JP2002328124A - 治療薬として実体の組み合わせを同定するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、生物系において改善された特性を
有する組み合わせを発見するための化合物の組み合わせ
の高スループットスクリーニングを系統的に実施する強
力な方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 本発明により、コンビナトリアルアレイ
を使用して生物活性について2つの実体またはより高次
数の組み合わせをスクリーニングする方法が提供され
た。本発明の方法は、(a)実体を提供する段階と、(b)実
体の組み合わせのアレイを作製する段階と、(c)1つまた
はそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験要素を提供
する段階と、(d)実体/試験要素の各接触が互いに確実に
隔離される条件下において、実体の組み合わせのアレイ
と試験要素とを接触させる段階と、(e)試験要素の特性
を検出または測定する段階と、(f)組み合わせの実体自
体の作用と異なる試験要素の特性に対する作用を生じる
実体の組み合わせを同定する段階とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、治療薬として実体
の組み合わせを同定するための方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】多数の疾患状態が多数の表現型の変化に
関連している。これは長い間、臨床において見られてい
たが、遺伝学の最近の進歩によって、この観察が分子レ
ベルで確認されている。例えば、癌細胞の発現プロファ
イリングは、多数の体細胞突然変異によって生ずる遺伝
子発現における数百の変化を明らかにしている。さら
に、ヒト細胞および組織は、それらが重複性および自己
緩衝性シグナル伝達系をしばしば含有するように、恒常
性機序を進化させている。細胞状態の変化を生じる天然
のシグナルは、1つの標的に送達されずに、標的の適切
な組み合わせに送達されることが多い。従って、多数の
変数の中程度の変化が、特異性の高い作用を与えうる。

【０００３】一方、歴史的および技術的理由のために、
薬学、化学および生物団体は、生物的影響を生じる1つ
の個々の分子に焦点を絞っている。歴史的なパラダイム
により、特定のタンパク質に影響を与える有機低分子が
同定され、生物および医学の両方において有用な試薬を
提供している。これらの分子は、治療的関連を有し、且
つ化学的タンパク質ノックアウトとして作用することに
よってタンパク質の機能の損失を生じることによってシ
グナル伝達経路を解明する際に有効であるタンパク質の
生物機能のプローブとしても有用である。また、これら
の低分子と特定の生物標的との相互作用、および特定の
生物機能に作用を与える能力によって、それらは治療薬
を開発するための候補物としても利用可能である可能性
がある。

【０００４】低分子が生物標的と相互作用することは予
測が不可能であるので、大多数の有機低分子の形成に懸
命な努力が払われている。これらは、このような化合物
のいわゆる「ライブラリー」として集められ、適当な望
ましい特徴を有する「多種多様なライブラリー（divers
e library）」を構築する目標を有している。このよう
な多種多様なライブラリーは、既存の低分子のコレクシ
ョンから構築されてもよいし、、または「コンビナトリ
アル・ケミストリー(combinatorial chemistry)」を使
用して作製されてもよい。これらのライブラリーは、活
性分子を同定するのに感受性のあるスクリーニングに関
連させることができる(Stocwellら、Chem. Biol. 1999,
6, 71〜83)。

【０００５】多くの場合、研究者らは、標的タンパク質
と相互作用する能力、またはあるクラスの天然化合物の
特定の局面を模倣するように設計される特徴的な構造特
徴などの、特定の特徴を全てのメンバーが共有するバイ
アス（bias）ライブラリーを開発している。例えば、多
くのライブラリーは天然ペプチドの1つまたはそれ以上
の特徴を模倣するように設計されている。このような
「ペプチド模倣物(peptidomimetic)」ライブラリーは、
フタルイミドライブラリー（国際公開公報第97/22594
号）、チオフェンライブラリー（国際公開公報第97/400
34号）、およびベンゾジアゼピンライブラリー（米国特
許第5,288,514号）を含む。天然産物に類似している構
造的特徴を有し、且つ小型細胞ベースアッセイ法に適合
性である1つのライブラリーが合成されている（Tanら、
J. Am. Chem 1998, 120, 8565）。

【０００６】現代の薬物発見過程は、主に、生物学的過
程に対する影響について化合物を迅速にアッセイする能
力に基づいて構成されている。製薬産業では、生物学的
分子間の相互作用を遮断、低下、または増強する化合物
を同定することに注意が集中している。具体的には、生
物系において、受容体とタンパク質リガンドの相互作用
はしばしば直接的に、または幾らか下流の事象を介し
て、その系および結果として治療が求められる患者に対
する有害な作用または有用な作用のいずれかを生じる。
従って、研究者らは、このような受容体/リガンド相互
作用を低下、遮断、または増強する化合物を長い間探索
してきた。

【０００７】高スループットスクリーニングシステム
は、既存の生化学および細胞ベースアッセイ法における
スループットの実際的な限界を克服するために設計され
た。有機化合物の従来の合成法および従来の生物学的ア
ッセイ法はかなりの時間と労働力と熟練とを要する。最
大数の化合物をスクリーニングするには、各スクリーニ
ングに関連する時間を短縮し、労力の必要量を低下する
ことが必要である。

【０００８】従って、異なる分子コレクションの高スル
ープットスクリーニングは、新規薬剤を開発するための
リード化合物を探索する際の中心的な役割を果たしてい
る。これらの高スループットスクリーニングのインプッ
トは、既存の化学的に合成された分子から集成された化
合物のライブラリー（製薬会社の専売権のあるライブラ
リー由来など）、天然産物（微生物の発酵培地）および
コンビナトリアル・ケミストリー技術によって作製され
た新規ライブラリーである（Tanら、J. Am. Chem Soc.
1998, 120, 8565）。ライブラリーは、リード薬剤候補
物として利用可能である、望ましい特性を有する1つの
化合物を発見する可能性を増加する数百万の化合物を含
む（Tanら、J. Am. Chem Soc.1999, 121, 9073〜908
7）。

【０００９】薬剤発見の従来のパラダイムを増強する
と、コンビナトリアル・ケミストリーは、スクリーニン
グに利用可能な化合物の数を劇的に増加させており、お
よびヒトゲノム研究は、スクリーニングのための大多数
の新規分子標的をカバーしていない。スクリーニング
は、酵素阻害剤、受容体アゴニスト、またはアンタゴニ
ストを探索する種々の方法においてこれらの新規標的を
使用することができる。生物系における1つの重大な相
互作用を低下、遮断、または増強する化合物を見出すこ
とが従来の目標であった（Weberら、Angew. Chem. Int.
Engl., 1995, 34,2280〜2282）。また、多くの研究者
が、スクリーニングを生細胞全体で実施し、スクリーニ
ングの読み出しが細胞の検出可能な特性である表現型に
基づいたアッセイ系に適合している（Stockwellら、Che
m. Biol. 1999, 6, 71〜83; Mayerら、Science, 1999,
286, 971〜974）。

【００１０】これまでに開発された高スループットスク
リーニング方法は、製薬産業の主流である「1-薬剤-1-
標的（one-drug-one target）」パラダイムに基づいて
設計されてきた。歴史的な理由のため、また通常の考え
方および認識されるリスク因子のため、現代の薬剤発見
過程は、主に、薬剤候補物として利用可能であると同時
に、1つの活性分子を見出すことを希望している。臨床
医は、「1-薬剤-1-標的（one-drug-one target）」方法
は、多くの疾患を治療するのに十分でないと長い間認識
してきた。臨床医は、同じ状態を治療する、または明確
な論理的関連を有する薬剤の明らかな組み合わせを試験
してきた。例えば、HIV治療および化学療法において、
多数の活性な薬剤の組み合わせが必要となった。常に最
も有望な薬剤の1つは組み合わせであり、閉経後の女性
の複雑な変化を治療するために使用されるプレマリン(P
remarin)は、22を超える別個で重要な成分を含む。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コンビナト
リアルアレイを使用して生物活性について2つの実体ま
たはより高次数の組み合わせをスクリーニングする方法
を提供することを課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、生物系を
乱す強力な新規方法を発明した。これは、生物系におい
て相乗的に相互作用する組み合わせを発見するために、
化合物の組み合わせ、すなわち、混合物または非化学的
結合した組み合わせの高スループットスクリーニングを
系統的に実施することを含む。本発明の方法は、組み合
わせの各化合物が以前には生物作用を認識されていない
場合でも、または化合物および組み合わせが先験的に組
み合わせで使用する明らかな候補でなかった場合でも、
以前には未知の治療的な作用を示す化合物の効果的な治
療的組み合わせを同定することができる。

【００１３】従って、一局面において、本発明は、実体
の少なくとも49の独自の組み合わせを含む少なくとも7
×7のコンビナトリアルアレイにおいて、少なくとも7つ
の実体を使用して、生物活性について2つの実体または
より高次数の組み合わせをスクリーニングする方法を提
供する。本発明の方法は、(a)実体を提供する段階と、
(b)実体の組み合わせのアレイを作製する段階と、(c)1
つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験要素
化合物を提供する段階と、(d)実体/試験要素の各接触が
互いに確実に隔離される条件下において、実体の組み合
わせのアレイに試験要素を接触させる段階と、(e)試験
要素の特性を検出または測定する段階と、(f)組み合わ
せの実体自体の作用とは異なる試験要素に対する作用を
生じる実体の組み合わせを同定する段階とを含む。

【００１４】第二の関連する局面において、本発明は、
生物活性について2つの実体またはより高次数の組み合
わせをスクリーニングする方法を特徴とする。本発明の
方法は、(a)2つまたはそれ以上の実体から少なくとも20
0の独自の組み合わせのアレイを作製する段階と、(b)1
つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験要素
を提供する段階と、(c)実体/試験要素の各接触が互いに
確実に隔離される条件下において、実体の組み合わせの
アレイに試験要素を接触させる段階と、(d)試験要素の
特性を検出または測定する段階と、(e)組み合わせの実
体自体の作用とは異なる試験要素に対する作用を生じる
実体の組み合わせを同定する段階とを含む。このアッセ
イ法の構成要素は、第一のアッセイ法に関連して上記の
ように変更されうる。好ましい態様において、本発明の
方法は、(f)段階(a)〜(e)までを少なくとも2回反復する
段階をさらに含み、段階(a)において、少なくとも200の
組み合わせのアレイが各反復において異なっている。他
の好ましい態様において、アレイは少なくとも400〜154
0の独自の組み合わせを含む。段階(f)の2回の反復を実
施する場合、好ましくは、それらは互いに10日以内に生
ずる。

【００１５】第三の関連する局面において、本発明は、
生物活性について2つの実体またはより高次数の組み合
わせをスクリーニングする方法を特徴とする。本発明の
方法は、(a)少なくとも49の独自の2つ以上の実体の組み
合わせのアレイを作製する段階と、(b)1つまたはそれ以
上の別個の生物学的部分を含む試験要素を提供する段階
と、(c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離され
る条件下において、実体の組み合わせのアレイに試験要
素を接触させる段階と、(d)試験要素の特性を検出また
は測定する段階と、(e)組み合わせの実体自体の作用と
は異なる試験要素に対する作用を生じる実体の組み合わ
せを同定する段階と、(f)各反復に異なるアレイを使用
して、段階(a)〜(e)を1週間の期間にわたって少なくと
も25回反復する段階とを含む。このアッセイ法の構成要
素は、先に記載したアッセイ法について上記のように変
更されうる。

【００１６】第四の関連する局面において、本発明は、
生物活性について2つの実体またはより高次数の組み合
わせをスクリーニングする方法を特徴とする。本発明の
方法は、(a)少なくとも49の独自の2つ以上の実体の組み
合わせのアレイを作製する段階と、(b)1つまたはそれ以
上の別個の生物学的部分を含む試験要素を提供する段階
と、(c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離され
る条件下において、実体の組み合わせのアレイに試験要
素を接触させる段階と、(d)試験要素の特性を検出また
は測定する段階と、(e)組み合わせの実体自体の作用と
は異なる試験要素に対する作用を生じる実体の組み合わ
せを同定する段階と、(f)各反復に異なるアレイを使用
して、段階(a)〜(e)を1ヶ月の期間にわたって少なくと
も100回反復する段階とを含む。このアッセイ法の化合
物は、先に記載のアッセイ法のように変更されうる。

【００１７】第五の局面において、本発明は、生物活性
について2つの実体またはより高次数の組み合わせをス
クリーニングする方法を特徴とする。本発明の方法は、
(a)実体のセットから、少なくとも10,000の独自の2つの
実体またはより高次数の組み合わせのアレイを作製する
段階と、(b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を
含む試験要素を提供する段階と、(c)実体/試験要素の各
接触が互いに確実に隔離される条件下において、実体の
組み合わせのアレイに試験要素を接触させる段階と、
(d)試験要素の特性を検出または測定する段階と、(e)組
み合わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の特性に
対する作用を生じる実体の組み合わせを同定する段階
と、(f)段階(a)〜(e)を10日またはそれ以下の期間にわ
たって少なくとも2回反復する段階であって、段階(a)に
おいて、少なくとも10,000の2つの実体の組み合わせの
アレイが2回またはそれ以上の反復において異なる段階
とを含む。

