KR100557338B1

KR100557338B1 - 자기조립 물질로 랩핑된 탄소나노튜브의 제조방법

Info

Publication number: KR100557338B1
Application number: KR1020030084888A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 정희태; 이석재; 박종필; 박태정; 최종현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2006-03-06
Also published as: JP4024785B2; US20060003401A1; CN1621341A; KR20050051148A; JP2005156534A; CN1310832C

Abstract

본 발명은 자기조립(self-assembly)물질을 탄소나노튜브 상에 자기조립시키는 것을 특징으로 하는 자기조립물질로 랩핑(wrapping)된 수용성 탄소나노튜브의 제조방법 및 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 탄소나노튜브에 관한 것이다.

본 발명에 따른, 자기조립물질로 랩핑된 탄소나노튜브는 수용성 성질을 나타내므로 일반 탄소나노튜브와 비교하여 월등히 우수한 응용성을 가지게 된다. 특히, 상기 자기조립물질로 랩핑된 탄소나노튜브에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 결합하는 리셉터를 선택적으로 부착하여 바이오센서를 제작하는 것이 가능하다.

자기조립, 탄소나노튜브, 자기조립, 수용성, 랩핑(wrapping), 바이오센서

Description

자기조립 물질로 랩핑된 탄소나노튜브의 제조방법 {Method for Producing a Carbon Nanotubes Wrapped with Self-Assembly Materials}

도 1은 자기조립을 하는 유기초분자의 모형에 대한 도시이다. 도 1a는 원판형 또는 디스크형 덴드리머(1)와 쐐기형(fan-shaped) 유기분자(2)가 자기조립을 통해 원기둥 형태(3)로 되고, 이 원기둥들이 육각형으로 배열된 3차원 구조(4)를 형성하는 것을 도시하고 있다. 도 1b는 막대-사슬형 또는 원뿔형의 분자(5)들이 자기조립을 통해 구형(6)으로 되고, 이 구들이 모여 3차원 공간상에 일정한 구조(7)로 배열되는 것을 도시하고 있다.

도 2는 정제된 SLP에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여주는 그림이다.

도 3은 SLP을 이용하여 탄소나노튜브를 랩핑하는 방법을 보여주는 개략도이다.

도 4와 도 5는 AFM (Atomic Force Microscopy) 분석을 통하여 SLP로 랩핑된 탄소나노튜브의 결과를 보여주는 이미지이다.

발명의 분야

본 발명은 자기조립(self-assembly)물질을 탄소나노튜브 상에 자기조립시키는 것을 특징으로 하는 자기조립물질로 랩핑(wrapping)된 수용성 탄소나노튜브(carbon natotube: CNT)의 제조방법, 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 탄소나노튜브 및 상기 자기조립물질로 랩핑된 탄소나노튜브에 표적 바이오물질과 결합하는 리셉터를 선택적으로 부착한 바이오센서에 관한 것이다.

발명의 배경

CNT란 지구상에 다량으로 존재하는 탄소로 이루어진 탄소동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 튜브의 직경이 나노미터 (nm=10 억분의 1미터) 수준으로 극히 작은 영역의 물질이다. CNT는 우수한 기계적 특성, 전기적 선택성, 뛰어난 전계방출 특성, 고효율의 수소저장매체 특성 등을 지니며 현존하는 물질 중 결함이 거의 없는 완벽한 신소재로 알려져 있다.

이에 CNT는 각종 장치의 전자방출원 (electron emitter), VFD(vacuum fluorescent display), 백색광원, FED (field emission display), 리튬이온 2차 전지전극, 수소저장 연료전지, 나노 와이어, 나노 캡슐, 나노 핀셋, AFM/STM 팁(tip), 단전자 소자, 가스센서, 의·공학용 미세 부품, 고기능 복합체 등에서 무한한 응용 가능성을 보여주고 있다.

CNT는 이처럼 역학적 견고성과 화학적 안정성이 뛰어나고, 반도체와 도체의 성질을 모두 가질 수 있으며, 직경이 작고 길이가 상대적으로 매우 긴 특성 때문에, 평판표시소자, 트랜지스터, 에너지 저장체 등의 소재로서 뛰어난 성질을 보이고, 나노크기의 각종 전자소자로서의 응용성 매우 크다 (Dai, H., Acc. Chem. Res., 35:1035-1044, 2002).

