KR100459638B1 - 재조합파아지 - Google Patents
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Abstract
본원 발명은 박테리아 감염, 특히 헬리코박터 필로리(Helicobacter phlori)와 같은 점성 박테리아 감염의 치료 또는 예방에 이용되는 박테리오파아지에 관계한다. 특히, 이는 M13과 같은 변형된 선상 박테리오파아지에 관계하고, 박테리오파아지의 표면에 있는 재조합 단백질은 (1) 박테리오파아지 표면 단백질로부터 유도한 제 1 성분; 그리고 (2) 박테리아 항원 결합 부위를 제공하기 위해 항체의 가변 부분 서열로 구성된 제 2 성분, 이때 제 2 성분은 박테리오파아지가 감염의 원인이 되는 박테리아 세포에 결합하여 박테리아 세포의 성장을 방해한다.
Description
본 발명은 박테리아 감염 특히 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염과 같은 점성 박테리아 감염을 치료하는데 유용한 박테리오파아지에 관계한다.
박테리오파아지와 항생제 저항성
의학 및 환경적으로 중요성이 증가하면서 항생제에 대한 저항성이 전세계적인 문제가 되었다. 따라서, 이와 같은 항생제 저항성을 교묘히 빠져나갈 박테리아를 근절하는 또 다른 방법이 절실히 요구된다.
박테리오파아지 또는 파이지는 특이적으로 박테리아를 감염시키는 바이러스이다. 파아지는 이들의 숙주 박테리아에 결합하여 다양한 파아지 단백질을 인코드하는 유전자를 전달한다. 파아지들은 이들의 복제를 위해 숙주 박테리아가 제공하는 단백질합성 기작, 아미노산 및 에너지를 이용한다(Maloy et al.,(eds); Microbial genetics, Jones and Bartlett Publishers, 1994).
대부분의 파아지는 다른 메커니즘으로 특정 균주 박테리아를 용균시키거나 파괴한다. 본 발명은 파아지의 유전적 변형 특히, 선상(filamentous) 박테리오파아지의 유전적 변형으로 특정 박테리아 가령 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)을 제거할 수 있고 항생제 저항성과 연관된 문제점을 극복할 수 있는 능력을 가지는 신규한 박테리아-특이적인 파아지를 고안하는 수단을 제공한다.
선상(filamentous) 박테리오파아지
털과 같은 F-선모(pili)를 가지는 대장균(E. coli) 세포는 M13, fd, f1와 같은 선상 파아지의 숙주이다. 이들 Ff(F pili, 선상) 파이지는 서열과 그 성질에 있어서 거의 동일하다(Rashed & Oberer(1986) Microbilogical reviews 50, 401-427; Kornberg & Baker in DNA Replication, p.557-570, W.H. Freeman and Co., New York 1992). 박테리아성 파아지에 속하는 Ff 파아지는 용균성 감염을 할 수 없고 감염된 숙주세포가 용균과정없이 파아지 입자를 생산하여 분비하는 단계를 유도한다.
파아지 M13의 단일 가닥 게놈은 10가지 상이한 단백질을 인코드한다. DNA는 유전자 8 단백질(g8p) 2700 복사체로 구성된 단백질 코오트안에 있다. 살아있는 M13 파아지 또한 그의 단부에서 43kDa 유전자 3 단백질(g3p) 5개 복사체를 발현하는데 이때, 단백질은 대장균(E. coli) 선모에 흡착하는 역할을 한다. 유전자 3 단백질은 폴리펩티드 사슬의 C-단부를 통하여 바이러스 코오트에 고정하나, 반면에 N-단부 구형 도메인은 노출되어 숙주 F 선모의 끝에 부착되는 것을 중개한다. 전자 현미경으로 관찰하면, 흡착 복합체는 파아지의 한 단부에서 "줄기에 있는 매듭(knob-on-stem)"형 구조로 나타난다. 감염하는 동안에 g3p와 g8p 리더 서열은 박테리아 세포의 내측 막으로 이들 단백질을 수송하는데 관여한다.
Ff 파아지는 패키지해야할 DNA 길이를 제한하는 물리적인 제한이 없고, 이들은 단일 가닥 DNA를 용이하게 정제할 수 있기 때문에 흔히 사용되는 것이다. 파아지미드(phagemid)는 M13(단일 가닥)과 플라스미드(이중가닥)의 복제 원점을 가지는 벡터이다. 파아지미드는 플라스미드와 같이 생장시키거나 또는 M13K07와 같은 헬퍼 파아지의 도움을 받아 재조합 M13 파아지로 패키지 할 수 있다(Veira & Messing(1987) Methods in Enxymol.153,3-11).