【００１８】第六の局面において、生物活性について実
体の組み合わせをスクリーニングする方法を特徴とす
る。本発明の方法は、(a)1つまたはそれ以上の別個の生
物学的部分を含む試験要素を提供する段階と、(b) 実体
/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条件下に
おいて、少なくとも100の実体を試験要素に接触させる
段階と、(c) 試験要素の特性を検出または測定する段階
と、(d)実体と接触させていない試験要素の特性と比較
して、特性の変化を生ずる実体を選択する段階と、(e)
同定した実体から、少なくとも49の独自の2つの実体ま
たはより高次数の組み合わせのアレイを作製する段階
と、(f) 実体の組み合わせ/試験要素の各接触が互いに
確実に隔離される条件下において、実体の組み合わせの
アレイに試験要素を接触させる段階と、(g)段階(f)の試
験要素の特性を検出または測定する段階と、(h)組み合
わせの実体自体の作用と異なる段階(g)の特性に作用を
生ずる実体の組み合わせを同定する段階とを含む。好ま
しくは、段階(a)の試験要素は段階(f)の試験要素と同一
であるが、各段階において異なる試験要素を使用するこ
とが望ましい場合もある（例えば、段階(a)における培
養細胞および段階(f)における動物全体）。同様に、段
階(c)の特性は、好ましくは、段階(g)の試験要素と同一
であるが、各段階において異なる特性を使用することが
望ましい場合もある。

【００１９】アッセイ法の全てについて、サイトブロッ
トアッセイ法、レポーター遺伝子アッセイ法、蛍光共鳴
エネルギー移動(FRET)アッセイ法、蛍光カルシウム結合
指示薬色素、蛍光顕微鏡、または発現プロファイリング
を含む数多くの活性読み出し技術を使用することができ
る。アッセイ法は、好ましくは、ロボット工学システム
および384および1536ウェルプレートを使用して自動化
される。アッセイ法はまた、過程の一部または全てがマ
イクロ流体工学を使用して実施することができるように
構成されうる。または、アッセイ法は、熟練した科学者
および効率的なライン工程を使用することによって実施
することができる。

【００２０】本発明に係る組み合わせで試験される好ま
しい実体は、化合物（例えば、非ポリマー有機化合物、
特に、低分子；脂質；炭水化物；ペプチド；無機化合
物；およびDNAおよびRNA分子を含むオリゴヌクレオチ
ド）、イオン（例えば、金属イオン）および放射線（例
えば、可視光線、可視外光線(outside the visible ran
ge)、マイクロ波放射線、赤外線またはx線およびγ線な
どの電離放射線）である。組み合わせで試験される実体
が化合物である場合には、それらは、好ましくは、精製
された形態であるが、例えば天然産物の抽出物のような
混合物の構成要素として提供されてもよい。例えば、サ
ブセット（1つまたはそれ以上の化合物）が精製された
形態であって、化合物の各々が精製された形態で使用さ
れてもよい。好ましくは、実体/試験要素の各接触は、2
00μL未満、より好ましくは100μL未満、最も好ましく
は50μLまたは25μL未満の容量中で実施される。ある種
の状況では、10μL程度の容量または500nLもしくはそれ
未満の少容量を使用することができる。また、化合物
は、好ましくは、100μL未満、より好ましくは1μL未
満、最も好ましくは100nLまたは50nL未満の少容量であ
る。当業者は、さらに少量の容量（例えば、10 nLまた
は1 nL）を使用することができることを認識すると思わ
れる。

【００２１】好ましい試験要素は、ニューロン、線維芽
細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、グリア細
胞、胎性幹細胞、造血幹細胞、肥満細胞、脂肪細胞、原
生動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、神経幹細胞、ならび
にT細胞およびB細胞を含む免疫細胞などの細胞全体（例
えば、形質転換細胞または非形質転換細胞）；細胞塊；
組織；動物；および再構成無細胞培地であり、ある場合
には、試験要素は、タンパク質またはオリゴヌクレオチ
ドなどの生物的に関連のある1分子を含んでもよい。

【００２２】試験要素に対して望ましい組み合わせによ
って示される作用は、好ましくは、DNA合成の増加また
は低下などの、試験要素の特性に対する相乗作用であ
る。または、組み合わせは、性質が補助的であってもよ
いが、副作用はより少なく、または1つの実体は他方に
対して負の有用な作用を発揮してもよく、例えば一方の
化合物は別の化合物の毒性を中和する。

【００２３】実体は任意の配列で試験要素と接触させる
ことができ、すなわち1つの実体を試験要素に添加する
ことができ、その後1つの第二の実体を添加するか、ま
たは代替え的には複数の第二の実体を組み合わせてか
ら、試験要素と接触させることができる。

【００２４】本発明の高スループットスクリーニング方
法は、製薬産業で使用される従来の薬剤発見方法の迅速
で、強力な別法となる。本発明は、例えば低分子（その
いくつかは新規に合成してもよく、またはそのいくつか
は既知のFDA承認済み薬剤であってもよい）の以前には
知られていなかった治療的に強力な組み合わせを同定す
ることができる。効果的な組み合わせが、全てがすでに
FDAの承認を得ている2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の
薬剤によってのみより作製される場合には、新たな組み
合わせは、FDA承認過程を介して容易に移動するさらな
る利点を有する。

【００２５】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳
細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

【００２６】定義 「コンビナトリアル・ケミストリーライブラリー」：本
明細書において使用される、「コンビナトリアル・ケミ
ストリーライブラリー」とは、足場構造の多様化の各段
階において異なる試薬を使用することによって、好まし
くは、多様化可能な足場構造から合成される天然産物と
類似している複数の複合分子である。

【００２７】「多様性ライブラリー（diverse librar
y)」：本明細書において使用される、「多様性ライブラ
リー」とは、既存の化学的に合成された分子（製薬会社
の専売権のあるライブラリー由来など）と、天然産物
（微生物の発酵培地）と、コンビナトリアル・ケミスト
リー技術によって作製される新規ライブラリーとを含
む、多数の可能性のある起源から集成された複数の複合
分子である。

【００２８】「多様化可能な足場構造」：本明細書にお
いて使用される、「多様化可能な足場構造」とは、合成
試薬とさらに反応して、少なくとも1つの新たな官能基
を形成することができる潜在的官能基または活性な官能
基を含有する、鋳型構造から合成される化合物である。
本明細書において使用される、「潜在的な（latent）官
能基」とは、存在しているが一時的に不活性であるもの
である。活性化試薬により放出されると、潜在的な官能
基は活性になり、さらなる多様化に利用することができ
る。

【００２９】「試験要素」：本明細書において使用され
る「試験要素」とは、実体の組み合わせを接触させ、次
いで実体の作用について観察される系である。試験要素
は、好ましくは、細胞の内部に2つまたはそれ以上の生
物学的部分を含む。

【００３０】「化合物プリンティング」；本明細書にお
いて使用される「化合物プリンティング」とは、cDNAマ
イクロアレイ法に使用されるものなどの高精度ロボット
を使用して表面（例えば、ガラス）に化合物を適用する
ことを意味する（J. Am. Chem Soc. 1999, 121, 7967〜
7968）。化合物は直径が250ミクロンまたはそれ以下で
あってもよく、化合物は、共有結合により結合されて
も、または静電気的相互作用または疎水性相互作用を介
して表面に接着されてもよい。

【００３１】「マイクロ流体工学」：本明細書において
使用される、「マイクロ流体工学」装置は、従来のフォ
トリソグラフィー（photolithography）（例えば、Cali
perTechnologies, Mountain View, CA; http://www.cal
ipertech.com）または従来的ではない方法（例えば、An
gew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 550〜575のソフ
トリソグラフィーなど）を含む、任意のフォトリソグラ
フィー方法によって作製される溝形構造である。

【００３２】「インクジェット」：本明細書において使
用される「インクジェット」技術は、小容量の液体を送
達するための熱インクジェットおよび圧電スプレー技法
を意味する。

【００３３】「低分子」：本明細書において使用される
「低分子」とは、実験室において合成される、または天
然に見出される有機化合物を意味する。典型的には、低
分子は、いくつかの炭素-炭素結合を含有し、1500g/mol
e未満の分子量を有するという点で特徴づけられるが、
この特徴は本明細書の目的を限定する意図のものではな
い。天然に存在する「低分子」の例には、タキソール、
ダイネマイシン(dynemicin)およびラパマイシンが挙げ
られるが、それらに限定されることはない。

【００３４】本発明に係る方法においては、（１）実体
の少なくとも49の独自の組み合わせを含む少なくとも7
×7のコンビナトリアルアレイにおいて少なくとも7つの
実体を使用して生物学的活性について2つの実体または
より高次数の組み合わせをスクリーニングする方法であ
って、(a)該実体を提供する段階；(b)実体の組み合わせ
の該アレイを作製する段階；(c)1つまたはそれ以上の別
個の生物学的部分を含む試験要素を提供する段階；(d)
実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条件
下において、実体の組み合わせの該アレイに該試験要素
を接触させる段階；(e)試験要素の特性を検出または測
定する段階；および(f)組み合わせの実体自体の作用と
は異なる試験要素の該特性に対する作用を生じる実体の
組み合わせを同定する段階を含む方法であることを特徴
とする。

【００３５】また、本発明に係る方法においては、
（２）段階(b)および(d)が、実体に試験要素を連続的に
接触させることによって該試験要素の存在下においてア
レイを作製する段階を含む、上記(1)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００３６】また、本発明に係る方法においては、
（３）試験要素が2つまたはそれ以上の別個の生物学的
部分を含む、上記(1)記載の方法であることを特徴とす
る。

【００３７】また、本発明に係る方法においては、
（４）試験要素が生細胞を含む、上記(3)記載の方法で
あることを特徴とする。

【００３８】また、本発明に係る方法においては、
（５）検出段階(e)がサイトブロットアッセイ法によっ
て実施される、上記(4)記載の方法であることを特徴と
する。

【００３９】また、本発明に係る方法においては、
（６）検出段階(e)がレポーター遺伝子アッセイ法によ
って実施される、上記(4)記載の方法であることを特徴
とする。

【００４０】また、本発明に係る方法においては、
（７）検出段階(e)が蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
法によって実施される、上記(4)記載の方法であること
を特徴とする。

【００４１】また、本発明に係る方法においては、
（８）検出段階(e)が蛍光カルシウム結合指示薬色素を
検出することによって実施される、上記(4)記載の方法
であることを特徴とする。

【００４２】また、本発明に係る方法においては、
（９）検出段階(e)が蛍光顕微鏡を使用する、上記(4)記
載の方法であることを特徴とする。

【００４３】また、本発明に係る方法においては、（１
０）段階(e)が発現プロファイリングを使用する、上記
(4)記載の方法であることを特徴とする。

【００４４】また、本発明に係る方法においては、（１
１）細胞がヒト細胞である、上記(4)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００４５】また、本発明に係る方法においては、（１
２）細胞が、癌細胞、免疫細胞、ニューロンおよび線維
芽細胞からなる群より選択される、上記(4)記載の方法
であることを特徴とする。

【００４６】また、本発明に係る方法においては、（１
３）試験要素が、少なくとも2つの生体分子と少なくと
も1つのレポーター分子を含む無細胞培地を含む、上記
(1)記載の方法であることを特徴とする。

【００４７】また、本発明に係る方法においては、（１
４）段階(b)および(d)の一方または両方が、ロボット工
学システムを使用して実施される、上記(1)記載の方法
であることを特徴とする。

【００４８】また、本発明に係る方法においては、（１
５）段階(b)および(d)の一方または両方がマイクロ流体
工学を使用して実施される、上記(1)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００４９】また、本発明に係る方法においては、（１
６）段階(b)および(d)の一方または両方がインクジェッ
トプリンター技術を使用して実施される、上記(1)記載
の方法であることを特徴とする。

【００５０】また、本発明に係る方法においては、（１
７）実体が、化合物、イオンまたは放射線である、上記
(1)記載の方法であることを特徴とする。

【００５１】また、本発明に係る方法においては、（１
８）化合物が、非ポリマー有機化合物、脂質、炭水化
物、ペプチド、無機化合物、およびオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、上記(17)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００５２】また、本発明に係る方法においては、（１
９）放射線が、可視光線、可視外光線、および電離放射
線からなる群より選択される、上記(17)記載の方法であ
ることを特徴とする。

【００５３】また、本発明に係る方法においては、（２
０）実体の少なくとも1つが精製された形態で使用され
る化合物である、上記(1)記載の方法であることを特徴
とする。

【００５４】また、本発明に係る方法においては、（２
１）化合物の各々が精製された形態で使用される、上記
(20)記載の方法であることを特徴とする。

【００５５】また、本発明に係る方法においては、（２
２）実体が混合物の構成要素として提供される化合物で
ある、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。

【００５６】また、本発明に係る方法においては、（２
３）混合物が天然産物の抽出物である、上記(22)記載の
方法であることを特徴とする。

【００５７】また、本発明に係る方法においては、（２
４）作用が相乗作用である、上記(1)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００５８】また、本発明に係る方法においては、（２
５）上記(1)記載の方法により同定される組み合わせを
患者に投与する段階を含む患者を治療する方法であるこ
とを特徴とする。

【００５９】また、本発明に係る組み合わせにおいて
は、（２６）上記(1)記載の方法により同定される実体
の組み合わせであることを特徴とする。

【００６０】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（２７）(i)上記(1)記載の方法により同定される実
体の組み合わせと、(ii)薬学的に許容されうる担体とを
含む薬学的組成物であることを特徴とする。

【００６１】また、本発明に係る方法においては、（２
８）生物学的活性について2つの実体またはより高次数
の組み合わせをスクリーニングする方法であって、(a)
実体のセットから少なくとも200の独自の2つの実体また
はより高次数の組み合わせのアレイを作製する段階；
(b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
要素を提供する段階；(c)実体/試験要素の各接触が互い
に確実に隔離される条件下において、実体の組み合わせ
の該アレイに該試験要素を接触させる段階；(d)試験要
素の特性を検出または測定する段階；および(e)組み合
わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の該特性に対
する作用を生じる実体の組み合わせを同定する段階を含
む方法であることを特徴とする。

