KR100463002B1 - 발광분석용흑연나노튜브 - Google Patents

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마크 티. 마틴
리웬 동
밍 루
앨런 피셔
파비안 저메이슨
팸 라이앙
로버트 호크
조너슨 케이. 렐런드
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메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시
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Abstract

관상 풀러렌("버킷튜브"로 통칭됨) 및 피브릴을 포함하고, 화학적 치환에 의해 작용화되는 흑연 나노튜브가 전기발생된 화학발광 분석에 고체지지체로 사용된다. 흑연나노튜브는 분석에 사용되기에 앞서 작용 그룹 생물학적 분자로 화학적으로 개질된다. 전기화학발광 루테늄 복합체와 작용그룹 생물학적 분자-개질된 나노튜브와의 결합은 다중 포맷에 의한 핵산, 항원, 효소, 및 효소기질을 포함한 분자의 검출을 허용한다.

Description

발광분석용 흑연 나노튜브
본 출원은 1994년 11월 30일자로 출원된 동시계류 중인 Massey 등의 출원번호 제 08/346,832 호의 일부 계속 출원이고, 이는 1993년 11월 24일자로 출원된 출원번호 제 08/158,193 호의 일부 계속 출원이며, 이는 1991년 2월 6일자로 출원된 출원번호 제 07/652,427 호의 일부 계속 출원이고 1990년 6월 18일자로 출원된 출원번호 제 07/539,389 호의 일부 계속 출원이며, 이는 1988년 11월 3일자로 출원되었으나 현재는 포기된 "Electrochemiluminescent Assays"라는 명칭의 출원번호 제 7/266,882 호의 일부 계속 출원이다. 본 출원은 또한, 1994년 11월 8일자로 출원된 동시계류 중인 "Functionalized Nanotubes"라는 명칭의 출원번호 제 08/352,400 호의 일부 계속 출원이다. 이들 출원의 요지는 본원에 참고문헌으로 인용된다.
본 출원은 결합분석 수행방법 및 장치, 더욱 구체적으로 말해서 분석 시스템의 하나 이상의 표지된 성분에 의해 방출된 발광을 측정함으로써 해당 분석물의 존재를 측정하는 것들에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면, 본 발명은 발광 성분이 분석 조성물에 농축되고 전기화학발광을 일으키기 전에 검출 시스템에 수집되는 감수성이 향상된 정확하고, 재현가능하며, 정확하게 균질성이거나 이질성인 특정 결합 분석에 관한 것이다.
생화학적 및 생물학적 물질내 해당 분석물의 검출 및 정량을 위한 다양한 방법 및 시스템이 개발되어 왔다. 미량의 미생물, 약제, 호르몬, 바이러스, 항체, 핵산 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템이 연구자와 임상의에게는 큰 가치가 있다.
이러한 기술의 실체는 익히 공지되어 있는 결합반응, 예를 들면, 항원-항체 반응, 핵산 하이브리드화 기술, 및 단백질-리간드 시스템을 토대로 개발되어 왔다. 많은 생화학적 및 생물학적 결합 시스템에 있어서 고도의 특이성은 연구와 진단에 가치있는 다수의 분석방법과 시스템을 주도하였다. 전형적으로는, 해당 분석물의 존재는 하나 이상의 결합물질에 부착되는 관찰가능한 "표지물"의 존재 유무에 의해 표시된다. 특히 관심을 끄는 것은 광화학, 화학, 및 전기화학 수단을 통해 발광을 일으키도록 만들 수 있는 표지물이다. "광발광"이란 전자기 복사선을 흡수할 때 물질이 발광하도록 유도되는 과정이다. 형광 및 인광은 광발광의 유형들이다. "화학발광" 과정은 에너지의 화학적 이동에 의한 발광종의 생성을 수반한다. "전기화학발광"은 전기화학적으로 발광종의 생성을 수반한다.
해당 분석물을 함유하는 샘플이 화학발광 표지물로 표지한 반응물과 혼합되는 화학발광 분석 기술이 개발되어 왔다. 반응성 혼합물을 배양하고 표지된 반응물의 일부는 분석물에 결합한다. 배양 후, 혼합물의 결합 및 비결합 분획을 분리하여 두 분획 중 하나 또는 모두내의 표지물의 농도를 화학발광 기술로 측정할 수 있다. 하나 또는 두 분획 모두에서 측정한 화학발광 수준은 생물학적 샘플내 해당 분석물의 양을 표시한다.
전기화학발광(ECL) 분석 기술은 화학발광 기술보다 개량된 기술이다. 이들은 해당 분석물의 존재 및 농도의 민감하고 정확한 측정을 제공한다. 이러한 기술에 있어서, 배양 샘플은 발광을 촉발하기 위해 전압측정 작동전극에 노출시킨다. 적당한 화학적 환경에서, 이러한 전기화학발광은 특정시간에, 특정방법으로 작동 전극에 인가된 전압에 의해 촉발된다. 표지물에 의해 생성된 광이 측정되며, 이는 분석물의 존재 또는 양을 표시한다. 이러한 ECL 기술의 더 상세한 설명을 위해, PCT 출원 US 85/01253 (WO 86/02734), PCT 출원 No. US 87/00987, 및 PCT 출원 US 88/03947을 참조한다. 전술한 특허출원의 내용은 참조로 인용된다.
분석과정 중에 분리단계를 요함이 없이 전기화학발광 분석을 수행하고, 정확하고 민감한 측정이 이루어질 수 있도록 분석물의 상이한 농도에서 시그널 변조를 최대화하는 것이 바람직하다. 비분리 분석을 위한 선행기술 방법으로는 분석샘플에 현탁된 미립자 물질을 사용하여 분석하려는 하나 이상의 결합성분을 결합시키는 것들이다.
US 특허출원 No. 539,389 (PCT 출원 US 89/04919)는 불활성 미립자 물질이 분석 시스템의 결합 반응물 중 하나에 특이적으로 결합되는 발광현상에 기초한 민감하고 특이적인 결합 분석법에 대해 교시하고 있다. 분석은 이질 (하나 이상의 분리단계) 분석 포맷으로 수행될 수 있고 균질(비분리) 분석 포맷으로 가장 유리하게 사용될 수 있다.
US 89/04919는 발광현상의 측정을 위한 결합반응에 기초한 분석용 조성물에 관한 것으로, 조성물은 분석 혼합물의 성분과 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 현탁입자을 포함한다. 다른 일면으로, 샘플내 해당 분석물의 검출 또는 정량용 시스템에 관한 것이고, 이러한 시스템은 발명의 분석 조성물을 사용하는 분석법을 수행할 수 있다. 시스템은 분석매질내의 표지 화합물이 발광하도록 유도하는 수단, 및 샘플내 해당 분석물의 존재를 검출하기 위해 발광을 측정하는 수단을 포함한다.
전기화학발광 잔기가 결합되는 분석 시스템의 성분을 현탁 미립자 물질에 결합시킴으로써 성분에 결합된 전기화학발광 잔기에 의해 발생된 발광 시그널의 강도가 크게 변조되고, 이에 따라 분석 시스템의 특이적 결합반응의 모니터 수단이 제공됨이 밝혀졌다. 현탁입자는 현탁 미립자 물질에 결합되지 않은 채로 잔류하는 시스템의 성분에 결합된 전기화학발광 잔기에 의해 생성된 발광 시그널의 강도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다.
따라서, US 89/04919는 (1) 해당 분석물을 함유하는 것으로 추정되는 샘플(a), 해당 분석물 또는 이의 동족체(i), 해당 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너(ii), 및 (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성 성분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분석 수행-물질(이러한 물질 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 화학 잔기를 갖는 표지 화합물에 결합된다), 및 분석물 및/또는 (b) (i), (ii), 또는 (iii)에 정의된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁입자를 포함하는 조성물을 형성시키고; (2) 입자 및 표지 화합물을 포함하는 복합체를 형성하도록 조성물을 배양하며; (3) 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음; (4) 조성물에 의해 방출된 발광을 측정하여 샘플내 해당 분석물의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플내 해당 분석물의 검출방법에 관한 것이다. 이러한 방법들은 분석 조성물의 발광을 기지량의 분석물을 함유하고 있는 조성물의 발광과 비교함으로써 샘플내 분석물의 양을 정량하는 데 사용될 수 있다.
천연이거나 합성일 수 있는 해당 분석물의 동족체는 분석물에 필적하는 결합특성을 지닌 화합물이지만, 더 높거나 더 낮은 결합능을 지닌 화합물도 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 결합 파트너는 익히 공지되어 있다. 이러한 예로는 항체, 효소, 핵산, 렉틴, 조인자 및 수용체이다. 분석물 또는 이의 동족체와 및/또는 결합 파트너와 결합할 수 있는 반응성 성분은 제 2 항체 또는 단백질, 예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G이거나 또는 아비딘 또는 바이오틴 또는 결합반응에 들어가는 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 다른 성분일 수 있다.
유리하게는, 발광은 특이적 결합 파트너에 결합되어 있든 결합되어 있지 않든 간에 표지 화합물을 전압측정 작동 전극에 노출시킴으로써 유도된 전기화학발광(ECL)으로부터 발생한다. ECL 반응성 혼합물은 특정 시간에 특정방식으로 광을 발생시키도록 작동전극에 인가된 전압에 의해 광을 방출하도록 조절적으로 촉발된다. 비록 가시광의 방출이 유리한 국면이지만, 조성물 또는 시스템은 적외선 또는 자외선, X선, 마이크로파 등과 같은 기타 유형의 전자기 복사선을 방출할 수 있다. "전기화학방광", "전기화학발광성", "전기화학발광", "발광", "발광성", 및 "발광"이란 용어의 사용에는 광 및 기타 형태의 전자기 복사선이 포함된다.
US 89/04919에 교시된 방법은 조사 및 임상 세팅에서 수행된 다양한 분석에서 극미량의 분석물의 검출 및 정량을 허용한다. 그러나, 연구자 및 임상의의 요구로 이들 방법에 의해 수행된 분석의 검출한계를 낮춰서 그러한 분석의 감도를 증가시키고 이들이 수행될 수 있는 속도를 증가시키는 것이 불가피하다.
측정단계에 투입하기에 앞서 농축에 의해 표지종으로부터 시그널을 증가시키기 위한 다양한 방법이 당해분야에 공지되어 있다. 예를 들면, US 특허 No. 4,652,333에는 형광성, 인광성 또는 원자 형광성 표지물로 표지된 입자가 측정단계 수행전에 미세여과에 의해 농축된다.
측정단계에 앞서, 예를 들면, 측정용기 표면에 반응성 표지 입자를 자기적으로 끌어당김으로써 표지된 면역화학종을 농축시키는 것이 또한 당해분야에 공지되어 있다. US 특허 No. 4,731,337, 4,777,145, 및 4,115,535에서, 예를 들면, 이러한 입자는 용기벽으로 끌어당겨지고 이어서 광의 플루오로포르 방출을 여기시키도록 조사된다.
US 특허 No. 4,945,045에서, 입자는 마그네틱 전극에 집중된다. 전기화학 반응은 표지된 화학 매개자에 의해 조장된 전극에서 발생한다. 면역화학 결합 반응은 결합이 발생할 때 변조된 시그널을 일으키는 매개자의 효율을 변경시킨다.
표면 여기, 예를 들면 전기화학발광의 특정 기계론적 설명에 구애됨이 없이, 고체상 복합체상의 표지물은 전극에서 산화되어야 하는 것으로 추측된다. 이러기 위해서는 전자가 표지물로부터 전극으로 이동하는 것이 요구된다. 전자는 전자가 포텐셜 에너지 장벽을 "건너감"이 없이 공간(이의 포텐셜 에너지가 매우 높은 영역, 예를 들면, 용액)을 통해 통과하는 터널링으로 알려져 있는 현상에 의해 이를 "도약"하게 만드는 것으로 추측된다. 에너지 장벽을 터널링할 수 있고, 따라서 한 분자에서 다른 한 분자로 또는 한 분자에서 전극으로 추가 에너지 입력없이 이동한다. 그러나, 이러한 터널링 현상은 초단거리에 대해서만 작동할 수 있다. 터널링 현상의 확률은 두 종간의 거리가 증가함에 따라 대수적으로 떨어진다. 두 종간에 발생하는 터널링 현상의 확률은 거리가 25Å(2.5nm) 이하이면 매우 높지만 거리가 그 이상이면 매우 낮다. 25Å의 거리는 당해분야의 전문가에 의해 사용되는 경험에서 얻은 일반원리이지 절대한계는 아니다.
따라서, 전극표면의 25Å을 갖는 ECL 표지물만이 ECL 공정에 관여할 것으로 예상될 수 있다. 전극표면의 25Å내에 있는 입자면적은 전형적으로 극히 작다.
따라서, 입자표면으로부터의 ECL이 여타 유의수준으로 측정될 수 있으리라고는 예상하지 않을 것이다. 더욱이, ECL 과정에 의해 생성된 광은 광전자증배관에 도달하기 위해 입자를 통해 통과하여야 한다. 입자는 본질상 불투명하므로(이들의 농축 현탁액은 흑색), 상당량의 광이 ECL에 의해 생성될 수 있더라도, 광이 입자를 통해 통과할 수 있고 광전자증배관에 의해 측정될 수 있으리라고는 예상하지 않을 것이다.
1970년대 이래로, 흑연 나노튜브 및 피브릴이 다양한 적용에 해당 물질로서 확인되어 왔다. 서브마이크론 크기의 흑연 피브릴은 종종 증기 성장 탄소 섬유로 불리고 있다. 탄소 피브릴은 직경이 1.0μ, 바람직하게는 0.5μ 이하, 더욱 바람직하게는 0.2μ 이하인 연충 탄소 퇴적물이다. 이들은 다양한 형태로 존재하고 금속 표면에서 각종 탄소-함유 가스의 촉매 분해를 통해 제조되어 왔다. 이러한 연충 탄소 퇴적물은 거의 전자 현미경의 출현 이래로 관찰되어 왔다.
우수한 초기 조사 및 참고자료는 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Baker and Thrower ed., Vol. 14, 1978, p. 83]에서 찾아볼 수 있다. 또한 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Rodriguez, N., J. Mater. Research, Vol. 8, p 3233 (1993)] 참조.
1976년에, Endo 등[참조문헌: Obelin, A. and Endo, M., J. of Crystal Growth, Vol. 32 (1976), pp. 335-349, 본원에서 참조로 인용]에 의해 탄소 피브릴이 성장하는 기본 메커니즘이 규명되었다. 탄화수소 함유 가스의 존재하에서 탄소에 과포화되는 금속 촉매 입자로부터 기원하는 것으로 나타났다. Endo 등에 따라, 즉시 열분해 침착된 흑연 외곽층으로 코팅되는 원통형의 규칙적인 흑연 코어가 압출된다. 열분해 오버코트를 갖는 이러한 피브릴은 전형적으로 직경이 0.1μ 초과, 더욱 전형적으로는 0.2 내지 0.5μ이다.
1983년에, 본원에서 참조로 인용되는 Tennent의 US 특허 No. 4,663,230는 열분해성 탄소로 오염되지 않은 원통형의 규칙적인 흑연 코어를 성장시키는데 성공하였다. 따라서, Tennent 발명은 전형적으로 35 내지 700Å(0.0035 내지 0.07μ)의 소직경 피브릴 및 규칙적인 "성장" 흑연 표면에 대한 접근법을 제공하였다. 구조는 덜 완전하지만, 또한 열분해성 탄소 외곽층이 없는 피브릴성 탄소도 또한 성장한다.
피브릴, 버키튜브 및 미세섬유는 보강재로서 시판되는 연속성 탄소섬유와는 구별된다. 바람직하게는 크되 불가피하게도 일정한 종회비를 갖는 피브릴과는 대조적으로, 연속성 탄소섬유는 적어도 104, 종종 106 이상의 종횡비(L/D)를 갖는다. 연속성 섬유의 직경은 또한, 항상 1.0μ, 전형적으로는 5 내지 7μ로서, 피브릴의 것보다 월등히 크다.
연속성 탄소섬유는 유기 전구체 섬유, 통상적으로 레이온, 폴리아크릴로니트릴(PAN) 및 핏치의 열분해에 의해 제조된다. 따라서, 이들은 자신의 구조안에 헤테로 원자를 포함할 수 있다. "제조된" 연속성 탄소섬유의 흑연 성질은 변화하지만, 이들은 후속 흑연화 단계에 투여될 수도 있다. 흑연화도의 차이, 배향 및 흑연 평면의 결정성(존재할 경우), 헤테로 원자의 잠정적인 존재 및 심지어는 기질 직경의 절대차는 연속성 섬유를 이용한 실험을 미세섬유 화학의 예측자를 어렵게한다.
Tennent의 US 특허 No. 4,663,230은 연속성 열 탄소 오버코트를 함유하지 않고, 피브릴 축에 실질적으로 평행한 다중 흑연 외곽층을 갖는 탄소 피브릴에 대해 기술하고 있다. 그들 자체는 원통형 축에 실질적으로 수직인 흑연의 만곡층의 접선에 실질적으로 수직인 축인 자신의 c-축을 갖는 것으로 특징지워질 수 있다. 이들은 일반적으로, 0.1μ 이상의 직경 및 적어도 5의 길이 : 직경비를 갖는다. 바람직하게는, 이들은 연속성 열 탄소 오버코트, 즉, 이들의 제조에 사용된 가스 공급물의 열 분해로부터 생기는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는다.
본원에서 참조로 인용되는 Tennent 등의 US 특허 No. 5,171,560은 피브릴 축상의 층의 돌기가 적어도 두 피브릴 직경의 거리만큼 연장하도록 피브릴에 실질적으로 평행한 흑연층을 갖고 열 오버코트가 없는 탄소 피브릴에 대해 기술하고 있다. 전형적으로, 이러한 피브릴은 실질적으로 일정한 직경의 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브이고 c-축이 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 포함한다. 이들은 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않고, 직경이 0.1μ 이하, 길이 : 직경비가 5 이상이다. 이러한 피브릴은 본 발명에서 주로 관심의 대상이 된다.
탄소 피브릴 응집체의 형성에 관한 더 상세한 사항은 1988년 1월 28일자로 출원된 Snyder 등의 US 특허출원 No. 149,573, 및 1989년 1월 28일자로 출원된 PCT 출원 No. US 89/00322 WO 89/07163, 및 1989년 9월 28일자로 출원된 Moy 등의 US 특허출원 No.413,837 및 1990년 9월 27일자로 출원된 PCT 출원 No. US 90/05498("Fibril Aggregates and Method of Making Same") WO 91/05089의 내용에서 찾아볼 수 있으며, 이들 모두는 본 발명과 같이 동일 양수인에 양도 되었으며 본원에서 참조로 인용된다.
본원에서 참조로 인용되는 Moy 등의 1992년 5월 22일자 출원된 USSN 07/887,307은 상호 무작위로 엉켜 새둥지("BN")를 닮은 피브릴의 엉킨 볼을 형성하는 다양한 거시적 형태(주사 전자 현미경으로 측정)를 갖는 응집체로서; 또는 실질적으로 동일한 상대적 배향을 갖고, 코밍(combed) 야안("CY")의 외향을 갖는, 즉, 각 피브릴의 종축(개개의 벤드 또는 킹크에도 불구하고)이 다발내 주변을 에워싸는 피브릴의 방향과 동방향으로 연장하는 직선 내지는 약간 구부러지거나 킹킹된 탄소 피브릴의 다발로 이루어진 응집체로서; 또는 상호 느슨하게 엉켜 "개방 네트" ("ON") 구조를 형성하는 직선 내지는 약간 구부러지거나 킹킹된 피브릴로 이루어진 응집체로서 제조되는 피브릴에 대해 기술하고 있다. 개방 네트 구조에 있어서, 피브릴 엉킴도는 코밍 야안 응집체(여기에서 개개 피브릴은 실질적으로 동일한 상대적 배향을 가짐)에서 관찰되는 것보다는 크지만 새둥지의 것보다는 작다. CY 및 ON 응집체는 구조 전반에 걸쳐 균일한 특성이 요망되는 복합 조립 2차 가공시 BN이 유용하게 하는 것보다 더 용이하게 분산된다.
피브릴 축상의 흑연 층의 돌기가 두 피브릴 직경 이하의 거리만큼 연장할 때, 흑연 미세섬유의 탄소평면은 단면에, 헤링본 외관을 취한다. 이들은 피쉬본 피브릴로 불린다. 본원에서 참조로 인용되는 Geus의 US 특허 No. 4,855,091호는 열분해성 오버코트를 실질적으로 함유하지 않는 피쉬본 피브릴의 제조절차를 제공한다. 이러한 피브릴은 또한 본 발명의 실행에 유용하다.
전술한 촉매적으로 성장한 피브릴과 유사한 형태를 갖는 탄소 나노튜브는 고온 탄소 아크에서 성장하였다[참조문헌: Iijima, Nature 354 56 1991]. 현재는 이러한 아크-성장 미세섬유가 Tennent의 초기 촉매 성장된 피브릴과 동일한 형태를 취하는 것으로 일반적으로 인식되고 있다[참고문헌, Weaver, Science 265 1994]. 아크 성장 탄소 미세섬유는 또한 본 발명에 유용하다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 유리하게 높은 광 방출을 달성하기 위한 분석 수행 물질의 부동화를 위한 고 표면적을 갖는 입자를 사용하는 발광 분석법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 발광하도록 유도할 수 있는 화합물로 표지될 수 있는 흑연 나노튜브(피브릴)를 사용하는 조성물 및 분석을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 이러한 분석에 사용하기 위한 작용화된 피브릴을 제공하는 것이다.
용어에 대한 본 발명 정의의 설명
용어 "ECL 잔기", "금속-함유 ECL 잔기", "표지물", "표지물 화합물", 및 "표지물질"은 상호 교환적으로 사용된다. 분석물 또는 이의 동족체와 같은 분자에 결합될 "ECL 잔기", " 금속 킬레이트", "전이금속 킬레이트", "희토 금속 킬레이트", "표지 화합물", "표지물질" 및 "표지물"로 불리는 종에 대한 본 발명의 범위내에는, 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너, 및 추가로 이러한 상기 결합 파트너의 추가 결합 파트너, 또는 상기 분석물, 이의 동족체 또는 결합 파트너와 결합할 수 있는 반응성 성분이 포함된다. 전술한 종은 또한 하나 이상의 결합 파트너 및/또는 하나 이상의 반응성 성분의 배합물에 연결될 수 있다. 추가로, 전술한 종은 또한 결합 파트너, 반응성 성분, 또는 하나 이상의 결합 파트너 및/또는 하나 이상의 반응 성분의 배합물에 결합된 분석물 또는 이의 동족체에 결합될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 직접, 또는 기타 분자를 통해 분석물에 또는 이의 동족체에 결합될 다수의 전술한 종에 대한 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 리간드는 분석-수행-물질로 간략하게 칭한다.
용어 검출 및 정량은 "측정"을 의미하는 것으로서, 정량에는 기준 조성물의 제조와 보정이 필요하다는 것을 알 것이다.
용어 복합체의 수집 및 농축은 분석 조성물내 복합체의 농도 및 예를 들면, 전극 표면에서 복합체의 수집을 묘사하는데 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
도 1은 미립자-기본 비분리 및 본 발명의 분리 분석 수행용 셀의 개략도.
도 2는 도 1의 셀과 사용하기 위한 전압 제어 장치의 단순 다이아그램도.
도 3은 Ru(bpy)3 2+-표지된 펩타이드 피브릴에서의 특이 효소 가수분해를 도시하는 개략도.
도 4는 아비딘-피브릴을 사용하는 DNA 탐침의 개략도.
도 5는 Nε-(3급-부톡시카보닐)-L-라이신의 첨가에 의한 이작용성 피브릴의 제조를 위한 반응도식 개략도.
도 6은 ECL-기본의 이작용성 바이오센서 피브릴 합성을 위한 반응도식 개략도.
도 7은 이작용성 ECL-기본 바이오센서 피브릴의 개략도.
도 8은 D-글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 촉매된 반응의 개략도.
