwendung eines Magneten zugefügt.
In den erfindungsgemäßen High-Throughput-Tests der automatischen Anwendung muss jede Vertiefung räumlich unabhängig ansteuerbar sein und es ist vorzugsweise möglich, sowohl große (bis zu 100 μl) als auch kleine (unter 1 nl) einer jeden Verbindung aus der Stockplatte zu entnehmen. Eine beispielhafte automatische Plattform zum Durchführen kombinatorischer Screeningtests gemäß der Erfindung ist unten beschrieben.
Eine automatische Plattform mit zwei Stationen wird gebildet. Die erste Station beherbergt einen einfachen XYZ-Roboterarm mit einer angehefteten Stiftübertragungsvorrichtung wie z. B. erhältlich über VWR (Kat-Nr. 62409-608). Eine Stockplatte und eine Testplatte gelangen in die Station und der Roboterarm taucht die Stifte in die Stockplatte und überträgt diese Stifte in die Testplatte, wodurch, in Abhängigkeit von der Stiftgröße, 1 bis 1000 nl übertragen werden (am typischsten werden 50 nl übertragen). Verschiedene Stiftvorrichtungen erlauben die Übertragung von verschiedenen Kombinationen von Verbindungen, wie oben in dem Beispiel beschrieben. Die zweite Station des Automaten ist ein piezoelektrischer Dispenser, der in der Lage ist, große Volumina (bis zu 10 μl) aus den Stockvertiefungen einer einzelnen Verbindung zu entnehmen und dann kleine Volumina in jede Vertiefung einer Testplatte zu verteilen. Zum Beispiel hat das Ivek-Digispense-2000-System (http://www.ivek.com/digi2000.html) eine Auflösung von 10 nl und sollte für diesen Zweck ausreichend sein.
Nicht-Verbindungs-Kombinations-Reagenzien
Wenn ein Kombinationsreagens, das über die gesamte Platte hinweg vorhanden ist, keine Verbindung ist (d.h. wenn es irgend eine Form von Bestrahlung ist), dann kann die Platte, die die Zellen und die zugegebene(n) Verbindung(en) enthält, an der Quelle der Bestrahlung vorbeigeführt werden, wodurch die Bildung der Kombination vervollständigt wird. Andere Formen von Nicht-Verbindungs-Kombinations-Reagenzien schließen z. B. Hyperbardruck und Hitze ein.
Einige Nicht-Verbindungs-Reagenzien können in einer Weise, die ähnlich der Zugabe einer Verbindung ist, variiert werden. Zum Beispiel können, um den pH zu ändern, verschiedene Mengen einer Base oder Säure zu den Vertiefungen zugefügt werden. In ähnlicher Weise können Ionen unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das für die Zugabe von Verbindungen anwendbar ist, zugegeben werden.
Bibliotheksgröße
Für kleine chemische Bibliotheken (< 1000 Verbindungen) können alle binären (bis zu einer halben Million Kombinationen) und tertiären Kombinationen (bis zu mehreren 100 Millionen Kombinationen) unter Verwendung der beschriebenen Systeme getestet werden.
Die Potenz der Kombinationen bildet schnell effektive Bibliotheken, um multivariable Therapeutika zu identifizieren. Die Größe der multivariablen therapeutischen Bibliotheken konkurriert schnell mit und übertrifft dann jede konventionell erhältliche vielfältige oder nicht vielfältige Bibliothek. Eine Bibliothek von 200 Verbindungen bildet durch paarweise Kombinationen eine multivariable therapeutische Bibliothek von 19.900 Kombinationen, was eine größere Größe ist als die Bibliothek von Naturprodukten, die kürzlich verwendet wurde, um eine neue, die Zellteilung bewirkende Verbindung zu identifizieren (Mayer et al., Science, 1999, 286, 971 – 974). Eine Bibliothek von 300 Verbindungen bildet in Dreifach-Kombinationen ungefähr 4,5 Millionen distinkte Kombinationen von Komponenten für eine multivariable therapeutische Bibliothek, was größer ist als die größte gegenwärtig gebildete Bibliothek der kombinatorischen Chemie mit einer potenziell höheren Diversität.