【００６２】また、本発明に係る方法においては、（２
９）段階(a)〜(c)が、実体に試験要素を連続的に接触さ
せることによって該試験要素の存在下においてアレイを
作製する段階を含む、上記(28)記載の方法であることを
特徴とする。

【００６３】また、本発明に係る方法においては、（３
０）(f)段階(a)〜(e)までを少なくとも2回反復する段階
をさらに含み、段階(a)において、少なくとも200の組み
合わせのアレイが各反復において異なる、上記(28)記載
の方法であることを特徴とする。

【００６４】また、本発明に係る方法においては、（３
１）段階(f)の少なくとも2回の反復が互いに10日以内に
生ずる、上記(30)記載の方法であることを特徴とする。

【００６５】また、本発明に係る方法においては、（３
２）アレイが少なくとも400の独自の組み合わせを含
む、上記(28)記載の方法であることを特徴とする。

【００６６】また、本発明に係る方法においては、（３
３）アレイが少なくとも1540の独自の組み合わせを含
む、上記(28)記載の方法であることを特徴とする。

【００６７】また、本発明に係る方法においては、（３
４）実体が、化合物、イオン、または放射線である、上
記(28)記載の方法であることを特徴とする。

【００６８】また、本発明に係る方法においては、（３
５）化合物が、非ポリマー有機化合物、脂質、炭水化
物、ペプチド、無機化合物、およびオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、上記(34)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００６９】また、本発明に係る方法においては、（３
６）放射線が、可視光線、可視外光線、および電離放射
線からなる群より選択される、上記(34)記載の方法であ
ることを特徴とする。

【００７０】また、本発明に係る方法においては、（３
７）実体の少なくとも1つが精製された形態で使用され
る化合物である、上記(28)記載の方法であることを特徴
とする。

【００７１】また、本発明に係る方法においては、（３
８）化合物の各々が精製された形態で使用される、上記
(28)記載の方法であることを特徴とする。

【００７２】また、本発明に係る方法においては、（３
９）実体が、混合物の構成要素として提供される化合物
である、上記(28)記載の方法であることを特徴とする。

【００７３】また、本発明に係る方法においては、（４
０）混合物が天然産物の抽出物である、上記(38)記載の
方法であることを特徴とする。

【００７４】また、本発明に係る方法においては、（４
１）作用が相乗作用である、上記(28)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００７５】また、本発明に係る方法においては、（４
２）段階(a)および(c)の一方または両方がロボット工学
システムを使用して実施される、上記(28)記載の方法で
あることを特徴とする。

【００７６】また、本発明に係る方法においては、（４
３）段階(a)および(c)の一方または両方がマイクロ流体
工学を使用して実施される、上記28記載の方法であるこ
とを特徴とする。

【００７７】また、本発明に係る方法においては、（４
４）段階(a)および(c)の一方または両方がインクジェッ
トプリンター技術を使用して実施される、上記(28)記載
の方法であることを特徴とする。

【００７８】また、本発明に係る方法においては、（４
５）上記(28)記載の方法により同定される組み合わせを
患者に投与する段階を含む患者を治療する方法であるこ
とを特徴とする。

【００７９】また、本発明に係る組み合わせにおいて
は、（４６）上記(28)記載の方法により同定される実体
の組み合わせであることを特徴とする。

【００８０】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（４７）(i)上記(28)記載の方法により同定される
実体の組み合わせと、(ii)薬学的に許容されうる担体と
を含む薬学的組成物であることを特徴とする。

【００８１】また、本発明に係る方法においては、（４
８）生物学的活性について2つの実体またはより高次数
の組み合わせをスクリーニングする方法であって、(a)
少なくとも49の独自の2つの実体またはより高次数の組
み合わせのアレイを作製する段階；(b)1つまたはそれ以
上の別個の生物学的部分を含む試験要素を提供する段
階；(c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離され
る条件下において、実体の組み合わせの該アレイに該試
験要素を接触させる段階；(d)試験要素の特性を検出ま
たは測定する段階；(e)組み合わせの実体自体の作用と
は異なる試験要素の該特性に対する作用を生じる実体の
組み合わせを同定する段階；および(f)各反復に異なる
アレイを使用して、段階(a)〜(e)を1週間の期間にわた
って少なくとも25回反復する段階を含む方法であること
を特徴とする。

【００８２】また、本発明に係る方法においては、（４
９）段階(a)〜(e)が、各反復において異なるアレイを使
用して、30日の期間にわたって少なくとも100回反復さ
れる、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。

【００８３】また、本発明に係る方法においては、（５
０）実体が、化合物、イオン、または放射線である、上
記(48)記載の方法であることを特徴とする。

【００８４】また、本発明に係る方法においては、（５
１）化合物が、非ポリマー有機化合物、脂質、炭水化
物、ペプチド、無機化合物およびオリゴヌクレオチドか
らなる群より選択される、上記(50)記載の方法であるこ
とを特徴とする。

【００８５】また、本発明に係る方法においては、（５
２）放射線が、可視光線、可視外光線および電離放射線
からなる群より選択される、上記(50)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００８６】また、本発明に係る方法においては、（５
３）実体が、精製された形態で使用される化合物であ
る、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。

【００８７】また、本発明に係る方法においては、（５
４）実体が、混合物の構成要素として提供される化合物
である、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。

【００８８】また、本発明に係る方法においては、（５
５）混合物が天然産物の抽出物である、上記(54)記載の
方法であることを特徴とする。

【００８９】また、本発明に係る方法においては、（５
６）作用が相乗作用である、上記(48)記載の方法である
ことを特徴とする。

【００９０】また、本発明に係る方法においては、（５
７）段階(a)および(c)の一方または両方が、ロボット工
学システムを使用して実施される、上記(48)記載の方法
であることを特徴とする。

【００９１】また、本発明に係る方法においては、（５
８）段階(a)および(c)の一方または両方が、マイクロ流
体工学を使用して実施される、上記(48)記載の方法であ
ることを特徴とする。

【００９２】また、本発明に係る方法においては、（５
９）段階(a)および(c)の一方または両方が、インクジェ
ットプリンター技術を使用して実施される、上記(48)記
載の方法であることを特徴とする。

【００９３】また、本発明に係る方法においては、（６
０）生物学的活性について2つの実体またはより高次数
の組み合わせをスクリーニングする方法であって、(a)
実体のセットから、少なくとも10,000の独自の2つの実
体またはより高次数の組み合わせのアレイを作製する段
階；(b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む
試験要素を提供する段階；(c)実体/試験要素の各接触が
互いに確実に隔離される条件下において、実体の組み合
わせの該アレイに該試験要素を接触させる段階；(d)試
験要素の特性を検出または測定する段階；(e)組み合わ
せの実体自体の作用とは異なる試験要素の該特性に対す
る作用を生じる実体の組み合わせを同定する段階；およ
び(f)段階(a)〜(e)を10日またはそれ以下の期間にわた
って少なくとも2回反復する段階であって、段階(a)にお
いて、少なくとも10,000の2つの実体の組み合わせの該
アレイが2回またはそれ以上の反復において異なる段階
を含む方法であることを特徴とする。

【００９４】また、本発明に係る方法においては、（６
１）生物学的活性について2つの実体またはより高次数
の組み合わせをスクリーニングする方法であって、(a)1
つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験要素
を提供する段階；(b) 実体/試験要素の各接触が互いに
確実に隔離される条件下において、少なくとも100の実
体を該試験要素に接触させる段階；(c) 該試験要素の特
性を検出または測定する段階；(d)該実体と接触させて
いない該試験要素の該特性と比較して、該特性の変化を
生ずる実体を選択する段階；(e)同定した実体から、少
なくとも49の独自の2つの実体またはより高次数の組み
合わせのアレイを作製する段階；(f) 実体の組み合わせ
/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条件下に
おいて、実体の組み合わせの該アレイに試験要素に接触
させる段階；(g)段階(f)の試験要素の特性を検出または
測定する段階；および(h)組み合わせの実体自体の作用
と異なる段階(g)の該特性に作用を生ずる実体の組み合
わせを同定する段階を含む方法であることを特徴とす
る。

【００９５】また、本発明に係る方法においては、（６
２）段階(a)の試験要素が、段階(f)の試験要素と同じで
ある、上記(61)記載の方法であることを特徴とする。

【００９６】また、本発明に係る方法においては、（６
３）段階(c)の特性が、段階(g)の特性と同じである、上
記(61)記載の方法であることを特徴とする。

【００９７】

【発明の実施の形態】本発明は、独自の組み合わせにお
いてのみ存在する分子の作用を同定するための関連する
生物学的アッセイ法を使用して、高スループットスクリ
ーニング系において2-、3-、4-およびより高次数の組み
合わせの個々の分子のライブラリーを組み合わせる方法
を提供する。このような組み合わせは、別の生物系を探
り、検討するために使用することができ、直接的な生物
用途を有する可能性があり、新規なヒト治療薬またはヒ
トにおける他の用途のための活性分子として利用可能で
ある可能性がある。これらの組み合わせは、成長、受
精、成熟、または動物または植物を含む、特定の農業産
物に特徴的な他のことを促進するために有用となりう
る。それらは、化粧製品、香水、食品保存剤、または栄
養補助食品を製造する際に有用となりうる。従って、本
発明は、生物系において改善された特性を有する組み合
わせを発見するための化合物の組み合わせの高スループ
ットスクリーニングを系統的に実施する強力な方法を提
供する。

【００９８】本発明者らは、多数の分子標的と相互作用
する多数の活性剤を含有する場合には、ヒト細胞および
組織などの複雑な系と相互作用する薬剤は極めて効果的
である可能性があると仮定する。薬剤がどのように作動
するかについてのこの理解により、それらがどのように
設計され、開発されるかの新規な方法の基礎の1つが形
成される。この新規な方法は、多数の現行の治療法に劇
的な改善を生じ、現在の難治性の疾患、特に多数の変数
の中程度の変化を必要とする疾患に対して効果的な治療
法を提供することを約束する。

【００９９】製薬産業の現在の主流のパラダイムは、1
薬剤を1標的に対して設計するものである。本発明者ら
の方法では、新規世代の薬剤の系統的な開発のためのフ
レームワークの中心として多変数設計要件の理解が使用
される。

【０１００】組み合わせで試験される実体 上記のように、多種多様の実体を、本発明に係る組み合
わせで試験することができる。これらは、本明細書にお
いて詳細に考察される。

【０１０１】 化合物およびイオン 本発明によりスクリーニングされる一般的なクラスの化
合物は有機低分子である。化合物は、合成または天然型
（例えば、プロスタグランジン、レクチン、天然型二次
代謝物、ホルモン等）であってもよい。精製された形態
のこのような分子の巨大ライブラリーは、製薬会社、化
学会社、および学術研究所において入手可能であり、こ
のようなライブラリーは既知のコンビナトリアル・ケミ
ストリー技術を使用して合成してもよい。化合物は既知
の生物活性を有しても、有さなくてもよい。本発明の化
合物およびコンビナトリアルライブラリーは、例えば、
シキミ酸系エポキシオール鋳型またはピリジン系鋳型イ
ソニコチンアミドから合成される多様化可能な足場から
形成される化合物およびライブラリーのような、多様化
可能な固体支持体に結合した足場から合成することがで
きる。有機低分子以外に、本発明に係る組み合わせでス
クリーニングすることができる他の分子には、オリゴヌ
クレオチド（DNAおよびRNA）；ポリペプチド（抗体、酵
素、受容体、リガンド、構造タンパク質、ヒトタンパク
質の変異類似体、およびペプチドホルモン）；脂質；炭
水化物および多糖類を含む生体高分子が含まれる。無機
分子も、例えば銅、鉄、銀、亜鉛、マグネシウム、マン
ガン、カルシウム、および金イオンのような金属イオン
などの生物活性である可能性を有しているイオンと同様
にスクリーニングすることができる。

【０１０２】他の実体 生物系に作用を与えると思われる他の非化学的実体も、
上記のように、他の化学的実体または化学的実体と組み
合わせて本発明によりスクリーニングすることができ
る。スクリーニングすることができる非化学的実体には
光線（可視光線および例えば、赤外線および紫外線のよ
うな可視外光線）、x線およびγ線などの電離放射線；
高圧；高温もしくは低温または高pHもしくは低pH；酸
素、窒素、二酸化炭素等などのガス状物質；および任意
の周波数の音響振動（音波）が含まれる。

【０１０３】試験要素 組み合わせの作用を検出するために使用される生物アッ
セイ法は、ほとんどの場合に多数の構成要素を含む。い
くつかのアッセイ法において、試験要素は、特にアッセ
イ法が表現型に基づいたアッセイ法である場合には、細
胞全体である。このような細胞全体のアッセイ法は、多
変量の治療化合物の有効性の基礎を形成する可能性のあ
る複雑な分子的相互作用の完全なセットを提供する。他
のアッセイ法は、多くの望ましい複合体系を含有し、ア
ッセイされる可能な組み合わせの作用に基づくいくつか
のレポーター作用を含んでもよい再構成された無細胞培
地を使用する。他のアッセイ法は、細胞塊などのより高
次数の生物系および多変量コンビナトリアルスクリーニ
ングの動物モデルを使用する。

【０１０４】個々の化合物のアッセイ法に有用な任意の
生物アッセイ法は、本発明のコンビナトリアルスクリー
ニングに容易に適合される。アッセイ測定には、例え
ば、細胞膜を貫通する化合物の輸送、電位、活動電位発
生、細胞増殖、細胞死、細胞特異化、細胞分化、細胞遊
走、遺伝子発現、またはタンパク質レベル（例えば、mR
NA、タンパク質、またはレポーター遺伝子を検出するこ
とによって測定される）、酵素活性、リン酸化、メチル
化、アセチル化、細胞核へのタンパク質の移行（または
タンパク質の位置の他の変化）、病原菌（例えば、ウィ
ルスまたは細菌）に抵抗する能力、ならびに免疫応答を
形成する能力が含まれてもよい。生物全体のアッセイ法
では、動物の挙動がレポーターとして利用可能である。