하지만, 현재 알려진 CNT 물질은 모든 유기 용매에 불용성 성질을 가지고 있어 많은 응용에 있어 제한점을 가지고 있고 (Bochrath, M., Science 275:1922-1925, 1997), 또한 CNT의 분자학적인 수준에서의 화학적 성질을 이해하는 데 큰 장애가 되고 있다 (Chen, J. et al., Science 282:95-98, 1998).

최근, 고분자, 천연고분자, 탄수화물 및 펩타이드를 이용한 공유결합, 비공유결합 및 마이셀 기법을 통해 CNT의 용해성을 높이기 위한 연구가 진행되어 왔다 (O'Connell, M. J. et al., Chem. Phy. Lett., 342:265-271, 2001; Chen, J., et al., JACS, 124:9034-9035, 2002; Mitchell, C.A. et al., Macromolecules, 35:8825-8830, 2002; Kang, Y. et al., JACS, 125, 5650-5651, 2003; Wang et al., Analyst., 127:1353-1358, 2002; Star and Stoddart Macromolecules, 35: 7516-7520, 2002; Bandyopadhyaya et al., Nano Lett, 2: 25-28, 2002; Pantarotto et al., Chemistry & Biology, 10:961-965, 2003).

또한 물리적 흡착을 이용하여 탄수화물을 CNT에 결합 또는 랩핑하여 바이오센서로서의 응용한 가능성을 제시하였다 (Wang, Z. et al., Analyst 127:1353-1358, 2002; Star, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 41:2508-2512, 2002). 그리 고 이러한 방법들은 CNT 표면에 단순히 물리적 흡착 또는 반데르발스 (van der Waals) 힘에 의해 결합되어 있어 결합력이 약할 뿐만 아니라 결합하는 탄수화물의 배향 등을 정확히 조절하기 어려운 치명적인 단점을 가지고 있다 (Chambers, G. et al., Nano Lett., 3:843-846, 2003).

이와 아울러 최근 본 발명의 발명자들은 효소반응을 이용하여 탄수화물을 CNT에 랩핑하고, 랩핑된 탄수화물에 바이오 리셉터를 결합시킨 바이오센서에 대하여 특허를 출원한 바 있다 (대한민국특허출원번호: 10-2003-15966). 비록 CNT 표면에 결합되는 탄수화물의 결합력을 보강하고, 결합하는 탄수화물의 배향 등을 정확히 조절할 수 있는 것이 큰 장점이나 탄수화물이 랩핑하는 효율이 다소 떨어지는 특징을 가지고 있다.

한편, CNT를 이용한 생명공학분야에서의 응용 분야가 최근에 많이 등장하고 있다. 포도당 센서 (glucose biosensor), 단백질의 검출, 특정 DNA 서열의 검출 (Sotiropoulou, S. et al., Anal Bioanal Chem, 375:103-105, 2003; Chen, R.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100:4984-4989, 2003; Cai, H. et al., Anal Bioanal Chem, 375:287-293, 2003) 등 바이오센서에 대한 CNT의 응용 가능성을 제시하고 있다. CNT를 기반으로 한 다층 (multilayer)에서의 바이오물질 검색은 표면적이 넓고 전기전도도 성질이 우수하여 DNA와 같은 바이오물질이 고정되는 양을 늘릴 수 있고, 바이오물질에 대한 검출 민감도를 증대시킬 수 있다.