Screenen nach Reihenfolge der Aktivität
Eine vielfältige Bibliothek kann anfänglich individuell unter Verwendung von Standardvorgehensweisen getestet werden. Die Verbindungen werden in einem biologischen Test gescreent und nach ihrer Aktivität eingeordnet. Die aktivsten Verbindungen (z. B. die zwanzig aktivsten oder die tausend aktivsten, in Abhängigkeit von der Größe des kombinatorischen Raums, der getestet werden soll) in der Bibliothek werden dann paarweise und in Dreierkombinationen getestet. Falls erwünscht können diese Kombinationen wiederum nach ihrer Aktivität eingeordnet werden und das Verfahren für Viererkombinationen, Fünferkombinationen, etc. wiederholt werden, bis eine gewünschte Anzahl effektiver Kombinationen identifiziert wird.
Genetische Algorithmen
Die Verwendung von genetischen Algorithmen stellt ein weiteres Verfahren zum Identifizieren von Kombinationen von Agenzien mit einer gewünschten biologischen Aktivität bereit, die distinkt von den einzelnen Agenzien selbst ist. In diesem Verfahren wird jedem einzelnen Agens ein einzigartiger Strichcode zugeordnet, der jede beliebige Abfolge von Zahlen, Buchstaben oder anderen Symbolen sein kann. In einer bevorzugten Weise der Ausführungsform ist der Strichcode ein binärer Code (Nullen und Einsen). Eine bestimmte Anzahl (N, die „Populationsgröße") der paarweisen Kombinationen wird (zufällig oder auf Grundlage einer anderen Eigenschaft) aus dem Gesamtpool möglicher paarweiser Kombinationen ausgewählt und die Aktivität jeder dieser Kombinationen wird bestimmt. Die X aktivsten Mitglieder dieser Population werden ausgewählt (wobei X kleiner ist als N). N neue Kombinationen werden aus den X aktiven Kombinationen unter Verwendung einer Reihe von Operatoren gebildet, die einschließen (i) Replikation (die ursprüngliche Kombination wird einfach noch mal ausgewählt), (ii) Mutation (ein Bit des Strichcodes wird in einen anderen Wert geändert) und (iii) Rekombination (zwei Strichcodes werden jeweils an einem Mittelpunkt gespalten und die entgegengesetzten Enden werden zusammengeführt, um zwei neue Hybrid-Strichcodes zu bilden. Dieser Prozess von Selektion, Amplifikation, Mutation und Rekombination wird über eine Vielzahl von Zyklen wiederholt und die Aktivität jeder Kombination von Agenzien am Ende jedes Zyklus bestimmt. Dies stellt ein Verfahren zum Testen einer begrenzten Anzahl von Kombinationen bereit, wobei es dennoch die Entdeckung von hochwirksamen Kombinationen von Agenzien erlaubt.
Ein Verfahren zum Optimieren der Parameter des genetischen Algorithmus (oder eines anderen Algorithmus) ist wie folgt: C Kombinationen von N Agenzien werden für die Studie ausgesucht. Die Aktivität jedes Mitglieds des vollständigen Satzes von (N!)/(N – C)!(C!) Kombinationen wird bestimmt. Darüber hinaus können auch alle Kombinationen niedriger Ordnung bestimmt werden. Mit dem vollständigen Datensatz der Aktivitäten ist es möglich, die Erfolgsrate und die Wirksamkeit verschiedener Algorithmen oder verschiedener Permutationen eines einzelnen Algorithmus zu bestimmen, ohne dass zusätzliche „feuchte" Laborarbeit durchgeführt werden muss. Das heißt, alle Strategien zum Auffinden aktiver Kombinationen können „in silico" verglichen werden und ihre relative Funktion verglichen werden.
Stocklösungen
Zwei Arten von Stocklösungen werden behalten. Jede Verbindung wird in beide Stockformate abgelegt. Das erste Stocklösungsformat besteht aus Verbindungen, die in 100 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Endkonzentration von 4 mM gelöst sind und in Polypropylenplatten mit 384 Vertiefungen (Matrix Technologies) gelagert werden. Der zweite Typ von Stocklösung besteht aus Verbindungen, die in 1500 μl DMSO mit einer Endkonzentration von 4 mM gelöst sind und in Polypropylenplatten mit 96 tiefen Vertiefungen gelagert werden. Viele Kopien jedes Typs von Platte werden hergestellt. Eine Kopie der Stockplatten wird bei –20 °C für die routinemäßige Verwendung gelagert und die Sicherungskopien werden bei –80 °C für die Langzeitlagerung gelagert.
Testplatten
Drei Arten von Testplatten werden verwendet. Die Größe der Stifte in der oben beschriebenen Stiftübertragungsvorrichtung wird an die jeweilige Größe der Testplatte angepasst.

