ES2221033T3

ES2221033T3 - Fagos recombinantes.

Info

Publication number: ES2221033T3
Application number: ES97902815T
Authority: ES
Inventors: Sven Mardh
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-06
Filing date: 1997-02-05
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2017-02-05
Also published as: AU712767B2; WO1997029185A1; NO983456L; KR19990082041A; EP0889955B1; SE506771C2; CA2244792A1; JP4015195B2; NO323359B1; CN1125174C; IL125645A0; EP0889955A1; AU1681797A; DE69728975D1; DE69728975T2; NO983456D0; NZ331580A; ATE266091T1; KR100459638B1; HUP9901242A2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A BACTERIOFAGOS PARA UTILIZACION EN EL TRATAMIENTO O PROFILAXIS DE INFECCIONES BACTERIANAS, ESPECIALMENTE DE INFECCIONES BACTERIANAS DE LA MUCOSA, COMO LAS PRODUCIDAS POR HELICOBACTER PYLORII. CONCRETAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A BACTERIOFAGOS FILAMENTOSOS MODIFICADOS PARA DICHO USO, P. EJ. FAGOS M13, QUE PRESENTAN EN SU SUPERFICIE UNA PROTEINA RECOMBINANTE QUE COMPRENDE: (I) UN PRIMER COMPONENTE DERIVADO DE UNA PROTEINA SUPERFICIAL DEL BACTERIOFAGO; Y (II) UN SEGUNDO COMPONENTE QUE COMPRENDE SECUENCIAS DE LA REGION VARIABLE DE UN ANTICUERPO QUE PROPORCIONAN UN SITIO DE UNION DEL ANTIGENO, DE FORMA QUE DICHO SEGUNDO COMPONENTE HACE QUE DICHO BACTERIOFAGO SEA CAPAZ DE UNIRSE A, Y POR TANTO INHIBIR EL CRECIMIENTO DE, CELULAS BACTERIANAS IMPLICADAS EN LA ETIOLOGIA DE DICHAS INFECCIONES.

Description

Fagos recombinantes.

Campo técnico

Esta invención se refiere a bacteriófagos útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas, especialmente de infecciones bacterianas mucosales tales como las infecciones por Helicobacter pylori.

Antecedentes Bacteriófagos y resistencia a antibióticos

La resistencia a antibióticos es un problema global de importancia médica y económica creciente. Existe por tanto una gran necesidad de métodos alternativos para erradicar bacterias que eviten el problema de tal resistencia.

Un bacteriófago, o fago, es un virus que infecta específicamente bacterias. Los fagos se unen a su bacteria huésped y transfieren genes que codifican varias proteínas del fago. Utilizan la maquinaria para sintetizar proteínas, aminoácidos, etc., y la energía proporcionada por la bacteria huésped para su replicación (Maloy y col. (eds.): Microbial genetics. Jones and Bartlett Publishers, 1994).

La mayoría de los fagos lisan o destruyen por otros mecanismos cepas específicas de bacterias. La presente invención resulta de la comprensión de que la modificación genética de fagos, en particular de bacteriófagos filamentosos, ofrece un medio para diseñar nuevos fagos específicos de una bacteria capaces de erradicar ciertas bacterias, por ejemplo Helicobacter pylori, y que tienen potencial para resolver los problemas relacionados con la resistencia a antibióticos.

Fagos filamentosos

Células de E. coli portadoras de pili F similares a pelos son huéspedes para fagos filamentosos tales como M13, fd y f1. Estos fagos Ff (pili F, filamentosos) son casi idénticos en secuencia y en comportamiento (Rashed y Oberer (1986) Microbiological reviews 50, 401-427; Kornberg y Baker, en: DNA Replication, p. 557-570, WH. Freeman and Co., New York 1992). Los fagos Ff solos entre los virus bacterianos no producen una infección lítica, sino que en su lugar inducen un estado en el que las células huésped infectadas producen y secretan partículas de fago sin experimentar lisis.

El genoma de hebra sencilla del fago M13 codifica 10 proteínas diferentes. El ADN está encerrado en un revestimiento proteico formado por 2700 copias aproximadamente de la proteína del gen 8 (g8p). Un fago M13 viable expresa también cinco copias de la proteína del gen 3 (g3p) de 43 kDa en su extremo, proteína que es responsable de la adsorción a los pili de E. coli. La proteína del gen 3 está anclada al revestimiento del virus a través de la parte C-terminal de la cadena polipeptídica, mientras que el dominio globular N-terminal está expuesto y media la unión del fago al extremo de un pilus F del huésped. Por microscopía electrónica, el complejo de adsorción aparece como una estructura de "protuberancia sobre un tronco" en un extremo del fago. Durante la infección, las secuencias líder de g3p y g8p dirigen el transporte de estas proteínas hacia la membrana interna de la célula bacteriana.

