ES2243367T3 - Procedimiento para identificar combinaciones de entidades como terapeuticas. - Google Patents
Procedimiento para identificar combinaciones de entidades como terapeuticas.Info
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Abstract
Procedimiento para cribar combinaciones de compuestos con vistas a identificar las combinaciones de compuestos que provocan un efecto que es diferente del efecto de un compuesto de la combinación por sí solo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a) proporcionar células completas de un ensayo de células completas, (b) poner en contacto dichas células completas con por lo menos 100 compuestos bajo condiciones que garanticen que cada contacto entre la célula completa y el compuesto sea diferente de los demás, y (c) detectar o medir los efectos mostrados por los compuestos sobre las células completas, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas adicionales siguientes: (d) seleccionar los compuestos que provocan un cambio en dicho efecto mostrado sobre las células completas en comparación con dicho efecto de dichas células completas que no han entrado en contacto con dichos compuestos, (e) crear una matriz ordenada de por lo menos 49 combinaciones únicas de dos entidades o de combinaciones de orden superior a partir de los compuestos identificados, (f) poner en contacto dicha matriz ordenada de combinaciones de compuestos con células completas del ensayo de células completas bajo condiciones que garanticen que cada contacto entre la célula completa y la combinación de compuestos sea diferente de los demás, (g) detectar o medir un efecto mostrado por las combinaciones de compuestos sobre las células completas de la etapa (f), y (h) identificar las combinaciones de compuestos que provocan un efecto de la etapa (g) que es diferente del efecto de un compuesto de la combinación por sí solo.
Description
Procedimientos para identificar combinaciones de
entidades como terapéuticas.
Muchos estados patológicos se encuentran
asociados a una multitud de cambios fenotípicos. Ello ha resultado
evidente desde hace mucho tiempo a nivel clínico, pero los últimos
avances en la genómica han confirmado esta observación a nivel
molecular. Por ejemplo, el perfilado de expresión de las células de
cáncer ha revelado cientos de cambios en la expresión génica que
son provocados por una multiplicidad de mutaciones somáticas.
Además, las células y tejidos humanos han desarrollado mecanismos
homeostáticos, de manera que con frecuencia contienen sistemas de
señalización redundantes y autotamponadores. Las señales naturales
que provocan un cambio en el estado celular con frecuencia no se
envían a una sola diana sino a la combinación correcta de dianas.
De esta manera, cambios modestos en múltiples variables pueden
presentar un efecto altamente específico.
En contraste, por motivos históricos y
tecnológicos, las comunidades farmacéutica, química y biológica se
han concentrado en las moléculas individuales que provocan efectos
biológicos. Este paradigma histórico ha resultado en la
identificación de pequeñas moléculas orgánicas que afectan a
proteínas específicas, proporcionando valiosos reactivos para la
biología y la medicina. Estas moléculas también resultan útiles como
sondas de la función biológica de las proteínas que potencialmente
presentan relevancia terapéutica y que han resultado efectivas para
elucidar las rutas de transducción de señales, al actuar como
supresores químicos de proteínas, provocando de esta manera la
pérdida de función de la proteína. Además, debido a la interacción
de estas moléculas pequeñas con dianas biológicas particulares y su
capacidad para afectar a funciones biológicas específicas, también
pueden ser candidatos para el desarrollo de terapias.
Debido a que resulta imposible predecir qué
moléculas pequeñas interaccionarán con una diana biológica, se han
dirigido esfuerzos intensos hacia la producción de un gran número
de pequeñas moléculas orgánicas. A continuación, éstas se reúnen en
las denominadas "bibliotecas" de dichos compuestos, con el
objetivo de construir una "biblioteca diversa" con las
características deseadas apropiadas. Dicha biblioteca diversa puede
construirse a partir de una colección preexistente de moléculas
pequeñas o puede producirse utilizando "química
combinatorial". Estas bibliotecas pueden enlazarse con cribados
sensibles con vistas a identificar moléculas activas (Stockwell
et al., Chem. Biol. 6:71-83, 1999).
En muchos casos, los investigadores han
desarrollado bibliotecas prefiguradas, en las que todos los
miembros comparten una característica particular, tal como una
capacidad para interaccionar con una proteína diana o un rasgo
estructural característico diseñado para imitar un aspecto
particular de una clase de compuestos naturales. Por ejemplo, se han
diseñado varias bibliotecas que imitan uno o más características de
los péptidos naturales. Dichas bibliotecas "peptidomiméticas"
incluyen las bibliotecas ftalimido (documento WO nº 97/22594), las
bibliotecas tiofeno (documento WO nº 97/40034) y las bibliotecas
benzodiacepina (patente US nº 5.288.514). Se ha sintetizado una
biblioteca que presenta características estructurales que recuerdan
los productos naturales y que es compatible con los ensayos
miniaturizados basados en células (Tan et al., J. Am. Chem.
Soc. 120:8565, 1998).
El procedimiento moderno de descubrimiento de
fármacos se construye en gran parte sobre una capacidad para
ensayar rápidamente compuestos con vistas a detectar sus efectos
sobre los procesos biológicos. En la industria farmacéutica, la
atención se ha centrado en la identificación de compuestos que
bloquean, reducen o incluso intensifican las interacciones entre
las moléculas biológicas. Específicamente, en los sistemas
biológicos, la interacción entre un receptor y su ligando proteico
con frecuencia puede resultar, sea directamente o a través de algún
suceso posterior, en un efecto deletéreo o beneficioso sobre dicho
sistema y, en consecuencia, sobre un paciente para el que se busca
un tratamiento. De acuerdo con ello, los investigadores han buscado
desde hace mucho tiempo compuestos que reduzcan, bloqueen o incluso
intensifiquen dichas interacciones
receptor-ligando.
Los sistemas de cribado de alto rendimiento se
han diseñado para superar las limitaciones prácticas sobre el
rendimiento de los ensayos bioquímicos y basados en células que
existen en la actualidad. Las síntesis tradicionales de compuestos
orgánicos y los ensayos biológicos tradicionales requieren
cantidades significativas de tiempo, trabajo y habilidad. El
cribado del máximo número de compuestos exige reducir los
requisitos de tiempo y trabajo asociados a cada cribado.
De esta manera, el cribado de alto rendimiento de
diversas colecciones de moléculas ha desempeñado un papel crucial
en la búsqueda de compuestos cabeza de serie para el desarrollo de
nuevos agentes farmacológicos. Las entradas a estos cribados de
alto rendimiento son las bibliotecas de compuestos que han sido
reunidas a partir de moléculas de síntesis química preexistentes
(tal como de una biblioteca patentada de una compañía
farmacéutica), de productos naturales (tal como los caldos de
fermentación microbiana) y de nuevas bibliotecas producidas
mediante técnicas de química combinatorial (Tan et al., J.
Am. Chem. Soc. 120:8565, 1998). Las bibliotecas consisten en hasta
un millón de compuestos, lo que incrementa la probabilidad de
encontrar un compuesto con propiedades deseables que sirva como
candidato a fármaco cabeza de serie (Tan et al., J. Am.
Chem. Soc. 121:9073-9087, 1999).
Al potenciar el paradigma tradicional de búsqueda
de fármacos, la química combinatorial ha resultado en un incremento
drástico en el número de compuestos disponibles para el cribado, y
la investigación del genoma humano ha descubierto un gran número de
nuevas dianas moleculares para el cribado. Los cribados pueden
utilizar nuevas dianas de una diversidad de maneras, en la búsqueda
de inhibidores de enzimas, agonistas o antagonistas de receptores.
El objetivo tradicional ha sido encontrar compuestos que reduzcan,
bloqueen o intensifiquen una sola interacción crucial en un sistema
biológico (Weber et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
34:2280-2282, 1995). Además, algunos investigadores
están adaptando los sistemas de ensayo que se basan en el fenotipo,
en los que el cribado se lleva a cabo sobre células vivas completas
y el resultado del cribado es alguna propiedad detectable de la
célula (Stockwell et al., Chem. Biol.
6:71-83, 1999; Mayer et al., Science
286:971-974, 1999).
Los procedimientos de cribado de alto rendimiento
desarrollados hasta el momento se han diseñado basándose en el
paradigma de "un fármaco, una diana", el cual domina la
industria farmacéutica. Por motivos históricos y debido a
consideraciones legales y de percepción de riesgo, el procedimiento
moderno de descubrimiento de fármacos principalmente intenta
encontrar una molécula activa cada vez, con vistas a servir como
fármaco candidato. Los médicos han reconocido desde hace mucho
tiempo que el enfoque de "un fármaco, una diana" no resulta
suficiente para el tratamiento de muchas enfermedades. Han ensayado
algunas combinaciones evidentes de agentes que tratan la misma
condición o que presentan una clara conexión lógica. Por ejemplo, en
la terapia del VIH y en la quimioterapia, las combinaciones de
múltiples agentes activos se han convertido en altamente
recomendables. Uno de los fármacos más prometedores de todos los
tiempos es una combinación de premarina, la cual se utiliza para
tratar los complejos cambios que suceden en las mujeres tras la
menopausia, está compuesta de más de 22 componentes separados e
importantes. A título de ejemplo adicional, el documento WO
nº 98/57174 da a conocer combinaciones sinérgicas de péptidos
inhibitorios y compuestos antimicrobianos.
Hemos inventado un potente nuevo procedimiento
para perturbar los sistemas biológicos. Dicho procedimiento implica
poner en práctica de manera sistemática cribados de alto
rendimiento de combinaciones de compuestos, es decir de mezclas o de
combinaciones unidas de manera no química, con vistas a descubrir
combinaciones que interaccionan sinérgicamente en los sistemas
biológicos. Los procedimientos de la invención pueden identificar
combinaciones terapéuticas efectivas de compuestos que muestran
efectos terapéuticos previamente desconocidos, incluso en los que
cada compuesto en la combinación puede no haber tenido anteriormente
ningún efecto biológico reconocido e incluso en los que los
compuestos y la combinación no serían, a priori, candidatos
obvios a su utilización en combinación.
De acuerdo con lo anterior, la invención
proporciona un procedimiento para cribar combinaciones de
compuestos con vistas a identificar combinaciones de compuestos que
provocan un efecto que es diferente del efecto de un compuesto de la
combinación por sí solo, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas de: (a) proporcionar células completas de un ensayo de
células completas, (b) poner en contacto dichas células completas
con por lo menos 100 compuestos bajo condiciones que garantizan que
cada contacto entre la célula completa y el compuesto sea diferente
de los demás, y (c) detectar o medir los efectos mostrados por los
compuestos sobre las células completas, en el que dicho
procedimiento comprende las etapas adicionales siguientes de: (d)
seleccionar compuestos que provocan un cambio en dicho efecto
mostrado sobre las células completas respecto a dicho efecto de
dichas células completas que no han entrado en contacto con dichos
compuestos, (e) crear una matriz ordenada de por lo menos 49
combinaciones únicas de dos entidades o de orden superior a partir
de los compuestos identificados, (f) poner en contacto dicha matriz
ordenada de combinaciones de compuestos con células completas del
ensayo de células completas bajo condiciones que garanticen que
cada contacto entre la célula completa y la combinación de
compuestos sea diferente de los demás, (g) detectar o medir un
efecto producido por la combinación de compuestos sobre las células
completas de la etapa (f), y (h) identificar las combinaciones de
compuestos que provocan un efecto según la etapa (g) que resulta
diferente del efecto de un compuesto de la combinación por sí
solo.