【０１０５】一例において、アッセイ法は非破壊的アッ
セイ法である（例えば、化合物の作用の測定が、細胞を
害することなく得られうる細胞ベースのアッセイ法）。
このようなアッセイ法により、ウェルあたり多数の組み
合わせの多数の濃度についてのアッセイ法を実施するこ
とができる。例えば、化合物Aを、濃度を増加させなが
らウェルに添加し、化合物の各添加後に測定を実施す
る。化合物Aが望ましい濃度に到達したら（化合物の望
ましいアッセイ応答または既知の特性（例えば、毒性、
溶解度）に基づいて測定）、化合物Bを、濃度を増加さ
せながら添加し、各添加後にアッセイ測定を実施する。
この過程を1つのウェルで多数回繰り返し、1つのプレー
トで数百、数千、または数百万回のアッセイ法を実施す
ることができる。

【０１０６】組み合わせにおいて考えられる副作用を同
定するためには、比較アッセイ法を実施することが望ま
しい場合がある。例えば、腫瘍細胞を死滅させるか、ま
たは腫瘍細胞の増殖を低下させる能力についてスクリー
ニングされる化合物の組み合わせは、正常な非腫瘍細胞
に対する作用についても同時にスクリーニングすること
ができる。腫瘍細胞に対して望ましい活性を示し、正常
な細胞にほとんどまたは全く作用を与えない化合物の組
み合わせが、好ましい組み合わせである。正常な細胞に
望ましくない作用を与えると思われる組み合わせはあま
り好ましくない。しかし、これらの後者の組み合わせ
（または、同様の構造を有する化合物の組み合わせ）は
異なる濃度では有効である場合があり、別の検討から必
ずしも排除されるべきではない。

【０１０７】タンパク質、炭水化物、および脂質などの
複雑な生体分子を含有する無細胞培地は、例えば、哺乳
類、カエル、酵母、もしくは細菌細胞を溶菌して細胞全
体の溶解物を提供することによって、またはこのような
細胞溶解物から特定の分画を精製することによって、ま
たは市販のウサギ網状赤血球溶解物（インビトロにおけ
る転写および/または翻訳反応を実施するために通常使
用される）を使用することによって、または哺乳類、酵
母、もしくは細菌細胞から下層を形成する細胞を溶解す
ることなく、培養上清を回収することによる既知の方法
により作製される。

【０１０８】サイトブロットアッセイ法 活性を検出する一方法はサイトブロットアッセイ法であ
る。この方法では、細胞をアッセイプレートのウェルに
播種する。細胞は、好ましくは、接着細胞であり、その
結果、それらはウェルの底部に接着して増殖する。上記
の方法を使用して、化合物を添加する。例えば、サイト
ブロットは、BrdUの取り込みを測定することによって増
殖を検出するために実施することができる。この例で
は、細胞をある期間の間インキュベーションする（例え
ば、4〜72時間）。次いで、例えばロボット液体移動装
置または16もしくは8チャネルワンドを使用して培地を
吸引する。70%エタノールおよびリン酸緩衝食塩水(PBS)
を添加して4℃にて1時間細胞を固定する。固定液を除去
し、PBSで1回細胞を洗浄する。PBS洗浄後、0.5% Tween
20を含む2N HClを各ウェルに添加して20分インキュベー
ションする。HClを、10容量%の2N NaOHを含有するハン
クスの平衡塩類溶液(HBSS)の溶液で中和する。この溶液
を除去し、細胞をHBSSで2回洗浄し、次いで0.5%ウシ血
清アルブミン(BSA)および0.1% Tween 20を含有するPBS
で1回洗浄する。洗浄液を除去し、抗BrdU抗体を、0.5%
ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1% Tween 20を含有す
るPBS溶液を溶媒とする0.5μg/mLマウス抗BrdU抗体とし
て添加する。この抗体溶液はまた、マウスIg抗体（例え
ば、マウス抗BrdU抗体）を認識する二次抗体（2000倍希
釈）も含有する。この二次抗体を酵素である西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)に結合する。1時間のインキュベ
ーション後、抗体溶液を除去し、細胞をPBSで2回洗浄す
る。2回目のPBS洗浄後、HRP基質（ルミノールを含有す
る）、過酸化水素、およびパラ-ヨードフェノールなど
のエンハンサーを各ウェルに添加する。次いで、各ウェ
ルの光線の量を、フィルムへの露出（プレートの上面に
フィルム片を配置することによって）、または標準的な
状態（例えば、ウェルあたり0.3秒の露出）を使用して
ルミノメーターもしくは発光プレートリーダーを使用し
て各ウェルの発光量を読むことによって検出する。各ウ
ェルからの光線の出力量は、ウェル内で生じたDNA合成
量を示す。薬剤の望ましい組み合わせは、対照と比較し
た場合に、光線の出力が増加または低下するものであ
る。例えば、光線の出力を低下する組み合わせは、DNA
合成速度を低下すると思われ、従って、腫瘍細胞の増殖
を阻止または抑制する際に有効となりうる。または、光
線の出力の増加はDNA合成の増加を示す。例えば、200×
1コンビナトリアルアレイにおいて初代細胞を使用して
もよい（1つの固定された構成要素がDNA合成を遮断し、
従って細胞に対して毒性作用を与える）。このアレイを
使用して、第一の化合物のこの毒性作用を抑制する第二
の試薬をスクリーニングすることができると考えられ
る。種々の免疫不全疾患において、免疫細胞は、同種抗
原または自己抗原に応答して増殖しない。培養免疫細胞
および前述の方法を使用して、免疫細胞の増殖を促進す
る試薬の組み合わせをスクリーニングすることができ
る。または、自己免疫抑制剤をスクリーニングすること
ができる。この例において、免疫細胞の1つの種の集団
（末梢血細胞から単離されたB細胞またはT細胞）を同種
抗原または自己抗原によって刺激する。自己抗原に応答
して増殖を特異的に阻害するが、同種抗原に応答して特
異的に増殖を阻害しない化合物の組み合わせは、有用な
自己免疫治療候補薬である。

【０１０９】活性を検出する他の方法 前述のサイトブロット方法は、BrdU以外の抗原の検出に
容易に適合させられる。さらに、細胞内の種々の翻訳後
修飾を検出することができる。例えば、ヌクレオリンま
たはヒストンH3のリン酸化型に対する抗体は、細胞周期
のM（有糸分裂）期にある細胞を検出するのに有用であ
る。従って、サイトブロットアッセイ法においてリン酸
化ヌクレオリンまたはヒストンH3の増加を生じる化合物
の組み合わせは、M期に細胞を停止させ、抗癌剤である
と思われる組み合わせとなると考えられる。例えば、ア
セチル化ヒストンH4を特異的に認識する抗体を使用し
て、ヒストンH4のアセチル化の増加を検出するためにサ
イトブロットアッセイ法を使用してもよい。ヒストンH4
の過剰アセチル化（hyperacetylation）の増加を生じる
化合物または化合物の組み合わせも抗癌剤である可能性
がある。

【０１１０】前述の例において、培地を除去し、固定液
（70%エタノールまたは4%ホルムアルデヒド（PBSまたは
Tris緩衝食塩水を溶媒とする））を添加するという点に
おいて手法を変更することができる。次いで、固定液を
除去し、透過化処理剤（例えば、Tween 20、TritonX-10
0またはメタノール）を添加することによって、細胞の
膜を透過化処理にする。膜透過化処理剤を除去し、次い
で細胞をPBSまたはTris緩衝食塩水にて洗浄し、次い
で、一次抗体を添加する。通常、これらの他のサイトブ
ロット態様を使用したとき、酸変性段階はない。

【０１１１】レポーター遺伝子アッセイ法 試験要素の特性の測定は、レポーター遺伝子を使用して
実施することができる。この方法は、試薬（例えば、安
定に形質転換した細胞系統）を調製したら、アッセイ法
は例えばサイトブロットアッセイ法より実施が容易で、
時間がかからない。レポーター遺伝子は、発色、蛍光、
発光、または酵素特性により容易に検出されるポリペプ
チドをコードするレポーター要素、およびレポーター遺
伝子の発現に特異性を与えるエンハンサー/プロモータ
ー要素を含む。レポーター要素には、ルシフェラーゼ、
βラクタマーゼ、緑色蛍光炭水化物、青色蛍光タンパク
質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(CAT)、βガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファ
ターゼが挙げられるが、それらに限定されることはな
い。エンハンサー/プロモーター要素には、例えば、NFA
T、p53、TGF-β、または応答するプロモーター/エンハ
ンサーが既知である任意の他のシグナル伝達経路もしく
は刺激に応答するものが含まれる。

【０１１２】NFkB 1つの市販のレポーター遺伝子は、NFkBが活性化された
場合に光線を生ずるルシフェラーゼレポーター遺伝子、
pNFkBである（Stratagene, La Jolla, CA）。このレポ
ーター遺伝子は、関心対象の細胞系統（すなわち、A549
ヒト肺癌細胞）を安定的または一過的にトランスフェク
ションすることができる。安定的にトランスフェクショ
ンした細胞系統を作製するために、pNFkBプラスミドDNA
をG418抵抗性プラスミドおよびトランスフェクション試
薬（例えば、リポフェクタミン、Life Technologies, I
nc., Rockville, MD）と混合し、A549または他の細胞を
ペトリ皿に約40%の集密度で接着させた10 cmのペトリ皿
に添加する。DNA/リポフェクタミンを含有するプレート
を37℃において4〜16時間5% CO2雰囲気下でインキュベ
ーションする。培地を除去し、細胞を無血清培地で2回
洗浄し、次いで10%ウシ胎児血清アルブミン(FBS)を含有
する培地を添加する。G418を、偽トランスフェクション
において全ての細胞を死滅させるのに十分である用量
（約700μg/mL）を添加する（すなわち、G418-抵抗性プ
ラスミドを用いないトランスフェクション）。細胞を37
℃において5% CO2雰囲気下で2週間インキュベーション
し、3日ごとに培地を交換する。安定にトランスフェク
ションしたクローンは、2週間の終了時までに小型のク
ローンとして増殖し、これらのクローンはリング-クロ
ーニングによって分離し、別個に増殖させる。G418-抵
抗性クローンは、一過的にトランスフェクションしたNF
kBが存在する場合に、または存在しない場合に細胞溶解
物からの光線の出力を測定することによって、関心対象
のレポーター遺伝子についてスクリーニングされる。ク
ローンを安定的にトランスフェクトしたpNFkBで同定し
たら、アッセイプレートに細胞を播種することによって
スクリーニングに使用する。

【０１１３】一過的ななトランスフェクションアッセイ
法では、pNFkBプラスミドDNAをトランスフェクション試
薬と混合し、例えばA549細胞を約70%集密度まで接着し
た10cmペトリ皿に添加する。DNA/リポフェクタミンを含
有するプレートを37℃において5% CO2雰囲気下で4〜16
時間インキュベーションする。培地を除去し、細胞を無
血清培地で2回洗浄し、次いで、10%FBSを含有する培地
を添加する。細胞を37℃において5% CO2雰囲気下で24時
間インキュベーションし、次いでスクリーニングするた
めにアッセイプレートに播種する。

【０１１４】レポーター遺伝子は、ウィルスまたはレト
ロウィルス感染、バイオリスティックインジェクション
および裸のDNAの細胞内取り込みを含むが、それらに限
定されることはない他の技術を使用して細胞内に導入す
ることができる。当業者は、アッセイされる細胞内への
レポーター遺伝子の任意の導入方法が本明細書に記載さ
れるスクリーニング方法に適合可能であることを認識す
ると思われる。

【０１１５】レポーター遺伝子を含有する細胞が入手さ
れたら、それらをピペット、マルチチャンネルピペッ
ト、384ウェルマルチドロップ(Multidrop)プレートフィ
ラー（Labsystems, Franklin, MA)、または他の液体取
り扱い装置によりアッセイプレート（96ウェル、384ウ
ェル等）に播種する。いくつかの方法の1つによる組み
合わせを形成するために化合物を添加する。4〜72時間
後、培地を除去し、細胞をHBSSで2回洗浄し、溶解緩衝
液を添加し（Stockwellら、J. Amer. Chem. Soc. 1999,
121: 10662〜106631を参照のこと）、ATP/ルシフェリ
ンを添加し、プレートリーダーまたはルミノメーター
（例えば、LJL BioSystems Inc., Analyst AD, Sunnyva
le, CA）で発光を測定する。

【０１１６】蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ法 別の例において、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ法
（FRET）を、関心対象の2つのタンパク質の相互作用を
検出し、測定するために使用する。この例では、第一の
タンパク質および第二のタンパク質に緑色蛍光タンパク
質（GFP）および青色蛍光タンパク質(BFP)をそれぞれ、
標準的な分子生物学的方法を使用して融合させる。2つ
の融合タンパク質をコードするDNA構築物を、上記のト
ランスフェクション技法または他の匹敵する方法を使用
して、哺乳類細胞、酵母、蠕虫、または他の細胞もしく
は生物において同時発現する。化合物の組み合わせを添
加する。プレートをプレートリーダー上に配置し、以下
のように蛍光を測定する。ドナー蛍光団（すなわち、BF
P）は励起し、アクセプター蛍光団（すなわち、GFP）の
発光を測定する。2つのタンパク質がより接近すると、
アクセプター蛍光団の発光が増加する。従って、関心対
象の2つのタンパク質を互いに接近させる化合物の組み
合わせは、アクセプター蛍光団の蛍光の増加によって同
定される。