최근, 나노바이오테크놀리지 분야에서 우수한 자기조립(self-assambly)하는 성질을 지닌 SLP에 높은 관심을 가지게 되었는데, SLP의 가장 큰 특징은 그 결정 배열 (crystalline array) 구조에 있다. 여러 다른 종류의 그람음성(gram negative) 및 그람양성 (gram positive) 박테리아 또는 아키 (Archae) 등에서도 SLP가 발견되고 있다 (Pum and Sleyter, TIBECH, 17:8-12, 1999). SLP는 1, 2, 4, 6개의 서브유닛으로 구성되어 경사진 형태, 사각형 형태, 육각형 형태의 대칭 격자 구조를 가지고 있으며 각 격자간의 거리가 2.5 nm - 35 nm로서 일정하게 이루어져 있다. 각각의 서브 유닛들은 비공유 단백질-단백질 결합에 의해서 여러 다양한 조건의 액상에서 자기조립 (self-assembly)하는 성질을 지닌 것으로 알려졌다 (Sleytr et al., TIBTECH, 7:253-260, 1999; Gyorvary et al., Nano Lett., 3:315-319, 2003). 그렇지만 일반적인 조건에서는 이러한 결정 배열 구조를 가지기가 매우 힘들며 그 구조 또한 비공유 단백질-단백질 결합으로서 약하다고 알려져 있다. 이러한 배향성을 가지고 자기조립을 하는 데 있어서 일부 박테리아에서 유래한 SLP의 경우 실리콘, 금속, 고분자 등의 기질표면에서 자기조립하는 결과가 보고되었다 (Moll et al., PNAS, 99:14646-14651, 2002; Shenton et al., Nature, 389:585-587, 1997; Kuen et al. J. Bac., 179:1664-1670, 1997).

이에, 본 발명자들은 정제된 SLP가 높은 배향성을 가지고 안정하게 CNT 둘레에 자기조립을 통해 랩핑되는 것을 확인하고, 상기 CNT에 랩핑된 SLP에 바이오 리셉터를 결합시켜 바이오센서로 응용함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 CNT 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CNT에 랩핑된 SLP에 다양한 종류의 바이오 리셉터를 부착시킨 바이오센서 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 이용하여 다양한 종류의 리셉터에 결합하는 다양한 표적 바이오물질을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자기조립물질과 CNT를 혼합한 다음, 상기 자기조립물질이 CNT 상에서 자기조립되도록 유도하는 단계를 포함하는 자기조립물질로 랩핑된 수용성 CNT의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 자기조립 성질을 가지는 자기조립물질은 SLP(surface layer protein) 또는 SLP 서브유닛인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 SLP는 Acetogenium kivui, Acetogenium kivui, Aeromonas salmonicida, Azotobacter vinelandii, Bacillus brevis, Bacillus polymyxa, Bacillus sphaericus, Caulobacter crescentus, Clostridium aceticum, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermosaccharolyticum, Comamonas acidovorans, Comamonas acidovorans, Delftia acidovorans, Deinococcus radiodurans, Phormidium uncinatum, Sporosarcina ureae, Thermoanaerobacter kivui, Thermoanaerobacter thermoydrosulfuricus, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 및 Clostridium thermosaccharolyticum로 구성된 군에서 선택되는 박테리아 유래 또는 Acidianus(Sulfolobus) brierleyi, Archaeoglobus fulgidus, Desulfurococcus mobilis, Desulfurolobus ambivalens, Halobacterium halobium (salinarum), Halobacterium volcanii, Hyperthermus botylicus, Methanoplanus limicola, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum organotrophum, Pyrodictium brockii, Pyrodictium occultum, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Staphylothermus marinus, Thermococcus celer 및 Thermoproteus tenax로 구성된 군에서 선택되는 아키 유래인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 SLP는 Geobacillus stearothermophilus 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 자기조립 성질을 가지는 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 CNT를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 CNT의 자기조립물질에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터를 부착시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 자기조립물질로 랩핑되어 있는 CNT의 자기조립물질에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 리셉터에 결합하는 표적 바이오물질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, SLP 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 수용성 CNT를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SLP(surface layer protein) 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 수용성 CNT의 SLP 또는 SLP 서브유닛에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터를 부착시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, SLP 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 CNT의 SLP 또는 SLP 서브유닛에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 리셉터에 결합하는 표적 바이오물질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 표적 바이오물질 혹은 유기화합물은 리셉터와 반응하여 검출되는 표적 역할을 할 수 있는 물질로서, 바람직하게는 단백질, 핵산, 항체, 효소, 탄수화물, 지질 또는 기타 바이오분자이며, 더욱 바람직하게는 질병에 관련된 단백질이다.