1) Kommerzielle Platten mit 384 Vertiefungen (z. B. weiße undurchsichtige steril behandelte Polystyrol-Zellkulturplatten mit Deckel NalgeNunc, Kat.-Nr. 164610);
2) kommerzielle Platten mit 1536 Vertiefungen (z. B. Greiner oder Corning);
3) speziell angefertigte Platten mit 1536 oder 6144 Vertiefungen (hergestellt aus Polydimethylsiloxan, Dow Corning) und Delran-Gussformen und Omni-Trays.

Software zur Steuerung der Zugabe der Verbindungen
Es wird Microsoft Visual Basic oder Programmiersprache unter Verwendung üblicher Programmiertechniken verwendet, um die Software zu schreiben, die die oben beschriebenen Instrumente bedient. Die Software erlaubt dem Instrument den Strichcode auf einer Stockplatte oder Testplatte zu lesen, die Lokalisation der Platten auf dem Teststapel nachzuvollziehen und das geeignete Volumen der korrekten Verbindung in die korrekte Testvertiefung zu übertragen. Folglich werden alle zu screenenden Kombinationen bestimmt oder im Voraus ausgewählt und das Instrument führt das Kombinationsscreenen in einer automatisierten Form durch, die nur einfache Bedienungsschritte erfordert, wie z. B. das Platzieren bestimmter Platten auf dem Teststapel und Entfernen bestimmter Platten von dem Teststapel in einen Inkubator.
Strichcode-Lesegerät und -Drucker
Ein Strichcode-Drucker wird unter Verwendung von Standardtechniken verwendet, um eine einzigartige Identifikationsnummer für jede Platte zu bilden, den Strichcode auf eine Markierung zu drucken und die Markierung auf die Test- oder Stockplatte zu stempeln. Die Software nimmt die Identifizierung jeder Verbindung in jeder Vertiefung jeder Testplatte und Stockplatte auf. Ein Strichcode-Lesegerät, das mit dem Teststapel verbunden ist, scannt jede Platte beim Eintritt oder Austritt aus dem Teststapel.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und von ihnen ist nicht beabsichtigt, dass sie in irgendeiner Weise einschränkend sein sollen.
Beispiel 1
1 ist ein konzeptionelles Diagramm, das zeigt, wie zwei verschiedene Reagenzien im Inneren einer Zelle synergistisch wirken könnten, wobei die Reagenzien an verschiedene Ziele in der gleichen Zelle binden. In dieser Figur überqueren die Verbindung A 10 und die Verbindung B 12 die Plasmamembran 14 und diffundieren frei in den zytosolischen Bereich einer Säugerzelle. Die Verbindung A bindet an Protein X 16, das eine Kinase ist, wodurch die Aktivität dieser Kinase inhibiert wird. Die Kinase X inaktiviert normalerweise den Transkriptionsfaktor Y 18, indem eine Phosphatgruppe an Y angefügt wird. Nachdem Verbindung A die Kinase X inhibierte, wird Transkriptionsfaktor Y aktiviert und Y transloziert in den Kern, wo er fest an die DNA in der Enhancer-Region eines therapeutischen Gens, wie z. B. Insulin bindet. Allerdings ist Transkriptionsfaktor Y nicht in der Lage, die Expression von Insulin in Abwesenheit eines zweiten Transkriptionsfaktors Z 20 zu aktivieren. Allerdings bindet in der Figur Verbindung D den Transkriptionsfaktor Z, wodurch ein autoinhibitorischer Loop auf diesem Transkriptionsfaktor entfernt wird, was bewirkt, dass dieser Transkriptionsfaktor Z in den Kern transloziert und an den Transkriptionsfaktor Y bindet. Y und Z erlauben zusammen, aber keiner für sich, die Aktivierung der Expression des therapeutischen Gens Insulin.
2 ist ein konzeptionelles Diagramm, das zeigt, wie zwei verschiedene Reagenzien in einer Organismus synergistisch wirken würden, wobei die Reagenzien an Ziele in verschiedenen Zellen oder Geweben binden. In dieser Figur diffundiert A 50 in beta-Inselzellen 52 der Bauchspeicheldrüse 54. Verbindung A bewirkt, dass ein therapeutisches Gen, das Insulin 56 kodiert, in diesen Zellen exprimiert wird. Allerdings ist Insulin in Abwesenheit des Insulin-Rezeptors auf den Zieladipozyten im Fettgewebe unwirksam. Währenddessen diffundiert Verbindung B in Adipozyten 58 im Fettgewebe 60 und schaltet die Expression des Insulinrezeptors 62 in diesen Zellen ein. A und B ermöglichen zusammen, aber keiner für sich, dass die Insulinaktivität in diesem Individuum wiederhergestellt wird.