재조합 항체 생산
항체 분자에는 재조합 기술에 의해 만들어지거나 또는 프로테아제 절단에 의해 분리될 수 있는 이산(離散) 단편을 포함한다. 이와 같은 단편 중에 하나는 Fv(가변성 단편)으로 항체의 VL과 VH 부분만 포함하는 것이다. 미국 특허 4,946,778에서는 단일 사슬 Fv(ScFv)라고 지정된 재조합 Fv 단편에 대해 상술하고 있는데 이때, 두 가지 가변 부분은 중성 링커에 인공적으로 결합시켜 단일 폴리펩티드 사슬로 발현시킨다.
재조합 항체를 생산하는 기술은 McCafferty and coworks(McCafferty(1990)NAture 348, 552-554; Winter & Milstein(1991) Nature 349, 293)에 의해 개발되었다. 이 방법은 파아지-디스플레이 시스템에 의존하는데 이때, VH(가변 중사슬)와 VL(가변 경사슬)을 파아지 벡터에 클론시키고, 그 다음 항체 단편은 파아지 표면에 나타나는 융합 단백질로 발현된다. 이 방법에서, 항체의 특이성과 친화성을 이용하여 집단에서 선별할 수 있다. 원핵생물 시스템에서 분리되고 제조된 항체는 "콜리클론성(coliclonal)"항제로 부른다(Chiswell & McCafferty(1992) Trends in Biotechnology 10, 80-84).
시판되는 파아지미드 pCANTAB5는 항체의 가변 부위 유전자가 M13 유전자 3의 리더 서열과 주요 몸체사이에 클론되도록 만든 것이다. g3p 리더 서열은 생성된 융합 단백질을 대장균(E. coli)의 내막 또는 주변세포질로 수송하는데 관여하는데 주요 g3p 도메인은 조립된 파아지의 단부에 융합 단백질을 부착시킨다. 항체-g3p 유전자의 발현은 파아지미드에 있는 유도성 lac 프로모터의 조절을 받는다.
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염
보고에 따르면 박테리아 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 위궤양과 십이지장 궤양의 각각 84%와 95%는 이로 인한 것이라는 것이 일반적으로 수용하는 견해이다(Kuipers, E.L. et al(1995) Aliment. Pharmacol. Ther. 9(suppl.2), 59-69). 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 위벽에 콜로니를 형성하여, 위벽에 있는 점성층과 유기체가 산을 중화시키는 암모니아를 분비하는 대사 공정으로 산성 환경으로부터 보호를 받는다.
통상적인 항생제 치료로는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 거의 영향을 주지 못하는 것으로 나타나는데 그 이유는 (1) 순환 혈액에 직접적으로 노출되지 않는 유기체에 항균제의 접근성이 나쁘고; (2) 위장의 산성 조건에 이와 같은 항생제의 분해 또는 위장을 통하여 많은 경구 항생제의 신속한 통과등이 된다.
발명의 목적
본원 발명의 목적은 박테리아의 제거 특히, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)와 같은 점성 박테리아 감염을 일으키는 박테리아를 제거하기 위한 새로운 형태의 치료 형을 제공하는 것이다. 특히, 치료 시에 사용할 수 있는 또 다른 박테리아 숙주에 대한 결합 특이성을 가지도록 유전공학적으로 변형된 선상 박테리오 파아지를 제공한다.
재조합 파아지를 이용한 점성 박테리아성 감염을 치료하는 방법은 다음과 같은 몇 가지 이유에서 통상적인 항생제 치료보다는 우수하다고 본다;
▶통상적인 항생제에 저항성이 있는 박테리아를 제거할 수 있고;
▶특정 박테리아 종에 대해 재조합 파아지의 높은 특이성;
▶파아지의 증식이 자체 제한되고;
▶헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염의 경우에, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 이동성은 위장 점막의 모든 부분에 파아지가 분포할 수 있도록 돕는다.
본 명세서와 실시예에서, "표준 과정" 및 "표준 프로토콜"은 Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.와 같은 일반적인 실험서에서 볼 수 있는 프로토콜과 공정으로 간주하면 된다.