도 9는 피브릴-지지된 ECL-기본 바이오센서를 사용하는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제의 ECL 검출 도시 그래프도.
도 10은 알콜 데하이드로게나제(ADH) 기본 ECL 바이오센서의 개략도.
도 11은 Dynal M450 비드(좌측) 및 알킬 피브릴(우측)에 부동화된 ADH-기본 바이오센서의 개략도.
도 12는 비드 및 피브릴에 부동화된 효소 바이오센서를 사용하는 에탄올의 ECL 검출을 도시하는 그래프도.
도 13은 두 상이한 방법에 의해 제조된 카복시 피브릴 및 PEG-개질 피브릴에 결합하는 Ru(bpy)3 2+의 분석 그래프도.
발명의 간단한 설명
가장 다양한 양태로서, 본 발명은 발광하도록 유도할 수 있는 표지 화합물과 결합된 성분이 부착되는 나노튜브에 있다. 특히, 나노튜브는 흑연 나노튜브이고 발광은 전기화학발광이다. 하나의 양태로서, 성분은 효소 바이오센서이다.
본 발명은 또한 샘플에 존재하는 해당 분석물의 검출을 위한 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물은
(i) 작용그룹을 갖는 흑연 나노튜브 및 (ii) 작용그룹에 결합되어 있고 분석물에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 분석-수행 물질을 포함한다.
하나의 양태로서, 작용그룹에 결합되는 분석-수행-물질은 이어서 분석물에 결합된다. 조성물은 추가로, 발광하도록 유도할 수 있는 표지 화합물에 결합되는, 분석물에 결합된 제 2 분석-수행-물질을 포함한다.
분석-수행-물질은 (i) 첨가된 해당 분석물 또는 첨가된 분석물의 동족체; (ii) 분석물의 결합 파트너 또는 동족체의 결합 파트너; 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성 성분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 함유한다. 이러한 물질 (i), (ii) 또는 (iii) 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 화학잔기를 갖는 표지 화합물에 결합된다.
광범위하게는, 입자는 작용화된 피브릴, 즉, 표면이 하나 이상의 물질과 반응하거나 접촉되어 상이한 화학 종의 화학적 치환 또는 물리적 흡착을 제공하는 피브릴이다.
본원에서 참조로 인용되는, 1989년 5월 15일자로 출원된 McCarthy 등의 US 특허출원 No. 351,967는 피브릴을 황산(H2SO4) 및 칼륨 클로레이트(KClO3)를 포함하는 산화제와 , 피브릴의 표면을 산화시키기에 충분한 반응조건(예를 들면, 시간, 온도, 및 압력)하에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 탄소 피브릴 표면의 산화방법에 대해 기술하고 있다. McCarthy 등의 방법에 따라 산화된 피브릴은 불균일하게 산화, 즉, 탄소원자는 카복실, 알데하이드, 케톤, 페놀 및 기타 카보닐 그룹으로 치환된다.
피브릴은 또한 질산처리에 의해 불균일하게 산화된다. 국제출원 PCT/US94/10168은 작용그룹의 혼합물을 함유하는 산화 피브릴의 형성방법에 대해 기술하고 있다. Hoogenvaad, M.S. 등("Metal Catalysts supported on a Novel Carbon Support", Presented at Sixth International Conference on Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts, Brussels, Belgium, September 1994))는 질산으로 피브릴 표면을 먼저 산화하기 위하여 피브릴-지지된 귀금속의 제조에 유익함을 발견하였다. 산에 의한 이러한 선처리는 탄소-지지된 귀금속 촉매의 제조에서 표준단계이며, 이러한 탄소의 통상의 공급원이 주어질 경우, 이는 바람직하지 않은 물질의 표면을 많이 소제하도록 작용화하는 역할을 한다.
간행물에서, McCarthy 및 Bening[참조문헌: Polymer Preprints ACS Div. of Polymer Chem. 30 (1) 420(1990)]은 표면이 다양한 산화그룹을 포함하는 것을 증명하기 위해 산화된 피브릴의 유도체를 제조하였다. 이들이 제조한 화합물인 페닐하이드라존, 할로아로마티세스터, 탤로스 염 등이 선택되었는 데, 그 이유는 밝게 착색되거나, 일부 다른 강력하고 쉽게 확인되고 구별되는 시그널을 보이는 이들의 분석적인 용도 때문이다
입자는 바람직하게는, 광범위하게 하기 화학식을 갖는 작용화된 피브릴이다.
화학식
[CnHL]Rm
상기식에서,
n은 정수이고,
L은 0.1n 이하의 수이며,
m은 0.5n 이하의 수이며,
각각의 R은 동일하고 SO3H, COOH, NH2, OH, CHO, CN, COCL, 할라이드, COSH, SH, COOR′, SR′, SiR′3, Si(OR′)yR′3-y, Si(O-SiR′2)OR′, R″, Li, AlR′2, Hg-X, TlZ2 및 Mg-X 중에서 선택되며,
y는 3 이하의 정수이며,
R′은 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 아랄킬이며,
R″은 플루오로알킬, 플루오로아릴, 플루오로사이클로알킬, 플루오로아랄킬 또는 사이클로아릴이며,
X는 할라이드이며,
Z는 카복실레이트 또는 트리플루오로아세테이트이다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브에는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것들이 포함된다. 나노튜브는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브, 더욱 바람직하게는, 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트을 갖는 것들 일 수 있다.
입자는 또한 불균일 치환된 나노튜브를 포함한다. 이러한 것들에는 하기 화학식의 조성물이 포함된다.
[CnHL]Rm
상기식에서,
n, L, m, R 및 나노튜브 자체는 상기에서 정의한 바와 같고, 단 각각의 R은 산소를 함유하지 않으며, 또는 각각의 R이 산소-함유 그룹이면 COOH는 존재하지 않는다.
하기 화학식의 작용화된 나노튜브도 본 발명내의 입자로서 포함된다.
화학식
[CnHL]Rm
상기식에서,
n, L, m, R 및 R′은 상기에서 정의한 바와 같고,
탄소원자는 길이 : 직경 비가 5 이상인 피쉬본 피브릴의 표면 탄소원자이다.
이들은 균일하게 또는 불균일하게 치환된다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
본 발명에서 입자로서 하기 화학식의 작용화된 나노튜브도 포함된다.
화학식
[CnHL][R′-R]m
상기식에서,
n, L, m, R 및 R′은 상기에서 정의한 바와 같다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하이다. 나노튜브는 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 피브릴 축상의 흑연층 돌기가 연장하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 갖는 것들 일 수 있다.
두 균일 및 불균일 치환된 나노튜브에서, 표면탄소 Cn이 반응된다. 흑연 피브릴의 표면층에 있는 대부분의 탄소원자는 흑연에서와 같이 기저면 탄소이다. 기저면 탄소는 화학물질 공격에 비교적 비활성이다. 결함부위에서, 예를 들면, 흑연 평면이 피브릴 주위를 완전히 확장하지 못할 경우, 흑연 평면의 엣지 탄소원자와 유사한 탄소원자가 존재하게 된다. 엣지 및 기저면 탄소의 논의에 대해서는 문헌[참조: Urry Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York 1989]을 참조하라.
결함부위에서, 나노튜브의 하부 내부층의 엣지 또는 기저면 탄소가 노출될 수 있다. 표면탄소라는 용어에는 나노튜브의 최외곽층의 기저면 및 엣지의 모든 탄소, 및 최외곽층의 결함부위에서 노출될 수 있는 하부층의 기저면 및/또는 엣지 모두의 탄소가 포함된다. 엣지 탄소는 반응성이고 탄소 원자가를 만족시키기 위해 일부 헤테로원자 또는 그룹을 함유하여야 한다.
전술한 치환된 나노튜브는 유리하게는 더욱 작용화될 수 있다. 이러한 조성물에는 하기 화학식의 조성물이 포함된다.
[CnHL]Am
상기식에서,
탄소는 나노튜브의 표면탄소이고,
n, L 및 m은 전술한 바와 같으며,
A는
Y는 단백질, 펩타이드, 효소, 항체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항원, 또는 효소기질, 효소 억제제 또는 효소기질의 전이상태 동족체의 적당한 작용그룹이거나, R′-OH, R′-NH2, R′SH, R′CHO, R′CN, R′X, R′SiR′3, R′Si(OR′)yR′3-y, R′Si(O-SiR′2)OR′, R′-R″, R′-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R′, (C3H6O)w-R′및 R′중에서 선택되며,
w는 1 이상 200 미만의 정수이다.
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.1μ 이하, 바람직하게는 0.05μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하고/하거나 또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트로 이루어짐을 특징으로 한다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
화학식 [CnHL][R′-R]m의 작용성 나노튜브를 더욱 작용화시켜 화학식 [CnHL][R′-A]m(여기에서, n, L, m, R′및 A는 전술한 바와 같다)의 조성물을 생성시킬 수 있다. 탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 나노튜브는 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하고/하거나 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 가짐을 특징으로 한다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
본 발명의 입자는 또한 특정 사이클릭 화합물이 흡착되는 나노튜브를 포함한다. 이러한 것들에는 하기 화학식 물질의 조성물이 포함된다.
화학식
[CnHL][X-Ra]m
상기식에서,
n은 정수이고,
L은 0.1n 이하의 수이며,
m은 0.5n 이하이며,
a는 0 또는 10 이하의 수이며,
X는 다핵성 방향족 잔기, 다이핵성 방향족 잔기 또는 금속다이핵성 방향족 잔기이며,
R은 전술한 바와 같다
탄소원자, Cn은 실질적으로 일정한 직경을 갖는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다. 나노튜브는 길이 : 직경비가 5 이상이고 직경이 0.5μ 이하, 바람직하게는 0.1μ 이하인 것을 포함한다. 나노튜브는 또한, 열분해 침착된 탄소를 실질적으로 함유하지 않는 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브, 더욱 바람직하게는, 적어도 두 피브릴 직경 거리만큼 연장하는 피브릴 축상의 흑연층 돌기를 갖는 것을 특징으로 하는 것들 및/또는 c-축이 이들의 원통형 축에 실질적으로 수직인 원통형 흑연 시이트를 갖는 것들 일 수 있다. 바람직하게는, 나노튜브는 열 오버코트를 함유하지 않으며, 직경이 0.5μ 이하이다.
바람직한 사이클릭 화합물은 문헌[참조: Cotton and Wilkinson, Advanced Organic Chemistry]의 76 페이지에 기술된 바와 같은 2차원 마크로사이클이다. 흡착을 위한 더욱 바람직한 사이클릭 화합물은 포피린 및 프탈로사이아닌이다.
흡착된 사이클릭 화합물은 작용화될 수 있다. 이러한 조성물에는 하기 화학식의 화합물이 포함된다.
[CnHL][X-Aa]m
상기식에서,
m, n, L, a, X 및 A는 전술한 바와 같고,
탄소는 전술한 바와 같이 실질적으로 원통형인 흑연 나노튜브의 표면탄소이다.
전술한 바와 같이 작용화된 탄소 피브릴은 매트릭스에 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 유기 중합체(예를 들면, 에폭시, 비스말레이미드, 폴리아미드 또는 폴리에스테르 수지와 같은 열경화성 수지; 열가소성 수지; 반응 사출성형 수지; 또는 천연고무, 스티렌-부타디엔 고무, 또는 시스-1,4-폴리부타디엔과 같은 엘라스토머); 무기 중합체(예를 들면, 유리와 같은 중합체 무기 옥사이드), 금속(예를 들면, 납 또는 구리), 또는 세라믹 물질(예를 들면, 포틀랜드 시멘트)이다.
특정 이론에 구애됨이 없이, 작용화된 피브릴은 중합체 시스템 중으로 더 잘 분산되는 데, 그 이유는 개질된 표면특성이 중합체와 더 상용성이거나, 또는 개질된 작용그룹(특히, 하이드록실 또는 아민 그룹)이 말단 그룹으로서 중합체에 직접 결합되기 때문이다. 이러한 방식으로, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리에스테르 또는 폴리아미드/이미드와 같은 중합체 시스템은 피브릴에 직접 결합되며, 이렇게 해서 피브릴은 향상된 접착력을 가지고 더욱 수월하게 분산된다.
탄소 피브릴을 피브릴 표면의 산화에 충분한 시간 동안 강 산화제와 접촉시키고 피브릴을 작용그룹을 산화 표면에 첨가하기에 적합한 반응물과 추가 접촉시킴으로써 작용그룹을 탄소 피브릴의 표면에 도입시킨다. 바람직하게는, 산화제는 알칼리 금속 클로레이트의 강산 용액으로 이루어진다. 다른 양태로서, 알칼리 금속 클로레이트는 나트륨 클로레이트 또는 칼륨 클로레이트이다. 바람직한 양태로, 사용된 강산은 황산이다. 산화에 충분한 시간은 약 0.5 내지 약 24 시간이다.
탄소 피브릴의 네트워크는 탄소 피브릴의 표면을 산화시키기에 충분한 시간동안 탄소 피브릴을 산화제와 접촉시키고, 표면-산화된 탄소 피브릴을 작용그룹을 탄소 피브릴의 표면에 첨가하기 적합한 반응물과 접촉시킨 다음, 표면-작용화된 피브릴을 탄소 피브릴의 네트워크 제조에 효과적인 가교결합제와 추가 접촉시킴으로써 생성된다. 바람직한 가교결합제는 폴리올, 폴리아민 또는 폴리카복실산이다.
작용화된 피브릴은 또한 피브릴의 경질 네트워크 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 산-작용화된 피브릴의 양호하게 분산된 3 차원 네트워크는 산 그룹(피브릴 간)을 폴리올 또는 폴리아민으로 가교결합시켜 경질 네트워크를 형성시킴으로써 안정화될 수 있다.
피브릴 입자는 또한 본 발명의 작용화된 피브릴을 결합시켜 형성된 3 차원 네트워크를 포함한다. 이러한 복합체는 직접결합 또는 화학 잔기를 포함하는 하나 이상의 링커에 의해 결합된 적어도 두 개의 작용화된 피브릴을 포함한다. 이들 네트워크는 매우 균일하고 동등한 세공 크기의 다공성 매질을 포함한다.
비록, 이들 피브릴 간의 간극이 크기와 형상 모두 불규칙하지만, 이들은 세공으로서 생각될 수 있고 다공성 매질의 특징규명에 사용된 방법에 의해 특징규명된다. 이러한 네트워크에서 간극의 크기는 피브릴 분산액의 농도와 수준, 및 가교결합제의 농도와 쇄 길이에 의해 조절될 수 있다.
입자를 포함하는 복합체는 예를 들면, 전극에 전압을 인가하여 여기되고 전기화학발광이 유도되는 전극 표면상에 수집될 수 있다. 본 발명은 바람직하게는, 측정대, 즉, 발광이 일어날 수 있는 표면에서 복합체를 수집함으로써 수행되지만, 본 발명은 또한, 복합체가 측정대에서 수집되고 이후에 그 측정대에 또는 발광 유도 및 측정에 취한 다른 단계에 수단이 도입되는 방법도 포함한다.
복합체의 수집은 중력 침강, 여과, 원심분리 및 복합체 부분을 형성하는 마그네틱 반응성 입자의 마그네틱 인력작용을 포함한 몇몇 상이한 방법에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 양태가 이하에서 더욱 상세히 기술된다.
본 발명은 또한, 샘플에 존재하는 해당 분석물에 대한 결합분석을 수행하는 방법에 있으며,
(a) (i) 샘플,
(ii) 발광하도록 유도될 수 있는 표지 화합물에 결합된 성분을 함유하는 분석-수행-물질, 및
(iii) 분석-수행-물질에 결합된 다수의 작용화된 흑연 나노튜브를 함유하는 조성물을 형성시키고;
(b) 조성물을 배양하여 작용화된 흑연 나노튜브 및 표지 화합물을 포함하는 복합체를 형성시키며;
(c) 복합체를 측정대에서 수집하며;
(d) 복합체내의 표지 화합물을 표면 선택성 여기에 의해 발광하도록 유도한 다음;
(e) 방출된 발광을 측정하여 샘플내 해당 분석물의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.
특히, 복합체는 발광 유도 및 발광 측정을 위한 수단의 표면에 수집된다.
방법은 유리하게는, 복합체가 전극 표면에서 수집되는 전기화학발광 측정에 기초한다.
본 발명은 또한, 전극표면에서 전기화학발광 측정에 기초하여 샘플에 존재하는 해당 분석물에 대한 결합분석을 수행하는 방법에 있으며,
(a) (i) 샘플,
(ii) 발광하도록 유도될 수 있는 표지 화합물에 결합된 성분을 함유하는 분석-수행-물질, 및
(iii) 분석-수행-물질에 결합된 다수의 작용화된 흑연 나노튜브를 함유하는 조성물을 형성시키고;
(b) 조성물을 배양하여 작용화된 흑연 나노튜브 및 표지 화합물을 포함하는 복합체를 형성시키며;
(c) 복합체를 수집하며;
(d) 수집된 복합체를 전극표면과 접촉되도록 하고 복합체내 내의 표지 화합물을 전극에 전압을 인가하여 발광하도록 유도한 다음;
(e) 전극표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 해당 분석물의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 전극표면에서의 전기화학발광 측정에 기초하여 샘플에 존재하는 해당 분석물에 대한 결합분석을 수행하는 방법에 있으며,
(a) (i) 샘플,
(ii) 발광하도록 유도될 수 있는 표지 화합물에 결합된 성분을 함유하는 분석-수행-물질, 및
(iii) 분석-수행-물질에 결합된 다수의 마그네틱 반응성이고, 현탁되고, 작용화된 흑연 나노튜브를 함유하는 조성물을 형성시키고;
(b) 조성물을 배양하여 흑연 나노튜브 및 표지 화합물을 포함하는 복합체를 형성시키며;
(c) 흑연 나노튜브에 자계를 인가하여 복합체를 수집하며;
(d) 수집된 복합체를 전극표면과 접촉되도록 하고 복합체내 내의 표지 화합물을 전극에 전압을 인가하여 발광하도록 유도한 다음;
(e) 전극표면에서 방출된 발광을 측정하여 샘플내 해당 분석물의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.
자계의 인가로 복합체는 전극표면에 수집되게 된다.
또한, 본 발명은 작용화된 흑연 나노튜브 및
(a) 전해질;
(b) ECL 잔기를 함유하는 표지 화합물;
(c) 해당 분석물 또는 해당 분석물의 동족체;
(d) 해당 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너;
(e) (c) 또는 (d)와 반응할 수 있는 반응성 성분;
(f) 환원제; 및
(g) 전기화학발광-반응 증진제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 기타 성분을 포함하는, 미립자-기본 결합 분석에서 시약으로 사용하기 위한 물질의 조성물에 있다(단, 여타 시약 조성물에 함유된 어떠한 두 성분도 의도하는 분석에서 이들의 작용에 손상을 주도록 저장 중에 상호 반응성을 띠지 않는다). 시약은 마그네틱 반응성 흑연 나노튜브를 함유할 수도 있다.
본 발명은 또한 결합반응 및 전기화학발광 현상의 측정을 토대로 하는 분석용의,
(a) 전해질;
(b) 분석-수행-물질에 결합된 표면을 갖는 다수의 마그네틱 반응성의 작용화된 흑연 나노튜브; 및
(c) 결합특성을 지니고, 전기화학발광 특성을 띠는 화학물질 잔기를 포함하는 표지물질을 포함하는 분석제에 있다.
본 발명은 샘플에 존재하는 해당 분석물에 대한 결합분석을 수행하는 방법에 있으며,
(a) (i) 샘플, 및
(ii) 발광하도록 유도될 수 있는 표지 화합물에 결합된 분석성분에 연결된 작용화된 나노튜브(성분은 해당 분석물의 기질이다)을 함유하는 조성물을 형성시키고;
(b) 조성물을 분석물 허용 조건하에 배양하여 성분을 절단하며;
(c) 조성물로부터 작용화된 흑연 나노튜브를 분리하며;
(d) 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
(e) 방출된 발광을 측정하여 샘플내 해당 분석물의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.
뱃치분석이 수행될 있지만 연속 또는 반-연속분석이 유동셀에서 수행될 수 있다. 유동셀에서, 고체상은 측정셀에 잔류하게 되지만 용액은 셀을 통해 유동하여 유출된다. 고체상(예를 들면, 입자)이 물보다 더 조밀하면, 즉 물의 밀도보다 높은밀도를 가지면, (1.0g/ml 이상) 입자에 미치는 중력은 이들을 셀의 바닥으로 낙하시키게 된다. 셀은 유체가 셀을 통해 유동함에 따라 입자가 바닥으로 침강하도록 제작될 수 있거나 셀은 샘플의 대부분이 ECL 시스템의 작동전극 위에 있는 원기둥형 구획내 셀에 함유되도록 제작될 수 있다. ECL 유도 전에 입자가 전극의 표면에 침강하도록 하기 위해 셀내 충분한 체류시간이 제공되어야 한다.
본 발명의 다른 양태로, 분석 조성물의 나머지 보다 큰 밀도를 갖는 현탁 피브릴 함유 분석 조성물을 원심분리시켜 입자를 측정대로 제거하며 여기에서 이들은 뒤에, 예를 들면, 전극과 접촉되어 전기화학발광을 유도하거나 원심분리 단계에서 전극과 직접 접촉된다.
이러한 양태에서, 샘플 및 샘플 폐쇄용기를 신속히 회전시키기 위한 수단이 측정셀에 제공된다. 원심력에 의해 샘플내 피브릴은 샘플 폐쇄용기의 회전축에서 외측으로 회전되어 샘플 폐쇄용기의 외면에 구비된다. 이러한 샘플 폐쇄용기의 외면은 ECL 측정 시스템의 작동전극을 구성한다.
세 번째 양태로, 피브릴은 분석 조성물로부터 여과에 의해 제거될 수 있다. 이러한 양태에서, 입자는 분석 조성물의 나머지보다 큰 밀도를 가질 필요는 없다. 피브릴은 용액으로부터 분리되어 용액을 필터를 통해 인출, 예를 들면, 필터의 표면상에 입자를 펌핑하고 수집함으로써 농축된다. 필터의 이러한 표면은 예를 들면, ECL 검출 시스템에서의 작동전극으로 작용할 수 있는 금속 박막으로 코팅된다.
다른 양태에서, 현탁된 피브릴은 마그네틱 반응성, 즉 이들은 상자성 또는 강자성일 수 있고, 측정대에서 또는, 바람직하게는 전극표면에서 직접, 자계를 입자에인가함으로써 수집된다. 측정셀에는 마그네트가 장착된다. 마그네트의 자계는 입자가 뱃치셀에 있게 되거나 이들이 유동셀을 통해 유동함에 따라 입자에 힘을 인가하게 되며, 이에 따라 이들은 용액의 벌크로부터 마그네트와 최인접의 셀 표면으로 분리된다. 마그네트가 적절한 배양으로 및 ECL 검출 시스템의 작동 전극에 인접하여 배치되면, 입자는 작동전극의 표면에 집중될 것이다.
전극표면에 복합체를 수집하고 집중시키기 위해 전술한 방법을 이용하여 결합분석을 위한 몇몇 상이한 이질 및 균질 포맷이 수행될 수 있다. 이질 결합 분석에 있어서, 복합체는 표지물로부터 발광을 측정하기에 앞서 조성물로부터 분리된다. 균질 분석에 있어서, (고체상에) 결합되거나 결합되지 않은 표지된 시약이 전혀 분리되지 않았다.