3 ist ein Beispiel von experimentellen Daten, die man in einem kombinatorischen Screen von der Art, die in dieser Patentanmeldung beschrieben ist, erhalten würde. Die Ergebnisse aus fünf verschiedenen Platten mit 384 Vertiefungen sind gezeigt. Die Ergebnisse sind im Plattenformat gezeigt, wobei es 16 mit A bis P markierte Reihen und 24 mit 1 bis 24 markierte Spalten gibt. Das Niveau der Aktivität ist in jeder Vertiefung als eine Zahl gezeigt, wobei 1 die Basalaktivität (keine Wirkung) anzeigt und 5 eine aktive Kombination anzeigt. Platte 1 zeigt die Aktivität der Verbindungen 1 bis 384, wobei diese in einem Bromdesoxyuridin-Zytoblot-Test für Zellzyklus-Stoppaktivität in humanen A549-Karzinomzellen mit 4 μg/ml getestet werden (unten beschrieben). Platte 2 zeigt die Aktivität der Verbindungen 1 bis 384, wenn 2 μg/ml im gleichen Test getestet werden. Platte 3 zeigt die Aktivität der Verbindungen 385 bis 768, wenn 4 μg/ml im gleichen Test getestet werden. Bitte bemerken Sie, dass in den Platten 1 bis 4 keine der Verbindungen irgendeine Aktivität zeigt. Platte 5 zeigt die Aktivität von 384 paarweisen Kombinationen der Verbindungen 1 bis 768, wenn 2 μg/ml getestet werden (d.h. Verbindungen 1 bis 384 und 385 bis 768 werden beide simultan zu der Testplatte mit 2 μg/ml jeder Verbindung zugefügt, wodurch 384 verschiedene zufällige paarweise Kombinationen erzeugt werden). Bitte bemerken Sie, dass A1 Aktivität zeigt. Das bedeutet, dass Verbindung 1 (in Vertiefung A1 der Platte mit Verbindungen 1 bis 384) keine Aktivität besaß und Verbindung 385 (in Vertiefung A1 der Platte mit den Verbindungen 385 bis 768) selbst keine Aktivität besaß, aber zusammen die Verbindungen 1 und 385 synergistisch wirken, um eine aktive Kombination zu bilden.
Beispiel 2
Allgemeine Verfahren
4 ist eine Darstellung der Verfahren zum Durchführen kombinatorischer Screens unter Verwendung gegenwärtig kommerziell erhältlicher Technologie. Humane A549-Lungenkarzinomzellen werden von der „American Type Culture Collection" (ATCC; Kat.-Nr. CCL185) erhalten, und bei 37 °C mit 5 % CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin G Natrium, 100 μg/ml Stremptomycinsulfat und 2 mM Glutamat (GibcoBRL, Rockville, MD) (mit 10 % Medium bezeichnet) kultiviert. Viertausend Zellen werden in jeder Vertiefung einer weißen undurchsichtigen Platte mit 384 Vertiefungen 100 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) unter Verwendung eines Multidrop 384 Flüssigkeitsdispensers 110 (Labsystems Microplate Instrumentation Division, Franklin, MA) ausgesät. Die Zellen werden in 40 μl 10 % FBS-enthaltendem Medium ausgesät.