제 1 측면에서, 본원 발명은 박테리아성 감염의 치료 및 예방에 이용할 수 있는 변형된 박테리오파아지를 제공하는데 이때, 박테리오파아지의 표면에는 다음과 같은 것으로 구성된 재조합 단백질이 있는데;
(1) 박테리오파아지 표면 단백질로부터 유도한 제 1 성분; 그리고
(2) 박테리아 항원 결합 부위를 제공하기 위해 항체의 가변 부분 서열로 구성된 제 2 성분, 이때 제 2 성분은 박테리오파아지가 감염의 원인이 되는 박테리아 세포에 결합하여 박테리아 세포의 성장을 방해하도록 한다.
이와 같은 변형된 박테리오파아지는 변형된 M13 파아지와 같은 변형된 선상 파아지가 될 수 있다.
박테리아 감염은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)와 같은 점성 박테리아성 감염이 될 수 있다. 그러나, 본원 발명은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)를 무력화시키는 파아지에 제한시키지 않고, 광범위한 박테리아를 무력화시킬 수 있는 변형된 성질을 가지는 파아지로 구성된다. 본원 발명에 따르는 파아지는 임의 박테리아 종에 특이성이 있는 것으로 본 명세서를 기초로하여 당업자가 준비할 수 있는 것이다. 본원 발명에 따르는 파아지는 외부 세계에서 접할 수 있는 임의 점성 박테리아성 감염을 치료하는데 적합하다. 이와 같은 점성 상피의 예로는 비강, 폐, 위장관, 뇨 방광 및 질을 들 수 있다.
본원 발명에 따른 파아지로 치료할 수 있는 다른 박테리아성 감염을 예시하면 다음과 같다;
▶대장균(E. coli), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus sparophyticus), 클렙스엘라종(Klebsiella spp), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 뇨도관의 감염;
▶클라미디아(Clamydia)에 의한 질 감염;
▶스트렙토코커스(Streptoccus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 헤모필러스 인플루언스(Haemophilus influence), 뉴모코커스(Pneumococcus), 미코플라스마 뉴모닉(Mycoplasma pneumonic)에 의한 코/편도선/폐 감염;
▶살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 에르시니아(Yersinia), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 헬리코박터(Helicobacter), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 대장균(E. coli)에 의한 위장관 감염.
전술한 재조합 단백질의 제 1 성분은 박테리아성 선모에 상기 변형 안된 박테리오파아지의 흡착을 담당하는 단백질에서 유도할 수 있는데 가령, M13 파아지로부터 g3p 단백질이 된다.
전술한 재조합 단백질의 제 2 성분은 재조합 단일 사슬 Fv(ScFv) 폴리펩티드로 구성된다. 결과적으로, 상기 재조합 단백질은 g3p-ScFv 융합 단백질이 된다.
적절한 형으로는 본원 발명에 따르는 박테리오파아지는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염의 치료 또는 예방에 이용되는 박테리오파아지인데, 이때, 재조합 폴리펩티드의 항체 가변 부분 서열은 하이브리도마 세포주 5F8(ECACC No.95121524), 2H6(ECACC No.95121526), 5D8(ECACC No.95121527)의 단일 클론 항체의 가변 부분 서열이다.
따라서, 본원 발명의 박테리오파아지는 NCIMB에 기탁된 기탁번호 NCIME 40779인 변형된 M13 박테리오파아지 B8가 되거나 또는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 결합하여 감염될 수 있는 능력을 보유한 이의 유도체가 될 수 있다.
원하는 성질을 가지는 파아지는 다음의 방법중 하나를 이용하면 만들 수 있다;
(1)가변 항체 단편 다수를 발현시킬 수 있는 파아지를 포함하는 파아지 라이브러리 또는 자연 발생 파아지를 스크리닝한다. 파아지 라이브러리는 여러 개체의 면역 세포에서 구할 수 있다. 유전성 다양성이 방대하기 때문에, 이와 같은 상당한 파아지 라이브러리는 이미 개체에게 나타난 박테리아에 대한 원하는 특이적인 파아지로 구성된다.
(2) 기존 파아지에 돌연변이를 발생시킨다. 돌연변이는 파아지를 포함하는 모든 살아있는 유기체에서 발생한다. 화학적 수단 또는 단파장의 전자 방사에 의해 돌연변이 발생빈도는 증가될 수 있다.
(3) 천연 또는 재조합 파아지의 원하는 성질을 증가시키기 위해 파아지의 결합부위의 하나이상의 아미노산 변형 또는 다른 탄수화물 또는 지질 성분에 유전적 변형을 시킨다. 이와 같은 방법의 예시는 실험부분에서 상술한다. a)박테리아 세포에 대한 항체를 분리하고; b) 항체의 중사슬과 경사슬의 가변 부분을 인코드하는 DNA를 분리하고; c) 분리된 DNA를 파아지 DNA에 넣고 항체 부분이 파아지의 표면에서 발현되도록 하여 본원 발명에 따른 박테리오파아지를 만들 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원 발명은 제약학적 수용 가능한 담체 또는 부형제와 본원 발명의 박테리오파아지를 혼합하여 제약학적 조성물을 제공한다.