Los fagos Ff han ganado popularidad como vectores de clonaje ya que no tienen restricciones físicas que limiten la longitud de ADN que puede ser empaquetado y debido a que permiten una purificación fácil de ADN de hebra sencilla. Un fagémido es un vector que lleva el origen de replicación de M13 (hebra sencilla) y de un plásmido (doble hebra). Los fagémidos pueden ser cultivados como plásmidos o empaquetados como fago M13 recombinante con la ayuda de un fago cooperador tal como M13K07 (Veira y Messing (1987) Methods in Enzymol. 153, 3-11).

Producción de anticuerpos recombinantes

Las moléculas de anticuerpo contienen fragmentos discretos que pueden ser aislados mediante digestión con proteasas o producidos mediante técnicas recombinantes. Uno de tales fragmentos es el Fv (fragmento variable), que está compuesto solamente por las regiones V_{L} y V_{H} del anticuerpo. En US 4.946.778 se describe una versión recombinante del fragmento Fv, denominada Fv de cadena sencilla (ScFv), en la que las dos regiones variables son unidas artificialmente con un adaptador neutro y expresadas como una única cadena polipeptídica.

Una tecnología para la producción de anticuerpos recombinantes ha sido desarrollada por McCafferty y colaboradores (McCafferty (1990) Nature 348, 552-554; Winter y Milstein (1991) Nature 349, 293). Este procedimiento se basa en un sistema de presentación de los fagos en el que los genes de V_{H} (variable pesada) y de V_{L} (variable ligera) son puestos en un fago vector en el que una vez que se han expresado los fragmentos de anticuerpo como proteínas de fusión se presentan en la superficie del fago. Con este método, pueden seleccionarse de una población anticuerpos con especificidad y afinidad definidas. Se ha sugerido que los anticuerpos aislados y producidos en sistemas procarióticos deberían ser denominados anticuerpos "coliclonales" (Chiswell y McCafferty (1992) Trends in Biotechnology 10, 80-84).

El fagémido pCANTAB5 comercialmente disponible está diseñado de tal forma que los genes de las regiones variables del anticuerpo pueden ser clonados entre la secuencia líder y el cuerpo principal del gen 3 de M13. La secuencia líder de g3p dirige el transporte de la proteína de fusión resultante hacia la membrana interna y/o el periplasma de E. coli, donde el dominio principal de g3p fija la proteína de fusión al extremo del fago que se está ensamblando. La expresión del gen de anticuerpo-g3p está controlada por un promotor lac inducible en el fagémido.

WO 92/01047 se refiere a un bacteriófago modificado en el que una secuencia variable de un anticuerpo es expresada en la superficie del bacteriófago en forma de una proteína de fusión con una proteína de superficie del bacteriófago. El documento describe también la utilización de tal bacteriófago en terapia génica. El documento describe además un bacteriófago filamentoso, por ejemplo M13, así como la inserción de una secuencia del anticuerpo, tal como ScFv, en la proteína g3p. El documento no discute ningún tratamiento de las infecciones por Helicobacter pylori.

WO 95/16027 se refiere a un método para seleccionar un bacteriófago específico, en particular para seleccionar una molécula tal como un anticuerpo, un antígeno, un péptido, una proteína o un fragmento de los mismos que está siendo expresada junto con una proteína de revestimiento del fago. El documento describe la utilización de MD delta3 y ligandos de M13 acoplados a la proteína 3 (g3p). El documento no discute ninguna terapia contra las infecciones por Helicobacter pylori.

Infección por Helicobacter pylori

Está aceptado de manera general que la bacteria Helicobacter pylori es la causa principal de la úlcera gástrica y duodenal, responsable del 84% y del 95%, respectivamente, de los casos informados (Kuipers, E.L. y col. (1995) Aliment. Pharmacol. Ther. 9 (suplemento 2), 59-69). H. pylori coloniza la pared del estómago, protegido del entorno ácido por una capa de mucus que tapiza la pared del estómago y por un proceso metabólico que permite al organismo secretar amonio para neutralizar el ácido.