En un segundo aspecto relacionado, el
procedimiento incluye la etapa de crear una matriz ordenada de por
lo menos 200 combinaciones únicas de dos o más entidades. Los
componentes de este ensayo pueden variarse tal como se ha indicado
anteriormente en referencia al primer ensayo. En las formas de
realización preferentes, este procedimiento incluye además la etapa
de (i) repetir las etapas (a) a (h) por lo menos dos veces, en el
que, en la etapa (a), la matriz ordenada de por lo menos 200
combinaciones es diferente en cada repetición. En otras formas de
realización preferentes, la matriz ordenada incluye por lo menos
400 ó 1.540 combinaciones únicas. En el caso de que se lleven a cabo
dos repeticiones de la etapa (i), preferentemente dichas
repeticiones se producen separadas por un intervalo de diez
días.
En un tercer aspecto relacionado, el
procedimiento incluye las etapas de (a) a (h) e (i), repitiendo las
etapas (a) a (h) por lo menos 25 veces a lo largo de un periodo de
una semana y utilizando una matriz ordenada diferente en cada
repetición. Los componentes de este ensayo pueden variarse tal como
se ha descrito antes para los ensayos descritos anteriormente.
En un cuarto aspecto relacionado, el
procedimiento incluye las etapas (a) a (h) e (i), repitiendo las
etapas (a) a (h) por lo menos 100 veces a lo largo de un periodo de
un mes, utilizando una matriz ordenada diferente en cada repetición.
Los componentes de este ensayo pueden variarse tal como en los
ensayos anteriormente descritos.
En un quinto aspecto, el procedimiento incluye
las etapas de (a) a (h) e (i), repitiendo las etapas (a) a (h) por
lo menos 100 veces a lo largo de un periodo de un mes, utilizando
una matriz ordenada diferente en cada repetición. Los componentes de
este ensayo pueden variarse tal como en los ensayos anteriormente
descritos.
En un quinto aspecto, el procedimiento incluye
las etapas de (a) a (h), creando una matriz ordenada de por lo
menos 10.000 combinaciones únicas de dos entidades o de orden
superior a partir de los compuestos identificados, e (i), repitiendo
las etapas (a) a (h) por lo menos dos veces a lo largo de un
periodo de diez días o menos, en el que, en la etapa (a), la matriz
ordenada de por lo menos 10.000 combinaciones de dos entidades es
diferente en dos o más de las repeticiones.
En un sexto aspecto, el efecto de la etapa (c) es
preferentemente el mismo que el de las células completas según la
etapa (g), aunque puede resultar deseable utilizar un efecto
diferente en cada etapa.
Para todos los ensayos pueden utilizarse varias
técnicas de lectura, incluyendo un ensayo de citotransferencia, un
ensayo de gen testigo, ensayos de transferencia de energía de
resonancia fluorescente (FRET), un colorante indicador de unión de
calcio fluorescente, la microscopía de fluorescencia o el perfilado
de expresión. Los ensayos preferentemente están automatizados con
sistemas robóticos y placas de 384 y 1.536 pocillos. Los ensayos
también pueden construirse de manera que las partes o la totalidad
del procedimiento pueda ser llevado a cabo utilizando sistemas
microfluídicos. Alternativamente, los ensayos pueden ejecutarse
mediante trabajo científico experto y un procedimiento en línea
eficiente.
Los compuestos objeto de ensayo en una
combinación de acuerdo con la invención son, por ejemplo,
compuestos orgánicos no poliméricos, particularmente, moléculas
pequeñas; lípidos; carbohidratos; péptidos; compuestos inorgánicos y
oligonucleótidos, incluyendo moléculas de ADN y de ARN, fuera del
intervalo visible, la radiación de microondas, la radiación
infrarroja o la radiación ionizante. Los compuestos preferentemente
se utilizan en forma purificada, pero también pueden proporcionarse
como componentes de mezclas, por ejemplo como extractos de
productos naturales. Por ejemplo, un subconjunto (uno o más
compuestos) puede proporcionarse en forma purificada, cada uno de
los compuestos puede utilizarse en forma purificada.
Preferentemente, cada contacto entre la célula completa y el
compuesto se encuentra en un volumen inferior a 200 \mul, más
preferentemente en un volumen inferior a 100 \mul y con la mayor
preferencia en un volumen inferior a 50 \mul o incluso en 25
\mul. En determinadas circunstancias, pueden utilizarse volúmenes
de tan solo 10 \mul o incluso de 500 nl o menos. Además, los
compuestos preferentemente se encuentran en volúmenes inferiores a
100 \mul, más preferentemente en volúmenes inferiores a 1 \mul
y con la mayor preferencia en volúmenes inferiores a 100 nl o
incluso de 50 nl. Un experto en la materia reconocerá que pueden
utilizarse volúmenes más pequeños (por ejemplo 10 nl o incluso 1
nl).
Las células completas preferentes son, por
ejemplo, las células humanas, las células transformadas o las
células no transformadas, tales como neuronas, fibroblastos,
células de músculo liso, células cardíacas, células de músculo
esquelético, células gliales, células madre embrionarias, células
madre hematopoyéticas, mastocitos, adipocitos, protozoos, células
bacterianas, células de levadura, células madre neurales y células
inmunológicas, incluyendo las células T y las células B,
agrupaciones de células, tejidos, animales y medios reconstituidos
libres de células.
Los efectos mostrados por las combinaciones
deseadas en la célula completa preferentemente son efectos
sinérgicos sobre una propiedad de la célula completa, tal como un
incremento o una reducción en la síntesis de ADN. Alternativamente,
la combinación puede ser de naturaleza aditiva pero presentar menos
efectos secundarios, o una entidad puede ejercer un efecto negativo
útil sobre otra, por ejemplo un compuesto puede contrarrestar la
toxicidad de otro compuesto.
Puede hacerse que los compuestos entren en
contacto con la célula completa en cualquier secuencia, es decir,
puede añadirse un compuesto a la célula completa, seguido de la
adición de un segundo compuesto, o alternativamente, los dos
compuestos pueden combinarse antes de hacerse entrar en contacto
con la célula completa.
Los procedimientos de exploración de alto
rendimiento de la invención representan alternativas rápidas y
potentes a los procedimientos tradicionales de descubrimiento de
fármacos utilizados por la industria farmacéutica. La invención
puede identificar combinaciones previamente desconocidas y
terapéuticamente potentes de, por ejemplo, moléculas pequeñas,
algunas de las cuales puede sintetizarse nuevamente y alguna de las
cuales pueden ser fármacos conocidos autorizados por la FDA. En el
caso de combinaciones efectivas que están enteramente formadas por
dos, tres, cuatro o más fármacos, todos los cuales ya están
autorizados por la FDA, la nueva combinación presenta la ventaja
adicional de que pasa fácilmente por el procedimiento de
autorización de la FDA.
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada
y de las reivindicaciones.
"Biblioteca de química
combinatorial": tal como se utiliza en la presente memoria,
"biblioteca de química combinatorial" es una pluralidad de
moléculas complejas, preferentemente que recuerda a productos
naturales sintetizados a partir de estructuras diversificables de
esqueleto mediante la utilización de diferentes reactivos en cada
etapa de diversificación de la estructura de esqueleto.
"Biblioteca diversa": tal como se
utiliza en la presente memoria, una "biblioteca diversa" es
una pluralidad de molécula complejas que han sido reunidas a partir
de cualquiera de entre múltiples fuentes potenciales, incluyendo
las moléculas de síntesis química preexistentes (tales como la
biblioteca patentada de una compañía farmacéutica), los productos
naturales (tales como los caldos de fermentación microbiana) y las
nuevas bibliotecas producidas mediante las técnicas de química
combinatorial.
"Estructura diversificable de
esqueleto": tal como se utiliza en la presente memoria, una
"estructura diversificable de esqueleto" es un compuesto
sintetizado a partir de una estructura de molde, que contiene
funcionalidades latentes o activas capaces de reaccionarse
adicionalmente con reactivos sintéticos produciendo por lo menos una
nueva funcionalidad. Tal como se utiliza en la presente memoria,
"funcionalidad latente" es una funcionalidad que está presente
pero que se encuentra temporalmente inactiva. Al liberarse con un
reactivo activador, la funcionalidad latente se activa y de esta
manera se encuentra disponible para su diversificación
adicional.
"Elemento de ensayo": tal como se
utiliza en la presente memoria, un "elemento de ensayo" es una
célula completa con la que entra en contacto la combinación de
compuestos, y que a continuación se observa con vistas a detectar
los efectos de los compuestos. Una célula completa incluye
preferentemente dos o más grupos biológicos dentro de la
célula.
"Impresión con compuestos": tal como
se utiliza en la presente memoria, la "impresión con
compuestos" se refiere a la aplicación de compuestos a una
superficie (por ejemplo de vidrio) utilizando un robot de alta
precisión, tal como el utilizado en el microdespliegue de ADNc (J.
Am. Chem. Soc. 121:7967-7968, 1999). Los puntos con
los compuestos pueden ser de 250 micrómetros de diámetro o más
pequeños, y los compuestos pueden estar unidos covalentemente o
adherentes a la superficie a través de interacciones
electrostáticas o hidrofóbicas.
"Sistemas microfluídicos": tal como
se utiliza en la presente memoria, los dispositivos de "sistemas
microfluídicos" son estructuras con canales realizadas mediante
cualquiera de los procedimientos de fotolitografía, incluyendo la
fotolitografía convencional (por ejemplo Caliper Technologies,
Mountain View, CA; http://www.calipertech.com) o mediante
procedimientos no convencionales (tales como la litografía blanda,
descrita por ejemplo en Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
37:550-575, 1998).
"Inyección de tinta": tal como se
utiliza en la presente memoria, la tecnología de "inyección de
tinta" se refiere tanto a la inyección térmica de tinta, como a
las tecnologías de pulverización piezoeléctrica para la liberación
de pequeños volúmenes de líquidos.
"Molécula pequeña": tal como se
utiliza en la presente memoria, "molécula pequeña" se refiere
a un compuesto orgánico sintetizado en el laboratorio o de origen
natural. Típicamente, una molécula pequeña se caracteriza porque
contiene varios enlaces carbono-carbono y porque
presenta un peso molecular inferior a 1.500 g/mol, aunque esta
caracterización no pretende ser limitativa para los fines de la
presente invención. Entre los ejemplos de "moléculas pequeñas"
de origen natural se incluyen, pero sin limitarse a ellos, el
taxol, la dinemicina y la rapamicina.