균질분석에서, 복합체가 작동전극의 표면에 집중될 때, 표지물로부터의 측정 시그널은 수집단계 부재시 보다 훨씬 크다. 복합체를 이루지 않은 시약으로부터의 시그널은 대조적으로 불변이다. 따라서, 비복합 표지 시약이 측정셀에 존재함에도 불구하고, 수집된 복합체로부터의 시그널은 복합체의 수집없이 한 분석에서 보다 더 강력하다. 결합분석에 대한 검출한계는 수집절차의 결과로 훨씬 향상된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 현장에서의 분리단계는 균질 결합 분석 절차에 포함된다. 분석 조성물, 즉 샘플 분석 수행 물질 및 입자가 측정 셀 중으로 펌핑되고 복합체가 작동 전극 상에서 포착된 후, 제 2 유체를 표지물이나 표지된 시약을 함유하지 않는 셀을 통해 펌핑시키며, 이에 따라 분석 조성물의 비결합 성분으로부터 복합체의 현장 세척 또는 분리가 수행된다. 이러한 분석 절차는 기술적으로 볼 때 이질 결합 분석이다. 그러나, 측정셀 내측에서의 분리 수행능은 추가의 분리장치를 요하지 않고 절차가 외부 분리법 보다 일반적으로 훨씬 신속하다는 점에서 유리하다.
이질 결합 분석은 분석 조성물의 성분을 혼합하고 이들을 소정의 시간 동안 반응시킴으로써 본 발명을 사용하여 수행한다. 분석 조성물을 이어서 용액이 입자로부터 분리되는 분리단계에 투입한다. 이어서, 전기화학발광을 복합체 또는 용액으로부터 측정한다. 농축단계 후의 복합체로부터의 ECL 측정은 농축과정 없이 수행할 때 보다 더 우수한 정확성과 더 낮은 검출한계로 분석물의 측정을 허용한다.
대표적인 예
본 발명의 하나의 대표적인 양태로서, 작용화된 피브릴을 아비딘(분석-수행-물질)과 추가 반응시켜 ECL 분석에 사용할 것을 제조한다. 이와같이 개질된 피브릴을 이어서 바이오티닐화 올리고뉴클레오타이드(분석-수행-물질)과 반응시켜 DNA 탐침 분석에 사용하기 위한 피브릴-아비딘-바이오틴-올리고뉴클레오타이드 복합체를 형성시킨다. 이러한 복합체는 ECL 잔기로 표지된 해당 분석물에 상보적인 제 2 올리고뉴클레오타이드의 존재하에 샌드위치 분석에서 탐침에 상보적인 해당 올리고뉴클레오타이드 분석물에 대한 탐침으로서 사용될 수 있다.
본 발명, 및 이의 기타 목적 및 특징은 특정의 바람직한 양태의 하기 상셍한설명으로부터 더욱 명쾌하고 상세하게 숙지된다.
본 발명은 결합분석에 들어갈 수 있는 해당 분석에 광범위하게 적용가능하다. 이러한 반응에는 예를 들면, 항원-항체, 리간드 수용체, DNA 및 RNA 상호작용, 및 기타 공지의 반응을 포함한다. 본 발명은 다성분 샘플내 해당 분석물의 존재여부를 정량 및 정성 검출하기 위한 상이한 방법 및 분석에 관한 것이다.
샘플
고체, 에멀션, 현탁액, 액체, 또는 가스 형태일 수 있는, 해당 분석물을 함유할 수 있는 샘플은 예를 들면, 세포 및 세포-유도 산물, 물, 음식, 혈액, 혈청, 털, 땀, 뇨, 대변, 조직, 타액, 오일, 유기 용매 또는 공기로부터 유도될 수 있다. 샘플은 또한, 예를 들면, 물, 아세토니트릴, 디메틸, 설폭사이드, 디메틸 포름아미드, n-메틸-피롤리돈 또는 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
분석물
전형적인 해당 분석물은 완전 세포 또는 표면 항원, 아세포성 입자, 바이러스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원, 햅텐, 지방산, 핵산, 단백질, 지질단백질, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 당단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 세포 대사산물, 호르몬, 약리학제, 합성 유기분자, 유기금속 분자, 진정제, 바비튜레이트, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 설탕, 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 세포에 존재하는 무기 분자이다. 전형적으로, 해당 분석물은 10-3 몰 이하 농도, 예를 들면, 10-12 몰 이하 정도의 낮은 농도로 존재한다.
분석-수행 물질
해당 분석물을 함유하는 샘플과 배합되는 분석-수행-물질은 (i) 전술한 바와 같은, 첨가된 해당 분석물 또는 이의 동족체, (ii) 해당 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너, 및 (iii) 전술한 바와 같은, (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성 성분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 함유하고, 이러한 물질 중 하나는 화합물 또는 잔기, 예를 들면, 발광을 유도할 수 있는 ECL 잔기에 결합된다. 표지된 물질은 완전 세포 또는 표면항원, 아세포성 입자, 바이러스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원, 햅텐, 지질, 지방산, 핵산, 폴리사카라이드, 단백질, 지질단백질, 리포폴리사카라이드, 당단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 세포 대사산물, 호르몬, 약리학제, 진정제, 바비튜레이트, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 설탕, 비생물학적 중합체(바람직하게는, 가용성), 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 합성 유기분자, 유기금속 분자, 무기 분자, 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘이다. 한 양태에서, 시약은 항체, 항원, 핵산, 햅텐, 소 뉴클레오타이드 서열, 올리고머, 리간드, 효소, 또는 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 또는 이의 복합체와 결합된 전기화학발광 부위, 또는 단백질 상호 작용을 통해 1차 결합 파트너에 결합할 수 있는 기타 2차 결합 파트너이다.
천연 또는 합성 가능한 해당 분석 동족체는 전형적으로는 분석체와 필적할만한 결합 특성을 지닌 화합물이지만, 더 높거나 낮은 결합능을 가진 화합물일 수도 있다. 분석물 또는 이의 동족체, 및/또는 이의 결합 파트너와 결합할 수 있으며ECL 부위가 분석물에 연결될 수 있는 반응 성분은 적당하게는 제 2 항체 또는 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 단백질, 또는 아비딘 또는 바이오틴 또는 결합 반응에 들어가는 것으로 당해 분야에 공지된 기타의 성분이다.
표지
유리하게는, ECL 잔기는 금속 킬레이트이다. 이 킬레이트 금속은 적당하게는 금속 킬레이트가 해당 반응 시스템에 놓여진 전기화학조건하에서 발광하는 금속이다. 이러한 금속 킬레이트의 금속은 예를 들면, 전이 금속(d-블록 전이 금속) 또는 희토류 금속이다. 금속은 바람직하게는 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 크롬 또는 텅스텐이다. 특히 바람직한 것은 루테늄 및 오스뮴이다.
이러한 킬레이트에서 금속과 결합된 리간드는 일반적으로 천연의 헤테로사이클릭 또는 유기 리간드이고, 금속 킬레이트가 수성 환경 또는 유기 또는 기타 비수성 환경에서 용해되는지의 여부를 결정하는 역할을 한다. 리간드는 여러 자리일 수 있고, 치환 가능하다. 여러 자리 리간드는 방향족 및 지방족 리간드를 포함한다. 적당한 방향족 여러 자리 리간드는 방향족 헤테로사이클릭 리간드를 포함한다. 바람직한 방향족 헤테로사이클릭 리간드는 질소-함유, 예를 들면, 비피리딜, 비피라질, 테르피리딜, 및 페난트롤릴이다. 적당한 치환체는 예를 들면, 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아랄킬, 치환 아랄킬, 카복실레이트, 카복스알데하이드, 카복사미드, 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카보닐, 아미노카보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 황-함유 그룹, 인 함유 그룹, 및 N-하이드록시석신이미드의 카복실레이트 에스테르를 포함한다. 킬레이트는 하나 이상의 한자리 리간드를 가질 수 있는데, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 적당한 한자리 리간드는 예를 들면, 일산화탄소, 사이아나이드, 이소사이아나이드, 할라이드, 및 지방족, 방향족 및 헤테로사이클릭 포스핀, 아민, 스틸벤, 및 아르신을 포함한다.
적당한 킬레이트의 예는 비스[(4,4'-카보메톡시)-2,2'-비피리딘] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘) [4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비피리딘] 루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부틸산] 루테늄 (II); 트리스(2,2'-비피리딘) 루테늄 (II); 트리스 (2,2' 비피리딘) 루테늄 (II); (2,2'-비피리딘) [비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴 (II); 비스(2,2'-비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민] 루테늄(II); 비스 (2,2'-비피리딘) [1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄] 루테늄 (II); 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도헥사논산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄 (II)이다. 기타 ECL 부분에 관해서는 양도된 PCT 출원 US87/00987 및 PCT 출원 88/0394에 기술되어 있다.
ECL 잔기의 기능은 전기화학에너지 반응 시스템으로의 도입으로 인한 전자기 복사선을 방출하는 것이다. 이를 위해, 여기(excited) 에너지 상태로 자극될 수 있어야 하고 또한 여기 상태에서 떨어짐과 동시에 광양자와 같은 전자기를 복사할 수 있어야 한다. 전기화학발광 반응에서 ECL 잔기의 참여 메커니즘의 이론적인 분석에 구애되길 원하지 않지만, 본 출원인은 이것이 전기화학에너지를 반응 시스템으로 도입시켜 산화된 다음, 시스템내에 존재하는 환원제와 상호 작용하여, 여기 상태로 전환되는 것으로 여기고 있다. 이 상태는 비교적 불안정하고, 금속 킬레이트는 빠르게 좀더 안정한 상태로 하강한다. 이렇게 하는 중에, 킬레이트는 검출 가능한 광양자와 같은 전자기 복사선을 복사하게 된다.
본 발명에 따라 결합된 금속 킬레이트 또는 기타 금속-함유 ECL 잔기의 양은 시스템에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이용되는 이러한 부분의 양은 앞서 언급된 조성물 또는 시스템에서, 검출 가능하고 원한다면, 정량 가능한 방출, 전자기 에너지의 방출을 야기하는데 효과적인 양이다. 해당 분석물의 검출 및/또는 정량은 전형적으로 해당 분석물 및 ECL 잔기를 함유하는 샘플과 기지량의 해당 분석물 및 ECL 잔기로써 전개시킨 표준 보정에 의해 방출된 발광을 비교함으로써 행해진다. 이는 균질 포맷으로 행한다. 이질 포맷의 경우에는, 앞서 논의된 것과 같은 분리는 ECL 분석 이전에 행해진다.
당업자가 인식할 수 있는 바대로, 금속-함유 ECL 잔기의 확인 및 양은 우세한 조건에 따라 시스템간에 달라질 것이다. 적절한 금속-함유 ECL 잔기, 및 원하는 결과를 얻기에 충분한 양은 본원의 교시에 따라, 추가 실험없이, 당업자의 경험에 의해 측정될 수 있다.
흑연 나노튜브
나노튜브는 예를 들어 다공성 컬럼에서, 응집제, 매트 또는 필름과 같이 분산되고, 비드를 포함하는 보다 큰 지지체에 부착되거나, 기타 물질과 혼합되고 복합체로 이용되는 경우를 포함하는 다양한 기하 구조에서의 분석용 고형 지지체로 이용될 수 있다. 나노튜브는 주로 화학적으로-개질가능한 흑연 탄소로 구성된다. 이는 일반적으로 0.1 ㎛ 이하의 직경을 가지고 길이 : 직경비가 최소 5이다. 전형적으로, 이들은 0.01 ㎛의 직경 및 1 내지 10 ㎛의 길이를 가진다.
작용화된 나노튜브
유리하게도, 피브릴은 작용화된 피브릴, 즉, 표면이 이와 결합되는 작용성 화학 부위를 지니기 위해 불균일하거나 균일하게 개질된 피브릴이다. 피브릴 표면은 산화 또는 기타 화학적 매질과 반응하여 작용화될 수 있다. 피브릴 표면은 자체로 화학 반응성을 지닌 종의 화학 반응 또는 물리적인 흡착에 의해 비균일하게 변형될 수 있다. 비브릴 표면은 예를 들면, 산화에 의해 변형될 수 있고 기타 작용 그룹과 반응하여 추가로 변형될 수 있다. 피브릴이 전기화학발광 분석시 결합 성분을 포함하는 다양한 기질에서 화학 그룹과 화학적으로 반응하거나 물리적으로 결합할 수 있도록 피브릴 표면은 다양한 작용 그룹으로써 변형될 수 있다.
피브릴의 복합 구조는 다양한 링커 화학에 의해 피브릴상의 작용 그룹들을 서로 연결시켜 수득될 수 있다.
피브릴 표면의 화학적인 변형 방법 및 피브릴 표면에서의 물리적인 흡착방법에 관해 기술되어 있는데 이는 각각의 경우에, 섬유 표면에 결합된 작용 부위를 제공하기 위함이다.
분석-수행-기질에 결합된 작용화된 나노튜브
작용화된 피브릴을 다양한 생물분자와 반응시켜 ECL 분석에 사용하도록 제조할 수 있다. 다양한 분석-수행-기질, 예를 들면, 항체, 수용체, 또는 기타 결합 잔기을 작용화된 피브릴과 반응시켜 ECL 분석에 이용하도록 제조할 수 있다.
입자
흑연 나노튜브는 공유 결합 또는 비공유 결합적으로 입자와 같은 보다 큰 고체상에 부착될 수 있다.
입자는 유리하게는 0.05 ㎛ 내지 200 ㎛, 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 100 ㎛, 가장 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛의 직경을 지닌 미립자, 및 상기 하부 단락 (b)(i), (b)(ii), 또는 (b)(iii)에서 규정된 분석물 및/또는 하나 이상의 기타 물질에 결합할 수 있는 표면 성분을 포함한다. 예를 들면, 미립 물질은 전분, 덱스트란, 셀룰로스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌/부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴/부타디엔/스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체, 또는 비닐 클로라이드/아크릴레이트 공중합체와 같은 스티렌 공중합체, 불활성 무기 입자, 크롬 디옥사이드, 철, 실리카, 실리카 혼합물, 및 단백성 물질과 같은 옥사이드, 또는 이들의 혼합물과 가교 결합될 수 있다. 바람직하게는, 이 입자는 ECL 시스템에서 현탁된다.
분석 매질
전극이 전기 화학적 에너지를 도입하는 시스템을 작동하기 위해서는, 전극이 함침되고 ECL 잔기를 함유하는 전해질을 제공하는 것이 필요하다. 전해질은 전하가 이온에 의해 운반되도록 하는 상이다. 일반적으로, 전해질은 액상이고, 물, 유기 액체 또는 유기 액체의 혼합물, 또는 물과 하나 이상의 유기 액체 혼합물 중의 하나 이상의 염 또는 기타 종의 용액이다. 그러나, 전해질의 기타 형태도 또한 본 발명의 임의 양태에 유용하다. 예를 들면, 전해질은 유체--예를 들면, 액체, 증기 또는 임계 유체--에서 하나 이상의 물질의 분산액이거나 고체, 증기 또는 임계 유체에서 하나 이상의 물질의 용액일 수 있다.
전해질은 적당하게는 수-중-염 용액이다. 염은 바람직하게는 나트륨 염 또는 칼륨 염일 수 있지만, 양이온이 전기화학발광 상호작용 순서를 방해하지 않는 한, 기타 양이온의 혼입도 어떤 양태에서는 적당하다. 염의 음이온은 예를 들어, 포스페이트일 수 있지만, 또한 선택된 음이온이 전기화학발광 상호 작용 순서를 방해하지 않는다면, 기타 음이온의 사용역시 본 발명의 임의 양태에 수용될 수도 있다.
조성물도 또한 비수성일 수 있다. 초임계 유체가 어떠한 경우에 유리하게 적용될 수 있지만, 비수성 조성에서는 유기 액체를 포함하는 전해질을 이용하는 것이 좀더 전형적이다. 수성 전해질과 같이, 비수성 전해질도 또한 전하가 이온에 의해 운반되는 상이다. 일반적으로, 이는 염이 유기 액체 매질에 용해됨을 의미한다. 적당한 유기 액체의 예는 아세토니트릴, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 메탄올, 에탄올, 및 상기 2종 이상의 혼합물이 있다. 예를 들자면, 유기 액체에 용해되는 테트라부틸암모늄 테트라플루오로보레이트와 같은 테트라알킬암모늄 염을 이용해 비수성 전해질을 형성할 수 있다.
전해질은 본 발명의 어떤 양태에서는, 완충 시스템이다. 포스페이트 완충액이 종종 유리하다. 예로는 나트륨 포스페이트/나트륨 클로라이드 수용액, 및 나트륨 포스페이트/나트륨 플루오라이드 수용액이 있다.
기타 분석 성분
아민-유도 환원제를 이용한 전기화학발광 반응이라는 표제하에, 본원에서 참조문헌으로 인용되는 양도된 PCT 출원 US 89/04859 명세서에서 기술한 바와 같이, 환원제, 전형적으로는 산화되고 자동 분해되어 높은 환원 종으로 전환될 수 있는 아민 또는 아민 잔기(보다 큰 분자)를 포함하는 것이 바람직하다. 아민 또는 아민 잔기는 또한 반응 시스템으로 도입된 전기화학에너지에 의해 산화될 수 있는 것으로 여겨진다. 아민 또는 아민 잔기는 하나의 전자를 잃은 다음 탈양성자화되거나, 그 자체로 강환원제로 재배열한다. 이 시약은 산화된 금속-함유 ECL 잔기와 작용하여 앞서 기술된 여기 상태를 띠게 된다. 이를 수행하기 위해, 아민 또는 아민 잔기는 바람직하게는 이러한 탄소로부터 제공될 수 있는 전자를 가진 탄소-중심 라디칼, 환원제를 형성하기 위해 탈양성자화 동안 양성자 공여체로 작용할 수 있는 알파 탄소를 가진다. 아민-유도 환원제는 금속-함유 ECL 잔기가 여기 상태로 전환하는 동안 필요한 자극을 제공하고, 이로부터 검출 가능한 전자기 복사선이 방출된다.
다양한 아민 및 상응하는 아민 잔기가 본 발명의 실행에 이용될 수 있다. 일반적으로, 아민 또는 아민 잔기는 전기화학발광 분석될 수 있는 시스템의 pH를 맞추기 위해 선택된다. 기타 관련 인자는 아민 또는 아민 부분이 환경 친화적이어야 한다는 것인데, 이는 즉, 경우에 따라, 분석하는 동안 수성 또는 비수성 환경과 조화되어 작용해야 한다는 것이다. 기타 고려 사항은 선택된 아민 또는 아민 잔기가 우세한 조건하에 시스템에서 산화된 금속-함유 ECL 잔기를 환원시키기에 충분히 강한 아민-유도 환원제를 형성해야한다는 점이다.
본 발명에 유리하게 이용되는 아민 (및 이로부터 유도된 상응하는 잔기)은 1급, 2급 및 3급 알킬 아민과 같은 지방족 아민, 각각 1 내지 3 개의 탄소 원자를 지닌 알킬 그룹, 및 치환 지방족 아민이다. 트리프로필 아민은 비교해서 말하면, 특히 높은-강도의 전자기 복사선을 방출시켜 사용되는 양태와 함께 검출 및 정량의 감도 및 정확도를 고양시키기 때문에 특히 바람직한 아민이다. 또한 적당한 것은 히드라진과 같은 디아민, 및 폴리(에틸렌이민)과 같은 폴리민이다. 본 발명의 실시에 적당한 기타 아민의 예로는 트리에탄올 아민, 트리에틸 아민, 1,4-디아자비사이클로-(2.2.2)-옥탄, 1-피페리딘 에탄올, 1,4-피페라진-비스-(에탄-설폰산), 트리-이소프로필 아민 및 폴리(에틸렌이민)이 있다.
전형적으로, 본 발명에 이용되는 금속-함유 ECL 잔기는 반응-제한 요소이다. 따라서, 아민 또는 아민 잔기는 이에 관해 화학양론적으로 과량이 제공되는 것이 전형적이다. 예를 들자면, 아민 또는 아민 잔기는 50 내지 150 mM의 농도로 이용된다. 대략 pH 7에서 이용할 경우, 100 mM의 농도가 가끔은 유리하다. 임의 양태에서, 아민 또는 아민 잔기의 농도에 대한 상한점은 이용되는 환경, 예를 들어 물에서 아민 또는 잔기의 최대 용해도에 의해 결정된다. 일반적으로, 적용된 아민 또는 아민 잔기의 양은 발광이 일어나도록 산화된 금속-함유 ECL 잔기를 여기 상태로 전이시키기에 충분한 양이다. 본원에서 교시한 바에 따라 당업자는 추가 실험없이, 특정 분석 시스템에 유리하게 이용되는 아민 또는 아민 잔기의 양을 경험적으로 결정할 수 있다.
전기화학발광 반응이라는 표제하에, 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 PCT 출원 US 89/04859 명세서에서 기술한 바와같이, 본 발명의 분석은 바람직하게는 증진제, 전형적으로는 하기 화합물의 존재하에 수행된다.
화학식
상기식에서,
R은 수소 또는 CnHn2+1이고,
R'은 CnH2n이며,
x는 0 내지 70이며,
n은 1 내지 20이다. 특히, n은 1 내지 4이다. 특정 예로는 상표명 Triton X-100하에 시판되고, x가 9 내지 10인 물질, 및 상표명 Triton N-401(NPE-40)하에 시판되고, x가 40인 물질로써, 화학식은 각각 하기와 같다.
화학식
화학식
증진제는 일반적으로 이의 존재시 전자기 복사에 있어 원하는 만큼의 증가가 일어나도록 하기에 충분한 양이 이용된다. 전형적으로, 이 양은 0.01 용적/용적%, 좀더 상세하게는 0.1 내지 1.0 용적/용적%이다. 이러한 적용에 관한 주요 사안이 참조 문헌으로 인용되고 있다.
본 발명에 따라 혼입된 ECL 잔기는 이를 여기 상태로 자극하여 전자기 복사를 유도한다. 이는 ECL 잔기를 전기화학에너지로 통합하는 시스템에 노출함으로써 달성된다. ECL 잔기 및 강 환원제를 형성하는 종의 산화가 일어나는 전위는 이의 정확한 화학 구조, 및 시스템의 pH 및 전기화학에너지를 유도하는데 이용되는 전극의 성질과 같은 인자에 좌우된다. 전기화학발광 시스템의 최적 전위 및 방출 파장 측정법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. ECL 시스템을 자극하는 바람직한 방법에 관해서는 본원에서 참고 문헌으로 인용되는, 공유 PCT 출원 US 89/01814의 명세서에 기재되어 있다.
전기화학발광 측정 장치
본 발명의 분석을 수행하는 장치에 관해서는 도 1 및 2에서 기술하고 있다. 도 1은 유리한 ECL 장치에 관해 기재하고 있지만, 본 발명의 방법은 장치(10)의 적용에만 한정되지 않고, 오히려 작동전극 또는 전기화학 에너지를 제공하여 ECL 잔기를 자극하여 전기화학발광을 제공하는 기타 자극 표면을 포함하는 기타 유형의 ECL 장치도 적용될 수 있다. 본 발명의 방법을 정지 또는 병류 양식에서 수행할 수 있지만, 장치(10)는 병류 셀을 포함하는데, 이 병류 셀은 결합 분석 샘플을 포함하는 다수 유형의 샘플에 뚜렷한 이점을 제공한다. 본 발명의 ECL 분석을 수행하기 위한 장치에 대한 추가 설명은 양도된 PCT 출원 US 89/04854 및 U.S. 90/01370에 기재되어 있다.
장치(10)는 유리하게는 광전자증배관(PMT), 광전 다이오우드, 전하 커플링 장치, 사진 필름 또는 에멀션 따위가 가능한 전기화학셀(12), 광 검출/측정 장치(14), 및 유리하게는 셀(12)을 들어와, 이를 경유해서 나가는 유체 이동을 제공하는 연동 펌프인 펌프(16)를 포함한다. 다른 방법으로, 양변위 펌프가 이용될 수 있다. 셔터 기구(18)는 셀(12)과 PMT(14) 사이에 놓여지고 ECL 측정 기간 동안 PMT 14를 셀(12)로 노출하는 경우에 한에서만 열리도록 제어 작동된다. 셔터 기구는 예를 들어, 유지되는 동안 닫혀질 수 있다. 도 1에서 설명된 경우를 제외하고 장치(10)에는 다양한 성분을 마운트시키고 ECL 측정 동안 외부광으로부터 PMT 14를 차단하도록 의도된 광차단 틀이 포함된다.