El tratamiento convencional con antibióticos parece tener poco efecto sobre H. pylori. Esto es debido probablemente a: (i) un mal acceso del agente antimicrobiano al organismo que no está expuesto directamente a la circulación sanguínea; y (ii) un paso rápido de muchos antibióticos orales a través del estómago, o la degradación de tales antibióticos en las condiciones ácidas del estómago.

Finalidad de la invención

La finalidad de la presente invención es proporcionar nuevas formas de tratamiento para la erradicación de bacterias, especialmente para la erradicación de las bacterias responsables de infecciones bacterianas mucosales tales como Helicobacter pylori. En particular, proporciona bacteriófagos filamentosos modificados genéticamente para que tengan especificidad de unión hacia otro huésped bacteriano para utilización en terapia.

Se cree que los métodos de tratamiento de las infecciones bacterianas mucosales basados en fagos recombinantes son superiores al tratamiento convencional con antibióticos por varias razones, por ejemplo las siguientes:

\bullet: será posible erradicar las bacterias resistentes a los antibióticos convencionales;

\bullet: la elevada especificidad del fago recombinante hacia especies bacterianas específicas;

\bullet: la propagación del fago es autolimitante;

\bullet: en el caso de las infecciones por Helicobacter pylori, la motilidad de Helicobacter pylori podría ayudar a distribuir el fago a todas las partes de la mucosa gástrica.

Descripción de la invención

En la presente descripción y en los ejemplos, los términos "protocolos estándar" y "procedimientos estándar" debe ser entendidos como protocolos y procedimientos encontrados en un manual de laboratorio común tal como: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

En un primer aspecto, esta invención proporciona la utilización de un bacteriófago modificado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una infección bacteriana mucosal causada por Helicobacter pylori, en la que el bacteriófago modificado, que es un bacteriófago M13, presenta en su superficie una proteína recombinante que comprende:

(i): un primer componente derivado de una proteína de superficie del bacteriófago; y

(ii): un segundo componente que comprende secuencias variables de un anticuerpo para proporcionar un sitio de unión del antígeno bacteriano, haciendo dicho segundo componente que dicho bacteriófago sea capaz de unirse a, y de inhibir de este modo el crecimiento de, las células bacterianas implicadas en la etiología de dicha infección bacteriana,

según lo cual dicho primer componente de dicha proteína recombinante deriva de la proteína g3p responsable de la absorción de la forma no modificada de dicho bacteriófago a los pili bacterianos, dicho segundo componente de dicha proteína recombinante contiene un polipéptido ScFv en forma de una proteína de fusión g3p-ScFv, y las secuencias de la región variable de un anticuerpo de dicho polipéptido recombinante son secuencias de la región variable de un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridomas 5F8 (ECACC Nº 95121524), 2H6 (ECACC Nº 95121526) y 5D8 (ECACC Nº 95121527).

Dicho primer componente de la proteína recombinante anteriormente mencionada deriva de la proteína responsable de la adsorción de la forma no modificada de dicho bacteriófago a los pili bacterianos, la proteína g3p de un fago M13.

Dicho segundo componente de dicha proteína recombinante comprende un polipéptido Fv de cadena sencilla recombinante (ScFv). Por consiguiente, dicha proteína recombinante es una proteína de fusión g3p-ScFv.

El bacteriófago es un bacteriófago para ser utilizado en el tratamiento o en la profilaxis de la infección por Helicobacter pylori, en el que las secuencias de la región variable del anticuerpo de dicho polipéptido recombinante son secuencias de la región variable de un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridomas 5F8 (ECACC Nº 95121524), 2H6 (ECACC Nº 95121526) y 5D8 (ECACC Nº 95121527).

Por tanto, el bacteriófago es el bacteriófago M13 modificado denominado B8 depositado en la NCIMB bajo el número de acceso NCIMB 40779, o un derivado del mismo que conserve la capacidad para unirse e infectar a Helicobacter pylori.

Los fagos con las propiedades deseadas pueden ser obtenidos mediante por ejemplo uno de los métodos siguientes:

(a): La selección de fagos que existen en la naturaleza o de bibliotecas de fagos que contienen fagos que expresan una multitud de fragmentos de anticuerpos variables. Las bibliotecas de fagos pueden ser obtenidas, por ejemplo, de células inmunes de un gran número de individuos. Debido a la gran variabilidad genética, es probable que tales bibliotecas de fagos grandes contengan el fago específico deseado dirigido hacia bacterias a las que los individuos han sido expuestos previamente.