본원 발명에 따른 파아지를 투여하는 적절한 방법은 다음과 같다;
▶비강 및 폐에 투여하기 위한 분무;
▶위장 점막을 치료하기 위해 오메프라졸로 선 처리하고, 중탄산염 완충액에 현탁된 박테리오파아지로 치료한다;
▶위장 점막 및 질 점막에 이용하기 위해 점성-접착성 겔(가령, 셀룰로오즈겔, 폴리카르보필[polycarbophil], 폴록사머[poloxamer]등) 혼합물;
▶뇨도 방광에 이용하기 위한 중탄산 완충염.
당업자는 투여할 파아지의 수를 결정할 수 있다. 감염형태에 따라서 투여할 파아지의 수는 104 내지 1010범위가 된다.
또 다른 측면에서, 본원 발명은 본원 발명에 따르는 박테리오파아지 또는 제약학적 조성물을 투여하는 것으로 구성된 포유류에서 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 이와 같은 박테리아 감염은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염과 같은 점성 박테리아성 감염이 된다. 또한 본 발명에는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염과 같은 점성 박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 약물을 제조하는데 본원 발명에 따른 박테리오파아지를 이용하는 것에 관계한다.
또한 본 발명은 5F8(ECACC No.95121524), 2H6(ECACC No.95121526), 5D8(ECACC No.95121527)에서 선택된 하이브리도마 세포주 및 이들 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일 클론 항체 등을 제공한다. 면역처리된 동물에서 항체를 생산하는 B 세포는 골수 세포와 융합되고, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 하이브리도마 기술은 당업자에게 공지된 기술이다.
실시예 1; 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 대한 단일 클론 항체의 생산
1.1 항원 분비물
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주 17874, 25, 66, 253, 1139(Astra Hassle, Sweden에서 구함)는 8.5% 말 혈액, 10% 말 혈청, 1% 이소비탈렉스가 보충된 콜로비아 한천에서 Anaerocult C를 이용한 마이크로에어로빅 상태로 37℃에서 배양시킨다.
Ma J-Y et al.,(1994) Scand. J. Gastroenterol. 29, 961-965에 상술된 과정에 따라 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 표면 단백질을 준비한다. 간략하면, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 5개 균주 총 4g을 0.2M 글리신-HCl(pH 2.2) 100㎖서 실온상태에서 15분간 배양하였다. 1M NaOH를 이용하여 pH를 중성으로 조정한다. 항원 준비물은 4℃에서 10분간 10,000Xg로 원심 분리한다. 펠렛은 버리고 현탁액은 4℃에서 증류수에 하룻밤동안 투석시킨 다음 "헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원 준비물" 또는 "헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 표면 단백질"로 이용한다.
1.2. 단일 클론 항체의 생산
면역화 과정은 기본적으로 Cabero, J.L. et al.,(1992) Acta Physiol. Scand. 144, 369-378에서 상술하고 있는 것에 따라 실행한다. 간략하면, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 표면 단백질 2mg/㎖을 4℃에서 플루언트 컴플리트 어쥬번트 동량에 유상으로 만든다. 두 마리 암컷 DBA/1쥐의 뒷발에 50㎕ 항원 에멀젼을 주사한다. 면역 주사한 후 11일 뒤에, 슬와 임파구의 임파세포를 50%(w/w) PEG 4000을 이용하여 쥐 골수종 세포(sp2 주)와 융합시킨다. 세포 융합 현탁액을 5개 미량적정 플레이트에 나눈다. 모든 세포는 10% 태아 송아지 혈청과 50㎍/㎖ 젠타마이신을 포함하는 DMEM 배양 배지에서 생장시킨다.
1.3. 효소 연결된 면역흡착 시험(ELISA)
면역 플레이트는 항원(10㎍/㎖)을 포함하는 0.05M Na2CO3/NaHCO3 완충액 pH 9.8 50㎕로 세척한 다음 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. 자유 결합부위는 37℃에서 1시간동안 0.05% Tween-20(PBS-T)를 포함하는 PBS로 차단시킨다. 1차 항체 상충액을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양시킨다. 2차 항체로는 염소 항-쥐 IgG 퍼옥시다제 공액체를 이용한다. 결합된 퍼옥시다제는 0.04%(w/v) OPD와 14mM 과산화수소/0.1M 시트르산/0.2M NaHPO4, pH 5로 검사한다. 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 492nm에서 플레이트를 판독한다. 각 배양마다 3회 PBS-T로 세척한다.