셀(12) 자체는 유입관(22) 및 배출관(24)를 통과하는 제 1 마운팅 블록(20)을 포함하는데, 이는 유리하게는 스테인레스 강으로 이루어질 수 있다. 마운팅 블록(20)은 제 1 외면(26) 및 제 2 내면(28)을 가지는데 이는 셀(12)이 상응하는 장치(10)의 조작동안 클린싱 및/또는 컨디셔닝 및/또는 측정 용액을 지지하는 셀(12)의 샘플-홀딩 용적(30)의 일 측면을 형성한다. 유입 및 배출관(22, 24)는 외면(26)에서 내면(28)까지 마운팅 블록(20)을 통과하고 샘플-홀딩 용적(30)쪽으로 통해 있다. 유리하게도 스테인레스 강으로 구성된 제 2 마운팅 블록(32)도 또한 제 1 외면(34) 및 제 2 내면(36)을 가진다. 제 2 마운팅 블록(32)은 유리하게도 테플론 또는 기타 비-오염성 물질로 구성된 환상 스페이서(38)에 의해 제 1 마운팅 블록(20)으로부터 분리된다. 따라서, 마운팅 블록(30)의 외면(34)은 샘플-홀딩 용적(30)의 제 2 측면 부위를 형성한다. 스페이서(38)는 내부 가장자리(44)가 샘플-홀딩 용적(30)의 측벽을 규정하는 외부(40) 및 중앙 개구(42)를 지닌다. 외부(40)는 제 1 마운팅 블록(20)의 내면(28)을 제 2 마운팅 블록(32)의 외면(34)쪽으로 밀봉하여 두 표면(28 및 34) 사이의 샘플-홀딩 용적(30)에 어떠한 용액도 통과하지 못하도록 막아준다. 마운팅 블록(32)은 윈도우(48)를 잘-밀봉하여 외면(34)의 연속인 샘플-홀딩 용적(30)의 제 2 측면의 나머지를 형성하는 중앙 개구(46)를 추가로 가진다. 윈도우(48)는 ECL 잔기에 의해 방출된 전기화학발광 광 파장에서 실질적으로 투명한 물질로 이루어진다. 따라서 윈도우(48)는 유리하게는 유리, 플라스틱, 석영 따위로 이루어진다.
유입관(22)은 스페이서(38)에 이웃한 제 1 단부(50)에서 샘플-홀딩 용적(30)과 교차하고 배출관(24)는 스페이서(38)에 이웃한 제 2 단부(52)에서 샘플-홀딩 용적(30)과 교차한다. 유입관(22), 샘플-홀딩 용적(30) 및 배출관(24)의 조합은 이로인해 셀(12)을 경유하고, 들어오고 나가는 좁은, 실질적으로 층류인 용액에 대한 연속 유동로를 제공한다.
설명된 양태에서, 제 1 및 제 2 작동 전극(56 및 58)을 포함하는 작동전극 시스템(54)이 제 1 마운팅 블록(20)의 내면(28)상에 마운팅된다. 기타 양태에서, 단일 작동전극이 유리하게 제공될 수 있거나, 전극(56)만이 작동전극일 수 있다. 작동전극(56 및 58)은 해당 전기화학 및 ECL 반응이 일어나는 곳이다. 작동전극(56,58)은 고형 전압 전류 전극이고 따라서 유리하게는 이를 위해 효과적인 백금, 금, 탄소 또는 기타 물질로 구성될 수 있다. 작동전극(56, 58) 각각에 연결된 와이어 커넥터(60, 62)는 제 1 마운팅 블록(20)을 통과한다.
도 2에서 설명되는 바와 같이, 커넥터(60, 62)는 둘다 전압 제어부(66)의 제 1, "작동전극" 단부(64)에 연결된다. 전압제어부(66)는 유리하게도 일정 전위기의 방식으로 작동하여 작동전극(56, 58)에 전압 시그널을 제공하고 임의로는 ECL 측정 동안 여기서 흐르는 전류를 측정한다. 다르게는, 커넥터(60, 62)는 개개 조작을 위해 전압제어부(66)의 개개 말단에 연결될 수 있다.
전압제어부(66)의 일정 전위기 조작은 카운터 전극(68) 및 임의지만 유리하게는 기준 전극(70)을 통해 추가로 행해진다. 설명된 양태에서, 마운팅 블록(32)은 스테인레스 강으로 이루어지고 카운터 전극(68)은 노출된 표면(72, 74)에서 마운팅 블록(32)으로 구성된다. 카운터 전극(72, 74) 및 작동전극(56, 58)은 화학 반응을 촉진하고 샘플중의 전기화학발광을 자극하는 샘플-홀딩 용적(30)내의 용액에 전위를 주도록 인터페이스를 제공하고/제공하거나 셀(12) 표면을 클린싱하고 컨딩셔닝하기 위한 에너지를 제공한다. 카운터 전극(72, 74)은 와이어 커넥터(76)에 의해 전압제어부(66)의 제2, "카운터 전극" 말단(78)에 연결된다.
기준 전극(70)은 작동전극(56,58)에 의해 적용된 전압이 예를 들어, 기준 전극에 대해 +1.2 볼트가 되는 기준 전압을 제공한다. 기준 전극(70)은 유리하게는 셀(12)에서 80 정도 떨어진 위치에서 배출관(24)에 위치하고 와이어 커넥터(82)를 통해 전압제어부(66)의 제 3 " 기준 전극" 말단(84)에 연결된다. 세가지 전극 모드에서, 전류는 기준 전극(70)을 통해 흐르지는 않는다. 기준 전극(70)은 균형이 포이즈되고, 공지된 안정한 전압을 제공하기 위해 3가지 전극 조작 모드로 이용될 수 있고 따라서 유리하게는 은/은 클로라이드(Ag/AgCl) 또는 포화 칼로멜 전극(SCE)으로 구성된다. 전압제어부(66)는 카운터/기준 전극인 작동전극(56) 및 전극(58)만을 이용해 2가지 전극 조작 모드로 조작 가능하다. 이러한 2가지 전극 조작 모드에서, 카운터/기준 전극(58)은 전압 조정기(66)상의 전압 조절 단자(78 및 84)에 전기적으로 연결된다. 이 경우, 전압제어부(66)는 필수적으로 배터리로 작동한다. 전압제어부(66)는 작업 및 카운터 전극(56 및 58)에 전압 시그널을 제공하고 임의로는 개개 전극을 통해 흐르는 전류를 측정한다. 기준 전극(70)은 다르게는 백금, 금, 스테인레스 강 또는 기타 물질로 구성된 소위 "준-기준"전극일 수 있고, 이는 덜 안정한 전압을 제공하지만, 접촉시 용액의 경우에는 측정가능하다. 2 및 3가지 전극 양태 모두에서, 기준 전극(70 또는 58)은 측정된 작동전극(56)에 적용된 전압에 대한 기준을 제공한다. 포이즈 전압 기준은 현재 좀더 유리한 것으로 인식되고 있다. 일정 전위기 조작에서 전압제어부(66)는 기준 전극(70)에 대해 작동전극(56, 58)에서의 기지 전압을 제공함으로써 다양한 전극을 조절하는데 이 동안 작동전극(56, 58)과 카운터 전극(72, 74) 사이의 전류 흐름을 측정한다. 이를 위한 일정 전위기가 익히 공지되어 있고, 전압제어부(66)의 내부 구조는 따라서 앞서-재인용된 기능을 생성하는 종래의, 시판용 일정 전위기에 상응할 수 있고 그 자체로 본 발명의 일부를 이루지는 않는다. 실제로, 장치(10)는 다르게는 내부 전압제어부(66)없이 구성될 수 있고, 전극(56, 58, 72, 74 및 70)에 요구되는 전압 시그널을 제공하기 위해 따로따로 조절되는 외부 일정 전위기에 연결되도록 조정될 수 있다. 하기에서 기술된 특정 방법이 적용된 이러한 전압 시그널은 작동전극(56, 58)의 표면 및 유리하게는 셀(12)의 표면에 반복 가능한 초기 조건을 제공하는데, 이러한 특성은 대체로 ECL 측정시 상당한 정도로 개선된 정밀도에 기여한다.
펌프(16)는 유리하게는 샘플 용적으로부터 유입관(22)으로 화살표 A 방향으로 용액을 "풀링"하기 위해 배출관(24)에 위치한다. 용액은 유입관(22), 샘플-홀딩 용적(30) 및 기준 전극(70)을 통과한 배출관(24)를 통해 흘러 화살표 B 방향으로 흘러나갈 것이다. 다르게는, 펌프(16)는 장치(10)를 통과하는 용액을 "푸시"하기 위해 유입관(22)에 위치할 수 있다. 유리하게도, 이는 셀(12)을 통과하는 모든 용액 및 유체에 이용되는 유입관(22), 샘플-홀딩 용적(30) 및 배출관(24)를 통해 흘러, 각 유체는 이전 유체가 셀(12) 밖으로 흐르도록 하는 유체 동역학적 클린싱 작용을 수행한다. 펌프(16)는 임의 시간 동안 셀(12)내의 특정 용액을 유지하기 위해 조작을 멈추도록 조절될 수 있다.
장치(10)의 병류 구조는 작동전극(56,58)(또는 카운터 및 기준 전극(72,74,70))을 공기에 노출시킴이 없이 작동전극이 다양한 전압에 영향을 받을 수 있게끔하거나 하나 이상의 용액에 연속 노출시키는 동안 작업전의 전위에서 연속적으로 유지되게끔 해준다. 기준 전극(70)에 대한 회로를 여는 공기 노출은 작동전극(56, 58)상의 표면 조건의 재생을 파괴하는 미지의, 무작위 전압 변동을 가능케 한다. 병류 구조는 전극 시스템(54)을 클린싱 및 조건화하는 초기 단계, 및 하나 이상의 측정 파형 또는 소사(sweep)가 ECL를 자극하는 측정 단계간의 빠른 변형을 가능케 한다.
본 발명은 또한 시약 조성물에 관한 것이다. 광범위하게는, 시약 조성물은 본 발명의 분석 시스템의 성분, 즉, (a) 전해질, (b) ECL 잔기를 함유한 표지 화합물, (c) 자기 반응 입자를 포함하면서 분석-수행-물질, 임의로는 입자와 결합된 작용화된 피브릴, (d) 해당 분석물 또는 해당 분석물의 동족체, (e) 해당 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너, (f) (d) 또는 (e)와 반응할 수 있는 반응 성분, (g) 환원제, 또는 (h) 전기화학발광-반응 증진제 중 하나일 수 있다. 시약은 이용에 편리하도록 서로 화합할 수 있는데, 즉, 이 성분, 삼 성분, 및 다중 성분 혼합물이 제조될 수 있지만, 단, 이들 성분은 저장 중에 의도된 분석에서 이들의 기능을 손상시킬 정도로는 서로 반응하지 않는다. 바람직하게는, 시약은 입자를 함유하는 이 성분 또는 다성분 혼합물 및 하나 이상의 기타 성분이다.
본 발명은 또한 키트에 관한 것이다. 키트는 앞서 인용된 성분 (a) 내지 (h)를 하나 이상 함유한 용기를 포함할 수 있거나 이들 성분의 혼합물을 포함하는 앞서 기술된 시약 성분을 하나 이상 함유할 수 있는데, 이들 모두 본 발명의 분석법 및 시스템에 유용하다.
피브릴을 작용화시키는 방법
본 발명의 작용화된 피브릴은 직접적으로는 설폰화, 탈산소화된 피브릴 표면에의 친전자성 첨가 또는 금속화에 의해 제조될 수 있다. 아크 성장 나노섬유를 이용할 경우, 이들은 작용화 이전에 광범위한 정제를 요구할 수 있다. Ebbesen et al. (Nature 367 519 (1994))에서는 이러한 정제 과정을 제공하고 있다.
바람직하게는, 탄소 피브릴은 이들을 작용화제와 접촉시키기 이전에 프로세싱된다. 이러한 프로세싱은 용매 중에서 피브릴 분산을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 탄소 피브릴은 여과되고 추가 접촉 이전에 건조될 수 있다.
1. 설폰화
배경 기술은 문헌[참조: March, J. P., Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Wiley, New York 1985; House, H., Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA 1972]에 기재되어 있다.
활성화된 C-H(방향족 C-H 포함) 결합은 20%이하의 SO3를 함유하는 진한 황산 용액인 발연 황산(올리움)을 이용해 설폰화될 수 있다. 종래의 방법은 온도∼80℃에서 올리움을 이용해 액상에서 행해졌다; 그러나, 활성화된 C-H 결합은 또한 비활성, 비양성자성 용매에서 SO3 또는 증기상에서 SO3를 이용해 설폰화될 수 있다. 이 반응은 하기와 같다:
-C-H + SO3 -----→ -C-SO3H
과-반응은 하기의 방법에 의해 설폰을 형성시킨다.
2 -C-H + SO3 -----→ -C-SO2-C- + H2O
제조 A
황산을 이용한 C-H 결합의 활성화
반응은 결과에 있어 여타의 유의한 차이없이 가스상 및 용액에서 수행된다. 증기상 반응은 린드버그 로에서 가열된 수평의 석영관 반응기에서 수행된다. 가스 유입/배출관이 갖추어진 20% SO3의 진한 H2SO4를 함유한 다중-경부 플라스크가 SO3원으로 이용된다.
마그네틱 보우트에 중량을 잰 피브릴 샘플(BN 또는 CC)을 가스 유입구가 장치된 1" 튜브에 놓는다; 배출구는 진한 H2SO4 버블러 트랩과 연결된다. 아르곤은 모든 공기를 제거하기 위해 20분 동안 반응기를 통해 흘려지고, 샘플은 잔류 수분을 제거하기 위해 1 시간 동안 300℃까지 가열된다. 건조 후, 온도는 아르곤하에 반응 온도로 조절된다.
원하는 온도가 안정화되면, SO3원은 반응기 튜브에 연결되고 아르곤 스트림은 SO3 증기를 석영관 반응기로 옮기는데 이용된다. 반응은 원하는 온도에서 원하는 시간 동안 수행되고, 이 후 반응기는 유동 아르곤하에 냉각된다. 피브릴은 90℃ 5" Hg 진공에서 건조되어 증가된 건조 중량을 얻는다. 설폰산(-SO3H) 함량을 0.100 N NaOH와 반응시켜 pH 6.0을 종점으로 이용해 0.10 N HCl로 역-적정하여 측정한다.
액상 반응은 온도계/온도 조절기 및 마그네틱 교반기가 갖추어진 다중-경부 100 cc 플라스크에서 20% SO3를 함유하는 진한 황산에서 수행된다. 진한 H2SO4(50) 중 피브릴 슬러리를 플라스크에 놓는다. 올리움 용액(20 cc)은 반응기에 첨가되기 이전에 약 60℃까지 미리가열된다. 반응 후, 산성 슬러리를 분쇄된 얼음에 붓고, 1 ℓ 탈이온수로 즉시 희석한다. 고형물를 여과하고 세척수의 pH가 변하지 않을 때까지 탈이온수로 철저하게 세척한다. 피브릴을 100℃ 5" Hg 진공에서 건조한다. 여과시의 운반 손실로 인해, 정확한 증가 중량을 얻을 수는 없다. 결과는 표 1에 실려 있다.
[표 1]
반응 요약
증기상 또는 액상에서의 반응에 의한 설폰산 함량에는 유의할 만한 차이는 없다. 이는 온도의 효과이다. 반응 온도가 높을수록 (증기상) 보다 높은 설폰 량을 제공한다. 118-61B에서, 4.2 중량%의 증가분은 설폰산 함량(이론적 0.51 meq/g)과 일치한다. 실행 60A 및 61A는 설폰산 함량만을 고려하기에는 중량 증가분이 매우 높다. 따라서 설폰의 양도 감지 가능한 것으로 여겨진다.
2. 무-옥사이드 피브릴 표면에 첨가
배경 기술은 문헌[참조: Urry, G., Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York 1989]에 기재되어 있다.
피브릴 중 표면 탄소는 흑연과 같이 행동하는데, 즉 이들은 기저면 및 엣지 탄소 모두를 함유하는 육각 시이트에 배열된다. 기저면 탄소가 화학 공격에 상대적으로 불활성인 반면, 엣지 탄소는 반응성이 있고 탄소 원자가를 만족시키기 위해 약간의 헤테로 원자 또는 그룹을 함유해야 한다. 피브릴은 또한 기본적으로 엣지 탄소이고 헤테로 원자 또는 그룹을 함유한 표면 결함 부위를 지닌다.
피브릴의 표면 탄소에 부착되는 가장 일반적인 헤테로 원자는 제조 동안 우세한 가스 성분인 수소; 반응성이 높고 흔적량을 없애기가 매우 어렵기 때문인 산소; 및 촉매 때문에 항상 존재하게 되는 H2O이다. 진공 중 약 1000℃에서의 열분해는 복잡한 반응에서 미지의 메커니즘, 그러나 공지된 화학량으로 표면을 탈산소화시킬 것이다. 산물은 CO 및 CO2가 2 : 1의 비로 존재한다. 생성된 피브릴 표면은 C1-C4 정렬로 활성화된 올레핀에 매우 반응적인 라디칼을 함유한다. 표면은 진공 또는 불활성 가스의 존재시에 안정하지만, 반응성 가스에 노출될 때까지 높은 반응성을 보유한다. 따라서, 피브릴은 진공 또는 불활성 대기하에 약 1000℃에서 열분해되고, 이러한 동일 조건하에 냉각되며 저온에서 적절한 분자와 반응하여 안정한 작용 그룹을 생성할 수 있다.
전형적인 예는 하기의 반응에 이어,
하기의 반응이 행해진다.
상기에서, R′는 탄화수소 라디칼, 알킬, 사이클로알킬 등이다.
제조 B
아크릴산을 무-옥사이드 피브릴 표면과 반응시켜 작용화된 피브릴의 제조
마그네틱 보우트 중의 BN 피브릴 1 그램을 열전쌍이 장치된 평면의 1" 석영관에 놓고 린드버그 튜브로에 위치시킨다. 말단을 가스 유입구/배출구에 맞춘다. 튜브를 건조, 탈산소화된 아르곤으로 10분간 퍼지시킨 후, 용광로의 온도를 300℃까지 상승시키고 30분간 유지한다. 이후, 연속 아르곤 유동하에, 온도를 100℃에서 1000℃까지 올리고, 16시간 동안 유지한다. 이 시기의 마지막에, 튜브를 유동 아르곤하에 실온(RT)으로 냉각한다. 아르곤의 유동을 50℃에서 말끔히 정제된 아크릴산을 함유하고 가스 유입구/배출구가 장치된 다중-경부 플라스크를 통과시킨다. 아크릴산/아르곤 증기 유동을 실온에서 6 시간 지속한다. 이 시기의 마지막에, 잔류성 비반응 아크릴산을 우선 아르곤으로 퍼지시킨 다음, 100℃ <5" 진공에서 진공 건조시켜 제거한다. 카복실산 함량을 과량의 0.100N NaOH와 반응시켜 pH 7.5의 종점까지 0.100N HCl로 역-적정하여 측정한다.
제조 C
아크릴산을 무-옥사이드 피브릴 표면과 반응시켜 작용화된 피브릴의 제조
본 과정은 상기 과정과 유사한 방법을 반복하지만, 열분해 및 냉각은 10-4 토르 진공에서 수행된다. 정제된 아크릴산 증기를 상기 과정과 같이 아르곤으로 희석한다.
제조 D
말산과 무-옥사이드 피브릴 표면을 반응시켜 작용화된 피브릴의 제조
본 과정은 제조 B에서와 같이 반복되지만, 반응물은 실온에서 정제된 말산 무수물(MAN)이고 이는 80℃에서 용융 MAN 베드를 통해 아르곤 가스를 통과시켜 반응기에 공급된다.
제조 E
아크릴로일 클로라이드를 무-옥사이드 피브릴 표면과 반응시켜 작용화된 피브릴의 제조
본 과정은 제조 B에서와 같이 반복되지만, 반응물은 실온에서 정제된 아크릴로일 클로라이드이고, 이는 25℃에서 순 아크릴로일 클로라이드 위에 아르곤 가스를 통과시켜 반응기에 공급된다. 산성 클로라이드 함량은 과량의 0.100 N NaOH와 반응시켜 0.100N HCl로 역-적정하여 측정된다.
진공에서 피브릴의 열분해는 피브릴 표면을 탈산소화한다. TGA 장치에서, 1000℃에서 진공 또는 정제된 Ar 유동에서의 열분해는 BN 피브릴의 3 샘플의 경우에 평균 3%의 중량 손실을 제공한다. 가스 크로마토그래피 분석은 단지 CO 및 CO2를 각각 ∼2 : 1의 비로 검출한다. 생성된 표면은 매우 반응성이 있고 아크릴산, 아크릴로일 클로라이드, 아크릴아미드, 아크롤레인, 말산 무수물, 알릴 아민, 알릴 알콜 또는 알릴 할라이드와 같은 활성화된 올레핀은 심지어 실온에서 반응하여 활성화된 올레핀에 결합된 작용기만을 함유한 순수한 산물을 형성할 것이다. 따라서, 카복실산만을 함유한 표면은 아크릴산 또는 말산 무수물과의 반응에 이용될 수 있고; 산 클로라이드만을 함유한 서프는 아크릴로일 클로라이드와의 반응; 단지 알데하이드는 아크롤레인과의 반응; 단지 하이드록실은 알릴 알콜과의 반응; 단지 아민은 알릴 아민과의 반응, 및 단지 할라이드는 알릴 할라이드와의 반응에 이용될 수 있다.
3. 금속화
배경 기술은 문헌[March, Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., p. 545]에서 제공된다.
방향족 C-H 결합은 다양한 유기금속제를 이용해 금속화되어 탄소-금속 결합(C-M)을 생성할 수 있다. M은 일반적으로 Li, Be, Mg, Al, 또는 Tl이지만; 기타 금속도 또한 이용될 수 있다. 가장 단순한 반응은 활성화된 방향족류에서 직접적인 수소 치환이다:
1. 피브릴-H + R-Li -----→ 피브릴-Li + RH
본 반응은 추가로, 강염기, 예를 들어 칼륨 t-부톡사이드 또는 킬레이팅 디아민을 요구할 수 있다. 비양성자성 용매가 필요하다(파라핀, 벤젠).
2. 피브릴-H + AlR3 -----→ 피브릴-AlR2 + RH
3. 피브릴-H + Tl(TGA)3 ---→ 피브릴-Tl(TFA)2 + HTFA
TFA = 트리플루오로아세테이트
HTFA = 트리플루오로아세트산
금속화된 유도체는 1차 일-작용화된 피브릴의 전형이다. 그러나, 이들은 반응하여 기타 1차 일-작용화된 피브릴을 추가로 생성한다. 몇몇 반응은 중간 산물의 분리없이 차후 동일한 장치에서 수행될 수 있다.
4.
제조 F
피브릴-Li의 제조
CC 피브릴 1 그램을 마그네틱 보우트에 놓고 린드버그 로에 넣어진 1" 석영관 반응기에 삽입한다. 튜브 말단을 가스 유입구/배출구에 적합시킨다. H2의 연속 유동하에, 피브릴을 700℃까지 2시간 동안 가열하여 표면 옥시게네이트를 C-H 결합으로 전환한다. 반응기를 유동 H2하에 실온으로 냉각한다.
수소화된 피브릴을 건조, 탈-산소화된 헵탄(LiAlH4과 함께)을 이용해 모든 공기를 제거하고 불활성 대기를 유지하는 정제된 아르곤 퍼징 시스템, 응축기, 자기 교반기 및 시린지에 의해 액체가 첨가될 수 있는 고무 격벽이 갖추어진 1 리터의 다중-경부 환저 플라스크로 옮긴다. 아르곤 대기하에, 헵탄 중에 5 mmol의 부틸리튬을 함유한 2% 용액을 시린지에 의해 첨가하고 슬러리를 완만한 환류하에 4시간 동안 교반한다. 이 시기의 마지막에, 피브릴을 아르곤 대기 글러브 박스에서 중력 여과에 의해 분리하고 건조, 탈산소화된 헵탄을 이용해 필터상에서 여러 번 세척한다. 피브릴을 스톱코크가 장치된 50 cc 환저 플라스크로 옮기고 50℃에서 10-4 토르 진공하에 건조시킨다. 리튬 농도는 피브릴 샘플을 탈이온수 중 과량의 0.100 N HCl과 반응시켜 pH 5.0이 종점이 되도록 0.100 N NaOH로 역-적정하여 측정된다.