(b): El desarrollo de mutaciones en fagos existentes. En todos los organismos vivos, incluyendo los fagos, tienen lugar mutaciones. La frecuencia de mutaciones puede ser incrementada mediante, por ejemplo, medios químicos o por medio de una irradiación electromagnética de corta longitud de onda.

(c): La modificación genética dirigida de uno o más aminoácidos, u otras modificaciones de, por ejemplo, componentes carbohidratados o lipídicos de la región de unión del fago, con el fin de incrementar las propiedades deseadas del fago natural o recombinante. Un ejemplo de este método se describe posteriormente en la sección experimental. Un bacteriófago de acuerdo con la invención puede ser por tanto producido mediante un método que comprende (a) el aislamiento de un anticuerpo contra una célula bacteriana; (b) el aislamiento del ADN que codifica una región variable de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo; y (c) la introducción de dicho ADN en el ADN del fago de tal manera que dichas regiones del anticuerpo se expresen en la superficie del fago.

Ejemplos de medios adecuados para la administración de fagos de acuerdo con la invención incluyen:

\bullet: pulverización para aplicaciones nasales y pulmonares;

\bullet: el pretratamiento con omeprazol seguido por fagos suspendidos en tampones bicarbonato para el tratamiento de mucosas gastrointestinales;

\bullet: mezclas de geles mucoadhesivos (esto es, geles basados en celulosa, policarbofil, poloxamer, etc.) para la mucosa gástrica y para la mucosa vaginal;

\bullet: tampones bicarbonato para utilización en la vejiga urinaria.

El número de fagos a administrar puede ser determinado por una persona experta. Dependiendo del tipo de infección, el número de fagos a administrar puede variar de 10^{4} a 10^{10}.

La invención describe un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, que comprende la administración de un bacteriófago o de una composición farmacéutica. Dichas infecciones bacterianas pueden ser, por ejemplo, infecciones bacterianas mucosales tales como infecciones por Helicobacter pylori. Está también incluida en la invención la utilización de un bacteriófago según describe la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un infección bacteriana mucosal por Helicobacter pylori.

Aspectos adicionales de la invención son un hibridoma seleccionado de 5F8 (ECACC Nº 95121524), 2H6 (ECACC Nº 95121526) y 5D8 (ECACC Nº 95121527), así como un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales producidos por dichos hibridomas. La tecnología de hibridomas, en la que células B productoras de anticuerpos procedentes de animales inmunizados son fusionadas con células de mieloma y se seleccionan las líneas celulares de hibridomas resultantes que producen el anticuerpo deseado, es bien conocida en el oficio.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de anticuerpos monoclonales frente a H. pylori 1.1. Preparación del antígeno

Las cepas 17874, 25, 66, 253 y 1139 de H. pylori (obtenidas de Astra Hässle, Suecia) fueron cultivadas en agar Columbia suplementado con un 8,5% de sangre de caballo, un 10% de suero de caballo, un 1% de isovitalex bajo condición microaerofílica con Anaerocult C a +37ºC.

Se siguieron los procedimientos descritos por Ma J-Y y col. (1994) Scand. J. Gastroenterol. 29, 961-965, para preparar la proteína de superficie de H. pylori. Brevemente, un total de 4 g de las cinco cepas de H. pylori fueron incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente en 100 ml de glicina 0,2 M-HCl (pH 2,2). El pH fue neutralizado con NaOH 1 M. La preparación del antígeno fue centrifugada a 10.000 x g durante 10 minutos a +4ºC. La pella fue desechada y el sobrenadante fue dializado durante una noche frente a agua destilada a +4ºC y utilizado posteriormente como "preparación del antígeno de H. pylori" o "proteínas de superficie de H. pylori".

1.2. Producción de anticuerpos monoclonales

El procedimiento de inmunización fue llevado a cabo esencialmente según está descrito por Cabero, J.L. y col. (1992) Acta Physiol. Scand. 144, 369-378. Brevemente, 2 mg/ml de proteína de superficie de H. pylori fueron emulsionados con un volumen igual de adyuvante completo de Freund a +4ºC. Dos ratones DBA/1 hembras fueron inyectados en las almohadillas subplantares posteriores con una sola dosis de 50 \mul de la emulsión del antígeno. Once días después de la inmunización, linfocitos procedentes de los nódulos linfáticos poplíteos fueron fusionados con células de mieloma de ratón (línea sp2) mediante la utilización de PEG 4000 al 50% (p/p). La suspensión de la fusión celular fue luego distribuida en cinco placas de microvaloración. Todas las células fueron cultivadas en medio de cultivo DMEM conteniendo un 10% de suero de ternera fetal más 50 \mug/ml de genta-
micina.