1.4. 초기 스크리닝
임파구 세포와 골수종 세포의 융합으로부터, ELISA에 의해 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 표면 단백질에 대해 45개 하이브리도마 클론이 양성으로 나타났다. 이들중 8개는 면역조직화학에 의한 플레이트 배양물로부터 취한 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)를 뚜렷하게 착색시켰다. 5F8(ECACC No.95121524), 2H6(ECACC No.95121526), 5D8(ECACC No.95121527)로 지정된 하이브리돔 클론은 다른 박테리아보다는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 더 강한 작용을 하였고 이들을 추가 연구에 사용하였다.
실시예 2: 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 대한 재조합 M13 파이지 생산
2.1. 재료
Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)에서 QuicjPreP mRNA 정제 키트TM, 쥐 ScFv 묘듈 키트TM, 발현 모듈 키트TM, , SfiI, NotI, T4 DNA 리게이즈, 항-M13 양 항체를 구하였다. Perkin Elmer에서 dNTPs 혼합물, 10XPCR 완충액, AmpliTaq DNA 중합효소를 구입하였다. Bacto-yeast 추출물, Bacto-tryptone, Bacto agar는 Difco Laboratories(Detroit, Mi chigan USA)에서 구입하였다. Department of Microbiology(Linkoping University, Sweden)에서 콜롬비아 한천 플레이트와 브루셀라 브로스(brucella broth)를 구입하였다. Merck(Germany)에서 AnaerocultR C를 구하였다. Molecular Probe Inc.(U.S.A)에서 SlowFadeTM antifade kit를 구하였다.
2.2. 파아지 항체 라이브러리 작제
재조합 파아지 항체 시스템TM(Pharmacia)를 이용하여 파아지 표면에 나타나는 융합 단백질로써 항체 단편을 발현시켰다.
하이브리도마 세포주(2H6, 5D8, 5F8)에서 전체 mRNA를 분리하여 QuickPrep mRNA Purification KitTM(Pharmacia)를 이용하여 올리고(dT)-셀룰로오즈에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
쥐 ScFv 모듈 키트TM을 이용하여 다음 단계를 실행하였다;
▶쥐 ScFv 모듈 키트TM에서 제공하는 역 전사효소와 프라이머(primer)를 이용하여 하이브리도마 mRNA에서 제 1 가닥 cDNA를 합성하였다.
▶mAb의 중사슬과 경사슬의 가변 부분에 상응하는 cDNA는 중합효소 사슬반응(PCR)을 이용하여 여러 프라이머(키트에 있는 VH, VL 프라이머)를 이용하여 증폭시칸다. VH와 VL 사슬은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분석한다. VH(340bp)와 VL(325bp)에 대해 정확한 크기의 단일 밴드를 얻었다.
▶증폭된 VH와 VL 사슬은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리 정제하였고 코트에서 제공하는 DNA 링커 단편을 이용하여 단일 사슬 Fv(ScFv) 유전자로 합체한다. 링커 단편은 한 단부가 중사슬의 3'단부에 어닐(anneal)되고, 다른 단부는 경사슬의 5'단부에 하이브리드되도록 작제된다. 전기영동후에 ScFv 유전자(750bp)에 대한 정확한 크기의 단일 밴드를 볼 수 있다.
▶합체된 항체 ScFv DNA 단편은 NotI와 SfiI 제한효소절단부위를 제공하는 올리고뉴클레오티드 프라이머(키트에서 제공)로 증폭시킨다. 단편은 링커, dNTPs, Taq DNA 중합효소를 제거하기 위해 스펀 칼럼(키트에서 제공)에서 정제한다. ScFv 단편은 NotI와 SfiI으로 절단하여 pCANTAB5 벡터에 결찰시키기 위한 코헤시트 단부를 만든다.
발현 모듈 키트TM을 이용하여 다음의 단계를 실행한다:
▶미리 NotI와 SfiI으로 절단한 파아지미드 벡터 pCANTAB5(키트에서 제공)에 ScFv 단편을 결찰시켜 코헤시브 엔드를 만든다. T4 DNA 리게이즈를 이용하여 파아지미드의 상응하는 단부에 단편의 단부를 결합시킨다. ScFv 단편은 ScFv-g3p 융합 단백질을 발현시키기 위해 적절한 방향을 가지면서 M13 유전자 3과 같은 틀에서 인접한다.