【０１１７】例えば、Smad2およびSmad4を含有する発現
ベクターを入手する。GFPのcDNAをSmad2の5'側末端に融
合させ、BFPのcDNAをSmad4の5'側末端に融合させる。こ
れらの発現ベクターを哺乳類細胞に安定的にまたは一過
的にトランスフェクションし、細胞を化合物の組み合わ
せで処理し、BFPを励起するがGFPを励起しない光線をプ
レートに照射する。GFPの蛍光（例えば、512 nmの光
線）を測定し、この波長の光線発光の増加を生ずる化合
物の組み合わせを同定する。このような組み合わせは、
Smad2およびSmad4の距離を互いに接近させ、TGF-βシグ
ナル伝達を活性化させ、従って癌化学療法の粘膜炎およ
び自己免疫疾患を治療するのに有用となりうる。

【０１１８】蛍光カルシウム指示薬色素 試験要素の特性の変化の別の読み取りは、flu-3（Molec
ular Probes, EugeneWA; http://www.molecularprobes.
com）、fura-2、およびindo-1などの蛍光カルシウム指
示薬色素を利用する。Fluo-3は、Ca²⁺に結合しない場合
には本質的に非蛍光であり、〜0.14の飽和Ca²⁺濃度にお
いて量子収率を示す。従って、fluo-3AM(fluo-3AM)の無
傷のアセトキシメチルエステル誘導体も非蛍光である。
Ca²⁺結合したfluo-3の緑色-蛍光発光（〜525 nm）は、
フルオレセイン（FITC)について設計された光学的フィ
ルターセットを使用して簡便に検出される。製造業者の
指示によると、fluo-3は少なくとも100倍のCa²⁺依存的
蛍光増強を示す。

【０１１９】細胞をウェルに播種し、製造業者の指示に
より、fluo-3を細胞に添加し、プレートリーダーを使用
して蛍光を測定する。従って、蛍光を増加させる（しか
し自身は蛍光性ではない）化合物の組み合わせは、細胞
内カルシウム濃度の増加を生じる。

【０１２０】蛍光顕微鏡 別のアッセイ法は、化合物の組み合わせに接触させた細
胞における蛍光のレベルまたは位置の変化を検出するた
めの従来の蛍光顕微鏡を使用する。一例において、GFP
標識したSmad2を発現する安定的にトランスフェクショ
ンした細胞系統を使用する。細胞を播種し、化合物を添
加し、1時間インキュベーションし、自動ステージ付蛍
光顕微鏡を使用して各ウェル内の細胞を画像化する。標
識タンパク質の位置の変化を生ずる化合物の組み合わせ
を同定する。例えば、GFP-Smad2を核の外側から核の内
側に移動させる組み合わせをこの方法で同定することが
できる。これらの組み合わせは、TGF-βシグナル伝達を
活性化し、従って、癌、自己免疫疾患、および粘膜炎を
治療するのに有用となりうる。

【０１２１】cDNAアレイによる発現プロファイリング 試験要素の変化を生じる化合物を検出する別のアッセイ
法は、発現プロファイリングである。この例では、細胞
を播種し、化合物の組み合わせを添加し、細胞を2〜24
時間インキュベーションする。ポリA RNAを、標準的な
方法を使用して各ウェルから回収する。蛍光色素（例え
ば、Cy3-dUTP）を逆転写の間に導入することを除いて、
標準的な方法を使用してRNAをcDNAに逆転写する。Cy3標
識cDNAを未処理の細胞のCy5-標識cDNAと混合し、DNAマ
イクロアレイ（例えば、Nature Genet. Suppl. 21, Jan
1999（参照として本明細書に組み入れられている）に
参照されている、Affymetrix, Santa Clara, CAまたはI
ncyte, Palo Alto, CAから購入可能なDNAマイクロアレ
イ）にハイブリダイゼーションする。マイクロアレイの
各スポットにおけるCy3およびCy5の相対的なレベルは、
各遺伝子の発現の変化であることを示す。この方法は、
疾患遺伝子発現プロフィールから健康なプロフィールへ
の回復などの遺伝子発現の望ましい変化を生じる組み合
わせを同定するために使用される。または、インスリン
などの、所与のシグナリング分子によって生じる発現プ
ロフィールを測定し、インスリンプロフィールを生じる
化合物の組み合わせを見出す。これは、これらの組み合
わせがインスリンの作用を模倣することを示している。

【０１２２】生物全体 本明細書に記載するスクリーニングアッセイ法に適合可
能な別のバイオアッセイ法は、動物全体を使用する。一
例において、線虫C.エレガンス（C. elegans）を個々の
ウェルに配置し（好ましくは、ウェルあたり1匹より多
い線虫）、生物の特性の変化を検出することによって化
合物の活性を検出する。例えば、ライフサイクルの特定
の段階において、または耐久型期（dauer state）にの
み緑色蛍光タンパク質を発現するように線虫を操作する
ことができる。自動式顕微鏡システムを使用して、各ウ
ェルの線虫を画像化し、緑色蛍光タンパク質を測定する
か、または化合物の特定の組み合わせによって生じる蠕
虫の形態変化を検出する。

【０１２３】別の動物全体アッセイ法は、皮膚表面上ま
たは皮膚表面付近に腫瘍を有するヌードマウスなどの大
型動物を使用する。化合物の組み合わせは、皮膚にすり
こみ、皮膚に浸透し、腫瘍に到達するDMSO中の混合物で
あってもよい。または、化合物は静脈内、筋肉内、また
は経口投与することができる。活性を検出するための他
の生物全体方法は、規定の培地中で発生する受精したア
フリカツメガエル卵母細胞から誘導される小型オタマジ
ャクシ、規定の培地中で一定の期間にわたって器官を培
養することができる器官型培養物（マウスまたは他の動
物の外植片）および種々の動物の卵（受精または未受
精）を使用することを含んでもよい。別のアッセイ法
は、2つのバネの間で伸縮する心筋組織または筋組織の
緊張を測定し、収縮を調節する化合物の組み合わせは、
それらのバネの緊張を増加または低下させると思われ
る。

【０１２４】化合物の標識化 組み合わせた実体のいずれをも標識しない場合にも一部
のアッセイを実施することができるが、いくつかの態様
において、試験要素に対する組み合わせの作用を検出ま
たは測定することができるように、組み合わせた実体の
1つまたはそれ以上を標識する。例えば、ビオチン-スト
レプトアビジン相互作用またはヘキサヒスチジン標識タ
ンパク質を使用したタンパク質のアフィニティークロマ
トグラフィーのために生化学において広範に使用されて
いるような技法のような多種多様の既知の任意の標識を
使用することができる（Janknectら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 1991, 88:8972; Wilcheckら、Methods in
Enzymology, Wilcheck, M; Bayer, E. A. Eds. Academi
c Press Inc. San Diego, 1990; pp123〜129）。

【０１２５】分子の組み合わせ 本発明の方法は、1週間あたり150,000までの化合物をス
クリーニングすることができる、既存のロボット工学シ
ステム、96-ウェル、384-ウェル、1536-ウェル、または
他の高密度ストックプレート、および96-、384-または1
536-ウェル、または他の高密度アッセイプレートを使用
することができる。この技術の自動化は、分子の組み合
わせをスクリーニングするために本発明により改良する
ことができる。本発明の方法はまた、従来のフォトリソ
グラフィーまたは工程を小型化する従来ではない方法
（ソフトリソグラフィーまたはニアフィールド光学的リ
ソグラフィーなど）を使用してもよい。本発明の方法は
また、インクジェットプリンティングまたは化合物プリ
ンティング技術を使用してもよい。また、本発明の方法
は、ロボット工学システムと同一の結果およびスループ
ットを達成するために、熟練した技術者を使用してもよ
い。化合物の組み合わせを実施してから、試験要素と接
触させても、または試験要素の存在下においてインサイ
チューで化合物を組み合わせてもよい。これらのプレー
ティングは以下にさらに詳細に記載されている。

【０１２６】手動式プレーティング 化合物は手動により、プレーティングしてもよい（すな
わち、試験する細胞に添加してもよい）。一例におい
て、精製した化合物を手動で組み合わせて、7×7コンビ
ナトリアルアレイにおいて試験する。この場合に7つの
化合物を含む化合物はストックプレート内に存在する。
化合物をアッセイプレート内で組み合わせる。オペレー
ターはストックプレートのウェルから第一の化合物（ま
たは、複数の化合物）をアッセイプレートの1列に配置
し、次いでアッセイプレートの1カラムに配置する。こ
れをストックプレートの第二のウェルを用いて反復し、
アッセイプレートへのプレーティングのみが、第一の化
合物をプレーティングしたものから列およびカラムを形
成する。この過程を、組み合わせの完全なセットがプレ
ーティングされるまで反復する。

【０１２７】ロボットプレーティング コンビナトリアルアレイを形成するためにウェルに化合
物を添加するための数多くの方法があり、当業者は、以
下の例は例示的な目的のためで、どのようにも限定的で
ないことを認識すると考えられる。

【０１２８】ロボットプレーティングの一例では、ロボ
ット液体移動システムを使用する。移動システムは、例
えばBeckman Coulter(Fullerton, CA)、Tecan(Research
Triangle Park, NC)またはZymark(Hopkinton, MA)から
購入可能である。ロボットシステムは、列1が同一の化
合物を有し、列2が同一の化合物を有するように所定の
列の各ウェル内に規定の容量の第一のセットの化合物を
プレーティングする。次いで、液体移動装置は、各カラ
ムが同一の化合物を収容するように（しかし、異なるカ
ラムは異なる化合物を収容する）、カラムに沿って同じ
セットの化合物をプレーティングする。移動システム
は、小容量（例えば、1nL）を移動するように改良する
ことができる。

【０１２９】効果的な移動のための別の方法はインクジ
ェット技術を使用する（Gordonら、J. Med. Chem. 199
4, 13: 1385〜1401; Lemmoら、Curr. Opin. Biotechno
l. 1998, 9: 615〜617）。インクジェットプリンターは
試験化合物を含有する複数の容器から液を出す；ソース
ウェルの各化合物を、各化合物のおのおのの個々の列お
よびカラムの表面にプリントアウトまたは注入する。上
記のように、次の化合物は次の列および次のカラムにプ
リントアウトされ、グリッド全体に化合物の組み合わせ
がプレーティングされるまでこれを反復する。

【０１３０】アッセイプレートに化合物を添加するため
のさらに別の方法は、DNAをスポットするためにスタン
フォード大学のPatrick Brownによって開発されたマイ
クロアレイスポッターを使用する。この装置は、ストッ
クプレートに浸漬し、全ての列にプリントする8-キルペ
ンプリンティングヘッドおよび8リニアキルヘッドを使
用する。その後、プレートが90度回転するか、またはプ
リンティングヘッドが90度回転する；次いで、プリント
ヘッドはカラムにプリントする。例えば、標準的な384
ウェルプレートの2、4または16のプリントヘッドおよび
より高密度プレートのより多い数を使用してプリントヘ
ッドのサイズを変更してもよい。

【０１３１】アッセイプレートに化合物を添加するさら
に別の方法は、化合物の標準的なストックプレートから
既知の用量を滴下することができる384の別個のシリン
ジを備えることができる、Hydra（Robbins Scientific,
Sunnyvale, CA）と呼ばれる市販の機器を使用する。

【０１３２】試験化合物をプレーティングするための別
の方法は、Caliper Technologies(Mountain View, CA)
から購入可能であって、この組み合わせを作製すると思
われるアレイを作製することにそのシステムを直接適用
するものなどのマイクロ流体工学システムを使用する。
この場合には、マイクロスケールの組み合わせのアレイ
は、マトリックスの交点に化合物溶液を分配する毛細管
流動を使用して作製される。

【０１３３】別のプレーティング方法 当業者は、任意のプレート構造を本発明のスクリーニン
グ方法に適合することができることを認識すると思われ
る。例えば、16×16スクエアプレートは、16×24プレー
トの384ウェルの代わりに256ウェルを有すると思われ
る。これにより、単純に四角プレートを90度回転して、
他の方向に添加することができるので、列にだけまたは
カラムにだけ液体を添加する任意の液体添加システムを
適合することができる。また、適合したマイクロスクエ
アープレートを任意の既存のプレート液体取り扱いシス
テム内にフィットするように、標準的な96ウェルまたは
386ウェルのマイクロタイタープレートの寸法またはフ
ットプリントを有するスクエアープレートホルダーをこ
の設計に導入してもよい。

【０１３４】組み合わせにおいて試験される化合物また
は要素を提供する別の方法は、液体ではなく、例えば少
量の乾燥粉末のような固形の形態でそれらを提供するこ
とである。従って、2つの乾燥成分（または一方は濡れ
た成分で、一方は乾燥した成分）を混合して、次いで組
み合わせを（組み合わせた実体が可溶性である）培地中
の細胞に添加する。固形化合物は、異なる化合物を添加
する組み合わせ合成（combinatorial synthesis）から
のビーズを含む。例えば、ビーズはビーズピッカーで添
加してもよい。一例において、ビーズは磁気で、磁石を
使用して添加される。

【０１３５】本発明のロボット工学適用の高スループッ
トアッセイ法では、各ウェルは独立に間隔をおいて処理
されなければならず、好ましくは、ストックプレートか
ら大容量（100μLまで）および小容量（1nLまで）の各
化合物を引き出すことができる。本発明のコンビナトリ
アルスクリーニングアッセイ法を実施するための例示的
なロボットプラットフォームを以下に記載する。