1.3. Ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA)

Las inmunoplacas fueron revestidas con 50 \mul de tampón Na_{2}CO_{3} 0,05 M/NaHCO_{3}, pH 9,8, conteniendo el antígeno indicado (10 \mug/ml) e incubadas durante una noche a +4ºC. Los sitios de unión libres fueron bloqueados con PBS conteniendo un 0,05% de Tween 20 (PBS-T) a +37ºC durante 1 hora. Se añadió el sobrenadante del anticuerpo primario y se incubó a +37ºC durante 1 hora. Se utilizó como anticuerpo secundario un conjugado de peroxidasa y anti-IgG de ratón producido en cabra. La peroxidasa unida fue detectada con OPD al 0,04% (p/v) y peróxido de hidrógeno 14 mM en ácido cítrico 0,1 M/NaHPO_{4} 0,2 M, pH 5. Las placas fueron leídas a 492 nm después de parar la reacción mediante la adición de H_{2}SO_{4} 2 M. Se realizó un lavado con PBS-T tres veces entre cada
incubación.

1.4. Procedimiento de selección inicial

De la fusión de las células de los nódulos linfáticos y de las células de mieloma, 45 clones de hibridomas eran positivos frente a las proteínas de superficie de H. pylori mediante ELISA. Ocho de los mismos teñían claramente H. pylori tomado de un cultivo en placa de agar por medio de inmunohistoquímica. Los clones de hibridomas denominados 2H6 (ECACC Nº 95121526), 5D8 (ECACC Nº 95121527) y 5F8 (ECACC Nº 95121524) producían una reacción frente a H. pylori más potente que los demás y fueron elegidos para estudios posteriores.

Ejemplo 2 Producción de un fago M13 recombinante contra H. pylori 2.1. Materiales

Los kits QuickPrep mRNA Purification Kit™, Mouse ScFv Module Kit™, Expression Module Kit™, Detection Module Kit™, SfiI, NotI, ADN ligasa de T4 y el anticuerpo anti-M13 de carnero fueron obtenidos de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). La mezcla de dNTPs, el tampón de PCR 10 x y la ADN polimerasa AmpliTaq fueron adquiridos a Perkin Elmer. El extracto de levadura Bacto-yeast, la Bacto-triptona y el Bacto agar fueron adquiridos a Difco Laboratories (Detroit, Michigan, EE.UU.). Las placas de agar Columbia y el caldo de Brucella fueron obtenidos del Departamento de Microbiología (Linköping Universitet, Suecia). Anaerocult® C fue obtenido de Merck (Alemania). El kit antidecoloración SlowFade™ fue obtenido de Molecular Probes Inc. (EE.UU.).

2.2. Construcción de una biblioteca de anticuerpos del fago

Se utilizó el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes Recombinant Phage Antibody System™ (Pharmacia) para expresar fragmentos de anticuerpos como proteínas de fusión presentadas en la superficie del fago.

Se aisló el ARNm total de las líneas celulares de hibridomas (2H6, 5D8 y 5F8) y se purificó mediante cromatografía de afinidad en oligo(dT)-celulosa utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep™ (Pharmacia).

Se llevaron a cabo las etapas siguientes utilizando el kit "Mouse ScFv Module Kit™":

\bullet: Se sintetizó la primera hebra del ADNc a partir del ARNm de los hibridomas mediante la utilización de transcriptasa inversa y mezclas de cebadores proporcionadas en el kit "Mouse ScFv Module Kit™".

\bullet: Se amplificó el ADNc correspondiente a las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los mAbs con diferentes cebadores (cebadores de las cadenas V_{H} y V_{L}, proporcionados con el kit) por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las cadenas V_{H} y V_{L} fueron analizadas mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Se obtuvieron bandas individuales en el tamaño correcto para las cadenas V_{H} (340 pb) y V_{L} (325 pb).