La figura 1 es un diagrama conceptual que
demuestra cómo dos reactivos diferentes pueden actuar en sinergia
dentro de una célula, en la que los reactivos se unen a diferentes
dianas dentro de la misma célula.
La figura 2 es un diagrama conceptual que
demuestra cómo dos reactivos diferentes pueden actuar en sinergia
dentro de un organismo, en el que los reactivos se unen a dianas en
diferentes células o tejidos.
La figura 3 es un ejemplo de los datos
experimentales que se obtendrían en una criba combinatorial del
tipo descrito en la presente memoria. Se muestran los resultados
obtenidos en cinco placas diferentes de 384 pocillos. Los resultados
se muestran en formato de placa, en la que hay 16 filas etiquetadas
de A a P, y 24 columnas, numeradas de 1 a 24. Se muestra el nivel
de actividad en cada pocillo, así como un número, donde 1 significa
actividad basal (ningún efecto) y 5 significa que se ha descubierto
una combinación activa.
La figura 4 es un diagrama de un procedimiento
para poner en práctica el cribado combinatorial utilizando
tecnología disponible comercialmente en la actualidad.
La presente invención proporciona procedimientos
de combinación de bibliotecas de moléculas individuales en
combinaciones de 2, 3, 4 y de orden superior en un sistema de
cribado de alto rendimiento mediante la utilización de ensayos
biológicos relevantes con vistas a identificar efectos de las
moléculas que únicamente se encuentran presentes en sus
combinaciones únicas. Dichas combinaciones seguidamente pueden
utilizarse para sondear y estudiar sistemas biológicos adicionales,
pueden presentar un uso biológico directo y pueden servir como las
moléculas activas para nuevas terapias humanas o para otros usos en
el ser humano. Estas combinaciones también pueden resultar útiles
para estimular el crecimiento, fertilidad, maduración u otra
característica en productos agrícolas específicos, entre ellos
animales o plantas. Pueden resultar útiles en la creación de
productos cosméticos, fragancias, conservantes alimentarios o
suplementos nutricionales. De esta manera, la invención proporciona
procedimientos potentes para poner en práctica de manera
sistemática cribados de alto rendimiento de combinaciones de
compuestos con vistas a descubrir combinaciones que presenten
propiedades mejoradas en los sistemas biológicos.
Se propone que los fármacos que interaccionan con
sistemas complejos, tales como las células y tejidos humanos, es
probable que resulten más efectivos que cuando contienen múltiples
agentes activos que interaccionan con múltiples dianas moleculares.
Esta comprensión de cómo funcionan los fármacos forma una de las
bases de nuestra estrategia de cómo deberían diseñarse y
desarrollarse los mismos. Este nuevo enfoque promete proporcionar
mejoras drásticas en muchos tratamientos existentes y terapias
efectivas para enfermedades que en la actualidad son intratables,
particularmente enfermedades que requieren cambios modestos en
múltiples variables.
El paradigma actualmente dominante en la
industria farmacéutica es uno en el que se diseña un fármaco contra
una sola diana. Nuestro enfoque aplica nuestra comprensión de los
requisitos multivariable de diseño como pieza central de un marco
para el desarrollo sistemático de una nueva generación de
fármacos.
Tal como se ha indicado anteriormente, pueden
someterse a ensayo dentro de una combinación de acuerdo con la
invención una amplia variedad de compuestos. Éstos se discuten a
continuación en más detalle.
La clase prevalente de compuestos cribados según
la invención son las moléculas orgánicas pequeñas. Los compuestos
pueden ser sintéticos o de origen natural (por ejemplo
prostaglandinas, lectinas, metabolitos secundarios de origen
natural, hormonas, etc.). Las bibliotecas de grandes dimensiones de
dichas moléculas, en forma purificada, se encuentran disponibles en
las compañías farmacéuticas, compañías químicas y laboratorios
académicos; dichas bibliotecas también pueden sintetizarse
utilizando técnicas conocidas de química combinatorial. Los
compuestos pueden presentar o no actividad biológica conocida. Los
compuestos y bibliotecas combinatoriales de la invención pueden
sintetizarse a partir de esqueletos diversificables unidos a un
soporte sólido, por ejemplo compuestos y bibliotecas producidas a
partir de un esqueleto diversificable sintetizado a partir de un
molde epoxiol de base el ácido shiquímico o a partir de un molde
isonicotinamida de base piridina. Además de las moléculas orgánicas
pequeñas, otras moléculas que pueden cribarse en combinación de
acuerdo con la invención incluyen los biopolímeros, entre ellos los
oligonucleótidos (de ADN y de ARN); los polipéptidos (anticuerpos,
enzimas, receptores, ligandos, proteínas estructurales, análogos
mutantes de proteínas humanas y péptidos hormonales); los lípidos;
los carbohidratos y los polisacáridos. También pueden cribarse las
moléculas inorgánicas, así como los iones biológicamente activos,
tales como los iones metálicos, por ejemplo los iones de cobre,
hierro, plata, zinc, magnesio, manganeso, calcio y oro.
Los ensayos biológicos utilizados para detectar
los efectos de las combinaciones en la mayoría de las casos
presentarán una composición de múltiples componentes. En los
ensayos, el elemento de ensayo es una célula completa,
particularmente en los que el ensayo se basa en el fenotipo. Dicho
ensayo de células completas proporciona el conjunto completo de
interacciones moleculares complejas que es probable que forme la
base de la eficacia multivariable de un compuesto terapéutico.
Otros ensayos utilizan sistemas biológicos de orden superior, tales
como agrupaciones de células completas, tejidos y modelos animales
para el cribado combinatorial multivariable.
Cualquier ensayo biológico que resulta útil para
el ensayo de compuestos individuales se adapta fácilmente al
cribado combinatorial de la presente invención. Las mediciones en
los ensayos pueden incluir, por ejemplo, el transporte de un
compuesto a través de la membrana celular, el potencial eléctrico,
la generación de un potencial de acción, la proliferación celular,
la muerte celular, la descripción celular, la diferenciación
celular, la migración celular, la expresión génica o los niveles de
proteínas (medidos, por ejemplo, mediante la detección del ARNm, de
proteínas o de un gen testigo), la actividad enzimática, la
fosforilación, la metilación, la acetilación, la traslocación de una
proteína hacia el núcleo celular (u otro cambio en la localización
de las proteínas), la capacidad para resistir un patógeno (por
ejemplo un virus o una bacteria) y la capacidad para producir una
respuesta inmunológica. En los ensayos de organismos completos, el
comportamiento animal puede servir como testigo.
En un ejemplo, el ensayo es no destructivo (por
ejemplo un ensayo basado en células en el que puede obtenerse una
medida del efecto de un compuesto sin dañar a las células). Dicho
ensayo permite poner en práctica ensayos sobre concentraciones
múltiples de múltiples combinaciones por pocillo. Por ejemplo, se
añade un compuesto A a concentraciones crecientes a un pocillo y se
realiza una medición tras cada adición de compuesto. Tras alcanzar
una concentración deseada de compuesto A (determinada basándose en
una respuesta deseada del ensayo o en propiedades conocidas (por
ejemplo toxicidad, solubilidad) del compuesto), se añade el
compuesto B en concentraciones crecientes, realizando una medición
de ensayo tras cada adición. Este procedimiento puede repetirse
muchas veces en un solo pocillo, permitiendo poner en práctica
cientos, miles o incluso millones de ensayos en una sola placa.
Puede resultar deseable poner en práctica un
ensayo de comparación con vistas a identificar posibles efectos
secundarios de las combinaciones. Por ejemplo, las combinaciones de
compuestos que se criban para identificar su capacidad para
eliminar o reducir la proliferación de células tumorales pueden
cribarse de manera simultánea para identificar su efecto sobre
células normales, no tumorales. Las combinaciones de compuestos que
muestran la actividad deseada sobre las células tumorales y que
presentan poco o ningún efecto sobre las células normales son las
combinaciones preferidas. Las combinaciones que aparentemente
presentan un efecto no deseado sobre las células normales son menos
preferidas. Estas últimas combinaciones (o las combinaciones de
compuestos que presentan estructuras similares) pueden, sin embargo,
resultar efectivas a diferentes concentraciones y no deben
excluirse necesariamente de un estudio adicional.
Un procedimiento para detectar la actividad es el
ensayo de citotransferencia. En este procedimiento, las células se
siembran en los pocillos de una placa de ensayo. Las células
preferentemente son células adherentes, de manera que se unen y
crecen sobre el fondo del pocillo. Los compuestos se añaden
utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Por ejemplo,
la citotransferencia puede llevarse a cabo para detectar la
proliferación mediante la medición de la incorporación de BrdU. En
este ejemplo, las células se incuban durante un periodo de tiempo
prefijado (por ejemplo 4 a 72 horas). A continuación, el medio se
aspira utilizando, por ejemplo, un dispositivo robótico de
transferencia de líquido o un lector de ocho o dieciséis canales.
Las células se fijan mediante la adición de etanol al 70% y
solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC durante 1 hora. Se
extrae el fijador y las células se lavan una vez con PBS. Tras el
lavado con PBS, se añade a cada pocillo HCl 2 N con Tween 20 al
0,5% durante 20 minutos. El HCl se neutraliza con una solución
salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 10% en volumen de
NaOH 2 N. Esta solución se extrae, las células se lavan dos veces
con HBSS y seguidamente una vez con PBS que contiene albúmina de
suero bovino (BSA) al 0,5% y Tween 20 al 0,1%. Se extrae la solución
de lavado y se introduce el anticuerpo anti-BrdU a
una concentración de 0,5 \mug/ml de anticuerpo
anti-BrdU de ratón en PBS que contiene albúmina de
suero bovino (BSA) al 0,5% y Tween 20 al 0,1%. Esta solución de
anticuerpo también contiene un anticuerpo secundario (a una
dilución de 1:2.000) que reconoce el anticuerpo Ig de ratón (por
ejemplo el anticuerpo anti-BrdU de ratón); este
anticuerpo secundario se conjuga con el enzima peroxidasa de rábano
picante (HRP). Tras una hora de incubación, se extrae la solución de
anticuerpo y las células se lavan dos veces con PBS. Tras el
segundo lavado con PBS, se añade a cada pocillo el sustrato HRP
(que contiene luminol, peróxido de hidrógeno y un intensificador,
tal como para-yodofenol). A continuación, se
detecta la cantidad de luz en cada pocillo mediante la exposición
de película (colocando un trozo de película sobre la placa) o
leyendo la cantidad de luminiscencia de cada pocillo con un
luminómetro o lector de luminiscencia de placa bajo condiciones
estándar (por ejemplo 0,3 segundos de exposición por pocillo). La
cantidad de luz de cada pocillo indica la cantidad de síntesis de
ADN que se ha producido en ese pocillo. Una combinación deseable de
agentes es una en la que se produje una cantidad de luz
incrementada o reducida en comparación con un control. Por ejemplo,
una combinación que reduce la cantidad de luz estaría reduciendo la
tasa de síntesis de ADN y, de esta manera, resultaría efectivo en
el bloqueo o prevención de la proliferación de las células
tumorales. Alternativamente, un incremento en la cantidad de luz
producida representa un incremento en la síntesis de ADN. Por
ejemplo, se podrían utilizar células primarias en, por ejemplo, una
matriz ordenada combinatorial 200 X (en la que el componente fijo
bloquea la síntesis de ADN y, de esta manera, presenta un efecto
tóxico sobre las células). Mediante la utilización de esta matriz
ordenada, se podría cribar en busca de un segundo reactivo que
evitase este efecto tóxico sobre el primer compuesto. En una
diversidad de enfermedades de inmunodeficiencia, las células
inmunológicas no proliferan en respuesta ni a un aloantígeno ni a un
autoantígeno. Mediante la utilización de un cultivo de células
inmunológicas y el procedimiento anterior, se puede cribar para la
identificación de combinaciones de reactivos que estimulen la
proliferación de las células inmunológicas. Alternativamente, puede
cribarse para identificar agentes autoinmunológicos supresores. En
este ejemplo, una población de un tipo de célula inmunológica
(células B o células T que han sido aisladas a partir de células de
sangre periférica) resulta estimulada por aloantígenos o
autoantígenos. Las combinaciones de compuestos que inhiben
específicamente la proliferación en respuesta a los autoantígenos
pero no a los aloantígenos resultan útiles como candidatos para la
terapia autoinmunológica.