【０１３６】2ステーション式ロボットプラットフォー
ムを作製する。第一のステーションはVWR(cat#62409-60
8)により入手可能なものなどのピントランスファー装置
が取り付けられた単純なXYZロボットアームを有する。
ストックプレートおよびアッセイプレートはステーショ
ン内に入り、ロボットアームがストックプレートにピン
を投入し、これらのピンをアッセイプレートに移動する
ことによってピンのサイズに応じて1〜1000nLを送達す
る（最も典型的には、50nLが送達される）。異なるピン
装置により、上記した例のように、化合物の異なる組み
合わせを移動することができる。ロボットの第二のステ
ーションは、1つの化合物のストックウェルから大容量
（10マイクロリッターまで）を引き出して、次いでアッ
セイプレートの各ウェルに小容量を分注することができ
るピエゾ電気式分注器である。例えば、Ivek Digispens
e 2000システム（http://www.ivek.com/digi2000.htm
l）は10nLの分解能を有し、この目的に十分であるはず
である。

【０１３７】非化合物組み合わせ試薬 実体プレートに存在する組み合わせ試薬が化合物でない
場合には（すなわち、なんらかの形態の放射線である場
合）、細胞および添加された化合物を含有するプレート
は放射線源を通過させることによって、組み合わせの形
成を完了することができる。他の形態の非化合物組み合
わせ試薬には、例えば高圧および熱が含まれる。

【０１３８】非化合物試薬は、化合物の添加と同様の方
法で変更することができる。例えば、pHを変更するため
には、異なる量の塩基または酸をウェルに添加する。同
様に、化合物の添加に適用可能な任意の方法を使用して
イオンを添加することができる。

【０１３９】ライブラリーサイズ 小型化学物質ライブラリー（<1000化合物）では、全て
のライブラリー（50万までの組み合わせ）および第三の
組み合わせ（数百万までの組み合わせ）を本明細書に記
載されるシステムを使用して試験することができる。

【０１４０】組み合わせの力は、多変量治療を同定する
のに効果的なライブラリーを速やかに形成する。多変量
治療ライブラリーのサイズは速やかに競争し、任意の従
来の入手可能な多様性ライブラリーまたは非多様性ライ
ブラリーにわたり拡大する。対応のある組み合わせの20
0の化合物のライブラリーは、細胞分裂に影響を与える
新規化合物を同定するために最近使用されている天然産
物ライブラリーよりサイズが大きい、19,900の組み合わ
せの多変量治療ライブラリーを作製する（Mayerら、Sci
ence, 1999, 286, 971〜974）。3ウェイ組み合わせにお
ける300化合物のライブラリーは、現在形成されている
最も大きいコンビナトリアル・ケミストリーライブラリ
ーより大きく、おそらくより大きい多様性を有する、多
変量治療ライブラリーの約450万の別個の組み合わせを
作製する。

【０１４１】活性順位付けスクリーニング 標準的な方法を使用して、多様性ライブラリーを最初に
個別に試験することができる。化合物は生物学的アッセ
イ法においてスクリーニングされ、活性によって格付け
される。次いで、ライブラリーの最も活性な化合物（例
えば、アッセイされる組み合わせ空間（combinatorial
space）の量に応じて、20の最も活性な化合物、または1
000の最も活性な化合物）を対応のある組み合わせおよ
び3-ウェイ組み合わせで試験する。望ましい場合には、
これらの組み合わせは活性よって格付けすることがで
き、望ましい数の効果的な組み合わせが同定されるま
で、この過程を4-ウェイ組み合わせ、5-ウェイ組み合わ
せ等について反復することができる。

【０１４２】遺伝的アルゴリズム 遺伝的アルゴリズムの使用により、1つの薬剤自体とは
別個の望ましい生物学的活性を有する薬剤の組み合わせ
を同定する別の方法が提供される。この方法では、各1
薬剤に、任意のシリーズの数、文字、または他の記号で
あってもよい独自のバーコードを割り付ける。好ましい
様式の態様において、バーコードはバイナリーコード
（ゼロおよび1）である。可能な対応のある組み合わせ
の総合プールから、対応のある組み合わせの特定の数
（N、「母集団サイズ」）を選択し（無作為またはいく
つかの他の特徴に基づいて）、これらの組み合わせの各
々の活性を測定する。母集団の最も活性なメンバーXを
選択する（XがNより小さい場合）。(i)複製（元の組み
合わせが再び単純に選択される）、（ii）変異（バーコ
ードの1ビットが異なる値に変異する）、および(iii)組
換え（2つのバーコードが各々中点で分割し、対向末端
が結合して2つの新規ハイブリッドバーコードを作製す
る）を含む一連のオペレーターを使用して、Xの活性な
組み合わせからNの新規組み合わせを形成する。この選
択、増幅、変異、および組換え過程を数多くのサイクル
にわたって反復し、薬剤の各組み合わせの活性を各サイ
クルの終了時に測定する。これは、限られた数の組み合
わせを試験する方法を提供すると同時に、薬剤の有効性
の高い組み合わせを発見することを可能にする。

【０１４３】遺伝的アルゴリズム（または他のアルゴリ
ズム）のパラメーターを最適にする方法は以下のようで
ある：N薬剤のC組み合わせを検討に選択する。(N!)の全
セットの各メンバーの活性/((N-C)！(C!))組み合わせ、
を測定する。さらに、全てのより低い次数の組み合わせ
を同様に測定することができる。この活性の十分なデー
タセットを用いて、種々のアルゴリズムの成功および有
効性、またはさらに「湿式」ベンチ作業を実施すること
なく1つのアルゴリズムの種々の順列を評価することが
可能である。すなわち、活性のある組み合わせを発見す
るための全ての方法を「コンピューター内（in silic
o）」で比較することができ、それらの相対的な性能を
比較することができる。

【０１４４】ストック溶液 2種類のストック溶液を維持する。各化合物は両方のス
トック様式で寄託される。第一のストック溶液様式は、
最終濃度4 mMで100マイクロリッターのジメチルスルホ
キシド(DMSO)に溶解し、384ウェルポリプロピレンプレ
ート（Matrix Technologies）に保存した化合物を含
む。第二の種類のストック溶液は、最終濃度4 mMで1500
マイクロリッターのDMSOに溶解し、深型ウェル96ウェル
ポリプロピレンプレートに保存した化合物からなる。各
種のプレートの多数のコピーを作製する。ストックプレ
ートの1コピーを、通常の用途のために-20℃において保
存し、バクアップコピーを長期保存のために-80℃にお
いて保存する。

【０１４５】アッセイプレート 3種のアッセイプレートを使用する。上記のピン移動装
置のピンのサイズは、各サイズのアッセイプレートを収
容するように適合される。 1)市販の384ウェルプレート（例えば、NalgeNunc白色不
透明なポリスチレン細胞培養処理済み滅菌プレート、ca
t#164610） 2)市販の1536ウェルプレート（例えば、GreinerまたはC
orning） 3)特注製造した1536または6144ウェルプレート（ポリジ
メチルシロキサン製、Dow Corning）およびdelranモデ
ルおよびOmniトレー。

【０１４６】化合物の添加を管理するためのソフトウェ
ア 上記の機器を操作するためにソフトウェアを書き込むた
めに、従来のプログラム技法を使用して、マイクロソフ
トビジュアルベイシック（Microsoft Visual Basic）ま
たはプログラム言語を使用する。プログラムにより、機
器はストックプレートまたはアッセイプレートのバーコ
ードを読むことができ、アッセイデッキ上のプレートの
位置を追跡することができ、適当な用量の適切な化合物
を適切なアッセイウェルに移動することができる。従っ
て、スクリーニングされる全ての組み合わせをあらかじ
め測定または選択し、機器は、アッセイデッキに規定さ
れたプレートを配置する段階およびアッセイデッキから
規定されたプレートをインキュベーターから取り出す段
階などの、単純なオペレーター段階だけを必要とする自
動式様式でコンビナトリアルスクリーニングを実施す
る。

【０１４７】バーコードリーダーおよびプリンター 各プレートの独自の識別番号を作製し、ラベルにバーコ
ードをプリントし、アッセイプレートまたはストックプ
レートにラベルをスタンプするために、標準的な技法を
使用してバーコードプリンターを使用する。ソフトウェ
アは、各アッセイプレートおよびストックプレートの各
ウエル中の各化合物の性質を記録する。アッセイデッキ
に結合したバーコードリーダーは、それが流入し、アッ
セイデッキを出るとき各プレートをスキャンする。

【０１４８】以下の実施例は例示的な目的のために提供
されており、いかなる限定も意図していない。

【０１４９】

【実施例】実施例1 図1は、試薬が同じ細胞の異なる標的に結合する場合
に、2つの異なる試薬が細胞の内部でどのように相乗的
に作用するかを示す概念図である。この図において、化
合物A(10)および化合物B(12)は原形質膜(14)を通過し、
哺乳類細胞の細胞質ゾル領域に自由に拡散する。化合物
Aは、キナーゼであるタンパク質X(16)に結合し、このキ
ナーゼの活性を阻害する。キナーゼXは、通常、Yにリン
酸基を付加することによって、転写因子Y(18)を不活性
化する。化合物AがキナーゼXを阻害すると、転写因子Y
が活性化され、Yは核内に移動し、インスリンなどの治
療遺伝子のエンハンサー領域のDNAに強く結合する。し
かし、転写因子Yは、第二の転写因子Z(20)が存在しない
場合にはインスリンの発現を活性化できない。しかし、
図では、化合物Bが、転写因子Zに結合して、この転写因
子の自己抑制性ループを除去することによって、この転
写因子Zを核内に移動させ、転写因子Yと結合する。Yお
よびZは一体として治療遺伝子、インスリンの発現の活
性化を可能にするが、単独では可能にしない。

【０１５０】図2は、試薬が異なる細胞または組織の標
的に結合する場合に、2つの異なる試薬が生物の内部で
どのように相乗的に作用するかを示す概念図である。こ
の図では、化合物A(50)は膵臓(54)のβ島細胞(52)に拡
散する。化合物Aは、インスリン(56)をコードする治療
遺伝子をこれらの細胞中で発現させる。しかし、インス
リンは、脂肪組織における標的脂肪細胞上にインスリン
受容体が存在しない場合には無効である。一方、化合物
Bは脂肪組織(60)における脂肪細胞(58)に拡散し、これ
らの細胞中でインスリン受容体(62)の発現を刺激する。
AおよびBは一体としてこの個体においてインスリンの活
性を回復させるが、一方の単独では回復させない。

【０１５１】図3から図7は、本特許明細書において本発
明者らが記載する種類のコンビナトリアルスクリーニン
グにおいて得られる実験データの例である。5つの異な
る384ウェルプレートの結果を示す。結果は、A〜Pまで
ラベルした16列および1〜24までラベルした24カラムか
らなるプレート様式で示す。活性レベルは各ウェルにお
いて数で示し、1は基底状態の活性（影響なし）を意味
し、5は活性の組み合わせが見られることを意味する。
プレート1は、A549ヒト癌細胞（以下に記載する）にお
いて細胞周期停止活性についてブロモデオキシウリジン
サイトブロットアッセイ法において4μg/mLで試験した
ときの、化合物1〜384の活性を示す。プレート2は、同
アッセイ法において2μg/mLで試験したときの、化合物1
〜384の活性を示す。プレート3は、同アッセイ法におい
て4μg/mLで試験したときの、化合物385〜768の活性を
示す。プレート4は、同アッセイ法において2μg/mLで試
験したときの、化合物385〜768の活性を示す。プレート
1〜4では、化合物のどれもいかなる活性も示さないこと
に注目されたい。プレート5は、2μg/mLで試験したとき
の（すなわち、化合物1〜384および385〜768を共に各化
合物2μg/mLの濃度でアッセイプレートに同時に添加
し、384の異なる無作為な対応のある組み合わせを作製
する）、384の対応のある化合物の組み合わせの活性を
示す。ウェルA1は活性を示すことに注目されたい。これ
は、化合物1(化合物1〜384のプレートのウェルA1)自体
は活性を持たず、化合物385(化合物385〜768のプレート
のウェルA1)自体は活性を持たないが、化合物1および38
5は一体として相乗的に作用して活性な組み合わせを作
製することを意味する。

【０１５２】実施例2 一般的方法 図8は、現在市販により入手可能な技術を使用してコン
ビナトリアルスクリーニングを実施する方法の模式図で
ある。ヒトA549肺癌細胞をアメリカンタイプカルチャー
コレクション（American Type Culture Collection）(A
TCC、カタログ番号CCL185)から入手し、10% FBS、100単
位/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプ
トマイシン、および2 mMグルタメート（GibcoBRL, Rock
ville, MD）を含有するダルベッコの改変イーグル培地
(DMEM)(10%培地と呼ぶ)中で37℃において5%CO2雰囲気下
で培養する。白色不透明な384-ウェルプレート(100)(Na
lgeNunc International, Rochester, NY)の各ウェル
に、マルチドロップ384液体ディスペンサー(110)(Labsy
stems Microplate Instrumentation Division, Frankli
n, MA)を使用して4000細胞を播種する。細胞は40μLの1
0%FBS含有培地に播種する。