본 발명에 있어서, 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 '자기조립물질'이란 용어는 비공유결합 (수소결합, 이온결합, 반데르발스 결합, 소수성 결합, 정전기적 결합 등)에 의해 유도되어 지지체에 조립되는 것을 포괄하는 개념으로, 상기 자기조립물질은 지질, 단백질, 펩타이드, DNA, RNA, 기타 유기물질을 포함하며 자기조립하여 형성된 물질은 일정한 배향과 구조를 가지며 또한 기능성을 유지하는 것을 그 특징으로 한다. 알려진 예로 써는 지질 이중막(lipid bilayer), 리포좀(liposome), 바이러스 표면 단백질(virus coat protein), 세포 표면 단백질(SLP), DNA, RNA 등이 있으나, CNT상에 자기조립되어 수용성을 가지는 한 유기초분자를 포괄하는 것으로 정의된다.

예컨대, 자기조립을 하는 유기초분자로는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 원판형 또는 디스크형 덴드리머(1), 쐐기형(fan-shaped) 유기분자(2), 막대-사슬형 또는 원뿔형의 분자(5) 등이 있다. 쐐기형 유기분자의 예로는 하기 화학식 1의 화합물을, 원판형 유기분자의 예로는 하기 화학식 2의 화합물을, 원뿔형 유기분자의 예로는 하기 화학식 3의 화합물을 들 수 있다.

이 유기초분자들은 단량체들이 공유결합으로 연결된 고분자와 달리, 반데르발스(van der Waals) 인력과 같은 물리적인 2차 결합에 의해 일정한 구조를 형성한다. 이러한 유기분자들은 적절한 온도나 농도, 외부 자기장, 전기장 등에 의해 자기조립을 하여 특정한 미세구조를 형성한다. 쐐기형의 분자들이 자기조립을 통해 판상 구조(1)를 형성하고, 이 판상구조들이 모여 기둥 형태(3)를 만들며, 다시 원 기둥들이 육각형으로 배열된 3차원 구조(4)를 형성한다(도 1a). 그 외에 원뿔형태의 유기분자(5)의 경우는 원뿔형들이 자기조립되어 구형(6)을 이루며, 구들이 모여 3차원 공간상에 일정한 구조(7)로 배열된다(도 1b).

본 발명에서 사용되는 '랩핑'이란 용어는 상기 자기조립물질이 CNT상에서 자기조립되어 비공유결합에 의해 CNT 표면을 둘러싸는 것을 총칭하는 것으로 정의된다.

본 발명에서 사용되는 '바이오센서'란 용어는 바이오물질과 반응하는 리셉터가 CNT에 랩핑되어 있는 자기조립물질에 결합되어 있는 것을 포괄하는 개념으로, 상기 CNT에 랩핑되어 있는 자기조립물질에 결합되어 있는 바이오칩을 포함하는 것으로 정의된다.

또한 본 발명에서 사용되는 '바이오물질'이란 용어는 핵산, 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소기질, 리간드, 아미노산, 코펙터, 탄수화물, 지질, 올리고뉴클레오티드, RNA 등 생체로부터 유래한 물질을 총칭하는 것으로 정의된다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 바람직한 예에 따라, 정제된 SLP를 사용하여 싸이트레이트 완충용액 (citrate buffer, pH 4.0)에 부유된 CNT에 첨가하여 자기조립 반응을 수행하여 SLP로 랩핑된 CNT를 제조하였다 (도 3). 이 반응산물을 AFM 이미지를 통해서 확인하였다 (도 4, 도 5).

미생물로부터 정제된 SLP는 소수성 성질을 지니고 있는 다양한 기질상에 쉽게 자기조립하는 성질을 가지고 있다. 이런 성질을 이용하여 SLP로 랩핑되어 있는 수용성 CNT를 제조할 수 있다.