\bullet: Las cadenas V_{H} y V_{L} amplificadas fueron purificadas y aisladas mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y fueron posteriormente ensambladas para dar un gen de Fv de cadena sencilla (ScFv) utilizando un fragmento adaptador de ADN proporcionado con el kit. El fragmento adaptador estaba construido de tal manera que un extremo hibridaba con el extremo 3' de la cadena pesada, mientras que el otro extremo hibridaba con el extremo 5' de la cadena ligera. Se observó una única banda en el tamaño correcto para un gen de ScFv (750 pb) después de la electroforesis.

\bullet: El fragmento de ADN del anticuerpo ensamblado ScFv fue amplificado con un grupo de cebadores oligonucleotídicos (proporcionados con el kit) que introducían sitios de restricción de NotI y SfiI. El fragmento fue purificado en una columna de centrifugación (proporcionada con el kit) para eliminar los adaptadores, los dNTPs y la ADN polimerasa Taq. El fragmento ScFv fue digerido con NotI y SfiI con el fin de crear extremos cohesivos para su ligadura en el vector pCANTAB5.

Las etapas siguientes fueron realizadas utilizando el kit "Expression Module Kit™":

\bullet: El fragmento ScFv fue ligado en el vector fagémido pCANTAB5 (proporcionado con el kit), previamente digerido con NotI y SfiI para generar extremos cohesivos. Se utilizó ADN ligasa de T4 para unir los extremos del fragmento con los extremos correspondientes del fagémido. El fragmento ScFv fue orientado posteriormente en la dirección correcta, adyacente a y en marco con el gen 3 de M13, para la expresión de la proteína de fusión ScFv-g3p.

\bullet: Células de E. coli TG1 (proporcionadas con el kit) se hicieron competentes y se transformaron con el fagémido recombinante que contenía un promotor lac y un marcador de resistencia a ampicilina. Las células transformadas fueron cultivadas a +30ºC en un medio que contenía glucosa y ampicilina. Se obtuvieron 3,2 x 10^{4} clones de ScFv. Las colonias resistentes a ampicilina fueron recogidas en medio para generar un cultivo madre de la biblioteca.

\bullet: Las células resistentes a ampicilina fueron infectadas con el fago cooperador M13K07 (proporcionado con el kit), que contenía un marcador de resistencia a kanamicina, y cultivadas en un medio deficiente en glucosa que contenía ampicilina y kanamicina. En ausencia de glucosa, el promotor lac presente en el fagémido ya no estaba reprimido. Se produjeron partículas de fago que mostraban fragmentos de anticuerpo recombinantes en sus extremos y se liberaron de las células.

\bullet: Los anticuerpos presentados por el fago capaces de unirse al antígeno de H. pylori fueron seleccionados mediante ciclos de selección repetidos ("panning") frente al antígeno. Un frasco de cultivo fue revestido con 5 ml de proteína de superficie de H. pylori (15 \mug/ml en tampón carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6) durante una noche. Después de tres lavados con PBS, el frasco que contenía 10 ml de BSA al 1% (p/v) en PBS fue incubado a +37ºC durante 1 hora. Después de tres lavados con PBS, el frasco fue incubado a +37ºC durante 2 horas en sobrenadante del fago (medio conteniendo fago). El frasco fue luego lavado 20 veces con PBS conteniendo un 0,1% (p/v) de Tween 20 y 20 veces con PBS. Las partículas de fago unidas fueron luego eluidas mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM con agitación suave durante 10 minutos y neutralizadas inmediatamente con 0,5 ml de Tris-HCl 1 mM, pH 7,4.

El fago eluido fue utilizado para infectar células de E. coli TC1 en fase logarítmica en el agar SOBAG conteniendo un 2% de Bacto-triptona, un 0,5% de Bacto-extracto de levadura, un 0,05% de NaCl, MgCl_{2} 0,01 M, un 0,01% de glucosa y un 0,01% de ampicilina. Las colonias fueron recogidas, transferidas, cultivadas y rescatadas de nuevo con M13K07.

Después de la primera ronda de selección mediante el recuento de 100 clones, el 6% de los clones procedentes del rescate de la placa de microvaloración eran positivos frente a la preparación de antígeno de H. pylori en un ELISA. En una tercera ronda de selección a partir del rescate de la placa de microvaloración, el 95% de los anticuerpos del fago procedentes de clones individuales reaccionaba con los antígenos de H. pylori.