▶대장균(E. coli) TG1 세포(키트에서 제공)는 감응세포(수용능력을 가진 세포)로 만들어 lac 프로모터와 암피실린 저항성 표식을 가지는 재조합 파아지미드로 형질변화시킨다. 형질전환된 세포는 포도당과 암피실린을 포함하는 배지에서 30℃에서 생장시킨다. 3.2×104 ScFv 클론을 얻는다. 암피실린 저항성 콜로니는 긁어내 배지로 옮겨 라이브러리 원액을 만든다.
▶임파실린 저항성 세포는 카나마이신 저항성 표식을 가지는 헬퍼 파아지 M13K07(키트에서 제공)로 감염시키고 암피실린과 카나마이신을 포함하는 포도당이 부족한 배지에서 생장시킨다. 포도당이 없으면, 파아지미드에 있는 lac 프로모터는 더 이상 억제를 받지 않는다. 이들의 단부에서는 재조합 항체 단편을 나타내는 파아지 입자를 만들고 세포로부터 이들을 방출한다.
▶헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원에 결합할 수 있는 항체를 가지는 파아지는 항원에 대해 스크니링하여 선별한다. 배양 플라스크는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 표면 단백질(50mM 중탄산 나트륨 완충액 pH 9.6에 15㎍/㎖) 5㎖로 피복시킨다. PBS로 3회 세척한 후에, PBS에 1% BSA(w/v) 10㎖을 포함하는 플라스크를 1시간동안 37℃에서 배양시켰다. PBS로 3회 세척한 후에, 플라스크는 2시간동안 37℃에서 파아지 상청액(파아지를 포함하는 배지)으로 배양시켰다. 플라스크는 0.1%(w/v) Tween-20을 포함하는 PBS로 20회 세척하고 PBS로 20회 세척한다. 결합된 파아지 입자는 10분간 부드럽게 흔들면서 100mM 트리에틸아민 1㎖을 첨가하여 용출시키고 즉시 1M 트리스-HCl, pH 7.4로 중화시킨다.
용출된 파아지를 이용하여 2% Bacto-tryptone, 0.5% Bacto-yeast 추출물, 0.05% NaCl, 0.01M MgCl2, 0.01% 포도당, 0.01% 암피시린을 포함하는 SOBAG 한천에서 로그(log) 상태의 대장균 (E.coli) TG1 세포에 감염시켰다. 콜로니를 선별하고, 옮기고, 배양하여 M13K07로 빼낸다.
100개 클론을 카운트하여 선별 제 1 단계 후에, 미량적정 플레이트 구제에서 클론의 6%는 ELISA에서 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 준비물에 대해 양성으로 나타났다. 미량적정 플레이트 구제로부터 선별 제 3 라운드에서는 개별 클론의 파아지 항체의 95%가 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원과 반응하였다.
항원으로써 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 준비물을 이용하여 파아지 ELISA에서 재조합 파아지 B8은 헬퍼 파아지(wide phage)보다 약 10배정도 역가가 더 높은 것으로 나타났다. 파아지 B8(NCIMB No.40779)는 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예 3 ; ELISA
재조합 항체를 나타내는 파아지는 Dection Module KitTM을 이용하여 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)에서 감지하고 확인한다.
96-웰 미량 적정 플레이트는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원(10㎍/㎖ 50mM Na2CO3/NaHCO3, pH 9.6) 200㎕로 피복시키고 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. 웰은 3회 동안 0.05% Tween 20(PBS-T)를 포함하는 PBS로 세척하고 37℃에서 1시간동안 1% BSA를 포함하는 PBS 300㎕로 차단시킨다. 재조합 파아지 항체는 동량의 1% BSA/PBS로 희석시키고 실온에서 20분간 배양하였다. 세척한 후에, 5×1010 파아지 형질도입 단위를 첨가하고(웰당 200㎕), 37℃에서 2시간동안 배양시켰다.
웰은 PBS-T로 3회 세척하고, 그 다음 Dection Module Kit에서 공급하는 HRP/항-M13 공액물을 1% BSA/PBS에 1:5000으로 희석시켜 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 웰은 PBS-T로 3회 세척시키고, 2'2;-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산) 디암모니움(ABTS)와 H2O2를 퍼옥시다제 기질로 첨가하고 30분간 실온에서 배양하였다. 컴퓨터화된 ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡수도를 읽는다. 기준 항원으로 오브알부민(10㎍/㎖ PBS)을 이용한다. 헬퍼 파아지는 음성 기준으로 이용한다. 결과는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원에 재조합 파아지 B8이 특이적으로 결합한다는 것을 증명하였다.