제조 G
피브릴-Tl(TFA) 2 의 제조
CC 피브릴 1 그램을 제조 E에서와 같이 수소화시키고 건조 아르곤으로 반복된 퍼징에 의해 탈가스화된 HTFA와 함께 다중-경부 플라스크로 부하한다. HTFA 중 5 mmol Tl(TFA)3 5% 용액을 고무 격벽을 통한 플라스크에 첨가하고 슬러리를 완만한 환류에서 6시간 동안 교반한다. 반응 후, 피브릴을 수거해 제조 A에서와 같이 건조한다.
제조 H
피브릴-OH(OH 작용기만을 함유한 산소화된 유도체)의 제조
제조 F에서 제조된 산화 피브릴 1/2 g을 아르곤-대기 글러브 백 중 건조, 탈산소화된 헵탄을 이용해 스톱코크 및 마그네틱 교반 바가 갖추어진 50 cc 단일-경부 플라스크에 옮긴다. 플라스크를 글러브 백에서 제거하고 자기 교반기상에서 교반한다. 스톱코크를 공기에 노출시키고 슬러리를 24시간 교반한다. 이 시기의 마지막에, 피브릴을 여과시켜 분리하고 수성 MeOH로 세척하며, 50℃ 5" 진공에서 건조한다. OH 그룹의 농도를 80℃에서 디옥산(0.252 M) 중 표준화된 아세트산 무수물 용액과 반응시켜 OH 그룹을 아세테이트 에스테르로 전환시켜 결정하고, 이렇게 하는 중에, 1당량의 아세트산/1몰의 반응된 무수물을 배출한다. 총 산 함량, 유리 아세트산 및 반응하지 않은 아세트산 무수물을 pH 7.5D의 종점까지 0.100 N NaOH로 적정하여 측정한다.
제조 I
피브릴-NH 2 의 제조
탈레이트화 피브릴 1 그램을 제조 G에서와 같이 제조한다. 피브릴을 디옥산에서 슬러리화하고 디옥산에 용해된 트리페닐 포스핀 0.5 g을 첨가한다. 슬러리를 50℃에서 몇 분간 교반한 다음, 50℃에서 가스성 암모니아를 30분간 첨가한다. 피브릴을 여과시켜 분리하고, 디옥산에 이어 탈이온수에서 세척한 다음 80℃ 5" 진공에서 건조한다. 아민 농도를 과량의 아세트산 무수물과 반응시켜 유리 아세트산 및 반응하지 않은 무수물과 0.100 N NaOH로 역-적정하여 결정한다.
4. 유도된 다핵성 방향족, 다이핵성 방향족 및 2 차원 마크로사이클릭 화합물
피브릴의 흑연질 표면은 방향족 화합물의 물리적인 흡착을 허락한다. 인력은 반 데르 발스 힘이다. 이러한 힘은 다중-환 이질핵 방향족 화합물과 흑연질 표면의 기저면 탄소간에 상당하다. 탈착은 경쟁 표면 흡착이 가능하거나 흡착체가 높은 용해도를 가지는 조건하에 일어날 수 있다.
제조 J
피브릴상에 포피린 및 프탈로사이아닌의 흡착
피브릴상에 물리적인 흡착을 위한 바람직한 화합물은 흑연 또는 카본 블랙상에 강하게 흡착하는 것으로 알려진 유도 포피린 또는 프탈로사이아닌이다. 몇몇 화합물, 예를 들면, 테트라카복실산 포피린, 코발트(II) 프탈로사이아닌 또는 디리튬 프탈로사이아닌이 이용될 수 있다. 후자의 두 화합물은 카복실산 형태로 유도될 수 있다.
포피린 또는 프탈로사이아닌의 부하 용량은 이들이 증액식으로 첨가될 때 용액의 탈색에 의해 측정될 수 있다. 짙은 색의 용액(MeOH 중 테트라카복실산 포피린은 짙은 핑크, Co(II) 또는 아세톤 또는 피리딘 중의 디리튬 프탈로사이아닌은 짙은 청록색)은 분자가 흡착에 의해 피브릴의 블랙 표면으로 제거될 경우에 탈색된다.
부하 용량은 이러한 방법에 의해 평가되고 유도체의 족적은 이러한 측정값(약 140 sq. Å)으로부터 계산된다. 250 ㎡/g의 피브릴의 경우 평균 표면적으로 인해, 최대 부하는 약 0.3 mmol/g이 될 것이다.
테트라카복실산 포피린을 적정 분석한다. 흡착의 완결은 주위 및 승온에서 수성 시스템 중 탈색에 의해 시험된다.
피브릴 슬러리를 초기에 (워링 블렌더) 혼합하고 부하동안 교반한다. 몇몇 슬러리를 색이 더이상 빠지지 않게 된 후에 초음파처리하지만, 효과가 없다.
부하 후, 실행 169-11. -12. -14 및 -19-1(표 2 참조)을 동일한 용매에서 세척하여 갖혀있던 색소를 제거한다. 모두 세척수에서 연속적인 옅은 담색을 제공하기 때문에, 포화점을 정확히 결정하기가 어렵다. 실행 168-18 및 -19-2는 부하를 위해 계산된 양의 색소를 사용하고 부하 후 매우 가볍게만 세척된다.
테트라카복실산 포피린(아세톤으로부터) 및 Co 프탈로사이아닌(피리딘으로부터)을 추가 특성화를 위해 피브릴로 부하한다(각각 실행 169-18 및 -19-2).
테트라카복실산 포피린의 분석
과량의 염기(pH 11-12)의 첨가는 적정 슬러리에서 즉각적인 핑크화를 야기한다. 이는 적정을 방해하지는 않지만, 높은 pH에서, 포피린이 탈착됨을 보여준다. 카복실산 농도는 pH 7.5의 종점을 이용해 과량의 NaOH로 역 적정하여 결정된다. 적정은 1.10 meq/g 산의 부하를 제공하고, 이는 0.275 meq/g 포피린과 동일하다.
코발트 또는 디리튬 프탈로사이아닌의 분석
이러한 흡착체의 농도는 단지 탈색 시험으로부터 평가된다. 청록색을 띠는 지점은 포화점이 되는 30분 후에는 옅어지지 않는다.
다수의 치환 다핵성 방향족 또는 다이핵성 방향족 화합물이 피브릴 표면에 흡착된다. 부착 동안, 다수의 방향족 환은 환당 2 개 이상/펜던트 작용기여야 한다. 따라서, 3 개의 융합 환을 함유한 치환 안트라센, 페난트렌 등, 또는 4 개 이상의 융합 환을 함유한 다작용성 유도체가 포피린 또는 프탈로사이아닌 유도체 대신 이용될 수 있다. 또한, 퀴놀린과 같은 치환 방향족 헤테로사이클릭 또는 4 개 이상의 환을 함유한 다중 치환 헤테로방향족류도 이용될 수 있다.
표 2는 3가지 포피린/프탈로사이아닌 유도체를 위한 부하 실험의 결과를 요약하고 있다.
[표 2]
흡착 실행의 요약
5. 클로레이트 또는 질산 산화
진한 황산 또는 질산에서 칼륨 클로레이트와 같은 강한 산화제에 의한 흑연의 산화에 관한 문헌은 문헌[참조: R.N. Smith, Quarterly Review 13, 287(1959); M.J.D. Low, Chem. Rev. 60, 267 (1960)]을 포함한다. 일반적으로, 엣지 탄소(결함 부위 포함)이 공격을 받아 카복실산, 페놀 및 기타 산화 그룹의 혼합물을 생성한다. 메커니즘은 라디칼 반응과 관련되어 복잡하다.
제조 K
클로레이트를 이용한 카복실산-작용화된 피브릴의 제조
CC 피브릴 샘플을 주걱으로 혼합하여 진한 H2SO4에서 슬러리화시킨 다음 가스 유입구/배출구 및 오버헤드 교반기가 장착된 반응기 플라스크로 옮긴다. 교반과 동시에 느린 아르곤 유동하에, NaClO3를 실행 도중 실온에서 일부 첨가한다. 염소 증기가 전 실행 과정 동안 발생하고 반응기를 벗어나 수성 NaOH 트랩으로 모아진다. 실행 마지막에, 피브릴 슬러리를 분쇄된 얼음에 붓고 진공 여과한다. 필터 케이크를 속슬렛 팀블로 옮기고 속슬렛 추출기에서 몇 시간마다 신선한 물로 교환되는 탈이온수로 세척한다. 새로운 탈이온수에 첨가할 경우, 피브릴 샘플이 물의 pH를 변화시키지 않을 때까지 계속 세척한다. 피브릴을 여과시켜 분리하고 100℃ 5 " 진공에서 밤새 건조한다.
카복실산 함량은 샘플을 과량의 0.100 N NaOH와 반응시켜 pH 7.5의 종점에 이를 때까지 0.100n HCl 로 역-적정하여 측정된다. 결과는 표 3에 실려있다.
[표 3]
직접 산화 실행 요약
제조 L
질산을 이용한 카복실산-작용화된 피브릴의 제조
무게를 잰 피브릴 샘플을 오버헤드 교반기 및 물 응축기를 갖춘 부착된 바닥의 다중-경부 만입 반응기 플라스크에서 적절한 강도의 질산으로 슬러리화한다. 일정하게 교반하면서, 온도를 맞추고 정해진 시간 동안 반응을 수행한다. 산의 강도에 관계없이 온도가 70℃를 초과 후 즉시 갈색 연기가 나온다. 반응 후, 슬러리를 분쇄된 얼음에 붓고 탈이온수로 희석한다. 슬러리를 여과하고 슬러리 샘플이 탈이온수로 인해 pH 변화가 없을 때까지 몇 시간마다 신선한 탈이온수로 저장고를 교체하면서 속슬렛 추출기로 세척하여 과량의 산을 제거한다. 피브릴을 100℃ 5 " 진공에서 밤새 건조한다. 중량을 잰 피브릴 일부를 표준 0.100 N NaOH와 반응시키고 카복실산 함량을 0.100 N HCl로 역-적정하여 결정한다. 표면 산소 함량을 XPS로 측정한다. 물에서의 분산도는 0.1 중량%로 워링 블렌더에서 2분간 혼합하여 시험된다. 결과는 하기 표 4에서 요약하고 있다.
[표 4]
직접 산화 실행 요약
6. 작용화된 피브릴의 2 차 유도체
카복실산-작용화된 피브릴
단지 카복실산으로부터 제조될 수 있는 다수의 2 차 유도체의 수는 본질적으로 제한이 없다. 알콜 또는 아민은 쉽게 산과 결합하여 안정한 에스테르 또는 아미드를 제공한다. 알콜 또는 아민이 이- 또는 다-작용성 분자의 일부인 경우, O- 또는 NH-를 통한 결합은 기타 작용기가 펜던트 그룹으로 남는다. 2 차 시약의 전형적인 예는 하기와 같다:
본 반응은 카복실산을 알콜 또는 아민과 에스테르화 또는 아민화시키기 위해 전개된 임의의 방법을 사용해 수행될 수 있다. 이들 중, N,N'-카보닐 디이미다졸(CDI)를 에스테르 또는 아미드에 대한 아실화제로 이용하는 문헌[참조: H.A.Staab, Angew. Chem. Internat. Edit., (1), 351 (1962)], 및 아미드화를 위해 카복실산을 활성화시키기 위해 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하는 문헌[참조: G.W. Anderson, et al., J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839(1964)]의 방법을 이용한다.
제조 M
작용화된 피브릴의 2 차 유도체의 제조
N,N'-카보닐 디이미다졸
순수한, 건조 비양성자성 용매(예: 톨루엔 또는 디옥산)가 이 과정에 요구된다. 화학양론적 양의 시약으로 충분하다. 에스테르의 경우, 톨루엔 중 카복실산 화합물을 실온에서 톨루엔에 용해되는 화학양론적 양의 CDI와 불활성 대기(아르곤)에서 2시간 동안 반응한다. 이 기간동안, CO2가 발생한다. 2 시간 후, 알콜을 촉매량의 Na 에톡시드와 함께 첨가하고 80℃에서 4시간 동안 반응을 계속한다. 일반 알콜의 경우, 수율은 정량적이다. 반응은 하기와 같다:
1. R-COOH + Im-CO-Im ---→ R-CO-Im + HIm + CO2
Im = 이미다졸리드, HIm = 이미다졸
2.
아민의 아미드화는 실온에서 촉매되지 않고 일어난다. 본 과정의 제 1 단계는 동일하다. CO2 방출 후, 화학양론적 양의 아민을 실온에서 첨가하고 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 반응은 정량적이다. 반응은 하기와 같다:
3. R-CO-Im + R'NH2 ----→ R-CO-NHR + HIm
N-하이드록시석신이미드
1급 아민으로의 아미드화를 위한 카복실산의 활성은 N-하이드록시석신아밀 에스테르를 통해 일어난다; 치환 우레아로 방출된 물을 막기 위해 카보디이미드를 이용한다. NHS 에스테르를 실온에서 1급 아민과 반응시켜 아미드로 전환한다. 반응은 하기와 같다:
1. R-COOH + NHS + CDI ---→ R-CONHS + 치환 우레아
2. R-CONHS + R'NH2 --→ R-CO-NHR'
실릴화
트리알킬실릴클로라이드 또는 트리알킬실라놀은 하기의 반응에 따라 산성 H와 즉시 반응한다:
R-COOH + Cl-SiR'3 --→ R-CO-SiR'3 + HCl
소량의 디아자-1,1,1-비사이클로옥탄(DABCO)을 촉매로 이용한다. 적당한 용매는 디옥산 및 톨루엔이다.
제조 N
카복실산-작용화된 피브릴로부터 에스테르/알콜 유도체의 제조
카복실산 작용화 피브릴을 제조 K에서와 같이 제조한다. 카복실산 함량은 0.75 meq/g이다. 피브릴을 CO2 방출이 중단될 때까지 실온에서 용매로 톨루엔을 이용해 불활성 대기하에서 화학양론적 양의 CDI와 반응시킨다. 이 후, 슬러리를 8 0℃에서 10-배의 몰 과량의 폴리에틸렌글리콜(분자량 600)과 반응시키고 소량의 NaOEt를 촉매로 이용한다. 2시간 동안 반응시킨 후, 피브릴을 여과시켜 분리하고, 톨루엔으로 세척하며 100℃에서 건조한다.
제조 O
카복실산-작용화된 피브릴로부터 아미드/아민 유도체의 제조(177-041-1)
클로레이트-산화 피브릴(0.62 meq/g) 0.242 g을 혈청 스토퍼가 장치된 100 ㎖ RB 플라스크에서 교반하면서 20 ㎖ 무수 디옥산에서 현탁한다. 20-배의 몰 과량의 N-하이드록시석신이미드(0.299 g)를 첨가하고 용해한다. 이 다음 20-배 몰 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDAC)(0.510 g)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 계속 교반한다. 이 시기의 마지막에 교반을 멈추고, 상등액을 빨아내며 고체를 무수 디옥산으로 세척한 다음 0.45 마이크론의 폴리설폰 막상에서 여과한다. 고형물을 필터막에서 추가 MeOH로 세척하고 추가 중량 감소가 관찰되지 않을 때까지 진공-건조시킨다. NHS-활성 산화 피브릴의 수율은 관측된 6%의 중량 증가분을 기준으로 100%이다.
에틸렌디아민(en) 100 ㎕를 0.2 M NaHCO3 완충액 10 ㎖에 첨가한다. 같은 부피의 아세트산(HOAc)을 첨가하고 pH 8 근처로 유지한다. NHS-활성 산화 피브릴(0.310 g)을 격렬히 교반하면서 첨가하고 1시간 동안 반응시킨다. 추가 300 ㎕ en 및 300 ㎕ HOAc를 추가 10분간 첨가한다. 용액을 0.45 마이크론 폴리설폰 막에서 여과하고 NaHCO3 완충액, 1% HCl, 탈이온수 및 EtOH로 연속 세척한다. 고형물을 진공하에 밤새 건조한다. HCl염을 추가 분석 및 반응을 위해 NaOH(177-046-1)와 반응시켜 유리 아민으로 전환시킨다.
ESCA를 아민화 피브릴(GF/NH2)상에 존재하는 N의 양을 정하기 위해 수행한다. 177-046-1의 ESCA 분석은 .90 at%N(177-059)을 보여준다. 이러한 N의 양을 추가 산정하기 위해, 접근 가능하고 반응성이 있는 아민 그룹 모두의 형태로 존재하고, 유도체가 가스상에 의해 펜타플루오로벤즈알데하이드와 반응하여 이용 가능한 1급 아민 그룹과의 상응하는 시프 염기 결합을 생성한다. ESCA 분석은 예측된 0.91 at% N 및 1.68 at%F를 보여준다. 이는 아민화 피브릴(5F/펜타플루오로벤즈알데하이드 분자)상에서 반응성 1급 아민으로 존재하는 0.34 at% N으로 개질된다. 0.45 at% N 수준은 각 N의 유리 말단과 완전한 반응을 가능케 하는 것으로 기대된다. 관측된 수준은 N과 NHS-활성화 피브릴과의 반응으로부터 매우 높은 수율을 지시하고 이용 가능한 유리 아민 그룹의 반응성을 확인시킨다.
0.34 at% 수준의 N은 ESCA 자료로부터 계산된 유리 아민의 형태로 존재하고, 이는 기타 물질의 커플링을 허락하는 유리 아민 그룹에 의한 피브릴의 거의 완전한 유효 범위이다.
제조 P
카복실산-작용화된 피브릴로부터 실릴 유도체의 제조
제조 K에서 제조된 산 작용화된 피브릴을 불활성 대기하에 디옥산에서 슬러리화한다. 교반하면서, 화학양론적 양의 클로로트리에틸 실란을 첨가하고 0.5시간 동안 반응시킨 후, 디옥산 중 5%의 DABCO 용액을 여러번 첨가한다. 시스템을 추가 시간동안 반응시킨 후, 피브릴을 여과에 의해 수집해 디옥산에서 세척한다. 피브릴을 100℃ V" 진공에서 밤새 건조한다.
표 5는 2 차 유도체의 제조에 관해 요약하고 있다. 산물을 C, O, N, Si 및 F 표면 함량에 대한 ESCA에 의해 분석한다.
[표 5]
2 차 유도체 제조 요약
제조 Q
카복실산-작용화된 피브릴로부터 실릴 유도체의 제조
제조 K에서와 같이 제조된 산 작용화된 피브릴을 불활성 대기하에 디옥산에서 슬러리화한다. 교반하면서, 화학양론적 양의 클로로트리에틸 실란을 첨가하고 0.5 시간 동안 반응시킨 후, 디옥산 중의 5% DABCO 용액을 몇 방울 첨가한다. 시스템을 추가 시간 동안 반응시킨 후, 피브릴을 여과에 의해 모아 디옥산에서 세척한다. 피브릴을 100℃ 5" 진공에서 밤새 건조한다.
표 6은 2 차 유도체 제조를 요약하고 있다. 산물을 ESCA로 분석한다. 분석은 원하는 펜던트 그룹의 결합을 확인시킨다. 산물을 C, O, N, Si 및 F 표면 함량에 대한 ESCA에 의해 분석한다.
[표 6]
2차 유도체 제조의 요약
설폰산-작용화된 피브릴
제조 A에서 제조된 아릴 설폰산을 2차 도체를 수득하기 위해서 추가로 반응시킬 수 있다. 설폰산은 LiAlH4 또는 트리페닐 포스핀과 요오드의 배합에 의해서 머캡탄으로 환원될 수 있다 (3월, J.P., 1107쪽). 이들은 또한 디알킬 에테르와의 반응, 즉,
피브릴--SO3H + R-O-R ----> 피브릴-SO2OR + ROH
에 의해서 설포네이트 에스테르로 전환될 수 있다.
산소-비함유 피브릴 표면으로의 친전자성 첨가에 의해 또는 금속화에 의해 작용화된 피브릴
활성화된 친전자체의 산소-비함유 피브릴 표면으로의 첨가에 의해 수득될 수 있는 1차 산물은 펜던트 -COOH, -COCl, -CN, -CH2NH2, -CH2OH, -CH2- 할로겐 또는 HC=O을 갖는다. 이들은 하기의 식에 의해 2차 유도체로 전환될 수 있다:
피브릴-COOH -----> 상기 참조.
피브릴-COCl (산 클로라이드) + HO-R-Y ----> F-COO-R-Y (Sec. 4/5)
피브릴-COCl + NH2-R-Y -------> F-CONH-R-Y
피브릴-CN + H2 -----> F-CH2-NH2
피브릴-CH2NH2 + HOOC-R-Y ----> F-CH2NHCO-R-Y
피브릴-CH2NH2 + O=CR-R'Y ----> F-CH2N=CR-R'-Y
피브릴-CH2OH + O(COR-Y)2 ----> F-CH2OCOR-Y
피브릴-CH2OH + HOOC-R-Y ----> F-CH2OCOR-Y
피브릴-CH2-할로겐 + Y- ----> F-CH2-Y + X-Y- = NCO-, -OR-
피브릴-C=O + H2N-R-Y -----> F-C=N-R-Y
다핵성 또는 다이핵성 방향족 또는 2차원 마크로사이클릭 화합물의 흡수에 의해 작용화된 피브릴
디리튬 프탈로사이아닌: 일반적으로, 두개의 Li+ 이온은 대부분의 금속(특히 다가) 착물에 의해서 프탈로사이아닌(Pc) 그룹으로부터 치환된다. 그러므로, Li+ 이온의 비-불안정 리간드와 결합된 금속 이온으로의 치환은 안정한 작용성 그룹을 피브릴 표면 위에 놓는 방법이다. 거의 모든 전이 금속 착물은 안정한 비-불안정 킬레이트를 형성하기 위해서 Li+를 Pc로부터 치환할 것이다. 요점은 이러한 금속을 적합한 리간드와 커플링하는 것이다.
코발트 (II) 프탈로사이아닌
코발트 (II) 착물이 이를 위해서 특히 적합하다. Co++ 이온을 매우 적합한 킬레이트를 형성하기 위해서 2 개의 Li++ 이온으로 치환할 수 있다. 이어서 Co++ 이온을 펜던트 카복실산 그룹을 갖는 피리딘 환을 함유하고 피리딘 그룹에 차별적으로 결합하는 것으로 알려진, 니코틴산과 같은 리간드에 배위시킬다. 과량의 니코틴산의 존재시, Co(II)Pc는 니코틴산의 피리딘 잔기를 갖는 비-불안정 착물을 형성하면서 Co(III)Pc로 전기화학적으로 산화된다. 이렇게하여, 니코틴산 리간드의 유리 카복실산 그룹이 피브릴 표면에 단단히 부착된다.
기타 적합한 리간드는 아미노피리딘 또는 에틸렌디아민 (펜던트 NH2), 머캅토피리딘 (SH), 또는 한 말단에 아미노- 또는 피리딜- 잔기를, 다른 말단에 바람직한 작용 그룹을 함유하는 기타 다작용성 리간드이다.
7. 3차원 구조
산화된 피브릴은 비산화 피브릴보다 수성 매질에 좀더 쉽게 분산된다. 메조- 및 마크로포어(포어>2 nm)를 갖는 안정한 다공성 3차원 구조는 촉매 또는 크로마토그래피 지지체로서 매우 유용하다. 피브릴이 개별화된 기준으로 분산될 수 있으므로, 가교결합에 의해 안정화된 잘-분산된 샘플은 이러한 지지체를 구성하게 한다. 작용화된 피브릴은 이들이 수성 또는 극성 매질에 쉽게 분산되고 작용성이 가교결합점을 제공하므로 이러한 적용을 위해 이상적이다. 또한, 작용성은 촉매 또는 크로마토그래피 부위를 지지하는 점을 제공한다. 최종 결과는 활성제를 지지하는 작용성 부위에 접근하기 쉬운 총 표면적을 갖는 경질의 3차원 구조이다.