En un ELISA de fagos utilizando como antígeno la preparación de antígenos de H. pylori, el fago recombinante B8 tiene un título 10 veces mayor que el fago cooperador (fago grande). El fago B8 (NCIMB Nº 40779) fue elegido para análisis posteriores.

Ejemplo 3 ELISA

Los anticuerpos recombinantes presentados por el fago fueron detectados e identificados en un ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), utilizando el kit "Detection Module Kit™".

Una placa de microvaloración de 96 pocillos fue revestida con 200 \mul de antígeno de H. pylori (10 \mug/ml en Na_{2}CO_{3} 50 mM/NaHCO_{3}, pH 9,6) e incubada durante una noche a +4ºC. Los pocillos fueron lavados con PBS conteniendo un 0,05% de Tween 20 (PBS-T) tres veces y posteriormente bloqueados con 300 \mul de PBS conteniendo BSA 1% durante 1 hora a +37ºC. Los anticuerpos del fago recombinante fueron diluidos con un volumen igual de BSA 1%/PBS e incubados durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar, se añadieron 5 x 10^{10} unidades de transducción de fago (200 \mul/pocillo) y se incubaron durante 2 horas a +37ºC.

Los pocillos fueron lavados con PBS-T tres veces y posteriormente se añadió el conjugado HRP/Anti-M13 suministrado en el "Detection Module Kit™", diluido 1:5000 en BSA 1%/PBS, y se incubó durante 1 hora a +37ºC. Los pocillos fueron lavados tres veces con PBS-T y posteriormente se añadió 2'-2'-Azino-Bis(Ácido 3-Etilbenzotiazolina-6-Sulfónico)Diamonio (ABTS) y H_{2}O_{2} como sustrato de la peroxidasa y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia fue leída a 405 nm utilizando un lector de ELISA computerizado. Se utilizó ovoalbúmina (10 \mug/ml en PBS) como antígeno control. El fago cooperador fue utilizado como control negativo. Los resultados verificaban que el fago recombinante B8 se unía específicamente al antígeno de superficie de H. pylori.

Ejemplo 4 Inmunotransferencia

Las proteínas de la preparación de antígeno de H. pylori fueron separadas por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida en SDS-PAGE (10 \mug de proteínas/pocillo) y posteriormente fueron transferidas a un papel de nitrocelulosa en una célula de transferencia electroforética mini "trans-blot" (BioRad, Richmond, CA, EE.UU.). El papel de nitrocelulosa fue bloqueado con BSA al 10% en PBS conteniendo un 0,1% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se añadió posteriormente el fago B8 (10^{11} unidades de transducción/ml) y se incubó junto con el papel de nitrocelulosa durante una noche con agitación suave a +4ºC. Se utilizó como control negativo la omisión del anticuerpo primario. Después de lavar con PBS-Tween 20 0,1%, el papel de nitrocelulosa fue incubado con el conjugado HRP/anti-M13 (dilución 1:5000 en tampón de bloqueo) durante 1 hora con agitación. La detección de la unión se llevó a cabo utilizando el kit "ECL Detection Kit" (Amersham, R.U.).

Después de teñir el papel de nitrocelulosa con negro amido, las bandas principales correspondían a proteínas de 64 kDa, 36 kDa, 31 kDa y 27 kDa. Los MAbs agrupados (2H6, 5D8 y 5F8 correspondientes a los hibridomas utilizados para la construcción de los fagos) reaccionaban con las bandas de 32 kDa y 64 kDa. Se obtuvo una tinción similar mediante inmunotransferencia con el anticuerpo del fago B8. Este resultado indicaba que los genes de las cadenas pesada y ligera variables correspondientes a los anticuerpos monoclonales específicos para H. pylori se expresaban correctamente en el fago.

Ejemplo 5 Efectos del fago recombinante sobe bacterias

En los experimentos siguientes, las bacterias fueron cultivadas a +37ºC en caldo de Brucella conteniendo un 5% de suero de ternera fetal en una atmósfera que contenía un 10% de CO_{2} y un 5% de O_{2}.

El experimento fue iniciado ("Tiempo 0") cuando 20 \mul de la solución madre de bacterias fueron mezclados con 10 ml de caldo. Se determinó el número de UFC (unidades formadoras de colonias) por ml de cultivo a los puntos de tiempo indicados mediante la dilución de alícuotas de los cultivos en PBS y la extensión de las diluciones sobre placas de agar. Las placas fueron incubadas durante dos días a +37ºC y se contó el número de colonias de cada placa.