Nach 16 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ werden 10 μl einer 50 mM Stocklösung einer interessierenden Verbindung in 10 % Medium zu jeder Vertiefung zugegeben, was ein Gesamtvolumen von 40 μl und eine Endkonzentration dieser Verbindung von 10 μM ergibt. Entweder vor, unmittelbar nach oder einige Stunden oder Tage später wird ein zweiter Satz von Verbindungen zugefügt, in dem kleine Stifte auf einem Stiftarray 130 in jede Vertiefung einer Stockplatte 140 oder 150 und dann in jede Vertiefung einer Testplatte 100 eingetaucht wurden. Eine Matrix Technologies Pin Transfer Vorrichtung 130 (384 oder 96 Stifte) ist ausreichend (Katalognummern 350500130 und 350510203). Dieses Zwei-Schritt-Verfahren erlaubt das Testen einer spezifischen Verbindung gegen eine große Anzahl anderer Verbindungen in vielen paarweisen Kombinationen. Es ist auch erforderlich, eine Platte zu haben, in der der Satz von Verbindungen, die mittels Stift übertragen werden, in Abwesenheit der ursprünglichen Verbindung (die in allen Vertiefungen vorhanden ist) zu testen, um zu bestimmen, ob eine neue Eigenschaft durch die Kombination erzielt wurde. Es kann auch ein davon verschiedenes Verfahren verwendet werden, um die Kombinationen von Verbindungen zum Inkontaktbringen mit dem Testelement bereitzustellen. Zum Beispiel ist es möglich, anstelle des Konstanthaltens einer Verbindung über alle Kombinationen, wie oben beschrieben, einen Satz von Verbindungen in einer solchen Weise mittels Stift zu übertragen, dass alle paarweisen Kombinationen dieses Satzes erreicht werden. Ein Satz von 16 Verbindungen wird mittels Stift von einer Stockplatte 140 auf 16 Reihen einer Testplatte mit 384 Vertiefungen 100 übertragen. Der gleiche Satz von 16 Verbindungen wird dann in 16 Spalten der gleichen Testplatte übertragen, was eine Matrix von 256 Vertiefungen mit verschiedenen paarweisen Kombinationen bereitstellt.
In jedem der vorgenannten Beispiele (oder entsprechenden Versionen) wird die Testplatte, die A549-Zellen und die Verbindungen enthält, für 48 Stunden bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid in einem Inkubator 120 inkubiert, nachdem alle gewünschten Verbindungen zugefügt wurden. Am Ende dieser Zeit werden 10 μl BrdU unter Verwendung eines Multidrop 384 110 aus einer 50 μM Stocklösung in Medium (hergestellt aus einer 10 mM Stocklösung in PBS, pH 7,4) auf eine Endkonzentration von 10 μM BrdU zugefügt. Die Zellen werden dann für zusätzliche 12 bis 16 Stunden in einem Inkubator (120) bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Der Überstand wird aus jeder Vertiefung mit einem 24-Kanalstab (V & P Scientific) entfernt, der während des gesamten Protokolls zum Absaugen verwendet wurde und an eine Haus-Vakuumquelle angeschlossen ist. Die Zellen werden mit 50 μl kalten (4 °C) 70 % Ethanol/30 % PBS fixiert, für eine Stunde auf Eis inkubiert, mit 90 μl kalter (4 °C) PBS gewaschen und dann werden 25 μl 2 M HCl/0,5 % Tween 20/ddH20 zugefügt. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert, dann mit 90 μl 10 % 2 M NaOH/90 % Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, GibcoBRL), zweimal mit 90 μl HBSS, einmal mit 75 μl PBSTB (PBS, 0,1 % Tween 20 (Sigma), 0,5 % bovines Serumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) gewaschen. Dann werden 20 μl Antikörperlösung, enthaltend 0,5 μl Maus-Anti-BrdU-Antikörper (1 : 1000 Verdünnung des Stocks, (BD Biosciences-PharMingen San Diego, CA) und 1 : 2000 Verdünnung eines an HRP konjugierten Anti-Maus-Ig-Antikörpers (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Pscataway, NJ)) in PBSTB zugefügt. Die Zellen werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, zweimal mit 90 μl PBS gewaschen und dann werden 20 μl HRP-Substratlösung zu jeder Vertiefung zugegeben. Die HRP-Substratlösung wird durch Mischen gleicher Volumina der Lösungen 1 und 2 des Amersham-ECL-Nachweiskits erhalten. Die Platte wird in ein LJL Biosystems Inc. (Sunnyvale, CA) Analyse AD-Plattenlesegerät 160 gestellt und die Lumineszenz in jeder Vertiefung für 0,3 Sekunden nachgewiesen. Die Aktivität der Kombinationen wird dann mit der Aktivität der einzelnen Agenzien alleine sowohl bei der ursprünglichen Konzentration als auch bei dem N-fachen der ursprünglichen Konzentration verglichen, wobei N gleich der Anzahl der aktiven Verbindungen, die in dem Screen gefunden werden, ist. Wenn eine Kombination eine Aktivität zeigt, die größer ist als die Aktivität jedes einzelnen Agenzes alleine sowohl bei der ursprünglichen Konzentration als auch bei dem N-fachen der ursprünglichen Konzentration, dann wurde eine synergistische Wirkung beobachtet. Selbst wenn keine Synergie beobachtet wird, kann die Kombination vorteilhafte Eigenschaften (z. B. weniger Nebenwirkungen) im Vergleich zu den einzelnen Verbindungen, die die Kombination ausmachen, haben.