El ensayo anterior de citotransferencia se adapta
fácilmente a la detección de antígenos diferentes de BrdU. Además,
puede detectarse una diversidad de modificaciones
post-traduccionales dentro de las células. Por
ejemplo, resulta útil un anticuerpo contra la versión fosforilada
de la nucleolina o de la histona H3 para detectar las células que
se encuentran en la fase M (mitosis) del ciclo celular.
Las combinaciones de compuestos que provocan un
incremento en la nucleolina o en la histona H3 fosforiladas en el
ensayo de citotransferencia por lo tanto resultarían ser
combinaciones que bloquean las células en la fase M y son posibles
agentes anticáncer. También podría utilizarse un ensayo de
citotransferencia para detectar incrementos en la acetilación de,
por ejemplo, la histona H4 utilizando un anticuerpo que reconozca
específicamente la histona H4 acetilada. Los compuestos o
combinaciones de compuestos que provocan un incremento en la
hiperacetilación de la histona H4 también serían agentes
anticáncer.
En los ejemplos anteriores, el procedimiento
puede alterarse en el aspecto de que el medio se extrae y se añade
un fijador (etanol al 70% o formaldehído al 4% en PBS o en solución
tamponada con Tris). A continuación, se permeabilizan las membranas
celulares eliminando el fijador y añadiendo un agente de
permeabilización (por ejemplo Tween 20, triton
X-100 o metanol). Se extrae el agente de
permeabilización de membranas, seguidamente las células se lavan
con PBS o con solución salina tamponada con Tris y después se añade
el anticuerpo primario. Habitualmente no hay etapa de
desnaturalización en ácido al utilizar estas otras formas de
realización de la citotransferencia.
La medición de una propiedad del elemento de
ensayo puede llevarse a cabo utilizando un gen testigo. Este
procedimiento proporciona la ventaja de que, tras haber preparado
los reactivos (por ejemplo una línea celular transfectada
establemente), el ensayo es de fácil realización y requiere menos
tiempo que, por ejemplo, el ensayo de citotransferencia. Entre los
genes testigo se incluyen un elemento testigo, que codifica un
polipéptido que es fácilmente detectable debido a una propiedad
colorimétrica, fluorescente, luminiscente o enzimática, y un
elemento intensificador/promotor, que proporciona especificidad a
la expresión del gen testigo. Entre los elementos testigo se
incluyen, pero sin limitarse a ellos, luciferasa,
beta-lactamasa, proteína fluorescente verde,
proteína fluorescente azul, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT),
beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Entre los
elementos intensificadores/promotores se incluyen, por ejemplo, los
que responden a NFAT, p53, TGF-beta o a cualquier
otra ruta o estímulo de señalización para el que se conozca un
promotor/intensificador que responda.
Un gen testigo disponible comercialmente es
pNFkB, un gen testigo de la luciferasa que produce luz cuando NFkB
está activado (Stratagene, La Jolla, CA). Este gen testigo puede
transfectarse, establemente o transitoriamente, en una línea celular
de interés (por ejemplo, células de carcinoma pulmonar humano
A549). Con vistas a producir una línea celular transfectada
establemente, se mezcla el ADN del plásmido pNFkB se mezcla con un
plásmido de resistencia G418 y con un reactivo de transfección (por
ejemplo la lipofectamina, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) y
se añade a una placa de Petri de 10 cm que contiene A549 u otras
células unidas a la placa a una confluencia aproximada del 40%. La
placa con ADN/lipofectamina se incuba durante 4 a 16 horas a 37ºC
con 5% de CO_{2}. El medio se extrae, las células se lavan dos
veces con medio libre de suero y después con medio con suero fetal
bovino (FBS) al 10%. Se añade G418 a una dosis (aproximadamente 700
\mug/ml) que es justamente la suficiente para eliminar todas las
células en una transfección simulada (es decir, una transfección
sin un plásmido de resistencia G418). Las células se incuban a 37ºC
con 5% de CO_{2} durante 2 semanas, cambiando el medio cada tres
días. Los clones transfectados establemente habrán crecido para
formar colonias pequeñas transcurridas dos semanas; estos clones se
separan mediante la técnica de anillo y se propagan de manera
separada. Los clones de resistencia G418 se criban para identificar
el gen testigo de interés midiendo la cantidad producida de luz en
lisados celulares con o sin presencia de NFkB transfectados
transitoriamente. Tras identificar un clon con transfección estable
de pNFkB, se utiliza para el cribado mediante el cultivo de las
células en la placa de ensayo.
Para un ensayo de transfección transitoria, el
ADN del plásmido pNFkB se mezcla con un agente de transfección, se
añade a un placa de Petri de 10 cm que contiene, por ejemplo,
células A549 unidas a la placa a una confluencia aproximada del 70%.
La placa con ADN/lipofectamina se incuba durante 4 a 16 horas a
37ºC con 5% de CO_{2}. Se extrae el medio, las células se lavan
dos veces con medio libre de suero y después se añade medio con FBS
al 10%. Las células se incuban a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 24
horas, después se siembran en placas de ensayo para el cribado.
El gen testigo puede introducirse en las células
utilizando otras técnicas, incluyendo, aunque sin limitarse a
ellas, la infección viral o retroviral, la inyección en bolo y la
incorporación celular de ADN desnudo. Un experto en la materia
reconocerá que cualquier procedimiento de introducción del gen
testigo en las células objeto de ensayo será compatible con los
procedimientos de cribado descritos en la presente memoria.
Tras encontrarse disponibles las células con el
gen testigo, se siembran en placas de ensayo (de 96 pocillos, de
384 pocillos, etc.) con una pipeta, pipeta multicanal, rellenador
Multidrop de placas de 384 pocillos (Labsystems, Franklin, MA) u
otro dispositivo de manipulación de líquidos. Los compuestos se
añaden para formar combinaciones mediante uno de entre varios
procedimientos. Tras 4 a 72 horas, se extrae el medio, las células
se lavan dos veces con HBSS, se añade un tampón de lisis (ver
Stockwell et al., J. Amer. Chem. Soc.
121:10662-10663, 1999), se añade ATP/luciferina y se
mide la luminiscencia con un lector de placas o con un luminómetro
(por ejemplo LJL BioSystems Inc., Analyst AD, Sunnyvale, CA).
En otro ejemplo, se utiliza la transferencia de
energía de resonancia fluorescente (FRET) para detectar y medir la
interacción de dos proteínas de interés. En el presente ejemplo, se
fusionan la primera y segunda proteínas con proteína fluorescente
verde (GFP) y proteína fluorescente azul (BFP), respectivamente,
utilizando procedimientos estándares de biología molecular. Los
constructos de ADN que codifican las dos proteínas de fusión se
coexpresan en las células de mamífero, de levadura, en gusanos o en
otras células u organismos utilizando técnicas de transfección
descritas anteriormente u otros procedimientos comparables. Se
añaden combinaciones de compuestos. La placa se coloca sobre un
lector de placas y se mide la fluorescencia de la manera siguiente.
El fluoróforo donante (es decir, BFP) se excita y se mide la
emisión del fluoróforo aceptor (es decir, GFP). La proximidad
incrementada de las dos proteínas resultará en un incremento en la
emisión del fluoróforo aceptor. De esta manera, se identifica
mediante un incremento en la fluorescencia del fluoróforo aceptor,
una combinación de compuestos que provoca que las dos proteínas de
interés se encuentren próximas entre sí.
Por ejemplo, se obtienen los vectores de
expresión que contienen Smad2 y Smad4. El ADNc para GFP se fusiona
con el extremo 5' de Smad2 y el ADNc de BFP se fusiona con el
extremo 5' de Smad4. Estos vectores de expresión se transfectan en
células de mamífero de manera estable o transitoria, las células se
tratan con combinaciones de compuestos y la placa se irradia con
luz que excita BFP pero no GFP. Se mide la fluorescencia de GFP
(por ejemplo la luz de 512 nm) y se identifican las combinaciones de
compuestos que provocan un incremento en la emisión lumínica a esta
longitud de onda. Dichas combinaciones provocan que Smad2 y Smad4
se sitúen próximos entre sí y pueden activar la señalización de
TGF-beta y por lo tanto pueden resultar útiles en el
tratamiento de la mucositis en la quimioterapia del cáncer y las
enfermedades autoinmunológicas.
Otra lectura de un cambio en una propiedad de un
elemento de ensayo utiliza los colorantes indicadores de calcio
fluorescente, tales como fluo-3 (Molecular Probes,
Eugene WA; http:/www.molecularprobes.com), fura-2 e
indo-1. El fluo-3 es esencialmente
no fluorescente a menos que se encuentre unido a Ca^{2+} y muestra
un rendimiento cuántico a concentraciones saturantes de Ca^{2+}
de \sim0,14. Por lo tanto, el derivado acetoximetil éster intacto
de fluo-3 AM (fluo-3 AM) también es
no fluorescente. La emisión fluorescente verde (\sim525 nm) de
fluo-3 unido a Ca^{2+} se detecta
convencionalmente utilizando conjuntos de filtros ópticos diseñados
para la fluoresceína (FITC). De acuerdo con el fabricante, el
fluo-3 muestra una intensificación de la
fluorescencia dependiente de Ca^{2+} de un factor de 100.