촉매에서 이들 지지체에 대한 전형적인 적용에는 액침에 의해 놓여진 금속 촉매, 예를 들면, 귀금속 수소화 촉매를 위한 매우 다공성 지지체로서의 용도가 포함된다. 또한, 구조의 매우 높은 다공성과 결합된 작용성에 의해서 분자 촉매를 구속에 의해 지지체로 부착시키는 능력은 균질 반응을 이질 방법으로 수행하게 한다. 구속된 분자 촉매는 본질적으로 균질 반응과 함께 수행되는 선택도 및 속도에 있어서의 장점을 이용할 수 있는, 균질 반응기에 유사한 연속적인 액체 상에 매달려 있다. 그러나, 고체 지지체에 구속됨은 활성의, 다수의 경우에 매우 고가인 촉매의 용이한 분리 및 회수를 허용한다.
이러한 안정한 경질 구조는 또한 지금까지 매우 어려운 반응, 예를 들면, 비대칭 합성 또는 친화성 크로마토그래피를 적합한 에난티오머 촉매 또는 선택적인 기질을 지지체에 부착시킴으로써 수행하도록 허용한다. 메탈로-Pc 또는 메탈로-포피린 착물을 통한 유도화가 또한 금속 이온에 결합된 리간드 및 2차 유도체를 통하여 리간드에 결합된 분자의 복구를 허용한다. 예를 들면, 작용화된 피브릴의 3차원 구조가 전극 또는 전극의 일부이고 작용화가 Co(II)Pc의 흡수로부터 유발되는 경우에, 니코틴산의 존재시에 Co(II)의 Co(III)로의 전기화학적 산화는 펜던트 그룹으로서 카복실 그룹을 갖는 비-불안정 Co(III)-피리딜 착물을 생성할 것이다. 적합한 항원, 항체, 촉매 항체, 또는 기타 부위-특이성 트래핑제를 부착시킴이 또한 매우 달성하기 어려운 분자(친화력 크로마토그래피)의 선택적인 분리를 허용할 것이다. 흡장된 물질을 제거하기 위해서 전극을 세척한 후, 표적 분자를 함유하는 Co(III) 착물을 불안정 co(II) 리간드의 질량 작용 치환에 의해서 회수할 수 있고, 이렇게하여 수행하기 매우 어렵고 고가 분자(예를 들면, 키랄 약물)의 분리 및 회수를 실행한다.
3차원 구조의 다른 예가 피브릴-세라믹 복합재이다.
제조 R
알루미나-피브릴 복합재 (185-02-01)의 제조
질산 산화된 피브릴(185-02-01) 1g을 U/S 분해기를 사용하여 100 cc DI 물에 잘 분산시킨다. 피브릴 슬러리를 90℃로 가열하고 20 cc 프로판올에 용해된 0.04 mol 알루미늄 트리부톡사이드의 용액을 서서히 첨가한다. 응축기를 알콜을 제거하기 위해서 없앤 후 환류를 4시간 동안 계속한다. 30분후 응축기를 다시 놓고 슬러리를 100℃에서 밤새 환류시킨다. 균일한 외양을 갖는 흑색 졸이 수득된다. 졸을 RT로 냉각하고 1주후, 매끄러운 표면을 갖는 흑색 겔이 형성된다. 겔을 300℃로 공기 중에서 12시간 동안 가열한다.
알루미나-피브릴 복합재를 SEM에 의해서 검사한다. 균열된 표면의 마이크로그래프는 겔에서의 피브릴의 균질 분산을 나타낸다.
제조 8
실리카-피브릴 복합재 (173-85-03)의 제조
질산 산화된 피브릴(185-01-02) 1g을 초음파 처리를 사용하여 200 cc 에탄올에 잘 분산시킨다. 50 cc 에탄올에 용해된 0.1 mol 테트라에톡시실란의 용액을 RT, 이어서 3 cc conc. HCL.로 슬러리에 서서히 첨가한다. 혼합물을 85℃로 가열하고 용적이 100 cc로 감소될 때까지 그 온도에서 유지한다. 혼합물을 냉각하고 이것이 흑색 고체 겔을 형성할 때까지 방치한다. 겔을 300℃에서 공기 중에서 가열한다.
실리카-피브릴 복합재를 SEM에 의해서 조사한다. 균열된 표면의 마이크로그래프는 겔에서의 피브릴의 균질 분산을 나타낸다.
세라믹, 예를 들면, 지르코니아, 티타니아, 희토류 옥사이드 및 3급 옥사이드로의 유사한 제조가 이루어질 수 있다.
전술한 기재 및 실시예에 의해 설명된 바와 같이, 본 발명은 다양한 작용화 나노튜브의 제형에 적용된다.
사용된 용어 및 표현은 제한의 의미가 아니라 기재의 의미로서 사용되고 일부로서 나타나고 기재된 동등한 특성을 배제하는 용어 또는 표현을 사용할 의도는 없으며, 다양한 변형이 본 발명의 범주 내에서 가능한 것으로 인식된다.
본 발명의 바람직한 양태의 설명
다양한 나노튜브가 본 발명의 분석에 사용될 수 있지만, 일반적으로 나노튜브는 1.0 내지 5.0 g/㎖의 밀도와 바람직하게는 약 1.1 내지 2 g/㎖의 밀도를 갖는다. 최적 밀도의 선택이 당해분야 기술에 해당하고, 중력-구동 분석의 침강속도는 분석의 속도와 착물의 균일한 층을 전극 표면에 생성하기 위한 바람직한 속도 사이에서 교체된다.
다양한 평균 직경을 갖는 나노튜브를 또한 사용할 수 있다. 0.001 내지 100 ㎛의 평균 직경을 갖는 입자를 사용할 수 있고 바람직하게는 입자는 0.01 내지 10 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 나노튜브의 길이는 직경의 적어도 5배이다.
분석 조성물내 입자의 다양한 농도를 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 농도는 1 x 10-9 내지 1 x 10-2 g/㎖, 바람직하게는 1 x 10-8 내지 1 x 10-3 g/㎖의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 입자의 밀도, 크기 및 농도는 입자가 적어도 0.5 mm/분의 속도로, 바람직하게는 더욱 빠른 속도로 침강하도록 선택된다.
본 발명을 수행하는 여과 양식에서, 여과는 바람직하게는 평균 직경으로서 측정되어 광범위하게 0.01 내지 90%, 바람직하게는 10 내지 90%의 입자의 평균 직경의 구멍 크기를 갖는다.
나노튜브는 상자성 또는 강자성일 수 있고 결합 화합물을 마그네틱 입자가 분석에 사용될 수 있도록 커플링시키는 다양한 물질로 코팅될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 사용된 마그네틱 나노튜브는 적어도 0.001 cgs 유닛의 자화율, 바람직하게는 적어도 0.01 cgs 유닛의 자화율을 갖는다. 마그네틱 나노튜브는 다양한 밀도, 즉, 실질적으로 물의 밀도 이하, 0.01 내지 5 g/㎖, 바람직하게는 0.5 내지 2 g/㎖를 지닐 수 있다. 입자 크기는 0.01 내지 100 ㎛, 바람직하게는 0.01 내지 10㎛ 범위일 수 있다. 입자의 농도는 광범위하게 1 x 10-9 내지 1 x 10-2 g/㎖, 바람직하게는 1 x 10-8 내지 1 x 10-3 g/㎖의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 사용된 마그네틱 나노튜브는 EP 0,180,384에 기재된 바와 같이, 자계가 전극 표면으로부터 제거된 후 나노튜브가 탈자화하고 분석 셀 밖으로 내몰려질 수 있도록 낮은 잔류 자기를 지닌다. 바람직하게는 마그네틱 나노튜브의 밀도, 농도 및 크기는 침강 시간이 적어도 0.5 mm/분이도록 선택되고 바람직하게는 이것은 상기의 그 속도이다. 마그네틱 셀의 작용시, 광전자증배관의 작동을 방해하지 않기 위해서 전기화학발광을 포함하기에 앞서 마그네트 수단을 전극 표면으로부터 제거하는 것이 종종 바람직하다.
분석
다양한 분석이 본 발명의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 분석은 작용화된 탄소 나노튜브를 사용하여 수행된다. 분석은 탄소 나노튜브(피브릴)를 사용하여 전해질 효소의 ECL 검출을 수반한다. 탄소 나노튜브(피브릴)는 가수분해 효소의 기질로 화학적으로 변형될 수 있다. 피브릴로부터 가장 먼 기질의 한 말단에 Ru(bpy)32+의 유도체가 부착된다. 고체상의 일반적인 구조는 피브릴-기질 (절단가능한 결합)-Ru(bpy)32+이다. 절단가능한 결합을 분해하는 효소가 존재할 경우, 기질의 Ru(bpy)32+가 효소의 작용에 의해서 용액으로 방출된다. 혼합 및 피브릴과 효소의 배양에 이어서, 피브릴을 용액으로부터 제거한다(여과 또는 원심분리에 의해서). 잔류 용액의 ECL을 측정한다. 효소가 존재할 경우, 기질의 Ru(bpy)3 2+ 말단이 용액에 존재하고 빛을 방출할 것이다. 따라서, 특정 효소의 존재는 혼합물의 용액 상으로부터 빛 방출을 유발한다. 분석은 이것이 항체를 수반하지 않으므로(이것은 면역분석이 아님) 프로테아제에 대한 신규한 ECL 분석이다. 따라서, 이는 효소의 존재에 대한 분석(효소가 불활성일 수 있음)이 아니라 효소 활성에 대한 분석이라는 장점이 있다. 또한, 분석은 고체 지지체로서 피브릴을 사용한다. 피브릴은 이의 높은 표면적 및 효소 기질과 같은 생분자를 부착시킴에 있어서의 용인능으로 인하여 양호하다. 또한, 작용화된 피브릴은 막(매트)을 통한 유동으로 형성될 수 있다. 효소 혼합물이 Ru(bpy)3 2+를 방출시키기 위해서 유동하고 분석을 신속하고 편리하게 할 수 있다.
피브릴 및 ECL을 사용하는 DNA 탐침 분석이 수행된다. 탄소 나노튜브 (피브릴)를 생물학적 유체 및 첨가된 시약을 포함할 수 있는 착혼합물로부터 분석물을 분리하기 위해서 분리 매질과 같은 DNA 탐침 분석의 고체 지지체로서 사용할 수 있다. 피브릴은 공유 결합 (NHS 에스테르에 의해서) 또는 알킬 피브릴로의 흡수에 의해서 아비딘 (또는 스트렙타비딘)으로 변형될 수 있다. 바이오티닐화 ssDNA("분석물")가 아비딘 피브릴에 결합하고 Ru(bpy)3 2+로 표지된 상보적인 일본쇄 올리고뉴클레오타이드의 ECL에 의해서 검출된다.
천연 (비바이오티닐화) DNA 분획을 검출하기 위한 하나의 포맷은 Ru(bpy)3 2+ 표지 올리고가 천연 DNA 또는 도입된 바이오티닐화 DNA로 결합할 수 있는 경쟁적 포맷이다. 따라서, 존재하는 분석물(비-바이오티닐화 DNA)이 많을 수록 더 적은 올리고가 아비딘 피브릴에 포획될 때 ECL 시그널을 제공하는 바이오티닐화 DNA에 결합하여 남는다.
이것은 1차 탄소 나노튜브가 DNA 분석에 사용되었음을 나타낸다. 장점은 (1) 탄소 나노튜브가 더 적은 고체 지지체가 기타 고체 지지체보다 필수적임을 의미하는 매우 높은 표면적을 지니고 (2) 피브릴이 ECL 적용에서 고체 지지체를 위한 양호한 성질인, 고체 지지체가 전극에 대해서 저항하는 전기적 도체라는 점이다. 전기적 도체이므로, 도체이지 않은 것보다 더 많은 표면적이 기타 지지체와 전기화학적으로 접촉한다.
탄소 나노튜브(피브릴) 상에 고정된 항체를 사용하는 ECL-기본 면역분석이 유리할 것이다. 항체 피브릴은 경쟁적 면역분석 포맷(항체 피브릴에 결합시키기 위해 분석물과 Ru(bpy)3 2+ 표지 분석물 사이에 경쟁이 존재한다)에서, 또는 샌드위치 포맷(Ru(bpy)3 2+ 표지 2차 항체가 항체 피브릴-분석물 착물에 결합한다)에서의 ECL 적용에 사용될 수 있다. 두 경우 모두에서, ECL 빛 방출은 해당 분석물의 존재 또는 부재를 시그널한다. 항체를 여러 다른 방법, 공유 또는 비-공유 수단에 의해서 피브릴에 고정시킬 수 있다. 비-공유 고정을 위해서, 항체는 변형되지 않은 피브릴 상에 또는 흡수 특성을 개선하기 위해서 개질된 피브릴 상에 흡수된다. 이러한 개질된 피브릴은 소수성 부속물(알킬쇄 또는 페닐-알킬쇄)을 갖는다. 항체의 피브릴 상의 공유 고정은 3가지 다른 방법, 카복실화된 피브릴의 NHS 에스테르 활성화에 의해서, 항체 탄수화물 그룹의 환원 아민화에 의해서, 환원되거나 말레이미도-개질된 항체와 반응하는 설프하이드릴/말레이미도 피브릴에 의해서 수행될 수 있다. 탄소 피브릴 상의 항체의 고정이 유리하다. 항체 피브릴은 항체에 대한 기타 고체지지체에 비하여 다수의 고유성을 지닌다. 이러한 장점은 중량당 높은 표면적, 전기전도성(특히 ECL 적용시), 및 화학 및 물리적 안정성을 포함한다.
탄소 나노튜브를 ECL-기본 바이오센서로서 사용할 수 있다. 효소 조인자 NAD+의 유도체가 하나의 작용성 그룹에 부착되고 Ru(bps)3 2+의 유도체가 다른 하나의 작용성 그룹(COOH)에 부착되는 이작용성 피브릴을 제조한다. 바이오센서 피브릴을 분석물(데하이드로게나제, 이 경우 G6PDH)을 함유하고 데하이드로게나제의 기질(이 경우 글루코스-6-포스페이트)이 첨가된 용액과 혼합한다. 효소가 기질과 반응하고 피브릴 상의 NAD+ 그룹을 NADH로 전환하기에 적합한 시간 후, 피브릴의 ECL를 ECL 기구로 측정한다. 바이오센서 피브릴의 ECL 성질의 변화는 효소, G6PDH의 존재를 나타낸다. 하기의 장점이 발견되었다. (1) NAD+와 Ru(bpy)3 2+ 조반응물의 근접성은 분자간 ECL 반응보다 효율적인 분자내 ECL 반응을 유발한다. (2) ECL 활성제(NAD+와 Ru(bpy)3 2+ 조반응물)는 이들이 침강하거나 ECL 전극으로 자기적으로 이끌리도록 하는 피브릴에 고정되어, 개선된 빛 방출을 유발한다. (3) 피브릴은 대량의 조반응물(NAD+와 Ru(bpy)3 2+)이 고정될 수 있도록 매우 높은 표면적을 지니어, 이론적으로 데하이드로게나제 검출 도중 빛 발산을 개선한다. (4) 피브릴은 전기적 도체이다- 바이오센서가 전극에 도달할 때, 전극과 실제로 접촉하지 않는 훨씬 더 많은 표면적이 전압을 받고 ECL 반응에 참여할 수 있다. (5) 바이오센서는 조인자로서 NAD+ 또는 NADH를 사용하는 데하이드로게나제를 검출하기 위해서 디자인된다. 다수의 이러한 효소가 존재하고 본 발명을 사용하여 검출할 수 있다.
탄소 피브릴을 효소 바이오센서를 위한 고체 지지체로서 사용한다. 효소 바이오센서가 수용성이므로, 고정되지 않을 경우(고정은 이것이 분석물 용액으로부터 회수되도록 함) 이것은 1회만 사용할 수 있다. US 출원 번호 제08/467,712호는 고체 지지체, 및 (고체) 전극으로의 고정을 논의하고 청구한다. 본 출원은 고체 지지체로서 탄소 피브릴의 사용을 설명한다. 효소 바이오센서가 흡수에 의해 피브릴에 부착될 수 있다. 피브릴은 변형되지 않은 피브릴 또는 바람직하게는 화학적으로 개질된 피브릴일 수 있다. 피브릴의 화학적 변형은 바람직하게는 알킬화에 의한 것이다. 바이오센서의 흡수는 효소 바이오센서와 알킬화된 피브릴의 혼합과 함께 배양에 의해 수행된다. 고체 지지체로서의 피브릴은 하기의 이유로 신규하고 양호하다. (1) 이들은 잠재적으로 높은 빛 방출을 유발하는 일정한 높은 표면적을 갖고, (2) 바이오센서와 같은 단백질은 공유 화학물질 없이 편리하게 흡수될 수 있으며, (3) 피브릴은 전극과 접촉시 ECL을 개선할 수 있는 전기적 도체이며, (4) 피브릴 자체는 바이오센서가 지지하는 경우 전극 자체를 케이싱할 수 전극으로 제조될 수 있다.
대자성 입자가 분리를 위한 장치로서 유용하다. 예를 들면, 착혼합물로부터의 특정 분석물의 분리는 분석물이 혈액과 같은 착혼합물에 존재할 수 있는 진단 산업에서 유용하다. 착혼합물이 분석물의 분석을 방해하므로, 분석물을 완전한 혼합물이 분석물로부터 세척될 수 있도록 고체 표면에 결합시키고 이렇게하여 측정하도록 하는 것이 바람직하다. 바람직한 분석물이 대자성 입자에 특이적으로 결합할 수 있는 경우, 그 입자는 자기에 의해서 유지될 수 있고 착혼합물을 이어서 검출될 분석물로부터 세척하도록 한다. 피브릴이 생분자를 특이적이고 효율적으로 결합시킬 수 있는 입자이므로, 대자성 피브릴은 유리하게도 고체 상 분리 장치로서, 특히 ECL 분석에 사용된다. 피브릴을 화학 반응 또는 이들이 현탁되는 용매(예를 들면, 물 내지 DMF)의 변화와 같은 처리를 수행함으로써 대자성이 되도록 제조한다. 이러한 조작이 다수의 피브릴의 물리적 응집에 있어서 변화를 유발한다고 추측된다. 피브릴이 내부에 약간의(약 0.5 중량%) 철을 지니므로 이들은 일단 응집하면 실질적으로 대자화되는 능력을 지닌다. 피브릴의 대자능을 증가시키는 여러 처리가 수행된다. 이러한 처리는 차례로 이들이 자기로 효율적으로 이끌리도록 하는 피브릴의 응집에 있어서의 변화를 유발하도록 요구된다. 대자성 피브릴은 적어도 2 개의 고유한 장점을 지닌다. 첫째, 이들은 중량당 매우 높은 표면적을 갖는다. 따라서, 동일한 결과를 달성하기 위해서 더 적은 피브릴이 사용될 필요가 있다(예를 들면, 다이날(Dynal) 비드에 비하여). 둘째, 이들은 대자 입자가 전극에 유지되는 ECL과 같은 적용의 장점을 갖는다. 따라서, 전기적 도체이므로, 이들은 실제로 전극의 일부가 되어 빛 방출 효율을 개선한다.
(1) 기구 사용
도 1 및 2에 기재된 바와 같이 세 전극을 사용하여 장치를 통한 유동을 이용한다.
작동 전극 -- Au 디스크, 3 mm 직경
카운터 전극 -- Au 디스크, 3 mm 직경
기준 전극 -- Ag/AgCl
테플론 가스켓 (0.15" 두께)
플렉시글라스 면판
유입관 = 0.042 " id 폴리프로필렌
교반 속도: 0.01 내지 5 ㎖/분으로 다양
일정전위기: 조절된 마이크로프로세서
하마마츠(Hamamatsu) R374 PMT(저이득 적색 민감성 관)를 사용하는 광도계; 0 내지 1400 V로 다양한 PMT 전압
(2) ECL 측정 사이클 (세개의 전극 셀 작동)
ECL 측정 사이클은 3 단계로 이루어진다: (1) 예비조건화 (2) 측정 및 (3) 세척. 예비조건화 단계는 2.0 V/초에서 0.0 V로 +2.2 V로 0.0 V로 +2.2 V로 -1.0 V로 0.6 V로의 전압 삼각파의 적용을 수반한다. 측정 단계는 1.0 V/s에서 +0.6 V로부터 +2.8 V로 +2.0 V로의 삼각 파형의 적용을 수반한다. 세척 단계는 0.0 V로부터 +3.0 V로 -0.5 V로 0.0 V로의 전압 사각파의 적용을 수반한다.
실시예 1
루테늄 택 펩타이드 피브릴 합성
본 실시예는 ECL 분석기에서의 효소 검출 시약의 합성을 나타낸다.
루테늄 펩타이드 피브릴 합성:
FmocNH-Gly-Lys(Nε-CBZ)-Phe-Gly-COOH의 테트라펩타이드를 통상의 용액 상 방법에 의해서 합성하고 이 펩타이드(71 mg, 0.093 mmol)를 Ru(bpy)3 2+의 1급 아민 유도화 버전(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) (73 mg, 0.078 mmol)와 반응시키고, EDC(17.8 mg, 0.093 mmol)를 활성화 시약으로서 사용하고 HOBT(12.58 mg, 0.093 mmol)를 촉매로서 사용한다. 생성물 FmocNH-Gly-Lys(Nε-CBZ)-Phe-Gly-CO-NH-택(170 mg, 0.223 mmol)을 피페리딘(96 ㎖)과 메틸렌 클로라이드(1.1 ㎖)로 탈보호한다. 테트라펩타이드-Ru(bpy)3 2+ 화합물의 구조를 1H-NMR에 의해서 확인한다. 메틸렌 클로라이드(2 ㎖) 중의 테트라펩타이드-Ru(bpy)3 2+ (5 mg, 0.003 mmol)의 용액에 카복실 피브릴(54 mg)을 첨가한다. 이어서 EDC (5.8 mg, 0.03 mmol)과 HOBT (4 mg, 0.03 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 피브릴을 물, 메탄올, 아세토니트릴 및 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척한다. 생성물 피브릴을 아세토니트릴(4 ㎖) 중의 트리메틸실릴 요다이드(TMSI, 1 ㎖)로 3시간 동안 40℃에서 처리한다. 최종 산물 피브릴을 물, 메탄올, 아세토니트릴, IGEN 표준 ECL 분석 완충제(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) 및 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척한다.
실시예 2
Ru(bpy) 3 2+ -표지 펩타이드 피브릴을 사용한 트립신 및 키모트립신 활성의 ECL 분석
Ru(bpy)3 2+-표지 펩타이드 (NH2-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 카복실화 피브릴에 접합시킨다. Ru(bpy)3 2+-표지된 펩타이드 (RPF)를 가수분해 효소 트립신 및 키모트립신의 활성을 검출하기 위해서 사용한다. 간단히 말해서, RPF를 효소 하나 또는 둘 모두를 함유하는 수용액에 첨가한다. 펩타이드가 트립신과 키모트립신 모두에 대한 특정 절단 부위를 함유하도록 디자인 되므로(도 3), 그리고 피브릴이 고체이므로, 효소의 작용은 Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+ (트립신) 또는 Gly-Ru(bpy)3 2+ (키모트립신)을 용액으로 유리시킨다. 효소가 고체상 펩타이드를 절단시키는 적합한 배양 시간 후, 수용액을 원심분리, 여과 또는 피브릴의 마그네트로의 제거와 같은 표준 방법에 의해서 피브릴로부터 분리시킨다. 이어서 수용액 중의 유리된 Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+ 또는 Gly-Ru(bpy)3 2+를 ECL에 의해서 검출한다.