실시예 4: 이뮤노블랏팅
SDS-PAGE(10㎍ 단백질/웰)에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 항원 준비물의 단백질을 분리하였고, 미니트란스-블랏 일렉트로포레트 전달 세포(BioRad, Richmond, CA, USA)에서 니트로셀룰로오즈 종이에 옮긴다. 니트로셀룰로오즈 종이는 부드럽게 흔들면서 실온에서 1시간동안 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS에서 10% BSA로 차단시킨다. 파아지 B8(1011 트란스듀스 단위/㎖)를 첨가하고 4℃에서 부드럽게 흔들면서 하룻밤동안 니트로셀룰로오즈 종이에 함께 배양하였다. 1차 항체가 없는 것을 음성 기준으로 이용한다. PBS-0.1% Tween 20으로 세척한 후에, 니트로셀룰로오즈 종이는 HRP/항-M13 공액체(차단 완충액으로 1:5000으로 희석함)와 1시간동안 교반하면서 배양하였다. ECL Dection Kit(Amersham, UK)를 이용하여 결합을 감지한다.
아미노 블랙으로 니트로셀룰로오즈 종이를 착색한 후에, 주용 밴드는 64kDa, 36kDa, 31kDa, 27kDa에 상응하였다. 모인 항체(파아지 작제에 사용된 하이브리도마에 상응하는 2H6, 5D8, 5F8)는 32kDa, 64kDa 밴드에 반응한다. 파아지 항체 B8과 면역블랏팅하여 유사한 착색을 얻는다. 이 결과에서 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 특정 단일클론 항체에 상응하는 가변 중사슬과 경사슬의 유전자는 정확하게 파아지에서 발현되었음을 나타낸다.
실시예 5: 박테리아에서 재조합 파아지의 영향
다음의 실험은 10% CO2와 5% O2를 포함하는 대기에서 5% 태아 송아지 혈청을 가지는 Brucella broth에서 37℃ 상태로 박테리아를 배양하였다.
박테리아 원액 20㎕를 10㎖ 브로스와 혼합하는 것으로 실험은 시작된다("0시간"). PBS에 배양물 한 방울씩을 희석하고 한천 플레이트에 희석액을 도말하여 지정된 시간에 배양물 ㎖당 CFU(콜로니 형성 단위)를 결정한다. 플레이트는 37℃에서 2시간동안 배양하고, 각 플레이트에 콜로니 수를 헤아린다.
5.1. 시간에 따른 효과
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주 17874의 생장에 재조합 파아지 B8의 시간에 대한 효과를 파아지 유무 하에 3일간 CFU를 측정(표 1)하였다. 106 파아지를 0시간에 10㎖ 배지에 첨가("+Phage")하였다. 기준("-Phage")에는 파아지를 첨가하지 않는다.
3일 후에, CFU는 재조합 파아지 없는 경우와 비교하면 약 5배 정도가 증가되었다. 파아지 존재 하에 약 1일 뒤에, 그 정도는 약 1배 정도로 CFU가 감소되고 브로스 배양물은 탁한 용액에서 탁도가 감소된 용액으로 변화되었다.
5.2. 다양한 박테리아 균주에 영향
24시간동안 파아지 없이 또는 파아지 존재 하에 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주 17874, 1139, 244와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 29213, 대장균(E. coli) TG1을 배양시켰다. 0시간과 24시간에 CFU를 분석하였다(표 2). 재조합 파아지는 테스트한 세 가지 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주의 CFU를 감소시켰으나, 스타필로코커스(Staphyloccus) 또는 대장균(E. coli)에는 영향을 주지 않았고, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 17874는 기준으로 이용된 헬퍼 파아지 M13K07에 의해서는 영향을 받지 않았다.
5.3. 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균중 대한 영향
제 2 실험에서(표 3), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 17874, 1139, 253, 66을 스트렙토코커스(Streptoccus Raf M87)와 함께 테스트하였다. 파아지가 없는 경우에, 테스트한 모든 박테리아에서 24시간 배양하는 동안에 CFU가 증가되었다. 그러나, 재조합 파아지와 함께 배양하는 경우에(0시간에 10㎖ 배지에 106 파아지를 첨가함) 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주 17874, 1139, 25의 CFU는 감소되었고 균주 253과 66의 생장 속도는 기준과 비교하였을 때 상당히 감소되었다. 따라서, 테스트한 모든 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 파아지에 영향을 받았다.