Los pocillos se siembran con células, se añade
fluo-3 a las células siguiendo las instrucciones
del fabricante, se añaden los compuestos y se mide la fluorescencia
utilizando un lector de placas. Las combinaciones de compuestos que
resultan en un incremento de fluorescencia (pero que no son
fluorescentes ellas mismas) de esta manera son causantes de un
incremento en la concentración de calcio intracelular.
Otro ensayo utiliza la microscopía de
fluorescencia convencional para detectar un cambio en el nivel o
situación de la fluorescencia en las células que han entrado en
contacto con combinaciones de compuestos. En un ejemplo, se utiliza
una línea celular transfectada establemente que expresa un Smad2
etiquetado con GFP. Se siembran los pocillos con células, se añaden
los compuestos y se incuban durante 1 hora y se utiliza un
microscopio de fluorescencia con una platina automatizada para
obtener imágenes de las células en cada pocillo. Se identifican las
combinaciones de compuestos que provocan un cambio en la situación
de la proteína etiquetada. Por ejemplo, pueden identificarse de esta
manera combinaciones que provocan que GFP-Smad2 se
transloque desde fuera del núcleo hasta el interior del mismo.
Estas combinaciones podrían estar activando la señalización de
TGF-beta y, de esta manera, podrían resultar útiles
en el tratamiento del cáncer, de las enfermedades autoinmunológicas
y de la mucositis.
Otro ensayo para la detección de compuestos que,
conjuntamente, produce una alteración en un elemento de ensayo es
el perfilado de expresión. En el presente ejemplo, se siembran
pocillos con células, se añaden las combinaciones de compuestos y
las células se incuban durante 2 a 24 horas. Se recolecta ARN poli
A de cada pocillo utilizando procedimientos estándar. El ARN se
transcribe inversamente en ADNc utilizando procedimientos estándar,
con la excepción de que se incorpora un colorante fluorescente (por
ejemplo Cy3-dUTP) durante la transcripción inversa.
El ADNc marcado con Cy3 se mezcla con ADNc marcado con Cy5
procedente de células no tratadas y se hibrida a un microdespliegue
de ADN (por ejemplo un microdespliegue de ADN disponible
comercialmente de Affymetrix, Santa Clara, CA o de Incyte, Palo
Alto, CA, revisión en Nature Genet. Suppl. 21, enero de 1999
(incorporado en el presente documento como referencia)). El nivel
relativo de fluorescencia de Cy3 y de Cy5 en cada punto en el
microdespliegue indica dónde se ha producido un cambio en la
expresión de cada gen. El procedimiento se utiliza para identificar
combinaciones que provocan un cambio deseado en la expresión génica,
tales como la reversión de un perfil de expresión génica de una
enfermedad a un perfil sano. Alternativamente, se determina el
perfil de expresión provocado por una molécula de señalización
dada, por ejemplo la insulina, y se descubren combinaciones de
compuestos que provocan que aparezca el perfil de la insulina,
indicando que estas combinaciones imitan los efectos de la
misma.
Otro bioensayo que es compatible con los ensayos
de cribado descritos en la presente memoria utiliza un animal
completo. En un ejemplo, se introduce en pocillos individuales el
nemátodo C. elegans (preferentemente más de un nemátodo por
pocillo) y se detecta la actividad de los compuestos mediante la
detección de un cambio en una propiedad del organismo. Por ejemplo,
el nemátodo puede modificarse para que exprese proteína fluorescente
verde en un estadio específico de su ciclo de vida o únicamente
durante el estadio de juvenil infectivo. Se utiliza un sistema
automatizado de microscopía para obtener imágenes de los nemátodos
en cada pocillo y para medir la proteína fluorescente verde o para
detectar los cambios morfológicos en los gusanos provocados por
combinaciones particulares de compuestos.
Otro ensayo de animal completo utiliza animales
grandes, tales como ratones desnudos que presentan tumores sobre la
piel o cerca de la superficie de la piel. Las combinaciones de
compuestos pueden ser mezclas en DMSO que se frotan para que
penetren en la piel, penetran en la piel y alcanzan el tumor.
Alternativamente, los compuestos pueden administrarse
intravenosamente, intramuscularmente u oralmente. Otros
procedimientos de organismo completo de detección de la actividad
pueden incluir la utilización de pequeños renacuajos derivados de
oocitos fertilizados de Xenopus que se desarrollan en un
medio definido, cultivos organotípicos (explantes procedentes de
ratones o de otros animales) en los que el órgano puede cultivarse
durante un periodo de tiempo en un medio definido, y huevos
(fertilizados o no) de una diversidad de animales. Otro ensayo mide
la tensión del tejido cardíaco o de tejido muscular estirado entre
dos muelles; las combinaciones de compuestos que modulan la
contracción resultarían en una tensión incrementada o reducida de
dichos muelles.
Aunque algunos ensayos pueden llevarse a cabo sin
marcaje de ninguna de las entidades combinadas, en algunas formas
de realización una o más de las entidades combinadas se marca de
manera que el efecto de la combinación sobre el elemento de ensayo
pueda ser detectado o medido. Puede utilizarse cualquiera de entre
una amplia diversidad de marcajes conocidos, por ejemplo técnicas
que se han utilizado ampliamente en bioquímica en la cromatografía
de afinidad de proteínas utilizando las interacciones
biotina-estreptavidina o proteínas etiquetadas con
hexahistidina (Janknect et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:8972, 1991; Wilcheck et al., Methods in Enzymology,
Wilcheck, M.; Bayer, E.A., editores, Academic Press Inc., San
Diego, páginas 123-129, 1990).
Los procedimientos de la invención pueden
utilizar sistemas robóticos existentes, placas madre de 96
pocillos, de 384 pocillos, de 1.536 pocillos u otras placas madre
de alta densidad y placas de 96, 384 ó 1.536 pocillos u otras placas
de ensayo de alta densidad, con las que resulta posible cribar
hasta 150.000 compuestos o más por semana. La automatización de esta
tecnología puede adaptarse de acuerdo con la invención para cribar
combinaciones de moléculas. Los procedimientos de la invención
también pueden utilizar sistemas microfluídicos realizados mediante
fotolitografía convencional o mediante métodos no convencionales
(tales como la litografía blanda o la litografía óptica de campo
cercano) con vistas a miniaturizar el procedimiento. Los
procedimientos de la invención también pueden utilizar la impresión
por inyección de tinta o las tecnologías de impresión compuesta.
Además, los procedimientos de la invención pueden utilizar el
trabajo de un técnico adiestrado para conseguir los mismos
resultados y rendimiento que los sistemas robóticos. Las
combinaciones de compuestos pueden prepararse previamente a su
entrada en contacto con el elemento de ensayo o pueden prepararse
in situ en presencia del elemento de ensayo. Estos
procedimientos de sembrado de placa se describen en más detalle a
continuación.
Los compuestos pueden sembrarse (es decir,
añadirse a las células sometidas a ensayo) de manera manual. En un
ejemplo, los compuestos químicos purificados se combinan manualmente
y se someten a ensayo en una matriz ordenada combinatorial 7X7. Los
compuestos, que en este caso incluyen siete compuestos, se
encuentran en una placa madre. Los compuesto se combinan en una
placa de ensayo. El operador siembra la placa con un primer
compuesto (o con una pluralidad de compuestos) desde un pocillo de
la placa madre en una fila de la placa de ensayo y después siembra
una columna en la placa de ensayo. Este procedimiento se repite con
un segundo pocillo de la placa madre, pero sembrando la placa de
ensayo en la fila y en la columna siguientes a las sembradas con el
primer compuesto. Este procedimiento se repite hasta que se ha
sembrado la placa con el conjunto completo de combinaciones.
Existen numerosos procedimientos para añadir
compuestos a pocillos con vistas a formar matrices ordenadas
combinatoriales y un experto en la materia reconocerá que los
ejemplos siguientes se presentan a título ilustrativo y en ningún
modo son limitativos de la invención.
En un ejemplo de sembrado de placas con un robot,
se utiliza un sistema robótico de transferencia de líquidos. Los
sistemas de transferencia se encuentran disponibles comercialmente
en, por ejemplo, Beckman Coulter (Fullerton, CA), Tecan (Research
Triangle Park, NC) o Zymark (Hopkinton, MA). El sistema robótico
siembra la placa con volúmenes específicos del primer conjunto de
compuestos en cada pocillo de una fila dada, de manera que la fila
1 presentará el mismo compuesto, la fila 2 presentará el mismo
compuesto, etc. A continuación, el dispositivo de transferencia de
líquido sembrará la placa con el mismo conjunto de compuestos a lo
largo de las columnas, de manera que cada columna reciba el mismo
compuesto (aunque diferentes columnas recibirán diferentes
compuestos). Los sistemas de transferencia pueden adaptarse para
transferir volúmenes pequeños (por ejemplo 1 nl).
Otro procedimiento para la transferencia efectiva
utiliza tecnología de impresión por inyección de tinta (Gordon
et al., J. Med. Chem. 13:1385-1401, 1994;
Lemmo et al., Curr. Opin. Biotechnol.
9:615-617, 1998). Las impresoras de chorro de tinta
extraen desde una pluralidad de vasos que contienen los compuestos
de ensayo; cada compuesto procedente de un pocillo de origen se
imprime o se inyecta sobre la superficie en cada fila y columna
individuales para cada compuesto. Tal como se ha descrito
anteriormente, el compuesto siguiente se imprime sobre la siguiente
fila y sobre la siguiente columna, y este procedimiento se repite
hasta que la matriz completa ha sido sembrada con combinaciones de
compuestos.
Todavía otro procedimiento para añadir compuestos
a una placa de ensayo utiliza un dispositivo de microdespliegue por
aplicación de puntos, desarrollado por Patrick Brown en la
Universidad de Stanford para la aplicación de puntos de ADN. Este
dispositivo utiliza una cabezal de impresión de ocho agujas y ocho
cabezas de aguja lineales que se sumergen en una placa madre y se
imprimen a lo largo de cada una de las filas. Posteriormente, la
placa se hace girar noventa grados o se hace girar noventa grados el
cabezal de impresión; a continuación el cabezal de impresión
imprime a lo largo de las columnas. Se puede variar el tamaño del
cabezal de impresión utilizando, por ejemplo, dos, cuatro o
dieciséis cabezales de impresión para placas estándar de 384
pocillos y números más elevados para placas de densidad más
elevada.
Todavía otro procedimiento para añadir compuestos
a una placa de ensayo utiliza un instrumento disponible
comercialmente llamado Hydra (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA),
que puede estar dotado de 384 jeringas separadas que son capaces de
depositar un volumen conocido desde una placa madre estándar de
compuestos.
Un procedimiento alternativo para sembrar la
placa con los compuestos de ensayo utiliza sistemas microfluídicos,
tales como los disponibles comercialmente de Caliper Technologies
(Mountain View, CA) y aplicar directamente el sistema para crear
una matriz ordenada que crearía esta combinación. En este caso, las
matrices ordenadas de combinaciones a microescala se crean
utilizando flujo capilar para distribuir las soluciones de
compuesto en los puntos de intersección en una matriz.