상기 제조된 SLP로 랩핑된 CNT에 표적 바이오물질과 반응하는 리셉터를 부착하는 방법은 종래의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 기질표면에 자기조립된 SLP를 글루타알데히드를 이용하여 cross-link시켜 human IgG를 고정시켜 샌드위치 immunoassay를 수행하였다 (Breitwieser et al., Biotechniques, 21:918-925, 1996; Gyorvary et al., Nano Lett., 3:315-319, 2003). 또한 유전자 재조합 기술을 이용하여 SLP의 N 말단에 스트렙타비딘을 융합시켜 발현한 다음, 자기조립 반응을 유도하여 바이오틴-아비딘 결합을 검사하는 방법(Moll et al., PNAS, 99:14646-14651, 2002)도 사용할 수 있다.

본 발명의 바이오센서를 이용하여 리셉터에 결합하는 표적 바이오물질을 검출하는 방법은 종래 알려진 여러 가지 방법을 이용할 수 있다.

바이오센서의 전기적 특성을 측정하는 프로브 스테이션과 바이오센서에서 발생되는 형광물질을 검출하는 형광 현미경을 이용하여 반응결과를 측정할 수 있다. 또한 반응물에 방사선동위원소를 부착시켜 반응 후 일정면에서 계측기를 이용하여 방사선을 측정할 수 있는 방법이 기존에 알려져 있다 (Petrou et al., Biosens. Bioelectron. 17:859-865, 2002).

상기 전기적 성질을 이용하여 액상에서 측정할 수 있는 방법으로 산화환원반응과 전하의 축적량을 이용하는 방법을 이용할 수도 있다. 산화환원반응은 현재 보 편화된 전기화학적 검출법으로 사이클릭 볼타메트리 (cyclic voltametry), 포텐티오메트리 (potentiometry), 암퍼로메트리 (amperometry) 등을 이용하여 수소나 전자의 변화를 측정할 수 있다.

또한 액상에서 바닥의 기판에 하전된 이온의 전하량을 측정하는 방법으로는 칩을 형성하는 상층기판에 전극을 형성하고, 상층기판의 전극이 대전되는 정도를 측정하여 CNT에 형성된 이온의 농도를 측정할 수도 있다. 여기서 전해질과 전류의 관계는 "전해질 수용액의 농도 ∝ 전류의 세기" 이다. 즉 CNT 표면에 생긴 반응물의 이온농도에 따른 전해질의 농도분포가 전류의 세기에 비례할 수 있으므로 아래쪽 기작에 형성된 이온의 농도를 측정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 자기조립물질로 SLP만을 예시하였으나, CNT 상에서 자기조립되어 수용성을 나타내는 것이라면, 제한없이 사용될 수 있으며, 또한, 이러한 자기조립물질을 혼합하여 사용하는 것도 가능하며, 이들 모두 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 SLP로 랩핑된 수용성 CNT만을 예시하고 있으나, 상기 SLP로 랩핑된 수용성 CNT상의 SLP에 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, RNA, PNA, 지질, 코펙터, 탄수화물 등의 리셉터를 고정하여 바이오센서를 제작 하고 이를 이용하여 상기 리셉터에 결합하는 표적 바이오물질 혹은 유기화합물을 용이하게 검출하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1. SLP의 제조

우선 나노 자기조립이 가능한 SLP를 효율적으로 생산할 수 있는 새로운 균주를 찾기 위하여 다양한 균주 (Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Geobacillus stearthermophilus, Bacillus stearthermophilus 등)에서 SLP의 생산 여부를 확인하였다. 여러 균주를 선택하여 배양한 후 SDS-PAGE에서 분석한 결과 SLP의 생산 효율이 제일 좋은 균주는 고온에서 배양이 가능한 Geobacilus stearothermophilus이었다.