Das vorhergehende Verfahren wird einfach modifiziert, so dass zwei verschiedene Verbindungen in dem ersten Schritt zugegeben werden, was das Testen von Dreierkombinationen erlaubt. In ähnlicher Weise können drei Verbindungen zugefügt werden, um das Testen von Vierfachkombinationen zu erlauben, usw. Unter Verwendung eines solchen Ansatzes werden Kombinationen von Verbindungen höherer Ordnung getestet.
Die Identifikation einer Kombination von Verbindungen, die die Proliferation inhibieren, ist unten beschrieben. Diese Beschreibung dient nur der Veranschaulichung und sollte in keiner Weise einschränkend sein.
Sieben Verbindungen wurden alleine und in allen 21 möglichen paarweisen Kombinationen in dem BrdU-Zytoblot-Test (siehe unten) auf ihre Wirkung auf das Fortschreiten des Zellzyklus getestet. Die sieben Verbindungen (Podophyllotoxin, Paclitaxel, Quinacrin, Bepridil, Dipyridamol, Promethazin und Agroclavin; alle erworben von Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MO) wurden alle in Glasgefäße mit einem Dram eingewogen und in Dimethylsulfoxid gelöst, um 4 mg/ml Stocklösungen zu bilden. Sechstausend A549-Lungenkarzinomzellen wurden in jede Vertiefung einer weißen undurchsichtigen Zellkultur-behandelten NalgeNunc 384-Platte (Kat.-Nr. 164610) in 30 μl 10 % Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium enthaltend 10 % fötales bovines Serum, 100 Einheiten/ml Penicillin G Natrium, 100 μg/ml Streptomycinsulfat und 2 mM Glutamin, alle erhalten von Life Technologies) ausgesät. Jede Verbindung wurde viermal auf die Testendkonzentration (Testendkonzentrationen betrugen 0,25 % DMSO, 240 nM Podophyllotoxin, 60 nM Paclitaxel, 420 nM Quinacrin, 25 μM Bepridil, 400 nM Dipyridamol, 25 μM Promethazin, 840 nM Agroclavin) in 10 % Medium verdünnt. 15 μl jeder 4-x-Stocklösung der Verbindung in Medium wurden zu einer Reihe und einer Spalte eines 8-Spalten- und 8-Reihen-Quadrats (die 8. Spur enthielt nur den Träger DMSO) zugefügt, so dass alle binären Kombinationen der 7 Verbindungen getestet wurden wie auch die einzelnen Agenzien selbst. Die Zellen wurden dann bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid für 46 Stunden inkubiert. BrdU wurde auf eine Endkonzentration von 10 μM durch Zugabe von 15 μl einer 50 μM-Lösung von BrdU in 10 % Medium zugefügt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.
Nach 16 Stunden wurde das Medium einer jeden Vertiefung mit einem 24-Kanal-Stab (V & P Scientific) abgesaugt, der während des gesamten Protokolls verwendet wurde und an eine Haus-Vakuumquelle angeschlossen war. 50 μl von 70 % Ethanol/30 % Phosphat-gepufferter Salzlösung (4 °C) wurden dann mit einem Multidrop 384-Plattenbefüllgerät (Labsystems), das für alle anschließenden Flüssigkeitszugabeschritte verwendet wurde, zu jeder Platte zugefügt. Die Platte wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurden die Vertiefungen abgesaugt und 25 μl 2 M HCl mit 0,5 % Tween 20 zu jeder Vertiefung zugefügt. Die Platte wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 25 μl 2 M NaOH wurden dann zu jeder Vertiefung zugefügt. Die Flüssigkeit in jeder Platte wurde abgesaugt und die Vertiefung zweimal mit 75 μl Hank's Balanced Salt Solution gewaschen. Die Vertiefungen wurden noch mal mit 75 μl PBSTB (Phosphat-gepufferte Salzlösung mit 0,5 % bovinem Serumalbumin und 0,1 % Tween 20) gewaschen. 20 μl Antikörperlösung wurden zu jeder Vertiefung zugefügt (enthaltend 0,5 μg/ml Anti-BrdU-Antikörper (PharMingen) und 1 : 2000 Verdünnung von Anti-Maus Ig-HRP (Amersham)). Die Platte wurde mit der Antikörperlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde die Antikörperlösung abgesaugt und jede Vertiefung einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Schließlich wurden 20 μl ECL-Nachweisreagens zu jeder Vertiefung zugefügt (eine gleiche Mischung der Lösungen 1 und 2 der ECL-Nachweisreagenzien von Amersham). Die Lumineszenz in jeder Vertiefung wurde auf einem LJL Analyst Plattenlesegerät mit 0,2 Sekunden Integrationszeit pro Vertiefung ausgelesen. Das Experiment wurde in zwei Platten wiederholt und jede paarweise Kombination in insgesamt 16 Wiederholungsexperimenten getestet. Die in der Tabelle gezeigten Daten zeigen die mittlere antiproliferative Aktivität jeder Kombination von Verbindungen. Fünf statistisch signifikante (p<0,001) Kombinationen sind hervorgehoben. Alle Aktivitäten sind auf einen Satz von Vertiefungen normalisiert, der Zellen, die keine Behandlung erhielten, enthielt. Folglich stellt ein Wert von Eins eine inaktive Substanz dar und ein Wert von größer Eins zeigt einen gewissen Spiegel antiproliferativer Aktivität.