트립신과 키모트립신의 분석이 본원에 제시되었지만, 기타 가수분해 효소를 적합한 Ru(bpy)3 2+-표지 효소 기질에 접합된 피브릴을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 효소 (및 개질된 피브릴)에는 뉴클레아제(Ru(bpy)3 2+-표지 RNA, 일본쇄 DNA, 또는 이본쇄 DNA에 접합된 피브릴을 사용), 글리코시다제(Ru(bpy)3 2+-표지 당, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드에 접합된 피브릴을 사용), 또는 리파제(Ru(bpy)3 2+-표지 지질에 접합된 피브릴을 사용)가 포함된다.
실시예 3
피브릴을 사용한 트립신의 ECL 검출
표준 ECL 분석 완충제 (메릴랜드 게이터스버그의 IGEN Inc.) 중의 RPF(피브릴-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+)(2.2 mg/㎖)의 2.97 ㎖ 현탁액에 1 mM HCl 또는 1 mM HCl 30 ㎕ 중의 58.9 μM 트립신 (최종 농도 = 0.59 μM) 30 ㎕를 첨가한다. 이어서 두 현탁액을 실온에서 회전시킨다. 주기적으로, 회전을 중단하고, 현탁액을 재빨리 원심분리하고 수성 현탁물의 ECL을 측정한다. 배양 30분 후, ECL 결과는 샘플(트립신 존재시의 ECl/트립신 부재시의 ECL)의 ECL 비가 1.29임을 나타낸다. 44시간 후, ECL 비는 2.05이다. 이러한 결과는 트립신이 전기화학형광 루테늄 표지를 피브릴로부터 가수분해적으로 유리시키는 능력에 의해 검출할 수 있다.
실시예 4
피브릴을 사용하는 키모트립신의 ECL 검출
표준 ECL 분석 완충제 (메릴랜드 게이터스버그의 IGEN Inc.) 중의 RPF(피브릴-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+)(0.15 mg/㎖)의 2.97 ㎖ 현탁액에 1 mM HCl 또는 1 mM HCl 30 ㎕ 중의 34.2 μM 키모트립신 (최종 농도 = 0.34 μM) 30 ㎕를 첨가한다. 이어서 두 현탁액을 실온에서 회전시킨다. 주기적으로, 회전을 중단하고, 현탁액을 재빨리 원심분리하고 수성 현탁물의 ECL을 측정한다. ECL결과가 초기에(시간 = 0) 샘플의 ECL 비(키모트립신 존재시 ECL/키모트립신 부재시 ECl)가 1.06임을 나타내었다. 배양 30분 후, 비는 1.25로 증가하고, 배양 25시간 후, 비는 1.85로 증가한다. 이러한 데이터는 키모트립신 활성이 전기화학형광 표지 Ru(bpy)3 2+를 피브릴로부터 유리시키는 능력에 의해 검출할 수 있다.
실시예 5
단백질의 NHS 에스테르에 의한 피브릴로의 공유 결합
단백질이 NHS 에스테르에 의해서 피브릴에 공유결합될 수 있음을 설명하기 위해서, 스트렙타비딘, 아비딘 및 트립신을 하기와 같이 피브릴에 부착시킨다.
NHS-에스테르 피브릴 0.5 mg을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH = 7.1)로 세척하고 현탁물을 제거한다. 200 ㎕ 스트렙타비딘 용액 (동일한 완충제 중의 1.5 mg)을 피브릴에 첨가하고 혼합물을 실온에서 5.5시간 동안 회전시킨다. 이어서 피브릴을 하기의 완충제 1 ㎖로 순서대로 세척한다: 5 mM 나트륨 포스페이트 (pH = 7.1), PBS (0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH = 7.4), ORIGEN 분석 완충제 (메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) 및 PBS. 스트렙타비딘 피브릴을 추가의 사용을 위해 PBS 완충제 중에서 저장한다.
NHS-에스테르 피브릴 2.25 mg을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1) 500 ㎕로 40분 동안 초음파처리하고 현탁물을 제거한다. 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1) 500㎕에 현탁시키고 2 mg 아비딘(Sigma, A-9390)을 함유하는 동일한 완충제에서 제조된 아비딘 용액 300 ㎕를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전시키고 4℃에서 밤새 저장하고 실온에서 1시간 동안 회전시킨다. 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1) 1 ㎖로 4회, PBS 완충제로 2회 세척한다. 아비딘 피브릴을 저장 동안 200 ㎕에 현탁시킨다.
트립신 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1)에 제조된 NHS-에스테르 피브릴 1.1 mg(아비딘 피브릴에서와 같이 처리)과 1.06 mM 트립신 용액 200 ㎕를 혼합하고 실온에서 6.5시간 동안 회전시킴으로써 제조한다. 이어서 트립신 피브릴을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1)로 3회 세척하고 저장 동안 동일한 완충제 400 ㎕로 현탁시킨다.
실시예 6
ECL 분석기를 사용한 DNA 탐침 분석
ECL 분석시 스트렙타비딘 (또는 아비딘) 결합된 피브릴 상의 분석물의 비-특정 결합을 제거하기 위해서, 이러한 피브릴을 4 mg/㎖ BSA (소 혈청 알부민) 용액에 의해서 6시간 동안 실온에서, 밤새 4℃에서 블로킹한다.
DNA 탐침 분석이 도 4에 도시되어 있다. 실험을 BSA 블로킹된 아비딘-피브릴 115 ㎍로 세척하면서 개시하고 스트렙타비딘 피브릴(실시예 5로부터)을 5 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH = 7.1)로 2회 세척한다. 각각의 피브릴을 동일한 완충제 100 ㎕ 중에 ∼57 ㎍을 갖도록 두 튜브로 분취한다. 한 튜브의 (스트렙트)아비딘 피브릴을 루테늄 택 표지 올리고머에 결합된 4 nM 바이오티닐화 DNA (70 뉴클레오타이드) 4㎕와 혼합한다. 다른 튜브에 단지 대조군 분석을 위해서 루테늄 택 표지 올리고머 (바이오티닐화 DNA 샘플에서와 동일한 농도) 4㎕를 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양하고 ORIGEN 분석 완충제(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) 300 ㎕로 7회 세척한다. 이어서 피브릴을 600 ㎕ ORIGEN 분석 완충제에 현탁시키고 피브릴의 중력 포획을 이용하여 중복 ECL 카운팅을 위해서 두 튜브로 분취한다. ECL 분석의 결과가 하기와 같이 요약된다:
아비딘 피브릴의 동일한 분석을 또한 피브릴의 마그네틱 포획을 이용하여 수행한다. 실험 절차는 피브릴로의 DNA 결합후 세척하는 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 샘플을 프로그래밍된 단계로 ECL 분석기로 세척한다. ECL 수는 아비딘 피브릴 DNA 탐침에 대해 3835이고 대조군에 대해 205이다.
C8-피브릴에 흡수된 아비딘은 또한 상술된 바와 같은 피브릴의 마그네틱 포획을 사용하여 DNA 탐침 분석에 의해서 조사된다. ECL 수는 아비딘 피브릴 DNA 탐침에 대해 15,792 이고 대조군에 대해 205이다.
실시예 7
탄소 나노튜브 상의 항체의 공유 고정화
본 실시예의 목적은 항체를 탄소 나노튜브의 표면 상에 고정하는 것이다. 이러한 항체-개질 나노튜브를 특정 분석물의 면역분석 검출 및 생특정 친화성 분리를 포함하는 다양한 적용에서 사용할 수 있다. 면역분석을 고체 지지체로서 항체-개질 나노튜브를 사용하여 수행할 수 있다. 고체 지지체의 사용은 고체 지지체가 고정되거나 이와 달리 (예를 들면, 여과, 원심분리 또는 자성에 의해서) 용액 상으로부터 분리될 경우, 세척 단계를 허용한다. 세척 단계의 사용은 다수 유형의 전기화학발광-기본 면역분석에서 항체-개질된 나노튜브의 사용을 허용한다. 항체-개질된 나노튜브를 통상적으로 사용된 마그네틱 비드의 치환으로서 또는 여과에 의해서 포획될 수 있는 현탁가능한 지지체로서, 또는 영구-고정된 지지체 이온 일회용 카드리지로서 사용할 수 있다.
1급 아민 및 카복실 그룹 간의 피브릴-항체 커플링
NHS 에스테르 피브릴의 형성
CH2Cl2/디옥산 혼합물 중의 탄소 피브릴(메릴랜드 캠브리지의 Hyperion Catalysis International)의 현탁액을 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 239 mg 및 EDC 399 g과 혼합하고 반응을 4시간 동안 진행하도록 한다. 생성된 NHS 에스테르-개질 피브릴(NHS-피브릴)의 수율은 214.7 mg이다.
항체-개질 피브릴의 형성
NHS 에스테르 피브릴(84.5 mg)을 1.0 ㎖ 커플링 완충제(0.2 M NaHCO3, pH 8.1)로 미리 처리하고, 이어서 커플링 완충제(0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.5 M NaCl, pH 7.5) 1.0 ㎖에 현탁시킨다. 모노클론 항체 (항-글루코스 옥시다제)(커플링 완충제 2.0 ㎖ 중의 1.5 mg)를 피브릴로 첨가하고 현탁액을 NHS 피브릴이 항체(주로 항체의 라이신 측쇄와)와 반응하도록 하기 위해서 1시간 동안 회전시킨다. 생성된 피브릴을 여과하고 커플링 완충제로 반복적으로 세척한다.
글루코스 옥시다제 항체-개질 피브릴의 결합
항체-개질 피브릴 상의 비-항체 코팅 부위를 pH 6.0의 포스페이트-완충 생리식염수 용액에 용해된 1% BSA로 10분 동안 회전에 의해 블로킹한다. 글루코스 옥시다제를 BSA 용액에 용해시키고 이 용액을 피브릴과 1.5시간 동안 혼합시킨다. 최종적으로, 방출물을 280 nm에서 분광광도계로 모니터링함으로써 용출하기 위해서 단백질이 관찰되지 않을 때까지 피브릴을 중성 pH의 포스페이트 완충제로 세척한다.
항체-개질된 피브릴 상의 항체의 검출
피브릴 상의 작용성 항체 분자를 결합된 항원, 글루코스 옥시다제의 촉매 활성에 의해서 정량한다. 글루코스 옥시다제 활성을 효소(유리 효소 또는 항체-개질 피브릴에 특이적으로 결합된 효소)의 샘플을 0.1 M 나트륨 포스페이트 (pH 6.0), 20 μM 글루코스, 183 nM 호스래디시 퍼옥시다제 및 30 μM 2.2'-아지노-비스(3-에틸렌벤즈티아졸린-6-설폰산) (ABTS)을 함유하는 큐벳에 첨가함으로써 분광광도계로 측정한다. 글루코스 옥시다제의 활성을 414 nm 25℃에서(녹색 형성) 흡광도 증가율을 분광광도계로 측정함으로써 측정한다. 결합된 효소의 정량이 피브릴 g당 작용성 항체 1.52 μmol이 존재함을 나타낸다.
1급 아민과 탄수화물 그룹 간의 피브릴-항체 커플링
아미노 피브릴의 형성
새로 제조된 pH 8.1의 0.2M NaHCO3 중의 NHS-피브릴(214.7 mg)의 현탁액을 실온에서 1,2-디아미노에탄(100 ㎕)으로 혼합한다. 현탁액을 약 5시간 동안 교반한다. 이어서 혼합물을 Buchner 깔때기에서 유입 여과하고 물(3 x 10 ㎖)과 메탄올(3 x 10 ㎖)로 세척하고 진공에서 밤새 건조한다. 아미노 피브릴의 수율은 144 mg이다. 닌히드린 시험은 디아미노에탄(비-접합)이 여전히 피브릴로 흡수됨을 설명한다. 피브릴을 물에서 재현탁하고 90분동안 초음파처리한다. 닌히드린 시험은 피브릴이 비-공유결합된 아민을 충분히 함유하지 않음을 나타낸다.
항체-개질된 피브릴의 형성
NAP-5 컬럼을 pH 5.5의 100 mM 아세테이트로 평형시키고 모노클론 항체(항-글루코스 옥시다제, 300 ㎕ 중의 1.5 mg)를 첨가하고 완충제(1 ㎖)로 용출한다. 이 용액이 20 mM NaIO4(1 mM의 최종 NaIO4 농도) 50 ㎕와 실온에서 2시간 동안 반응하도록 한다. 미리 평형된 NAP-10 (0.15 M KH2PO4, pH 6.0)을 첨가함으로써 종결하고 동일한 완충제로 용출한다. 용출물을 아미노 피브릴을 함유하는 10-㎖ 튜브에 수집하고 현탁액이 2 내지 3 시간 동안 반응하도록 한다. 이어서 피브릴을 반응 완충제로 세척하고 pH 5.5의 5㎖ KH2PO4에 저장한다.
항체-개질된 피브릴 상의 항체의 검출
피브릴 상의 작용성 항체 분자를 상술된 바와 같은 결합된 항원인 글루코스 옥시다제의 촉매 활성에 의해서 정량한다. 결합된 효소의 정량은 피브릴 g당 작용성 항체 0.36 μmol이 존재함을 나타낸다.
말레이미드 및 설프하이드릴 그룹간의 피브릴-항체 커플링
마우스 모노클론 항체의 환원
항체용액(24.7mg, 2.9ml 중)에, 디티오트레이톨(DT, 25mg, 0.16mmol)을 가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한다. 환원 항체를 PD-10 일회용 겔 여과 컬럼(Pharmacia)을 사용하여 정제한다.
항체와 말레이미드 피브릴의 공유 커플링
말레이미드 피브릴(0.18 mg)과 평이한 피브릴(0.15 mg)을 15분 동안 실온에서 초음파처리하고 30분 동안 40℃에서 배양한다. 이어서 피브릴을 원심분리하고 상등액을 제거한다. 이어서 피브릴을 나트륨 포스페이트 완충제(0.1 M, pH 7.2, 1.1 ㎖) 중의 환원된 항체(12.4 mg)와 4시간 동안 실온에서 배양한다.
호스래디시 퍼옥시다제(HRP)-표지 염소 항-마우스 항체를 사용한 항체 피브릴 상의 항체의 정량
마우스 항체 피브릴을 나트륨 포스페이트 완충제(0.1M, pH 7.5, 1㎖) 중의 0.1% PEG로 30분 동안 40℃에서 예비배양한다. 이어서 이들을 원심분리하고 상등액을 제거한다. 마우스 항체 피브릴을 0.1% PEG를 함유하는 나트륨 포스페이트 완충제(0.1 M, pH 7.5, 500 ㎖) 중의 HRP-표지 염소 항-마우스 항체 (0.01 mg)와 2시간 동안 실온에서 배양한다. 이어서 피브릴을 나트륨 포스페이트 완충제 (0.1 M, pH 7.5, 1 ㎖) 중의 0.1% PEG로 5회 세척한다. 결합된 HRP의 양을 결합된 효소의 촉매 활성을 분광광도계로 측정함으로써 측정한다. 효소 반응이 하기에 예시되어 있다:
HRP
H2O2 + ABTS ------> 2H2O + 산물 (414 nm)
결과는 피브릴 상의 마우스 항체의 밀도가 피브릴 g당 1.84 mg 항체임을 나타내고 평이한(대조군) 피브릴 상의 마우스 항체의 밀도가 피브릴 g당 0.48 mg 항체임을 나타낸다 (비특이적 결합정도는 약 26%이다).
실시예 8
이작용성 피브릴의 라이신 첨가에 의한 제조
Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르의 합성:
반응 서열이 도 5에 예시되어 있다. Nε-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신 (2 g, 8.12 mmol)을 메탄올(40 ㎖)과 물 (40 ㎖)에 용해시키고, pH를 트리에틸아민으로 8로 조정한다. 디옥산(2.4 g, 20 ㎖ 중의 9.7 mmol) 중의 N-(벤질옥시카보닐-옥시)석신이미드 용액을 상기의 혼합물에 첨가하고 pH를 트리에틸아민으로 8 내지 9로 유지한다. 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 용매를 조 Nα-CBZ-Nε-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신을 수득하기 위해서 회전식 증발에 의해 제거한다. Nα-CBZ-Nε-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신을 0.2M 칼슘 카보네이트(4 ㎖)로 처리하고 수층을 백색 고체를 수득하기 위해서 제거한다. 고체를 N,N-디메틸포름아미드(40 ㎖)와 벤질 브로마이드(1.16 ㎖)에서 재현탁한다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 작업하고 유기상을 마그네슘 설페이트로 건조한다. 용매를 용매로서 에틸 아세테이트 중의 25% 헥산을 사용하여 조 Nα-CBZ-Nε-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신 벤질 에스테르를 수득하기 위해서 제거한다. 메틸렌 클로라이드 (10 ㎖) 중의 Nα-CBZ-Nε-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신 벤질 에스테르 (1 g, 2.2 mmol)에 0℃에서 트리플루오로아세트산을 첨가한다. 반응 혼합물을 10분 동안 0℃에서 교반한 다음, 추가의 2.5 시간 동안 실온에서 교반한다. 용매를 제거하고 조 산물을 수득한다. 순수한 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해서 수득한다.
Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르 피브릴의 합성:
메틸렌 클로라이드 (18 ㎖) 중의 카복실 피브릴(300 mg)의 현탁액에 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르 (148 mg, 20 ㎖ 메틸렌 클로라이드와 176 ㎕ 트리메틸아민 중의 0.32 mmol)의 용액을 첨가한다. 이어서 HOBT(43.3 mg, 0.32 mmol)와 EDC (61.3 mg, 0.32 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 조 산물을 수득하기 위해서 밤새 실온에서 교반한다. 반응 피브릴을 메탄올, 메틸렌 클로라이드 및 물로 광범위하게 세척한 다음 진공하에 건조한다.
이작용성 피브릴 Fib-lys(COOH)NH2의 합성:
메탄올(4 ㎖) 중의 Nα-CBZ-L-라이신 벤질 에스테르 피브릴 (113 mg)에 나트륨 하이드록사이드(1N, 4 ㎖)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 산물 Nα-CBZ-L-라이신 피브릴을 물과 메탄올로 광범위하게 세척하고 피브릴을 진공하에 건조한다. 아세토니트릴(4 ㎖) 중의 Nα-CBZ-L-라이신 피브릴(50 mg)의 현탁액에 메틸 실릴 요다이드(1 ㎖)를 첨가한다. 혼합물을 3시간 동안 40℃에서 교반한다. 최종 이작용성 피브릴을 물, 메탄올, 0.5 N 나트륨 하이드록사이드 아세토니트릴 및 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척한다. 아미노산 분석은 피브릴 g당 라이신 0.3 μmol 라이신을 나타낸다.
하이드록실 및 카복실 (또는 아미노) 이작용성 피브릴을 세린, 트레오닌 또는 티로신을 사용함으로써 본원에 기재된 바와 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다. 티올화 및 카복실 (또는 아미노) 이작용성 피브릴을 시스테인을 사용하여 제조할 수 있다. 카복실 및 아미노 이작용성 피브릴을 아스파트산 또는 글루탐산을 사용하여 제조할 수 있다.
실시예 9
ECL-기본 바이오센서로서의 탄소 나노튜브
메틸렌 클로라이드(8 ㎖) 중의 이작용성 피브릴(113 mg)의 현탁액에 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 19.5 mg, 0.16 mmol)과 1,3-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC, 33 mg, 0.16 mmol)를 첨가한다 (도 6). 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 4-메틸-4'-(8-하이드록시옥틸) 2,2'-비피리딘 (47 mg, 0.16 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한다. 생성된 산물 피브릴을 연속적으로 DMF, 물 중의 50% 디옥산, 메탄올 및 물로 광범위하게 세척한다. 피브릴을 에탄올(4 ㎖)의 혼합물에서 현탁하고 물(4 ㎖) 및 시스-디클로로비스 (2,2'-비스피리딘) 루테늄 (II) 디하이드레이트 (45.2 mg, 0.087 mmol)를 첨가한다. 혼합물을 5.5 시간 동안 110℃에서 환류시킨다. 루테늄 착물-개질된 피브릴을 물, 표준 ECL 분석 완충제 (메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.), 톨루엔, 물 중의 50% 디옥산으로 광범위하게 세척한 다음 연속적으로 아세토니트릴, 에틸렌 글리콜 및 메탄올에서 환류시킨다. 루테늄 착물 개질된 피브릴을 CBZ 그룹을 탈보호하기 위해서 아세토니트릴(4 ㎖) 중의 TMSI(4 ㎖)와 4시간 동안 40℃에서 반응시킨 다음, 메탄올, 물 및 나트륨 하이드록사이드 (1N)로 세척한다. 최종 산물을 진공하에서 건조한다. 이어서 피브릴을 메틸렌 클로라이드(5 ㎖)에서 현탁하고 트리에틸아민(5 방울)을 첨가한다. 현탁액에 석신산 무수물(40 mg)을 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고 산물을 메틸렌 클로라이드, 메탄올 및 물로 세척한 다음 진공 하에서 건조한다. 카복실산/루테늄 착물-개질된 피브릴을 디옥산(5 ㎖)으로 재현탁한 다음, N-하이드록시석신이미드(100 mg)와 EDC(167 mg)를 첨가한다. 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반한다. 생성된 NHS 에스테르/루테늄 착물-개질된 피브릴을 디옥산과 메탄올로 세척한다. NHS 에스테르/루테늄 착물-개질된 피브릴을 디옥산(2 ㎖)에서 재현탁하고 나트륨 비카보네이트(0.2 M pH 8.6 NaHCO3 2 ㎖ 중의 75 ㎖) 중의 NAD 동족체의 용액을 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반한다. 피브릴을 물, 나트륨 비카보네이트(0.2 M) 및 메탄올로 세척한 다음, 바이오센서 피브릴을 수득하기 위해서 진공하에서 건조한다.
실시예 10
탄소 나노튜브의 ECL-기본 바이오센서로서의 사용
ECL-기본 바이오센서를 피브릴의 화학적 변형에 의해서 제조한다. 개질된 피브릴을 NH2/COOH 이작용성 피브릴(실시예 8)을 사용하여 제조한다. 하나의 작용성 그룹(NH2)에 NAD+ 동족체를 첨가하고 다른 하나의 작용성 그룹(COOH)에 Ru(bpy)3 2+의 유도체를 첨가한다. 바이오센서 피브릴의 구조가 도 7에 도시되어 있다.
바이오센서를 조인자로서 NAD(P)+/ NAD(P)H를 받아들이는 데하이드로게나제 효소 및 조인자로서 NAD(P)+/NAD(P)H를 받아들이는 데하이드로게나제 효소의 기질의 검출을 촉진하기 위해서 디자인한다. NAD(P)+ 및 NAD(P)H가 Ru(bpy)3 2+ ECL을 촉진하기 위해서 현저하게 다른 능력을 지님(참조문헌: E. Jameison et al., Analytical Chemistry, in press)이 공지된다. 따라서, 데하이드로게나제의 활성은 Ru(bpy)3 2+ 전기화학발광을 유발하는 NAD(P)+와 NAD(P)H의 능력차에 의해서 관찰가능한 NAD(P)+/NAD(P)H의 환원능/산화능에 의해 검출될 수 있다 (도 8). 유사하게도, 기질 상의 데하이드로게나제의 작용이 NAD(P)+의 NAD(P)로의 또는 NAD(P)H의 NAD(P)+로의 전환에 의해서 화학양론적으로 달성될 수 있으므로, 이들 기질의 존재가 또한 전기화학발광에 의해서 검출될 수 있다.
피브릴 지지된 ECL-기본 바이오센서를 사용하기 위해서, 바이오센서를 데하이드로게나제 및 미지량의 데하이드로게나제의 기질(분석물 중의 기질)을 함유하는 수용액 또는 데하이드로게나제 기질 및 미지량의 데하이드로게나제를 함유하는 수용액과 혼합한다(데하이드로게나제가 분석물임). 효소 반응이 진행되고 피브릴 상에 고정된 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H이 환원되거나 산화되도록 하는 적합한 배양 시간 후, 피브릴을 ECL 기구로 끌어들이고 피브릴의 ECL을 측정한다. ECL 측정을 트리프로필아민의 적합한 농도를 함유하지 않는 완충제에서 수행한다 (NAD(P)+/NAD(P)H가 본 발명에서 트리프로필아민 치환이므로).