SLP의 대량생산을 위해 Geobacillus stearthermophilus (KCTC 2107)를 발효조를 이용한 고농도 배양을 수행하였다. 생산 균주는 초고열성 그람 양성 박테리아로서 적절한 배양 온도가 55℃로 매우 높으며, 이런 hyperthermophilic한 균주의 경우 고농도 배양한 예가 없다. 고동도 배양은 R/2 배지를 이용하여 55℃에서 수행하였다. 500g/L glucose, 50g/L yeast extract, 15g/L MgSO₄·7H₂O의 조성을 가진 feeding 용액을 DO-stat 방식으로 공급하되 glucose에 의한 catabolic repression과 cell lysis를 막기 위하여 feeding시 glucose농도가 1g/L를 넘지 않도록 하였다. 약 65시간의 배양 후 세포 건조 중량은 약 10g/L를 나타내었으며 이와 같은 결과는 지금까지 고열성 세균을 가장 높은 농도로 키운 것이다. 이때 SLP의 생산 정 도를 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였으며, 전체 단백질의 약 30% 이상의 효율로 생산되었음을 확인하였다.

SLP를 분리하기 위하여 우선 french press (APV system, 영국)를 이용하여 세포를 완전히 파쇄한 후 0.5% Triton X-100으로 1 시간 동안 전 처리하였다. 이렇게 전 처리된 것을 5 M GuHCl에 녹여 4℃에서 2 시간 동안 SLP를 extraction 하였다. 초고속 원심분리기 (40,000g)를 이용하여 세포외막을 제거하였으며, 마지막으로 상등액을 투석 방법을 이용하여 순수한 SLP를 매우 효율적으로 분리하였다.

상기에서 얻은 SLP 함유 용액을 64 ㎕씩 취하여 SDS-PAGE 샘플 버퍼(25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올 및 0.1% 브로모페놀블루(bromophenol blue)를 포함한 60 mM Tris-HCl) 16 ㎕와 혼합하고 10 분간 끓인 다음, 이를 12% 분리용 겔 (separating gel)에서 SDS-PAGE 겔 전기영동하였다. 이어, 겔을 염색 용액 (메탄올 40%, 아세트산 10% 및 쿠마시에 브릴리언트 블루 R (coomassie brilliant blue R) 0.25g/L로 구성된 용액)에 2 시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액 (메탄올 40% 및 아세트산 7%로 구성된 용액)에 2시간 이상씩 두 번 담가두어 탈색하였다.

도 2에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량을 나타내며, 레인 1과 2는 상기과정을 통하여 정제된 SLP을 나타낸다. 도 2에서 보는 바와 같이, SLP가 매우 효율적으로 분리 정제되었음을 알 수 있다.

실시예 2. SLP로 랩핑된 CNT의 제조

본 발명에 사용된 탄소 나노튜브는 카보렉스사(CarboLex Inc.)로부터 CNT를 입수하여 분리·정제 하여 사용하였다 (Rao et al., Science, 275:187-191, 1997). 실시예 1에서 정제된 SLP를 20mM citrate 버퍼(pH 4.0)에 미리 부유시킨 CNT (100 μg)에 혼합하되, 상기 SLP의 최종농도가 1 mg/mL가 되도록 혼합한 다음, 상온에서 10시간 동안 방치하여 자기조립 반응을 유도하였다 (도 3). SLP는 소수성 성질을 지니고 있는 CNT상에서 자기조립하는 성질을 가지고 있어, 특별한 조건을 가하지 않고도 쉽게 SLP로 랩핑되어 있는 수용성 CNT를 제조할 수 있다.

반응이 끝난 후 SLP-CNT 반응 산물을 6000 rpm에서 5 분 동안 증류수로 3 번 세척한 후 20 ㎕ SLP-CNT 반응 산물을 실리콘 웨이퍼 (silicon wafer) 위에 떨어뜨린 후, 이 웨이퍼를 진공이 걸려있는 3000 rpm에서 30 초 동안 원심분리하였다.

실시예 3. SLP로 랩핑된 CNT의 확인

생물학적인 자가반응을 통해서 만들어진 SLP-CNT 반응산물은 다음과 같은 방법으로 이미지를 확인하였다.