Die Tabelle zeigt fünf Kombinationen von bestehenden Wirkstoffen, die von der US-amerikanischen Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (FDA) zugelassen sind, mit einer antiproliferativer Aktivität, die von der der Einzelverbindungen unterschiedlich ist. Podophyllotoxin und Paclitaxel sind beide Stabilisatoren von Mikrotubuli, die die Zellen in der Mitose arretieren, Dipyridamol ist ein Anti-Plättchen-Agens, Bepridil ist ein Calciumkanalblocker und Promethazin ist ein H1-Histaminrezeptor-Antagonist und wird auch als ein ZNS-Sedativ und anticholinerges Mittel verwendet. Dipyridamol wird im Allgemeinen als ein humanes Therapeutikum mit einem relativ hohen Sicherheitsprofil angesehen, insbesondere im Vergleich zu den toxischen Nebenwirkungen von Paclitaxel und Podophyllotoxin. Folglich verstärkt in diesem Test Dipyridamol die antiproliferative Wirkung von sowohl Paclitaxel als auch Podophyllotoxin auf humane Lungenkrebszellen. Darüber hinaus verstärkt Bepridil die Wirkungen von Podophyllotoxin, inhibiert aber die Wirkung von Paclitaxel. Dieses Resultat wäre vorher nicht vorausgesagt worden und hebt die Wichtigkeit von empirischem High-Throughput-Testen von Kombinationen hervor, um unerwartete Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen zu beobachten. Zum Beispiel inhibieren Bepridil und Promethazin in Kombination die Proliferation von Lungenkrebszellen stark, wobei keines dieser Mittel als ein antiproliferatives Agens in den gegenwärtigen therapeutischen Indikationen eingesetzt wird.
Andere Ausführungsformen
Alle Publikationen und in der obigen Beschreibung genannten Patente werden hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Verschiedene Modifikationen und Variationen des beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens und Systems werden dem Fachmann ersichtlich werden, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte verstanden werden, dass die Erfindung, wie sie beansprucht ist, nicht unangemessener Weise auf solche spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden sollte. In der Tat ist beabsichtigt, dass verschiedene Modifikationen der beschriebenen Arten zur Ausführung der Erfindung, die für den Fachmann auf dem Gebiet der Wirkstoffentwicklung und verwandter Gebiete offensichtlich sind, in dem Bereich der Erfindung sind.