본 ECL-기본 바이오센서의 양호한 특성은 하기와 같다: 전기화학 ECL 메커니즘의 전자 전달 효율을 개선하는 피브릴 상의 동일한 이작용성 그룹 상의 NAD(P)+/NAD(P)H와 Ru(bpy)3 2+의 근접성(분자간 전자 전달이 분자내 전자전달보다 더욱 효율적임); ECL 활성 시약인 NAD(P)+/NAD(P)H와 Ru(bpy)3 2+ 모두는 빛 방출을 증가시킬 ECL 기구 전극 상에 자기적으로 보유될 수 있는 피브릴 상에 지지된다; 피브릴은 더 많은 빛이 방출되도록 허용할 NAD(P)+/NAD(P)H와 Ru(bpy)3 2+의 높은 밀도(중량당)의 고정을 허용하는 매우 높은 표면적을 갖는다; 바이오센서는 이것이 다수의 다른 분석물(조인자로서 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 받아들이는 데하이드로게나제 또는 이들 효소의 기질)을 검출할 수 있다는 점에서 다용도이다.
실시예 11
글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH)의 피브릴 지지된 ECL-기본 바이오센서를 사용한 검출
이작용성 부가물(ECL 바이오센서 피브릴)에 공유 결합된 NAD+ 동족체 및 Ru(bpy)3 2+ 동족체 모두로 개질된 피브릴을 효소 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 검출하기 위해서 사용한다. ECL 바이오센서 피브릴(860 ㎍/㎖)을 약 50 μM 글루코스-6-포스페이트를 함유하는 중성 pH 완충된 용액과 혼합한다. 하나의 튜브로 G6PDH를 3.6 μM의 농도로 첨가한다. 제 2 대조군 튜브로 탈이온수를 첨가한다. 즉시 피브릴의 ECL을 첨가한다. 도 9는 시간 0에서 G6PDH의 존재시 (DH+) 및 부재시 (DH-)의 피브릴의 ECL이 유사한 수준임을 도시한다. 분석 완충제(피브릴이 없음)를 생성하는 배경 ECL이 또한 도시되어 있다(A.B.). 배양(실온에서 회전) 42시간 후, 더 많은 피브릴을 제거하고 ECL을 다시 측정한다. 도 9에 도시된 바와 같이, G6PDH (DH-)의 부재시 분석 완충제 (A.B.)와 피브릴의 ECL은 시간 0에서 나타난 ECL과 유사하다. 그러나, G6PDH (DH+)를 함유하는 샘플의 ECL은 시간 0에서보다 실질적으로 더 낮다. 결과는 G6PDH 활성을 피브릴 지지된 ECL 바이오센서를 사용하여 검출할 수 있음을 나타낸다. 피브릴 부재시 본원에 사용된 특정 NAD+ 동족체(비-고정)와 Ru(bpy)3 2+(비-고정)로의 분리 작업은 NAD+ 동족체의 환원된 (NADH) 버전이 Ru(bpy)3 2+이 전기화학발광되도록 유발시에 산화된 (NAD+) 버전보다 덜 효율적임을 확증한다.
실시예 12
탄소 나노튜브의 ECL-기본 효소 바이오센서를 위한 지지체로서의 사용
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NAD+) 효소 조인자의 동족체와 루테늄 (II) 트리스-비피리딘 (Ru(bpy)3 2+)의 동족체 모두가 접합된 데하이드로게나제 효소를 함유하는 효소 바이오센서를 제조한다. NAD+ 동족체는 이것이 효소의 조인자 결합 부위에 결합하고 결합시 자연스럽게 행동할 수 있도록 구속된다 (즉, 이것은 효소의 천연 기질의 존재시 통상의 화학적 메커니즘에 의해서 효소에 의해서 환원될 수 있다). 또한, (Ru(bpy)3 2+)의 동족체는 이것이 NAD+와 물리적으로 접촉하게 할 수 있도록 구속된다 (도 10). IGEN OrigenR 분석기(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.)와 같은 ECL 기구에서, NAD+ 및 이의 환원된 형태, NADH는 Ru(bpy)3 2+ 전기화학발광을 다른 정도로 촉진한다. 따라서, 빛 방출을 기준으로, NAD+, NADH 또는 이 둘의 혼합물이 용액에 존재하는지를 측정할 수 있다 (참고문헌: F. Jameison et al., Analytical Chemistry, in press). 따라서, 바이오센서는 NAD+의 환원과 그에 따른 효소 기질의 존재의 정도를 검출하기 위해서 Ru(bpy)3 2+의 ECL 반응의 효율간 차이를 사용한다. 실례로서, 알콜 데하이드로게나제는 하기에 예시된 반응을 촉매한다;
에탄올(환원) + NAD+(산화) → 아세트알데하이드(산화) + NADH(환원).
알콜 데하이드로게나제-기본 ECL 바이오센서는 에탄올을 아세트알데하이드로 전환하고, 추가로 NAD+를 NADH로 전환한다. 바이오센서 상에 고정된 Ru(bpy)3 2+의 ECL 성질이 NAD+ 또는 NADH가 고정되는지에 의존하므로, 효소 바이오센서의 ECL은 에탄올의 존재를 보고할 수 있다. 바이오센서의 양호한 성질은 ECL 반응 동안 조인자의 NADH 형태가 NAD+ 형태로 재-산화되므로 하나의 바이오센서 분자가 다수 분자의 분석물을 검출하기 위해서 반복적으로 사용될 수 있다는 점이다.
바이오센서가 가용성 효소(데하이드로게나제)를 기초로 하고 분석물(실시예를 위한 에탄올)이 또한 가용성이므로, 소비된 분석물-함유 용액으로 세척하지 않으면서 다른 분석물-함유 샘플을 분석하기 위해서 각각 사용될 수 있도록 바이오센서를 고정하는 것이 유리할 것이다. 이러한 고정은 알콜 데하이드로게나제 (ADH) 기제 ECL 바이오센서로 수행된다 (도 10에서 개략적으로 도시됨). 도 11은 다이날 M450 비드 상의 ADH-기본 바이오센서의 고정 (뉴욕의 Lake Success)(좌측) 및 알킬 피브릴 상의 고정(우측)을 도시한다. 다이아그램은 바이오센서 분자가 고체 지지체의 크기에 대하여 실제로 훨씬 더 작은 규모로 그려지지 않는다. 알킬 피브릴을 산화된 피브릴(COOH 그룹을 지님)의 1-아미노옥탄과의 반응에 의해서 제조한다. 두 경우 모두(비드와 피브릴)에서 효소 바이오센서는 완충된 수용액 중의 비공유 흡수에 의해서 고정된다.
에탄올을 비드- 및 피브릴-고정 ECL ADH-기본 바이오센서를 사용하여 검출한다. 비드 또는 피브릴에 흡수된 효소 바이오센서의 양은 용액에 잔존하는 (비-흡수된) 단백질의 양을 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해서 측정함으로써 측정한다 (280 nm에서의 흡광도는 용액 중의 단백질의 양을 나타낸다). 결과는 ADH 바이오센서의 0.308 mg이 피브릴 mg당 결합되고 반면에 ADH 바이오센서 0.015 mg이 비드 mg당 결합됨을 나타낸다. 따라서, 고체 지지체의 단위 중량당, 피브릴의 흡수 용량은 다이날 비드의 흡수 용량보다 20.5배 초과한다.
에탄올의 ECL 센싱은 ADH 바이오센서 흡수된 비드(0.50-1.25 mg) 또는 피브릴(0.04-0.10 mg)을 0.1 M 나트륨 포스페이트 완충제 (pH 7.2), 12 mM 세미카비자이드를 함유하는 용액과 혼합함으로써 수행된다. 일부 실시예는 또한 분석물, 에탄올의 0.5 mM를 함유한다. 바이오센서로 코팅된 고체 지지체를 IGEN OrigenR ECL 분석기(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.)로 유도하고 ECL을 측정한다. 이러한 실험의 하나의 결과가 도 12에 도시되어 있다. 비드와 피브릴 모두에서, 효소 바이오센서의 ECL 시그널이 에탄올 존재시에 감소한다. 이러한 결과는 Ru(bpy)3 2+ 전기화학발광에 대한 이러한 NAD+ 동족체의 산화/환원 상태의 효과의 용액 연구에서(비-고정된 NAD+/NADH 및 비-고정된 Ru(bpy)3 2+) 수득된 결과와 일치한다. 이러한 결과는 피브릴이 ECL에서 효소에 대한 지지체로서, 특히 효소-기본 ECL 바이오센서에 대한 지지체로서 사용될 수 있음을 나타낸다. 피브릴로 보여진 결과가 20배 적은 피브릴을 사용한다 하더라도 다이날 비드로 보여지는 결과와 유사함을 또한 주지해야 한다.
실시예 13
바이오티닐화 피브릴 및 이작용성 바이오티닐화 알킬 피브릴
피브릴 표면을 바이오티닐화하거나, 알킬화하고 바이오티닐화할 수 있다. 이어서 이러한 변형을 함유하는 피브릴은 스트렙타비딘 비드 및 스트렙타비딘 효소와 같은 스트렙타비딘 접합된 물질을 결합시킬 수 있다.
피브릴은 이의 높은 표면적으로 인하여 고체 담체로서 대단한 장점을 지닌다. 본원에 기재된 바이오티닐화 피브릴은 피브릴과 비드의 장점을 결합시킨다. 바이오티닐화 알킬 피브릴은 동일한 개념의 확장이지만 알킬 피브릴의 추가의 단백질 흡수성을 나타낸다.
스트렙타비딘- 및 바이오틴-코팅 피브릴을 진단에 사용할 수 있고 전기화학발광 분석을 위한 포획제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 신규한 특성은 이작용성 피브릴을 생성하기 위한 한 피브릴 상의 두 고체 담체의 조합이다. 또한, 기재된 방법은 비드를 위한 표면적을 증가시키고 피브릴 자기화를 확대한다.
바이오티닐화 피브릴의 제조
바이오티닐화 피브릴을 본질적으로 제조 O에 기재된 바와 같은 아미노 피브릴 2.4 mg과 pH 8.15의 0.2 M 완충제 NaHCO3 중의 NHS 장쇄 바이오틴 9 mg을 혼합함으로써 제조한다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 회전시키고 동일한 완충제로 2회 세척한다.
바이오티닐화 알킬 피브릴의 제조
바이오티닐화 알킬 피브릴을 2 단계 반응에 의해서 제조한다. 첫째, 이작용성 피브릴 4.25 mg(아미노 및 카복실 함유)과 NHS 에스테르 장쇄 바이오틴 25 mg을 혼합한다. 피브릴을 세척하고 진공하에서 건조한다.
제 2 반응을 바이오티닐화 이작용성 피브릴 4 mg을 DMF 0.5 ㎖ 중의 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드) 11 mg, DMAP (4-디메틸아미노피리딘) 7.5 mg 및 NH2(CH2)7CH3 10㎕와 혼합함으로써 수행한다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 최종 바이오티닐화 알킬 피브릴을 CH2Cl2, MeOH 및 dH2O로 세척한다.
실시예 14
ECL 분석에서 고체 지지체로서 바이오티닐화 피브릴
스트렙타비딘-바이오틴 또는 아비딘-바이오틴 상호작용을 요하는 포맷을 수반하는 바이오티닐화 피브릴을 ECL 분석에서 사용할 수 있다. 바이오티닐화 피브릴은 예를 들면 스트렙타비딘으로 추가로 유도될 수 있다. 피브릴의 바이오틴 공유 결합(실시예 14 참조)은 스트렙타비딘과의 강한 비-공유 결합 상호작용을 형성할 수 있다. 스트렙타비딘이 4 개의 동등한 결합 부위를 갖는 사량체 단백질이므로, 바이오티닐화 피브릴에 결합된 스트렙타비딘은 거의 특히 추가의 바이오티닐화 시약이 결합할 수 있는 비점유된 결합 부위를 지닐 것이다. 따라서, 바이오티닐화 피브릴은 스트렙타비딘-코팅 피브릴로 전환될 수 있다.
이러한 피브릴-바이오틴-스트렙타비딘(FBS) 지지체로 수행할 수 있는 다수의 분석 시험이 있다. 예를 들면, 바이오티닐화 항-분석물 항체는 (항체가 분석물에 복합되기 전후에) FBS 지지체 상에 포획될 수 있다. 바이오티닐화 항-분석물 항체를 사용하는 분석이 잘 성립되어 있다. 이러한 분석에는 해당 분석물이 항-분석물 항체로의 결합을 위해 도입된 Ru(bpy)3 2+-표지 분석물과 경쟁하는 경쟁 분석이 포함된다. 유리 (결합된) 분석물 및 유리 (비결합된) Ru(bpy)3 2+-표지 분석물을 피브릴 고정된 항체로부터 세척할 수 있다. 세척 단계는 원심분리, 여과를 수반하는 통상의 실행에 의해서, 또는 자기로의 인력에 의해서 용액 상으로부터 물리적으로 분리된 피브릴에 의존한다.
경쟁 분석외에, 샌드위치 유형 면역분석이 FBS 지지체에 수행될 수 있다. 샌드위치 면역분석은 일반적으로 진단의 분야에서, 특정 ECL 검출에서 익히 공지되어 있다. 이러한 분석은 두 항체; 예를 들면, 바이오틴으로 표지됨으로써 고체 표면 상에 포획되는 첫번째 "1차" 항체와 고체 표면에 의해서 포획되지 않지만 ECL 적용시 Ru(bpy)3 2+와 같은 리포터 그룹으로 표지되는 "2차" 항체에 의해서 동시에 결합되는 분석물을 수반한다. 이러한 샌드위치 분석은 고체 포획 지지체와 같은 피브릴을 사용하여 수행할 수 있고 이렇게하여 피브릴은 전 단락에 기재된 바와 같이 포획된다. 그러므로, 이러한 분석에서, 피브릴은 이것에 바이오틴을 공유적으로 결합시키고, 여기에 스트렙타비딘이 결합되고, 여기에 차례로 바이오티닐화 1차 항체가 결합되고, 분석물이(존재시) 결합되고, 여기에 Ru(bpy)3 2+-표지 2차 항체가 결합된다.
유사하게도, DNA 탐침 분석은 FBS 지지체를 사용하여 수행할 수 있다. 바이오티닐화 일본쇄 DNA가 FBS 지지체에 결합될 수 있고 경쟁적인 하이브리드화가 상보적인 일본쇄 표준 분석물 DNA 분자와 상보적인 Ru(bpy)3 2+-표지 올리고뉴클레오타이드 사이에서 발생할 것이다.
다른 유형의 바이오티닐화 피브릴, 바이오티닐화 알킬화 피브릴이 면역분석과 DNA 탐침 분석에 사용될 수 있다. 실시예 13에 기재된 바와 같이, 이작용성 피브릴을 바이오틴의 한 유형의 작용성 그룹으로의, 도입된 알킬쇄의 다른 한 유형의 작용성 그룹으로의 공유 결합에 의해서 변형시킬 수 있다. 생성된 알킬화, 바이오티닐화 피브릴을 스트렙타비딘 또는 아비딘과 특정하게 연계하여(바이오틴에 의해서), 또한 단백질의 흡수를 위해서(알킬쇄에 의해서) 사용할 수 있다.
알킬 피브릴을 다이날 마그네틱 비드를 포함하여 스트렙타비딘-코팅 마그네틱 비드와 같은 기타 고체 지지체와 접합하여 사용할 수 있다. 이러한 비드에 대한 하나의 장점은 이들이 훨씬 더 높은 표면적을 갖는다(단위 중량당)는 점이다. 따라서, 피브릴이 마그네틱 비드의 외면에 부착될 수 있지만, 이것은 표면적 및 이에 따른 비드의 결합 용량을 현저하게 향상시킨다. 알킬화, 바이오티닐화 피브릴을 높은 친화력 스트렙타비딘(비드)-바이오틴(피브릴) 상호작용을 유발하는 스트렙타비딘-코팅 비드와, 이에 따라 매우 높은 표면적을 갖는 피브릴-코팅 비드와 혼합시킬 수 있음이 계획된다. 알킬 피브릴이 흡수에 의해서 단백질을 결합시킬 수 있으므로, 피브릴-코팅 비드는 스트렙타비딘과 항체를 포함하는 흡수된 단백질과 추가로 유도될 수 있다. 상술된 바와 같이, 스트렙타비딘 또는 항체 코팅 피브릴을 면역분석과 DNA 탐침 분석에 사용할 수 있다. 따라서, 피브릴-코팅 비드는 더 적은 비드가 동일한 결과를 제공하기 위해서 해당 분석에 요구되도록 이의 면적을 현저하게 증가시킴으로써 비드의 성질을 개선할 수 있다.
실시예 15
자기-민감성 탄소 나노튜브
피브릴은 자기성을 갖는다. 피브릴이 자기성 또는 비자기성일 수 있는 정도는 피브릴 생성 과정의 결과로서 피브릴에 존재하는 촉매의 양에 의해서 조절된다. 이러한 방법이 US 특허 제4,664,230호, 5,165,909호 및 5,171,560호에 기재되어 있다.
피브릴의 자성은 피브릴이 작용화(즉, 알킬 피브릴, 단백질 결합된 피브릴 등)된 후 관찰된다. 특정 반응(예를 들면, 알킬화) 후의 피브릴이 반응 전보다 현저하게 빠르게 자기로 이동한다. 이러한 현상에 대한 하나의 가설은 일종의 응집 또는 용매화가 반응 과정동안 발생할 수 있다는 것이다. 그러나, 진정한 메커니즘은 현재 측정되지 않았다.
실시예 16
PEG 개질된 피브릴과 Ru(Bpy) 3 의 비-특이적 결합의 환원
클로레이트 산화된 피브릴, 벤조일 퍼옥사이드를 사용하여 PEG로 개질된 피브릴 및 NHS 에스테르 커플링에 의해서 PEG로 개질된 피브릴의 스톡 분산물을 초음파처리로 pH 7.0의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제 중의 1.0 mg/㎖로 제조한다. 각각의 10배 연속 희석물 2 ml를 5개의 폴리프로필렌 튜브 각각에 배치한다. 동일한 완충제 중의 스톡 용액 Ru(bpy)3 (약 10μM) 50 ㎖를 각각의 튜브와 3 개의 완충제 블랭크에 첨가한다. Ru(Bpy)3가 없는 3 개의 완충제 튜브를 또한 제조한다. 모든 튜브를 와동 혼합기 상에서 혼합하고 밤새 배양하도록 한다. 모든 튜브를 피브릴을 분리하기 위해서 원심분리하고 0.1 ㎖ 분취량 상등액을 새로운 튜브로 전달하고 OrigenR 분석 완충제(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.) 1.0 ㎖로 희석하고 MagnalyzerR(메릴랜드 게이터스버그의 IGEN, Inc.)를 사용하여 ECL에 의해서 Ru(Bpy)3에 대해 분석한다. 상등액에 잔존하는 Ru(Bpy)3의 수준은 피브릴에 비-특이적으로 결합된 양의 간접 측정이다 (도 13). PEG 개질된 피브릴 물질 모두에 있어서 실질적으로 모든 Ru(Bpy)3이 0.1 mg/㎖ 이하의 피브릴 수준으로 상등액에 잔존한다. 이러한 피브릴의 1.0 mgs/㎖로 상등액의 Ru(Bpy)3의 20 내지 30 % 감소가 존재한다. 대조적으로, 클로레이트 산화된 피브릴에 있어서, 상등액에 1.0 mgs/㎖로 잔존하는 Ru(Bpy)3는 거의 존재하지 않고 PEG 변형하지 않은 피브릴 0.1 mg/㎖의 상등액에 Ru(Bpy)3 20 내지 30 % 감소가 존재한다.
참조문헌

Claims (20)

  1. 전극 유도 발광 표지 화합물을 포함하는 분석 수행 물질이 부착된 나노튜브.
  2. 제 1 항에 있어서, 분석 수행 물질이 효소 바이오센서인 나노튜브.
  3. 제 1 항에 있어서, 표지 화합물이 전기화학발광 표지인 나노튜브.
  4. 제 3 항에 있어서, 전기화학발광 표지가 희토류 금속 또는 전이 금속을 포함하는 나노튜브.
  5. 제 3 항에 있어서, 전기화학발광 표지가 루테늄, 오스뮴 및 레늄으로 구성된 군으로부터 선택되는 금속 원자를 포함하는 나노튜브.
  6. 제 1 항에 있어서, 분석 수행 물질이 항체를 포함하는 나노튜브.
  7. 제 1 항에 있어서, 분석 수행 물질이 항체, 단백질 수용체, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 비오틴 또는 핵산을 포함하는 나노튜브.
  8. 샘플에 존재하는 해당 분석물의 검출용 조성물로서, 하기를 포함하는 조성물:
    (i) 작용그룹을 함유하는 흑연 나노튜브, 및
    (ⅱ) 작용그룹에 결합하는 생물학적 물질로서, 상기 생물학적 물질은 분석물, 그 분석물의 동족체 또는 그 분석물의 결합 파트너에 결합할 수 있거나 분석물, 그 분석물의 동족체 또는 그 분석물의 결합 파트너에 결합되어 있는 물질.
  9. 샘플 내 존재하는 해당 분석물에 대한 결합 분석을 수행하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법.
    (a) (i) 샘플,
    (ⅱ) 전극 유도 발광 표지 화합물을 포함하는 분석-수행 물질, 및
    (ⅲ) 생물학적 물질에 결합된 다수의 작용화된 나노튜브를 함유하는 조성물을 형성하는 단계;
    (b) 상기 조성물을 인큐베이션하여 다수의 작용화된 나노튜브 및 표지 화합물 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 복합체 내의 표지 화합물을 발광하도록 유도하는 단계; 및
    (d) 방출된 발광을 측정하여 샘플 내 해당 분석물의 존재를 측정하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 복합체가 전극표면에서 수집되는 전기화학발광의 측정에 기초하는 방법
  11. 생물학적 물질에 결합된 작용화된 흑연 나노튜브, 및 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 미립자-기본 결합 분석에서 시약으로 사용하기 위한 조성물:
    (a) 전해질;
    (b) 전기화학발광(ECL) 잔기를 함유하는 표지 화합물;
    (c) 해당 분석물 또는 해당 분석물의 동족체;
    (d) 해당 분석물 또는 이의 동족체의 결합 파트너;
    (e) (c) 또는 (d)와 반응할 수 있는 반응성 성분;
    (f) 환원제; 및
    (g) 전기화학발광-반응 증진제;
    단, 여타 시약 조성물에 함유된 어떠한 두 성분도 의도하는 분석에서 이들의 작용에 손상을 주도록 저장 중에 상호 반응성을 띠지는 않는다.
  12. 제 11 항에 있어서, 표지 화합물을 포함하는 제 2의 생물학적 물질을 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 표지 화합물이 전기화학발광 표지인 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 전기화학발광 표지가 희토류 금속 또는 전이 금속을 포함하는 조성물.
  15. 하나 이상의 용기에 하기를 포함하는 전기화학발광 결합 분석을 수행하기 위한 키트:
    (a) 제 1 생물학적 물질에 결합된 나노튜브; 및
    (b) 표지 화합물을 포함하는 제 2의 생물학적 물질.
  16. 제 15 항에 있어서, 표지 화합물이 전기화학발광 표지인 분석시약.
  17. 제 16 항에 있어서, 표지 화합물이 희토류 금속 원자 또는 전이 금속 원자를 포함하는 분석시약.
  18. (i) 전기화학발광 표지; (ⅱ) 효소; 및 (ⅲ) 효소 조인자로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 성분에 결합된 흑연 나노튜브.
  19. 효소 바이오센서가 전기화학발광하도록 유도될 수 있는 표지 화합물을 포함하는, 효소 바이오 센서에 결합된 흑연 나노 튜브.
  20. 제 8 항에 있어서, 생물학적 물질이 항체인 조성물.
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