사용한 원자탐침현미경 (Digital Instruments)은 태핑모드 (tapping mode) 운전하여 공기중에서 분석하였으며, 팁은 NanoProbe TESP를 사용하였다. 전형적으로 부드러운 시료 분석에서 접촉모드 (contact mode)의 적용이 어렵기 때문에 이를 극복하기 위해 태핑모드라고 명명된 기법이 사용되며, 시료와 탐침사이의 인력도 고려하여 이미지를 얻는 비접촉모드 (non-contact mode) 기법이 이용되기도 한다. 때에 따라 태핑모드를 다이나믹모드 (dynamic mode)라고 명명하기도 하며, 비접촉 모드와 다이나믹 모드를 모두 포함하여 비접촉 모드라고 부르기도 한다. 주파수는 240-280kHz이며 스캔속도 (scanning rate)는 1.97 Hz로 분석하였다.

도 4와 도 5는 AFM 분석을 통하여 SLP이 랩핑된 CNT의 결과를 보여주는 이미지이다. 스캔사이즈 (scan size)는 0.8 ㎛이며 스캔속도 (scan rate)는 0.7825 Hz이다. 약 650 nm 길이를 가진 CNT를 랩핑(wrapping)하고 있는 SLP가 CNT를 피복하는 형상으로 이미지화되고 있음을 보여주고 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 자기조립물질로 랩핑된 수용성 CNT 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른, 자기조립물질로 랩핑된 탄소나노튜브는 수용성 성질을 나타내므로 일반 탄소나노튜브와 비교하여 월등히 우수한 응용성을 가지게 된다.

특히, 상기 수용성 CNT에 랩핑된 자기조립물질에 다양한 리셉터를 부착한 바이오센서의 제작이 가능하여 이를 이용하여 상기 리셉터에 결합하는 표적 바이오물 질 혹은 유기화합물을 용이하게 검출할 수 있다.

Claims

자기조립물질과 CNT를 혼합한 다음, 상기 자기조립물질이 CNT 상에서 자기조립되도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자기조립물질로 랩핑된 수용성 CNT의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 자기조립물질은 SLP(surface layer protein) 또는 SLP 서브유닛인 것을 특징으로 하는 수용성 CNT의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 SLP(surface layer protein)는 Acetogenium kivui, Acetogenium kivui, Aeromonas salmonicida, Azotobacter vinelandii, Bacillus brevis, Bacillus polymyxa, Bacillus sphaericus, Caulobacter crescentus, Clostridium aceticum, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermosaccharolyticum, Comamonas acidovorans, Comamonas acidovorans, Delftia acidovorans, Deinococcus radiodurans, Phormidium uncinatum, Sporosarcina ureae, Thermoanaerobacter kivui, Thermoanaerobacter thermoydrosulfuricus, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 및 Clostridium thermosaccharolyticum로 구성된 군에서 선택되는 박테리아 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 SLP(surface layer protein)는 Acidianus (Sulfolobus) brierleyi, Archaeoglobus fulgidus, Desulfurococcus mobilis, Desulfurolobus ambivalens, Halobacterium halobium (salinarum), Halobacterium volcanii, Hyperthermus botylicus, Methanoplanus limicola, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum organotrophum, Pyrodictium brockii, Pyrodictium occultum, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Staphylothermus marinus, Thermococcus celer 및 Thermoproteus tenax로 구성된 군에서 선택되는 아키 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 SLP(surface layer protein)는 Geobacillus stearothermophilus 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법에 의해 제조되고, 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 CNT.
제2항의 방법에 의해 제조되고, SLP 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 수용성 CNT.
제6항의 자기조립물질로 랩핑되어 있는 수용성 CNT의 자기조립물질에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터를 부착시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항의 SLP(surface layer protein) 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 수용성 CNT의 SLP 또는 SLP 서브유닛에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터를 부착시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항의 방법에 의해 제조되고, 자기조립물질로 랩핑되어 있는 CNT의 자기조립물질에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제12항에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제10항의 방법에 의해 제조되고, SLP(surface layer protein) 또는 SLP 서브유닛으로 랩핑되어 있는 CNT의 SLP 또는 SLP 서브유닛에 표적 바이오물질 혹은 유기화합물과 반응하는 리셉터가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제14항에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 리셉터에 결합하는 표적 바이오물질 혹은 유기화합물을 검출하는 방법.
제16항에 있어서, 검출은 전기화학적 신호를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 표적 바이오물질 혹은 유기화합물은 단백질, 핵산, 효소, 항체, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 하는 방법.