Claims

Verfahren zum Screenen von Kombinationen von Verbindungen zum Identifizieren von Kombinationen von Verbindungen, die eine Wirkung hervorrufen, die von der Wirkung einer Verbindung der Kombination an sich verschieden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen von ganzen Zellen eines Ganz-Zell-Tests, (b) Inkontaktbringen der ganzen Zellen mit mindestens 100 Verbindungen unter Bedingungen, die sicherstellen, dass jedes Inkontaktbringen von Verbindung/ganzer Zelle von den anderen getrennt ist, und (c) Nachweisen oder Messen von Wirkungen, die durch die Verbindungen auf den ganzen Zellen entfaltet werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden zusätzlichen Schritte umfasst: (d) Auswählen von Verbindungen, die eine Veränderung der auf den ganzen Zellen entfalteten Wirkung im Vergleich zu der Wirkung auf die ganzen Zellen, die nicht mit den Verbindungen in Kontakt gebracht wurden, hervorrufen, (e) Bilden eines Arrays von mindestens 49 einzigartigen Kombinationen von Zweier-Einheiten oder von höherer Ordnung aus den identifizierten Verbindungen, (f) Inkontaktbringen des Arrays von Kombinationen von Verbindungen mit ganzen Zellen des Ganz-Zell-Tests unter Bedingungen, die sicherstellen, dass das Inkontaktbringen jeder Verbindungskombination/ganzen Zelle von den anderen getrennt ist, (g) Nachweisen oder Messen einer Wirkung, die durch die Kombinationen von Verbindungen auf den ganzen Zellen von Schritt (f) entfaltet wird, und (h) Identifizieren von Kombinationen von Verbindungen, die eine Wirkung des Schritts (g) hervorrufen, die von der Wirkung einer Verbindung der Kombination an sich verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (e) das Bilden eines Arrays aus mindestens 200 einzigartigen Kombinationen von zwei oder mehr Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt (e) das Bilden eines Arrays aus mindestens 400 einzigartigen Kombinationen von zwei oder mehr Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei Schritt (e) das Bilden eines Arrays aus mindestens 1540 einzigartigen Kombinationen von zwei oder mehr Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) mittels eines Cytoblot-Tests durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) mittels eines Reportergen-Tests durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) mittels eines Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Tests durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) mittels Nachweisen eines fluoreszierenden Calcium-bindenden Indikator-Farbstoffs durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) Fluoreszenzmikroskopie benutzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt (g) das Erstellen eines Expressionsprofils benutzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ganzen Zellen humane Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ganzen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer Krebszelle, einer Immunzelle, einem Neuron, einem Fibroblasten, Bakterienzellen und Hefezellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei einer oder beide Schritte (e) und (g) unter Verwendung eines Robotersystems durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei einer oder beide Schritte (e) und (g) unter Verwendung von Mikrofluid-Technik durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei einer oder beide Schritte (e) und (g) unter Verwendung von Tintenstrahldrucker-Technologie durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus nicht-polymeren organischen Verbindungen, Lipiden, Kohlenhydraten, Peptiden, anorganischen Verbindungen und Oligonukleotiden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Verbindungen in gereinigter Form eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei jede der Verbindungen in gereinigter Form eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindungen als Bestandteile von Mischungen bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Mischungen Exktrakte natürlicher Produkte sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirkung eine synergistische Wirkung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Verbindungen ein Molekül mit einer molaren Masse von weniger als 1500 g/mol ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Molekül ein Wirkstoff ist, der von der US-amerikanischen Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (FDA) zugelassen ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei jede der Verbindungen ein Molekül mit einer molaren Masse von weniger als 1500 g/mol ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei jede der Verbindungen ein Wirkstoff ist, der von der US-amerikanischen Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (FDA) zugelassen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kombinationen, die auf wirksame therapeutische Kombinationen gescreent werden, Kombinationen von zwei Verbindungen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kombinationen, die auf wirksame therapeutische Kombinationen gescreent werden, Kombinationen von drei Verbindungen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirkung, die auf den ganzen Zellen in dem Ganz-Zell-Test entfaltet wird, ein Transport einer Verbindung über die Zellmembran, ein elektrisches Potenzial, die Bildung eines Aktionspotenzials, eine Zellproliferation, ein Zelltod, eine Zellspezifizierung, eine Zelldifferenzierung, eine Zellmigration, eine Genexpression, Proteinspiegel, eine enzymatische Aktivität, eine Phosphorylierung, eine Methylierung, eine Acetylierung, eine Proteintranslokation in den Kern oder die Fähigkeit, eine Immunantwort hervorzurufen, ist.
Kombination von Verbindungen, ausgewählt aus einer paarweisen Kombination von Bepridil und Podophyllotoxin, Bepridil und Promethazin, Dipyridamol und Podophyllotoxin oder Dipyridamol und Paclitaxel.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend (i) eine Kombination von Verbindungen, ausgewählt aus der paarweisen Kombination von Bepridil und Podophyllotoxin, Bepridil und Promethazin, Dipyridamol und Podophyllotoxin oder Dipyridamol und Paclitaxel, und (ii) einen pharmazeutisch geeigneten Träger.