【０１５３】37℃において5%CO2雰囲気下で16時間後、
関心対象の化合物の10%培地における50μMストックの10
μLを各ウェルに添加し、総ウェル容量を40μLにし、こ
の化合物の最終濃度を10μMとする。その前、直後、ま
たは数時間後もしくは数日後に、ピンアレイ130の小さ
いピンをストックプレート(140)または(150)の各ウェル
に浸漬し、次いでアッセイプレート(100)の各ウェルに
浸漬することによって第二のセットの化合物を添加す
る。マトリックステクノロジーピントランスファー（Ma
trix Technologies Pin Transfer）装置(130)(384また
は96ピン)が十分であると考えられる（カタログ番号350
500130および350510203）。この二段階方法により、多
数の対応のある組み合わせにおいて、1つの特定の化合
物を大多数の他の化合物に対して試験することが可能に
なる。新規特性が組み合わせで達成されるかどうかを判
定するために、元の化合物（全てのウェルに存在する化
合物）が存在しない場合に、ピン移動化合物のセットを
試験するプレートを有することも必要である。

【０１５４】試験要素と接触させる化合物の組み合わせ
を提供するために、異なる方法を使用することもでき
る。例えば、上記のように、対応のある組み合わせ全体
に1つの化合物を固定させないで、そのセットの全ての
対応のある組み合わせが達成される方法で化合物のセッ
トをピン移動することができる。16化合物のセットをス
トックプレート(140)から384ウェルアッセイプレート(1
00)の16列にピン移動する。次いで、同じ16化合物のセ
ットを同アッセイプレートの16カラムに移動して、異な
る対応のある組み合わせを有する256ウェルマトリック
スを提供する。

【０１５５】前述の実施例の各々（または類似の形態）
において、望ましい化合物を全て添加した場合に、A549
および化合物を含有するアッセイプレートをインキュベ
ーター(120)で37℃において5%二酸化炭素雰囲気下にお
いて48時間インキュベーションする。この時間の終了時
に、マルチドロップ384(110)を使用して、培地の50μM
ストック（PBS、pH 7.4の10 mMストックから調製）から
10μLのBrdUを添加し、最終濃度10μM BrdUとする。細
胞を37℃において5%CO2雰囲気下においてインキュベー
ター(120)でさらに12〜16時間インキュベーションす
る。吸引のためにプロトコール全体で使用し、ハウス真
空源に取り付けた24-チャネルワンド（V&P Scientifi
c）を用いて各ウェルから上清を除去した。細胞は冷却
した50μLの(4℃)70%エタノール/30%PBSで固定し、氷上
で1時間インキュベーションし、90μLの冷却した(4℃)P
BSで洗浄し、次いで25μLの2M HCl/0.5%Tween 20/ddH₂O
を添加する。細胞を室温において20分間インキュベーシ
ョンし、90μLの10% 2M NaOH/90%ハンクスの平衡塩類溶
液(HBSS, GibcoBRL)で洗浄し、90μLのHBSSで2回、75μ
LのPBSTB(PBS, 0.1% Tween 20(Sigma), 0.5%ウシ血清ア
ルブミン(Sigma-Aldrich,St. Louis, MO)で1回洗浄す
る。次いで、0.5μg/mLのマウス抗BrdU抗体（ストック
の1000倍希釈、(BD Biosciences-PharMingen San Dieg
o, CA)）およびHRPに結合した2000倍希釈の抗マウスIg
抗体(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway,
NJ)をPBSTB中に含有する20μLの抗体溶液を添加する。
細胞を室温において1時間インキュベーションし、90μL
のPBSで2回洗浄し、次いで20μLのHRP基質溶液を各ウェ
ルに添加する。Amersham ECL検出キットの等容量の溶液
1および溶液2を混合することによってHRP基質溶液を得
る。プレートをLJL Biosystems Inc.(Sunnyvale, CA)
アナリストAD プレートリーダー(160)に配置し、各ウェ
ルの発光を0.3秒検出する。次いで、組み合わせの活性
を、元の濃度および元の濃度のN倍の両方において1つの
薬剤単独の活性と比較する。ただし、Nはスクリーニン
グに見出される活性ナトリウム化合物の数に等しい。組
み合わせが元の濃度および元の濃度のN倍の両方におい
て1つの薬剤単独の各々の活性より大きい場合には、相
乗作用が観察された。相乗作用が観察されない場合で
も、組み合わせは、組み合わせを形成する個々の構成要
素と比較したとき、有利な特性（例えば、低い副作用）
を有する場合がある。

【０１５６】前述の方法は、2つの異なる化合物を第一
の段階において添加し、3-ウェイ組み合わせの試験を可
能にするように容易に改良される。同様に、3つの化合
物を添加して、4-ウェイ組み合わせ等の試験を可能にす
ることができる。このような方法を使用すると、より高
次数の化合物の組み合わせが試験される。

【０１５７】増殖を阻止する化合物の組み合わせの同定
を以下に記載する。この記載は例示的な目的のものであ
り、いかなる場合においても限定的であるべきではな
い。

【０１５８】7つの化合物を単独および21の全ての可能
な対応のある組み合わせで、BrdUサイトブロットアッセ
イ法（以下を参照）において細胞周期進行に対する作用
を試験した。7つの化合物（ポドフィロトキシン(podoph
yllotoxin)、パクリタキセル(paclitaxel)、キナクリン
(quinqcrine)、ベプリジル(bepridil)、ジピリダモー
ル、プロメタジン、およびアグロクラビン(agroclavin
e)；各々Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MOより購入
した）をガラスバイアルに1グラムを秤量し、ジメチル
スルホキシドに溶解して4 mg/mMストック溶液を作製し
た。6000のA549肺癌細胞を、384の白色不透明NalgeNunc
細胞培養処理済みプレート（cat#164610）の各ウェルに
10%培地（全てLife Technologiesから入手した；10% ウ
シ胎児血清アルブミン、100単位/mLペニシリンGナトリ
ウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、および2 mM
グルタメート（GibcoBRL, Rockville, MD）を含有する
ダルベッコの改変イーグル培地）30μLに播種した。各
化合物を最終アッセイ濃度まで10%培地で4倍希釈した
（最終アッセイ濃度は0.25%DMSO、240nMポドフィロトキ
シン、60 nMパクリタキセル、420 nMキナクリン、25μM
ベプリジル、400 nMジピリダモール、25μMプロメタジ
ンおよび840nMアグロクラビン）。培地中の化合物の各4
×ストックの15マイクロリッターを、7つの化合物の全
ての可能なバイナリー組み合わせおよび1つの薬剤自体
が試験されるように、8カラムおよび8列の四角（第8レ
ーンは基剤DMSOだけを含有する）の1つの列および1つの
カラムに添加した。細胞を37℃において5%二酸化炭素雰
囲気下で46時間インキュベーションした。10%培地中のB
rdU 50μM溶液の15μLを添加することによって、BrdUを
10μMの最終濃度まで添加した。細胞を37℃において5%
二酸化炭素雰囲気下で一晩インキュベーションした。

【０１５９】16時間後、プロトコール全体で使用され、
ハウス真空源に取り付けられた24-チャネルワンド（V&P
Scientific）を用いて各ウェルから培地を吸引した。
全てのその後の液体の添加段階に使用されるMultidrop
384プレートフィラー（Labsystems）を用いて、50μLの
70%エタノール/30%リン酸緩衝食塩水（4℃）を各ウェル
に添加した。室温においてプレートを1時間インキュベ
ーションし、次いでウェルを吸引し、0.5%Tween 20を含
有する2M HCl 25μLを各ウェルに添加した。プレートを
室温において20分間インキュベーションした。次いで、
25マイクロリッターの2M NaOHを各ウェルに添加した。
各ウェルの液体を吸引し、ウェルを75μLのハンクスの
平衡塩類溶液で2回洗浄した。ウェルを75μLのPBSTM(0.
5%ウシ血清アルブミンおよび0.1% Tween 20を含有する
リン酸緩衝食塩水)で再度洗浄した。20マイクロリッタ
ーの抗体溶液を各ウェル（0.5μg/mLの抗BrdU抗体（Pha
rmMingen）および2000倍希釈の抗マウスIg-HRP(Amersha
m)を含有する）に添加した。プレートを抗体溶液ととも
に室温において1時間インキュベーションし、次いで抗
体溶液を吸引除去し、各ウェルをリン酸緩衝食塩水で1
回洗浄した。最後に、20μLのECL検出試薬を各ウェルに
添加した（Amersham's ECL検出試薬の溶液1および溶液2
の等量混合物）。各ウェルの発光をLJLアナリストプレ
ートリーダーで、ウェルあたり0.2秒の積算時間を用い
て読み取った。2つのプレートにおいて実験を反復し、
各対応のある組み合わせを16の反復実験の全てにおいて
試験した。表1に示すデータは、化合物の各々の組み合
わせの平均抗増殖活性を示す。5つの統計学的に有意な
（p<0.001）組み合わせを強調してある。全ての活性
は、いかなる処理も受けていない細胞を含有するウェル
のセットに正規化してある。従って、値1は不活性基質
であり、1より大きい値は抗増殖活性のレベルを示す。

【０１６０】

【表１】 チャートは、個々の構成要素とは別個の、抗増殖活性を
有する既存のFDA承認薬の5つの組み合わせを示す。ポド
フィロトキシンおよびパクリタキセルは共に、細胞を有
糸分裂状態で停止させる微小管安定剤であり、ジピリダ
モールは抗血小板剤であり、ベプリジルはカルシウムチ
ャネル遮断剤であり、プロメタジンはH1ヒスタミン受容
体アンタゴニストであってCNS抑制剤および抗コリン作
動薬としても使用される。ジピリダモールは、一般に、
特に、パクリタキセルおよびポドフィロトキシンの毒性
の副作用と比較した場合に、ヒトに対する治療薬として
比較的安全性の高いプロフィールを有すると考えられて
いる。従って、このアッセイ法において、ジピリダモー
ルはパクリタキセルおよびポドフィロトキシンのヒト肺
癌細胞に対する抗増殖作用を増強する。さらに、ベプリ
ジはポドフィロトキシンの作用を増強するが、パクリタ
キセルの作用を阻害する。この結果は、従来には予測さ
れておらず、薬剤間の予期されない相互作用を観察する
ための組み合わせの実験的高スループット試験の重要性
を強調している。例えば、ベプリジルおよびプロメタジ
ンは、どちらも現在の治療薬の適応では抗増殖薬として
使用されていないが、組み合わせると、肺癌細胞の増殖
を強力に阻止する。

【０１６１】他の態様 上記の明細書に記載した全ての刊行物および特許は参照
として本明細書に組み入れられている。本発明の範囲お
よび精神から逸脱することなく、記載されている本発明
の方法およびシステムの種々の改良および変更を加える
ことができることは当業者に明らかである。本発明は具
体的な好ましい態様に関連して記載されているが、主張
されている本発明はこのような具体的な態様に不用意に
限定されるべきではないことが理解されるべきである。
実際、薬剤発見分野または関連する分野の当業者に明ら
かである本発明を実施するための記載されている様式の
種々の改良は本発明の範囲内であることが意図されてい
る。

【０１６２】

【発明の効果】本発明の高スループットスクリーニング
方法は、製薬産業で使用される従来の薬剤発見方法の迅
速で、強力な別法となる。本発明は、例えば低分子（そ
のいくつかは新規に合成してもよく、またはそのいくつ
かは既知のFDA承認済み薬剤であってもよい）の以前に
は知られていなかった治療的に強力な組み合わせを同定
することができる。効果的な組み合わせが、全てがすで
にFDAの承認を得ている2つ、3つ、4つ、またはそれ以上
の薬剤によってのみより作製される場合には、新たな組
み合わせは、FDA承認過程を介して容易に移動するさら
なる利点を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 試薬が同一の細胞内の異なる標的に結合する
場合に、細胞の内部で2つの異なる試薬が相乗的にどの
ように作用するかを示す概念図である。

【図２】 試薬が異なる細胞または組織内の標的に結合
する場合に、生物の内部で2つの異なる試薬が相乗的に
どのように作用するかを示す概念図である。

【図３】 本明細書に記載される種類のコンビナトリア
ルスクリーニングにおいて得られる実験データの例であ
る。5つの異なる384ウェルプレートの結果のうちプレー
ト1の結果を示す。結果は、A〜Pまでラベルした16列お
よび1〜24までラベルした24カラムからなるプレート様
式で示す。活性レベルは各ウェルにおいて数で示し、1
は基底状態の活性（作用なし）を意味し、5は活性の組
み合わせが見られることを意味する。

【図４】 本明細書に記載される種類のコンビナトリア
ルスクリーニングにおいて得られる実験データの例であ
る。5つの異なる384ウェルプレートの結果のうちプレー
ト2の結果を示す。結果は、A〜Pまでラベルした16列お
よび1〜24までラベルした24カラムからなるプレート様
式で示す。活性レベルは各ウェルにおいて数で示し、1
は基底状態の活性（作用なし）を意味し、5は活性の組
み合わせが見られることを意味する。

【図５】 本明細書に記載される種類のコンビナトリア
ルスクリーニングにおいて得られる実験データの例であ
る。5つの異なる384ウェルプレートの結果のうちプレー
ト3の結果を示す。結果は、A〜Pまでラベルした16列お
よび1〜24までラベルした24カラムからなるプレート様
式で示す。活性レベルは各ウェルにおいて数で示し、1
は基底状態の活性（作用なし）を意味し、5は活性の組
み合わせが見られることを意味する。

【図６】 本明細書に記載される種類のコンビナトリア
ルスクリーニングにおいて得られる実験データの例であ
る。5つの異なる384ウェルプレートの結果のうちプレー
ト4の結果を示す。結果は、A〜Pまでラベルした16列お
よび1〜24までラベルした24カラムからなるプレート様
式で示す。活性レベルは各ウェルにおいて数で示し、1
は基底状態の活性（作用なし）を意味し、5は活性の組
み合わせが見られることを意味する。