El experto en la materia reconocerá que puede
adaptarse cualquier configuración de placa a los procedimientos de
cribado de la invención. Por ejemplo, una placa cuadrada de 16X16
presentaría 256 pocillos en lugar de los 384 pocillos de una placa
de 16X24. Esto permitiría que pudiese adaptarse cualquier sistema
de adición de líquido en el que el líquido únicamente se añade a lo
largo de las filas o únicamente a lo largo de las columnas debido a
que se podría simplemente hacer girar noventa grados la placa
cuadrada y permitir la adición en la otra dirección. También podría
incorporarse en este diseño, un soporte de placa cuadrada que
presentase las dimensiones o estructura de una placa estándar de
microtitulación de 96 pocillos o de 384 pocillos de manera que la
placa microcuadrada adaptada encajaría con cualquier sistema de
manipulación de líquidos para placas.
Otro procedimiento para proporcionar los
compuestos o elementos que son objeto de ensayo en combinación es
proporcionarlos en forma sólida y no en forma líquida, por ejemplo
en forma de pequeñas cantidades de polvos secos. De esta manera,
pueden mezclarse dos componentes secos (o un componente húmedo y un
componente seco) y después añadirse la combinación a las células en
el medio (en el que las entidades combinadas son solubles). Entre
los compuestos sólidos se incluyen perlas procedentes de una
síntesis combinatorial sobre las que se añade un compuesto
diferente. Por ejemplo, las perlas se añaden con un dispositivo
recogedor de perlas. En un ejemplo, las perlas son magnéticas y se
añaden utilizando un imán.
En los ensayos de alto rendimiento de la
aplicación robótica de la invención, debe ser posible tratar cada
pocillo de manera independiente y preferentemente resulta posible
extraer volúmenes tanto grandes (hasta 100 \mul) como pequeños
(hasta de tan solo 1 nl) de cada compuesto de una placa madre. A
continuación se describe una plataforma robótica ejemplar para
poner en práctica los ensayos de cribado combinatorial de la
invención.
Se crea una plataforma robótica de dos
estaciones. La primera estación está dotada de un brazo robótico
simple XYZ con un dispositivo de aguja unido para transferencias,
tal como se encuentra disponible a través de VWR (nº de cat.
62409-608). Una placa madre y una placa de ensayo
entran en la estación y el brazo robótico hace descender las agujas
hasta el interior de la placa madre y transfiere estas agujas hasta
el interior de la placa de ensayo, administrando de esta manera 1 a
1.000 nl, dependiendo del tamaño de la aguja (más típicamente se
administran 50 nl). Diferentes dispositivos de aguja permiten la
transferencia de diferentes combinaciones de compuestos, tal como se
ha descrito anteriormente en el ejemplo. La segunda estación del
robot es un dispensador piezoeléctrico capaz de extraer grandes
volúmenes (hasta 10 microlitros) de un pocillo de la placa madre
con un solo compuesto y después dispensar pequeños volúmenes en cada
pocillo de una placa de ensayo. Por ejemplo, el sistema Ivek
Digispense 2000 (http://www.ivek.com/digi2000.html) presenta una
resolución de 10 nl y debería ser suficiente para este
propósito.
Si un reactivo de combinación que se encuentra
presente en la totalidad de la placa no es un compuesto (es decir,
si es alguna forma de radiación), la placa que contiene las células
y el compuesto o compuestos añadidos puede pasarse por dicha fuente
de radiación, completando de esta manera la formación de la
combinación. Entre otras formas de reactivos de combinación que no
son compuestos se incluyen, por ejemplo, la presión hiperbárica y
el calor.
Algunos reactivos que no son compuestos pueden
variarse de una manera similar a la adición de un compuesto. Por
ejemplo, para alterar el pH, se añaden diferentes cantidades de
base o de ácido a los pocillos. De manera similar, pueden añadirse
iones utilizando cualquier procedimiento que resulte aplicable para
la adición de compuestos.
Para las bibliotecas químicas pequeñas (<1.000
compuestos), pueden someterse a ensayo todas las combinaciones
binarias (hasta medio millón de combinaciones) y terciarias (hasta
varios cientos de millones de combinaciones) utilizando los
sistemas descritos en la presente memoria.
El carácter exponencial de las combinaciones
genera rápidamente bibliotecas efectivas para la identificación de
terapias multivariable. Las dimensiones de las bibliotecas
terapéuticas multivariable llega a igualar rápidamente, y a
expandirse más allá de cualquier biblioteca disponible
convencionalmente, sea diversa o no diversa. Una biblioteca de 200
compuestos en combinaciones binarias genera una biblioteca
terapéutica multivariable de 19.900 combinaciones, mayor que la
biblioteca de productos naturales utilizada recientemente para
identificar un nuevo compuesto que afecta a la división celular
(Mayer et al., Science 286:971-974, 1999).
Una biblioteca de 300 compuestos en combinaciones ternarias genera
aproximadamente 4,5 millones de combinaciones distintas de
entidades para una biblioteca terapéutica multivariable, más grande
que las bibliotecas de química combinatorial generadas en la
actualidad y potencialmente con una diversidad mayor.
Una biblioteca diversa inicialmente puede
someterse a ensayo individualmente aplicando metodologías estándar.
Los compuestos se criban en un ensayo biológico y se ordenan según
su actividad. Los compuestos más activos (por ejemplo los veinte
más activos o los mil más activos, dependiendo de la cantidad de
espacio combinatorial que es objeto de ensayo) en la biblioteca
seguidamente se someten a ensayo en combinaciones binarias y
terciarias. Si se desea, estas combinaciones pueden ordenarse
nuevamente según actividad y repetirse el procedimiento para las
combinaciones de cuatro direcciones, las combinaciones de 5
direcciones, etc. hasta identificar un número deseado de
combinaciones efectivas.
La utilización de algoritmos genéticos
proporciona otro procedimiento para identificar combinaciones de
agentes con una actividad biológica deseada que es diferente de la
de cada agente por separado. En el presente procedimiento se asigna
un código de barras único a cada agente individual, que puede ser
cualquier serie de números, de letras o de otros símbolos. En una
forma de realización preferente, el código de barras es un código
binario (ceros y unos). Se selecciona un número especificado (N, el
"tamaño de la población") de combinaciones binarias
(aleatoriamente o basándose en alguna otra característica) del
total de posibles combinaciones binarias y se determina la actividad
de cada una de estas combinaciones. Se seleccionan los X elementos
más activos de la población (donde X es inferior a N). Se forman N
nuevas combinaciones a partir de las X combinaciones activas
utilizando una serie de operadores, que incluyen: (i) replicación
(la combinación original simplemente se selecciona nuevamente),
(ii) mutación (un trozo del código de barras se convierte en un
valor diferente), y (iii) recombinación (dos códigos de barra se
rompen cada uno en algún punto intermedio y los extremos opuestos se
unen para crear dos nuevos códigos de barra híbridos. Este
procedimiento de selección, amplificación, mutación y recombinación
se repite en numerosos ciclos y la actividad de cada combinación de
agentes se determina al final de cada ciclo. Esto proporciona un
procedimiento para someter a ensayo un número limitado de
combinaciones y aún de esta manera descubrir combinaciones de
agentes altamente efectivas.
Un procedimiento para optimizar los parámetros
del algoritmo genético (u otro algoritmo) es el siguiente: se
seleccionan para su estudio C combinaciones de N agentes. Se
determina la actividad de cada elemento del conjunto completo de
(N!)/((N-C)!(C!)) combinaciones. Además, también
pueden determinarse todas las combinaciones de orden inferior. Con
este conjunto completo de datos sobre actividades resulta posible
evaluar la tasa de éxito y la eficiencia de diversos algoritmos o de
diversas permutaciones de un solo algoritmo sin necesidad de poner
en práctica trabajo "húmedo" de laboratorio adicional. Es
decir, pueden compararse todas las estrategias de búsqueda de
combinaciones activas "in silico" y compararse su
rendimiento relativo.
Se mantienen dos tipos de soluciones madre. Cada
compuesto se deposita en ambos formatos madre. El primer formato de
solución madre consiste en compuestos disueltos en 100 microlitros
de dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 4 mM y
almacenados en placas de polipropileno de 384 pocillos (Matrix
Technologies). El segundo tipo de solución madre consiste en
compuestos disueltos en 1.500 microlitros de DMSO a una
concentración final de 4 mM y almacenados en placas de polipropileno
de 96 pocillos profundos. Se llevan a cabo copias múltiples de cada
tipo de placa. Una copia de las placas madre se almacena a -20ºC
para su utilización rutinaria y se almacenan copias de seguridad a
-80ºC para su almacenamiento a largo plazo.
Se utilizan tres tipos de placas de ensayo. El
tamaño de las agujas en los dispositivos de transferencia de aguja
descritos anteriormente se adapta para que se ajuste a cada tamaño
de placa de ensayo.
1) placas comerciales de 384 pocillos (por
ejemplo placas tratadas estériles de cultivo celular de
poliestireno blanco opaco NalgeNunc con tapa, nº de cat.
164610).
2) placas comerciales de 1.536 pocillos (por
ejemplo Greiner o Corning).
3) placas preparadas especialmente de 1.536 o de
6.144 pocillos (realizadas en polidimetilsiloxano, Dow Corning) y
moldes delran y bandejas Omni.
Se utiliza Visual Basic de Microsoft o lenguaje
de programación, utilizando técnicas convencionales de
programación, para escribir un programa informático para controlar
los instrumentos descritos anteriormente. El programa informático
permite que el instrumento lea el código de barras de una placa
madre o de una placa de ensayo, encuentre las placas en el panel de
ensayo y transfiera el volumen apropiado del compuesto correcto al
pocillo de ensayo correcto. De esta manera, se determinan o
seleccionan previamente todas las combinaciones que serán objeto de
cribado, y el instrumento lleva a cabo el cribado de la combinación
en un formato automatizado, requiriendo únicamente intervenciones
simples del operador, tales como colocar placas especificadas sobre
el panel de ensayo y retirar placas especificadas del panel de
ensayo para introducirlas en un incubador.
Se utiliza una impresora de código de barras,
utilizando técnicas estándar, para generar un número de
identificación único para cada placa, imprimir el código de barras
sobre una etiqueta y pegar la etiqueta sobre la placa de ensayo o
placa madre. El programa informático registra la identidad de cada
compuesto en cada pocillo de cada placa de ensayo y de cada placa
madre. Un lector de código de barras ligado al panel de ensayo
escanea cada placa a medida que entra y abandona el panel de
ensayo.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título
ilustrativo y no pretenden ser limitativos en modo alguno.