실시예 6: 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 면역형광 착색
파아지 항체 B8은 PEG 준비에 의해 농축시키고 배양물에서 취한 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)(l7874 균주)에서 면역형광 착색을 실행하였다.
면역형광 착색을 실행하기 위해 다음의 원액 시약을 이용하였다:
시약 A; 1012 형질도입 단위/파아지 항체(㎖)를 1% BSA/PBS로 1:1로 착색하였다.
시약 B; 1% BSA/PBS로 희석된 양 항-M13 IgG
시약 C; 1% BSA/PBS로 1:100으로 희석된 항-양 IgFITC 공액체
시약 D; PBS에 프로네이즈 1mg(w/v)
배양후 3일 뒤에, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 5가지 종, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 29213, 스트렙토코커스(Streptococcus Raf M87)를 1% BSA를 포함하는 PBS에 각각 현탁시켰다. 각 박테리아 현탁액 20㎕를 유리 슬라이드에 첨가한다. 박테리아는 공기 건조시키고 2분간 중성 포르말린에 고정시킨 다음 슬라이드는 물에 6회 담구어 세척시키고 실온에서 공기 건조시킨다. 시약 D로 간단히 처리하면 시그날:노이즈의 비율이 기준과 비교하였을 때 증가된다. 슬라이드는 30㎕ 시약 A, B, C로 각 30분간 배양하고 배양사이에 PBS로 세척한다. 슬라이드는 공기 건조시키고, 덮기전에 SlowFade를 한방울 떨어뜨린다. 모든 배양은 실온에서 실행한다. 음성 기준은 1차 항체를 생략한 것이다.
결과에서 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 파아지 항체에 양성으로 착색된다는 것을 알 수 있다. 결과에서 배양 실험으로부터 얻은 CFU 값이 일치한다. 따라서, 박테리아 표면에서 특정 항원의 발현은 파아지 B8에 의한 생물학적 영행을 주는데 필수적인 것으로 보인다.
생물학적 물질의 기탁
다음의 하이브리도마 클론은 부다페스트 조약에 준하여 Eurepean Collection of Animal Cell Culture(ECACC), Salisbury, Wiltshire, U.K.에 1995년 12월 15일자로 기탁되었다;
2H6(ECACC No.95121526) ; 5D8(ECACC No.95121527) ; 5F8(ECACC No.95121524).
재조합 파아지 B8은 부다페스트 조약에 준하여 National Collections of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB), Aberdeen, Scotland에 1995년 12월 20일자로 기탁되었고, 기탁번호가 NCIMB 40779이다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
Claims (4)
- 헬리코박터 필로리(Helicobacter phloris)에 의한 점성 박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 이용되는, 다음으로 구성된 재조합 단백질이 있는 M13 박테리오파아지인, 변형된 박테리오파아지;(i) 박테리오파아지 표면 단백질로부터 유도한 제 1성분; 그리고(ii) 박테리아 항원 결합 부위를 제공하기 위해 항체의 가변 부분 서열로 구성된 제 2성분, 이 때 상기 제 2성분은 상기 박테리오파아지가 상기 감염의 원인이 되는 박테리아 세포에 결합하여 박테리아의 세포 성장을 방해하도록 하며,여기서, 상기 재조합 단백질의 제 1성분은 g3p 단백질에서 유도된, 변형 안된 형태의 상기 박테리오파아지가 박테리아 선모에 흡착할 수 있도록 하는 단백질에서 유도되며; 상기 재조합 단백질의 제 2성분은 g3p-ScFv 융합 단백질 형태의 ScFv 폴리펩티드를 포함하고, 상기 재조합 폴리펩티드의 항체 가변 부위 서열은 하이브리도마 세포 주 5F8 (ECACC No. 95121524), 2H6 (ECACC No. 95121526) 그리고 5D8 (ECACC No. 95121527)에서 만들어 지는 단일 항체에서 선택된 단일 클론 항체의 가변 부분임.
- 제 1항에 있어서, NCIMB에 기탁되어 기탁번호가 NCIMB 40779인 B8로 지정된 변형된 박테리오파아지.
- 하이브리도마 세포주 5F8 (ECACC No. 95121524), 2H6 (ECACC No. 95121526) 그리고 5D8 (ECACC No. 95121527).
- 제 3항에 따른 하이브리도마에서 생산되는 단일클론 항체에서 선택된 단일클론 항체.
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