【図７】 本明細書に記載される種類のコンビナトリア
ルスクリーニングにおいて得られる実験データの例であ
る。5つの異なる384ウェルプレートの結果のうちプレー
ト5の結果を示す。結果は、A〜Pまでラベルした16列お
よび1〜24までラベルした24カラムからなるプレート様
式で示す。活性レベルは各ウェルにおいて数で示し、1
は基底状態の活性（作用なし）を意味し、5は活性の組
み合わせが見られることを意味する。

【図８】 現在市販されている入手可能な技術を使用し
て、コンビナトリアルスクリーニングを実施する方法の
線図である。

【符号の説明】

１０ 化合物A、１２ 化合物B、１６ タンパク質X、
１８ 転写因子Y、２０転写因子Z、１４ 原形質膜、５
０ 化合物A、５２ β島細胞、５４ 脾臓、５６ イ
ンスリン、５８ 脂肪細胞、６０ 脂肪組織、６２ イ
ンスリン受容体、１００ アッセイプレート、１１０
マルチドロップ384プレートリーダー、１２０ 5％CO₂
による37℃インキュベーター、１３０ ピンアレイ（Ma
trix Technologies Pin Transfer 装置）、１４０ 貯
蔵プレート、１５０ 貯蔵プレート、１６０ LJLアナ
リストADプレートリーダー。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年７月１８日（２００２．７．１
８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ Ｍ 33/58 33/58 Ａ 37/00 １０２ 37/00 １０２ １０３ １０３ // Ｇ０１Ｎ 21/64 21/64 Ｅ Ｆ (72)発明者 ブレント アール． ストックウェル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン アパートメント ＃４ ウエスト シダー ストリート 59 (72)発明者 アレクシス ボリシー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン アパートメント ＃２ リベル ストリート 31 (72)発明者 マイケル エー． フォリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 チ ェストナット ヒル ウォルコット ロー ド 93 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA01 FA02 GA25 GB21 KA02 KA05 2G045 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA30 DA36 DA60 DA80 DB00 FA11 FA16 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 GC22 HA16 4B063 QA01 QQ05 QR68 QS24 QS31 QS40 4C084 AA17 NA14 ZB262

Claims (63)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実体の少なくとも49の独自の組み合わせ
   を含む少なくとも7×7のコンビナトリアルアレイにおい
   て少なくとも7つの実体を使用して生物学的活性につい
   て2つの実体またはより高次数の組み合わせをスクリー
   ニングする方法であって、以下の段階を含む方法： (a)該実体を提供する段階； (b)実体の組み合わせの該アレイを作製する段階； (c)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
   要素を提供する段階； (d)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条
   件下において、実体の組み合わせの該アレイに該試験要
   素を接触させる段階； (e)試験要素の特性を検出または測定する段階；および (f)組み合わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の
   該特性に対する作用を生じる実体の組み合わせを同定す
   る段階。
2. 【請求項２】 段階(b)および(d)が、実体に試験要素を
   連続的に接触させることによって該試験要素の存在下に
   おいてアレイを作製する段階を含む、請求項1記載の方
   法。
3. 【請求項３】 試験要素が2つまたはそれ以上の別個の
   生物学的部分を含む、請求項1記載の方法。
4. 【請求項４】 試験要素が生細胞を含む、請求項3記載
   の方法。
5. 【請求項５】 検出段階(e)がサイトブロットアッセイ
   法によって実施される、請求項4記載の方法。
6. 【請求項６】 検出段階(e)がレポーター遺伝子アッセ
   イ法によって実施される、請求項4記載の方法。
7. 【請求項７】 検出段階(e)が蛍光共鳴エネルギー移動
   アッセイ法によって実施される、請求項4記載の方法。
8. 【請求項８】 検出段階(e)が蛍光カルシウム結合指示
   薬色素を検出することによって実施される、請求項4記
   載の方法。
9. 【請求項９】 検出段階(e)が蛍光顕微鏡を使用する、
   請求項4記載の方法。
10. 【請求項１０】 段階(e)が発現プロファイリングを使
    用する、請求項4記載の方法。
11. 【請求項１１】 細胞がヒト細胞である、請求項4記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 細胞が、癌細胞、免疫細胞、ニューロ
    ンおよび線維芽細胞からなる群より選択される、請求項
    4記載の方法。
13. 【請求項１３】 試験要素が、少なくとも2つの生体分
    子と少なくとも1つのレポーター分子を含む無細胞培地
    を含む、請求項1記載の方法。
14. 【請求項１４】 段階(b)および(d)の一方または両方
    が、ロボット工学システムを使用して実施される、請求
    項1記載の方法。
15. 【請求項１５】 段階(b)および(d)の一方または両方が
    マイクロ流体工学を使用して実施される、請求項1記載
    の方法。
16. 【請求項１６】 段階(b)および(d)の一方または両方が
    インクジェットプリンター技術を使用して実施される、
    請求項1記載の方法。
17. 【請求項１７】 実体が、化合物、イオンまたは放射線
    である、請求項1記載の方法。
18. 【請求項１８】 化合物が、非ポリマー有機化合物、脂
    質、炭水化物、ペプチド、無機化合物、およびオリゴヌ
    クレオチドからなる群より選択される、請求項17記載の
    方法。
19. 【請求項１９】 放射線が、可視光線、可視外光線(out
    side the visible range)、および電離放射線からなる
    群より選択される、請求項17記載の方法。
20. 【請求項２０】 実体の少なくとも1つが精製された形
    態で使用される化合物である、請求項1記載の方法。
21. 【請求項２１】 化合物の各々が精製された形態で使用
    される、請求項20記載の方法。
22. 【請求項２２】 実体が混合物の構成要素として提供さ
    れる化合物である、請求項1記載の方法。
23. 【請求項２３】 混合物が天然産物の抽出物である、請
    求項22記載の方法。
24. 【請求項２４】 作用が相乗作用である、請求項1記載
    の方法。
25. 【請求項２５】 請求項1記載の方法により同定される
    組み合わせを患者に投与する段階を含む患者を治療する
    方法。
26. 【請求項２６】 請求項1記載の方法により同定される
    実体の組み合わせ。
27. 【請求項２７】 (i)請求項1記載の方法により同定され
    る実体の組み合わせと、(ii)薬学的に許容されうる担体
    とを含む薬学的組成物。
28. 【請求項２８】 生物学的活性について2つの実体また
    はより高次数の組み合わせをスクリーニングする方法で
    あって、以下の段階を含む方法： (a)実体のセットから少なくとも200の独自の2つの実体
    またはより高次数の組み合わせのアレイを作製する段
    階； (b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
    要素を提供する段階； (c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条
    件下において、実体の組み合わせの該アレイに該試験要
    素を接触させる段階； (d)試験要素の特性を検出または測定する段階；および (e)組み合わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の
    該特性に対する作用を生じる実体の組み合わせを同定す
    る段階。
29. 【請求項２９】 段階(a)〜(c)が、実体に試験要素を連
    続的に接触させることによって該試験要素の存在下にお
    いてアレイを作製する段階を含む、請求項28記載の方
    法。
30. 【請求項３０】 (f)段階(a)〜(e)までを少なくとも2回
    反復する段階をさらに含み、段階(a)において、少なく
    とも200の組み合わせのアレイが各反復において異な
    る、請求項28記載の方法。
31. 【請求項３１】 段階(f)の少なくとも2回の反復が互い
    に10日以内に生ずる、請求項30記載の方法。
32. 【請求項３２】 アレイが少なくとも400の独自の組み
    合わせを含む、請求項28記載の方法。
33. 【請求項３３】 アレイが少なくとも1540の独自の組み
    合わせを含む、請求項28記載の方法。
34. 【請求項３４】 実体が、化合物、イオン、または放射
    線である、請求項28記載の方法。
35. 【請求項３５】 化合物が、非ポリマー有機化合物、脂
    質、炭水化物、ペプチド、無機化合物、およびオリゴヌ
    クレオチドからなる群より選択される、請求項34記載の
    方法。
36. 【請求項３６】 放射線が、可視光線、可視外光線、お
    よび電離放射線からなる群より選択される、請求項34記
    載の方法。
37. 【請求項３７】 実体の少なくとも1つが精製された形
    態で使用される化合物である、請求項28記載の方法。
38. 【請求項３８】 化合物の各々が精製された形態で使用
    される、請求項28記載の方法。
39. 【請求項３９】 実体が、混合物の構成要素として提供
    される化合物である、請求項28記載の方法。
40. 【請求項４０】 混合物が天然産物の抽出物である、請
    求項38記載の方法。
41. 【請求項４１】 作用が相乗作用である、請求項28記載
    の方法。
42. 【請求項４２】 段階(a)および(c)の一方または両方が
    ロボット工学システムを使用して実施される、請求項28
    記載の方法。
43. 【請求項４３】 段階(a)および(c)の一方または両方が
    マイクロ流体工学を使用して実施される、請求項28記載
    の方法。
44. 【請求項４４】 段階(a)および(c)の一方または両方が
    インクジェットプリンター技術を使用して実施される、
    請求項28記載の方法。
45. 【請求項４５】 請求項28記載の方法により同定される
    組み合わせを患者に投与する段階を含む患者を治療する
    方法。
46. 【請求項４６】 請求項28記載の方法により同定される
    実体の組み合わせ。
47. 【請求項４７】 (i)請求項28記載の方法により同定さ
    れる実体の組み合わせと、(ii)薬学的に許容されうる担
    体とを含む薬学的組成物。
48. 【請求項４８】 生物学的活性について2つの実体また
    はより高次数の組み合わせをスクリーニングする方法で
    あって、以下の段階を含む方法： (a)少なくとも49の独自の2つの実体またはより高次数の
    組み合わせのアレイを作製する段階； (b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
    要素を提供する段階； (c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条
    件下において、実体の組み合わせの該アレイに該試験要
    素を接触させる段階； (d)試験要素の特性を検出または測定する段階； (e)組み合わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の
    該特性に対する作用を生じる実体の組み合わせを同定す
    る段階；および (f)各反復に異なるアレイを使用して、段階(a)〜(e)を1
    週間の期間にわたって少なくとも25回反復する段階。
49. 【請求項４９】 段階(a)〜(e)が、各反復において異な
    るアレイを使用して、30日の期間にわたって少なくとも
    100回反復される、請求項48記載の方法。
50. 【請求項５０】 実体が、化合物、イオン、または放射
    線である、請求項48記載の方法。
51. 【請求項５１】 化合物が、非ポリマー有機化合物、脂
    質、炭水化物、ペプチド、無機化合物およびオリゴヌク
    レオチドからなる群より選択される、請求項50記載の方
    法。
52. 【請求項５２】 放射線が、可視光線、可視外光線およ
    び電離放射線からなる群より選択される、請求項50記載
    の方法。
53. 【請求項５３】 実体が、精製された形態で使用される
    化合物である、請求項48記載の方法。
54. 【請求項５４】 実体が、混合物の構成要素として提供
    される化合物である、請求項48記載の方法。
55. 【請求項５５】 混合物が天然産物の抽出物である、請
    求項54記載の方法。
56. 【請求項５６】 作用が相乗作用である、請求項48記載
    の方法。
57. 【請求項５７】 段階(a)および(c)の一方または両方
    が、ロボット工学システムを使用して実施される、請求
    項48記載の方法。
58. 【請求項５８】 段階(a)および(c)の一方または両方
    が、マイクロ流体工学を使用して実施される、請求項48
    記載の方法。
59. 【請求項５９】 段階(a)および(c)の一方または両方
    が、インクジェットプリンター技術を使用して実施され
    る、請求項48記載の方法。
60. 【請求項６０】 生物学的活性について2つの実体また
    はより高次数の組み合わせをスクリーニングする方法で
    あって、以下の段階を含む方法： (a)実体のセットから、少なくとも10,000の独自の2つの
    実体またはより高次数の組み合わせのアレイを作製する
    段階； (b)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
    要素を提供する段階； (c)実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される条
    件下において、実体の組み合わせの該アレイに該試験要
    素を接触させる段階； (d)試験要素の特性を検出または測定する段階； (e)組み合わせの実体自体の作用とは異なる試験要素の
    該特性に対する作用を生じる実体の組み合わせを同定す
    る段階；および (f)段階(a)〜(e)を10日またはそれ以下の期間にわたっ
    て少なくとも2回反復する段階であって、段階(a)におい
    て、少なくとも10,000の2つの実体の組み合わせの該ア
    レイが2回またはそれ以上の反復において異なる段階。
61. 【請求項６１】 生物学的活性について2つの実体また
    はより高次数の組み合わせをスクリーニングする方法で
    あって、以下の段階を含む方法： (a)1つまたはそれ以上の別個の生物学的部分を含む試験
    要素を提供する段階； (b) 実体/試験要素の各接触が互いに確実に隔離される
    条件下において、少なくとも100の実体を該試験要素に
    接触させる段階； (c) 該試験要素の特性を検出または測定する段階； (d)該実体と接触させていない該試験要素の該特性と比
    較して、該特性の変化を生ずる実体を選択する段階； (e)同定した実体から、少なくとも49の独自の2つの実体
    またはより高次数の組み合わせのアレイを作製する段
    階； (f) 実体の組み合わせ/試験要素の各接触が互いに確実
    に隔離される条件下において、実体の組み合わせの該ア
    レイに試験要素に接触させる段階； (g)段階(f)の試験要素の特性を検出または測定する段
    階；および (h)組み合わせの実体自体の作用と異なる段階(g)の該特
    性に作用を生ずる実体の組み合わせを同定する段階。
62. 【請求項６２】 段階(a)の試験要素が、段階(f)の試験
    要素と同じである、請求項61記載の方法。
63. 【請求項６３】 段階(c)の特性が、段階(g)の特性と同
    じである、請求項61記載の方法。