La figura 1 es un diagrama conceptual que
demuestra cómo dos reactivos diferentes pueden actuar en sinergia
dentro de una célula, en la que los reactivos se unen a diferentes
dianas dentro de la misma célula. En dicha figura, el compuesto A 10
y el compuesto B 12 atraviesan la membrana plasmática 14 y se
difunden libremente en la región citosólica de una célula de
mamífero. El compuesto A se une a la proteína X 16, que es una
quinasa, inhibiendo la actividad de dicha quinasa. La quinasa X
normalmente inactiva el factor de transcripción Y 18 al añadir un
grupo fosfato a Y. Después de la inhibición de la quinasa X por
parte del compuesto A, se activa el factor de transcripción X e Y se
trasloca hacia el interior del núcleo, uniéndose fuertemente al ADN
en la región intensificadora de un gen terapéutico, tal como el de
la insulina. Sin embargo, el factor de transcripción Y es incapaz
de activar la expresión de la insulina sin la presencia de un
segundo factor de transcripción Z 20. En la figura, sin embargo, el
compuesto B se une al factor de transcripción Z, eliminando un
bucle de autoinhibición en este factor de transcripción, provocando
de esta manera que este factor de transcripción Z se trastoque
hacia el interior del núcleo y se una al factor de transcripción Y.
Conjuntamente, Y y Z, pero ninguno de ellos por separado, permiten
la activación de la expresión del gen terapéutico, de la
insulina.
La figura 2 es un diagrama conceptual que
demuestra cómo dos reactivos diferentes pueden actuar en sinergia
dentro de un organismo, en el que los reactivos se unen a dianas en
diferentes células o tejidos. En esta figura, el compuesto A 50 se
difunde hacia el interior de células beta del islote 52 del
páncreas 54. El compuesto A provoca que un gen terapéutico que
codifica la insulina 56 se exprese en estas células. Sin embargo, la
insulina no es efectiva sin la presencia del receptor de la
insulina en los adipocitos diana en el tejido adiposo.
Simultáneamente, el compuesto B se difunde hacia el interior de los
adipocitos 58 en el tejido adiposo 60 y activa la expresión de los
receptores de insulina 62 en estas células. Conjuntamente A y B,
pero ninguno de los dos por separado, pueden restaurar la actividad
de la insulina en este individuo.
La figura 3 es un ejemplo de los datos
experimentales que se obtendrían en un cribado combinatorial del
tipo descrito en la presente solicitud de patente. Se muestran los
resultados de cinco placas diferentes de 384 pocillos. Se muestran
los resultados en formato de placa, en la que hay 16 filas
etiquetas de A a P, y 24 columnas, numeradas de 1 a 24. Se muestra
para cada pocillo el nivel de actividad, así como un número, donde 1
indica actividad basal (ningún efecto) y 5 indica una combinación
activa. La placa uno muestra la actividad de los compuestos 1 a 384
sometidos a ensayo con 4 \mug/ml en un ensayo de
citotransferencia con bromodesoxiuridina para detectar actividad de
detención del ciclo celular en células de carcinoma humano A549
(descritas después). La placa dos muestra la actividad de los
compuestos 1 a 384 sometidos a ensayo con 2 \mug/ml en el mismo
ensayo. La placa tres muestra la actividad de los compuestos 385 a
768 sometidos a ensayo con 4 \mug/ml en el mismo ensayo. La placa
cuatro muestra la actividad de los compuestos 385 a 768 sometidos a
ensayo con 2 \mug/ml en el mismo ensayo. Nótese que en las placas
1 a 4, ninguno de los compuestos muestra ninguna actividad. La
placa cinco muestra la actividad de 384 combinaciones binarias de
los compuestos 1 a 768 al someterlos a ensayo con 2 \mug/ml (es
decir, se añadieron simultáneamente los compuestos 1 a 384 y los
compuestos 385 a 768 a la placa de ensayo a una concentración de 2
\mug/ml de cada compuesto, creando 384 combinaciones binarias
aleatorias diferentes). Nótese asimismo que el pocillo A1 muestra
actividad. Esto significa que el compuesto 1 (en el pocillo A1 de la
placa con los compuestos 1 a 384) por sí mismo no presentaba
actividad y el compuesto 385 (en el pocillo A1 de la placa con los
compuestos 385 a 768) por sí mismo no presentaba actividad, pero
que conjuntamente los compuestos 1 y 385 actúan en sinergia creando
una combinación activa.
La figura 4 es una ilustración de un
procedimiento para poner en práctica el cribado combinatorial
utilizando tecnología disponible comercialmente en la actualidad.
Se obtuvieron células de carcinoma pulmonar humano A549 de la
American Type Culture Collection (ATCC, número de catálogo CCL185)
y se cultivaron a 37ºC con 5% de CO_{2} en medio Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM) con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G
sódica, 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina y glutamato 2 mM
(GibcoBRL, Rockville, MD) (denominado medio al 10%). Se sembraron
cuatro mil células en cada pocillo de una placa blanca opaca de 384
pocillos 100 (Nalge Nunc International, Rochester, NY) utilizando
un dispensador de líquidos Multidrop 384 110 (Labsystems Microplate
Instrumentation Division, Franklin, MA). Las células se sembraron
en 40 \mul de medio que contenía FBS al 10%.
Tras 16 horas a 37ºC con 5% de CO_{2}, se
añadieron a cada pocillo 10 \mul de una solución madre 50 \muM
de un compuesto de interés en medio al 10%, enrasando el volumen
total del pocillo a 40 \mul y la concentración final de este
compuesto a 10 \muM. Antes o inmediatamente después, o varias
horas o días después, se añadió un segundo conjunto de compuestos
mediante inmersión de pequeñas agujas de una matriz ordenada de
agujas 130 en cada pocillo de una placa madre 140 ó 150 y después en
cada pocillo de una placa de ensayo 100. Resulta suficiente un
dispositivo 130 de transferencia con aguja Matrix Technologies (384
ó 96 agujas) (números de catálogo 350500130 y 350510203). Este
procedimiento en dos etapas permite someter a ensayo un compuesto
específico frente a un gran número de otros compuestos en muchas
combinaciones binarias. Resulta necesaria también una placa en la
que se someta a ensayo el conjunto de compuestos transferidos con
aguja en ausencia del compuesto original (el compuesto presente en
todos los pocillos) con vistas a determinar si se ha conseguido una
nueva propiedad con la combinación.
También puede utilizarse un procedimiento
diferente para proporcionar combinaciones de compuestos para poner
en contacto con el elemento de ensayo. Por ejemplo, en lugar de
mantener un compuesto fijo en todas las combinaciones binarias, tal
como se ha descrito anteriormente, resulta posible transferir con
aguja un conjunto de compuestos de tal manera que se consigan todas
las combinaciones binarias de dicho conjunto. Se transfirió un
conjunto de 16 compuestos con aguja desde la placa madre 140 a las
16 filas de la placa de ensayo 100 de 384 pocillos. Seguidamente se
transfirió el mismo conjunto de 16 compuestos a las 16 columnas de
la misma placa de ensayo, proporcionando una matriz de 256 pocillos
en diferentes combinaciones binarias.
En cada uno de los ejemplos anteriores (o en
versiones análogas de los mismos), tras añadir todos los compuestos
deseados, la placa de ensayo que contiene las células A549 y los
compuestos se incuba durante 48 horas a 37ºC con 5% de dióxido de
carbono en un incubador 120. Al final de este periodo, se añaden 10
\mul de BrdU mediante la utilización de un Multidrop 384 110
desde una solución madre 50 \muM en medio (preparada a partir de
solución madre 10 mM en PBS, pH 7,4) hasta una concentración final
de BrdU de 10 \muM. Las células se incuban durante 12 a 16 horas
más en un incubador (120) a 37ºC con 5% de CO_{2}. Se extrae el
sobrenadante de cada pocillo con una varilla de 24 canales (V&P
Scientific), utilizado en todo el protocolo de aspiración, unida a
una fuente de vacío doméstica. Las células se fijan con 50 \mul
de etanol al 70%/PBS al 30% frío (4C), se incuba durante una hora
en hielo, se lava con 90 \mul de PBS (4C) frío y seguidamente se
añaden 25 \mul de HCl 2 M/Tween 20 al 0,5%/ddH_{2}O. Las
células se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos,
seguidamente se lavan con 90 \mul al 10% 2M NaOH / 90% Hank's
Balanced Salt Solution (HBSS, GibcoBRL) seguidamente se lavan con 90
\mul de HBSS y una vez con 75 \mul de PBSTB (PBS al 0,1%,
GibcoBRL), albúmina de suero bovino al 0,5%
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A continuación se
añaden se añaden 20 \mul de solución de anticuerpo que contiene
0,5 \mug/ml de anticuerpo anti-BrdU de ratón
(dilución 1:1.000 de la solución madre, BD
Biosciences-PharMingen San Diego, CA) y una dilución
1:2.000 de anticuerpo Ig antiratón conjugado con HRP (Amersham
Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) en PBSTB. Las células se
incuban durante una hora a temperatura ambiente, se lavan dos veces
con 90 \mul de PBS y después se añaden 20 \mul de solución de
sustrato HRP a cada pocillo. La solución de sustrato HRP se obtiene
mezclando volúmenes iguales de las soluciones 1 y 2 del kit de
detección de Amersham ECL. La placa se introduce en un lector de
placas LJL Biosystems Inc. (Sunnyvale, CA) Analyst AD 160 y se
detecta la luminiscencia en cada pocillo durante 0,3 segundos. A
continuación se compara la actividad de las combinaciones con la
actividad de los agentes individuales por separado a la
concentración original y a N veces la concentración original, donde
N es igual al número de compuestos activos descubiertos en el
cribado. Si una combinación muestra una actividad mayor que la
actividad de cada uno de los agentes individuales por sí solos,
tanto a la concentración original como a N veces la concentración
original, entonces se ha observado un efecto de sinergia. Aunque no
se observe sinergia, una combinación puede presentar propiedades
ventajosas (por ejemplo menores efectos secundarios) en comparación
con los componentes individuales que forman la combinación.
El procedimiento anterior se modifica fácilmente
de manera que se añaden dos compuestos diferentes en la primera
etapa, permitiendo el ensayo de combinaciones ternarias. De manera
similar, pueden añadirse tres compuestos para permitir el ensayo de
combinaciones de cuatro compuestos, etc. Mediante la utilización de
dicho enfoque, se someten a ensayo combinaciones de orden superior
de los compuestos.
A continuación se describe la identificación de
una combinación de compuestos que inhibe la proliferación. Esta
descripción es a título ilustrativo y no es limitativa de la
invención en modo alguno.
Se sometieron a ensayo siete compuestos
individuales solos y en total 21 combinaciones binarias posibles en
el ensayo de citotransferencia BrdU (ver después) para detectar su
efecto sobre la progresión del ciclo celular. Los siete compuestos
(podofilotoxina, paclitaxel, quinacrina, bepridil, dipiridamol,
prometacina y agroclavina; adquiridos de Sigma Aldrich Corp., St.
Louis, MO) se pesaron introduciéndolos en viales de vidrio de un
dram y se disolvieron en dimetilsulfóxido, creando soluciones madre
de 4 mg/ml. Se sembraron seis mil células de carcinoma
pulmonar A549 en cada pocillo de una placa de cultivo celular 384
tratada blanca opaca NalgeNunc (nº de cat. 164610) en 30 \mul de
medio al 10% (medio Eagle modificado por Dulbecco que contiene
suero de feto bovino al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G
sódica, 100 \mug/ml de estreptomicina sulfato y glutamina 2 mM,
todos obtenidos de Life Technologies). Cada compuesto se diluyó a
cuatro veces la concentración final de ensayo (las concentraciones
finales de ensayo eran DMSO al 0,25%, podofilotoxina 240 nM,
paclitaxel 60 nM, quinacrina 420 nM, bepridil 25 \muM,
dipiridamol 400 nM, prometacina 25 \muM, agroclavina 840 nM) en
medio al 10%. Se añadieron quince microlitros de cada solución
madre 4X de compuesto en medio a una fila y a una columna de un
cuadrado de 8 columnas y 8 filas (la octava pista contenía
únicamente el vehículo, DMSO), de manera que se sometieron a ensayo
todas las posibles combinaciones binarias de los 7 compuestos, así
como los agentes individuales solos. Las células se incubaron a
37ºC con 5% de dióxido de carbono durante 46 horas. Se añadió BrdU a
una concentración final de 10 \muM mediante la adición de 15
\mul de una solución 50 \muM de BrdU en medio al 10%. Las
células se incubaron durante la noche a 37ºC con 5% de dióxido de
carbono.
Tras 16 horas, el medio se extrajo por aspiración
de cada pocillo con una varilla de 24 canales (V&P Scientific),
utilizada durante todo el protocolo, unida a una fuente de vacío
doméstica. Se añadieron cincuenta microlitros de etanol al
70%/solución salina tamponada con fosfato al 30% (4ºC) a cada
pocillo con un rellenador de placa Multidrop 384 (Labsystems),
utilizado para todas las etapas posteriores de adición de líquidos.
La placa se incubó durante una hora a temperatura ambiente, después
los pocillos se aspiraron y a cada pocillo se añadieron 25 \mul
de HCl 2 M con Tween 20 al 0,5%. La placa se incubó durante 20
minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadieron
veinticinco microlitros de NaOH 2 M a cada pocillo. Se extrajo por
aspiración el líquido en cada pocillo y los pocillos se lavaron dos
veces con 75 \mul de solución salina equilibrada de Hank. Los
pocillos se lavaron nuevamente con 75 \mul de PBSTB (solución
salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino al 0,5% y
Tween 20 al 0,1%). Se añadieron a cada pocillo veinte microlitros
de solución de anticuerpo (que contenía 0,5 \mug/ml de anticuerpo
anti-BrdU (PharMingen) y una dilución 1:2.000 de Ig
anti-ratón-HRP (Amersham)). La placa
se incubó con la solución de anticuerpo durante una hora a
temperatura ambiente, después se extrajo la solución de anticuerpo
por aspiración y cada pocillo se lavó una vez con solución salina
tamponada con fosfato. Finalmente, se añadieron 20 \mul de
reactivo de detección ECL a cada pocillo (una mezcla igual de
soluciones uno y dos de los reactivos de detección ECL de
Amersham). Se leyó la luminiscencia en cada pocillo en un lector de
placas LJL Analyst con un tiempo de integración de 0,2 segundos por
pocillo. El experimento se repitió en dos placas y cada combinación
binaria se sometió a ensayo en un total de dieciséis réplicas de
experimentos. Los datos mostrados en la tabla muestran la actividad
antiproliferativa media de cada combinación de compuestos. Se
subrayan cinco combinaciones estadísticamente significativas
(p<0,001). Toda la actividad se normalizó a un conjunto de
pocillos que contenían células que no habían recibido ningún
tratamiento. De esta manera, un valor de uno representa una
sustancia inactiva y un valor mayor que uno indica algún nivel de
actividad antiproliferativa.
La tabla muestra cinco combinaciones de fármacos
actualmente autorizados por la FDA con actividad antiproliferativa
que es diferente de la de los componentes individuales. Tanto la
podofilotoxina como el paclitaxel son estabilizadores de los
microtúbulos que bloquean el ciclo celular en la mitosis, el
dipiradamol es un agente antiplaquetario, el bepridil es un
bloqueante de los canales del calcio y la prometacina es un
antagonista de los receptores de la histamina H1 y también se
utiliza como depresor del SNC y como agente anticolinérgico. El
dipiridamol en general se considera que presenta un perfil de
seguridad relativamente elevado como fármaco terapéutico en el ser
humano, particularmente en comparación con los efectos secundarios
tóxicos del paclitaxel y la podofilotoxina. De esta manera, en este
ensayo, el dipiridamol intensifica el efecto antiproliferativo de
tanto el paclitaxel como la podofilotoxina sobre las células de
cáncer de pulmón en el hombre. Además, el bepridil potencia los
efectos de la podofilotoxina pero inhibe el efecto del paclitaxel.
Este resultado no se habría predicho a priori y subraya la
importancia de los ensayos empíricos de alto rendimiento de
combinaciones con vistas a observar interacciones inesperadas entre
los fármacos. Por ejemplo, el bepridil y la prometacina, ninguno de
los cuales se utiliza como agente antiproliferativo en las
indicaciones terapéuticas actuales, se combinan para inhibir
fuertemente la proliferación de las células de cáncer pulmonar.
Todas las publicaciones y patentes indicadas en
la descripción anterior se incorporan a la presente memoria como
referencia. Las diversas modificaciones y variaciones del
procedimiento y sistema descrito de la invención resultarán
evidentes a los expertos en la materia sin apartarse del alcance de
la invención. Aunque la invención ha sido descrita en referencia a
las formas específicas de realización preferentes, debe
interpretarse que la invención según se reivindica no debe
considerarse limitada indebidamente a dichas formas específicas de
realización. En efecto, se pretende que las diversas modificaciones
de los modos descritos anteriormente para poner en práctica la
invención, que resultan evidentes a los expertos en el campo del
descubrimiento de fármacos o campos relacionados, se encuentren
comprendidas dentro del alcance de la invención.
Claims (30)
1. Procedimiento para cribar combinaciones de
compuestos con vistas a identificar las combinaciones de compuestos
que provocan un efecto que es diferente del efecto de un compuesto
de la combinación por sí solo, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar células completas de un ensayo de células completas,
- (b)
- poner en contacto dichas células completas con por lo menos 100 compuestos bajo condiciones que garanticen que cada contacto entre la célula completa y el compuesto sea diferente de los demás, y
- (c)
- detectar o medir los efectos mostrados por los compuestos sobre las células completas,
estando dicho procedimiento
caracterizado porque comprende las etapas adicionales
siguientes:
- (d)
- seleccionar los compuestos que provocan un cambio en dicho efecto mostrado sobre las células completas en comparación con dicho efecto de dichas células completas que no han entrado en contacto con dichos compuestos,
- (e)
- crear una matriz ordenada de por lo menos 49 combinaciones únicas de dos entidades o de combinaciones de orden superior a partir de los compuestos identificados,
- (f)
- poner en contacto dicha matriz ordenada de combinaciones de compuestos con células completas del ensayo de células completas bajo condiciones que garanticen que cada contacto entre la célula completa y la combinación de compuestos sea diferente de los demás,
- (g)
- detectar o medir un efecto mostrado por las combinaciones de compuestos sobre las células completas de la etapa (f), y
- (h)
- identificar las combinaciones de compuestos que provocan un efecto de la etapa (g) que es diferente del efecto de un compuesto de la combinación por sí solo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la etapa (e) comprende crear una matriz ordenada de por lo
menos 200 combinaciones únicas de dos o más compuestos.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que la etapa (e) comprende crear una matriz ordenada de por lo
menos 400 combinaciones únicas de dos o más compuestos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el
que la etapa (e) comprende crear una matriz ordenada de por lo
menos 1.540 combinaciones únicas de dos o más compuestos.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha etapa de detección (g) se lleva a cabo mediante un ensayo
de citotransferencia.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha etapa de detección (g) se lleva a cabo mediante un ensayo
de gen testigo.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha etapa de detección (g) se lleva a cabo mediante un ensayo
de transferencia de energía de resonancia fluorescente.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha etapa de detección (g) se lleva a cabo mediante la
detección de un colorante indicador de unión de calcio
fluorescente.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha etapa de detección (g) utiliza microscopía de
fluorescencia.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha etapa de detección (g) utiliza perfilado de
expresión.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas células completas son células humanas.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas células completas se seleccionan de entre el grupo
que comprende una célula de cáncer, una célula inmunológica, una
neurona, un fibroblasto, células bacterianas y células de
levadura.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una o ambas etapas (e) y (g) se llevan a cabo utilizando un
sistema robótico.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una o ambas etapas (e) y (g) se llevan a cabo utilizando
sistemas macrofluídicos.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una o ambas etapas (e) y (g) se llevan a cabo utilizando
tecnología de impresión de chorro de tinta.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos compuestos se seleccionan de entre el grupo que
comprende compuestos orgánicos no poliméricos, lípidos,
carbohidratos, péptidos, compuestos inorgánicos y
oligonucleótidos.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se utiliza por lo menos uno de dichos compuestos en forma
purificada.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que se utiliza cada uno de dichos compuestos en forma
purificada.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos compuestos se proporcionan como componentes de
mezclas.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dichas mezclas son extractos de productos naturales.
21. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho efecto es un efecto sinérgico.
22. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que por lo menos uno de dichos compuestos es una molécula con un
peso molecular inferior a 1.500 g/mol.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que dicha molécula es un fármaco autorizado por la FDA.
24. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que cada uno de dichos compuestos es una molécula con un peso
molecular inferior a 1.500 g/mol.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que cada uno de dichos compuestos es un fármaco autorizado por
la FDA.
26. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas combinaciones cribadas con vistas a identificar
combinaciones terapéuticas efectivas son combinaciones de dos
compuestos.
27. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas combinaciones cribadas para formar combinaciones
terapéuticas efectivas son combinaciones de tres compuestos.
28. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho efecto mostrado sobre las células completas en el
ensayo de células completas es el transporte de un compuesto a
través de la membrana celular, el potencial eléctrico, la generación
de potencial de acción, la proliferación celular, la muerte
celular, la descripción celular, la diferenciación celular, la
migración celular, la expresión génica, los niveles de proteínas, la
actividad enzimática, la fosforilación, la metilación, la
acilación, la traslocación de proteínas hasta el núcleo o la
capacidad de producir una respuesta inmunológica.
29. Combinación de compuestos seleccionada de
entre una combinación binaria de bepridil y podofilotoxina,
bepridil y prometacina, dipiridamol y podofilotoxina, o dipiridamol
y paclitaxel.
30. Composición farmacéutica que comprende (i)
una combinación de compuestos seleccionados de entre una
combinación binaria de bepridil y podofilotoxina, bepridil y
prometacina, dipiridamol y podofilotoxina o dipiridamol y
paclitaxel, e (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
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