5.1. Efecto dependiente del tiempo

Se investigó el efecto dependiente del tiempo del fago recombinante B8 sobre el crecimiento de H. pylori cepa 17874 midiendo UFC durante tres días con o sin fago (Tabla 1). Se añadieron 10^{6} fagos ("+Fago") a 10 ml de medio a Tiempo 0. En el control no se añadieron fagos ("-Fago").

Después de 3 días, las UFC habían aumentado en 5 órdenes de magnitud aproximadamente en ausencia del fago recombinante. Después de un día en presencia del fago, se produjo una caída de UFC de un orden de magnitud aproximadamente y el caldo de cultivo cambió su apariencia de solución turbia a una solución menos turbia.

5.2. Efecto sobre varias cepas bacterianas

Las cepas de H. pylori de laboratorio 17874, 1139 y 244, junto con Staphylococcus aureus, ATCC 29213, y E. coli TG1 fueron cultivadas con o sin fago (10^{6} fagos por cada 10 ml de medio) durante 24 horas. Se analizaron las UFC a Tiempo 0 y a las 24 horas (Tabla 2). El fago recombinante disminuyó las UFC de las tres cepas de H. pylori analizadas, pero no afectó a Staphylococcus ni a E. coli. H. pylori 17874 no fue afectado por el fago cooperador M13K07 utilizado como control.

5.3. Efecto sobre cepas de H. pylori

En un segundo experimento (Tabla 3), se analizaron las cepas 17874, 1139, 253, 25 y 66 de H. pylori junto con Streptococcus (Raf M87). Sin fago, las UFC aumentaron durante las 24 horas de incubación en todas las bacterias analizadas. Sin embargo, en un cultivo con el fago recombinante presente (10^{6} fagos para 10 ml de medio a Tiempo 0), los valores de UFC de las cepas 17874, 1139 y 25 de H. pylori se redujeron en número y la tasa de crecimiento de las cepas 253 y 66 disminuyó claramente en comparación con los controles. Por tanto, todas las cepas de H. pylori analizadas fueron afectadas por los fagos.

Ejemplo 6 Tinción inmunofluorescente de H. pylori

El anticuerpo del fago B8 fue concentrado mediante precipitación con PEG y se realizó una tinción inmunofluorescente en el H. pylori (cepa 17874) tomado del cultivo.

Se prepararon las siguientes soluciones madre de reactivos para llevar a cabo la tinción inmunofluorescente:

Reactivo A: 10 unidades de transducción/ml de anticuerpos del fago fueron diluidas 1:1 con BSA 1%/PBS;

Reactivo B: IgG anti-M13 de carnero diluido con BSA 1%/PBS;

Reactivo C: conjugado anti-Ig de carnero-FTC diluido 1:100 en BSA 1%/PBS;

Reactivo D: 1 mg (p/v) de pronasa en PBS.

Tres días después del cultivo, H. pylori (5 cepas diferentes), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) y Streptococcus (Raf M87) fueron suspendidos separadamente en PBS que contenía un 1% de BSA. Se añadieron a portaobjetos de vidrio 20 \mul de cada suspensión bacteriana. Las bacterias fueron secadas al aire y fijadas en formalina neutra durante 2 minutos, lavadas posteriormente mediante inmersión de los portaobjetos seis veces en agua y secadas al aire a temperatura ambiente. Un breve tratamiento en el reactivo D incrementaba la proporción de la señal respecto al ruido cuando los portaobjetos con la muestra fueron comparados con los controles. Los portaobjetos fueron incubados consecutivamente con 30 \mul de los reactivos A, B y C, 30 minutos con cada uno, y lavados en PBS entre las incubaciones. Los portaobjetos fueron secados al aire y se añadió 1 gota de "SlowFade" antes de cubrirlos. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El control negativo fue realizado omitiendo el anticuerpo primario.

Los resultados mostraban que H. pylori fue teñido positivamente con el anticuerpo del fago. Estos resultados indican una buena concordancia con los valores de UFC obtenidos de los experimentos con cultivos. Por tanto, la expresión de un antígeno específico en la superficie de las bacterias parece ser un prerrequisito para que el fago B8 ejerza su efecto biológico.

Depósito del material biológico

Los clones de hibridomas siguientes han sido depositados bajo el Tratado de Budapest en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, R.U., el 15 de Diciembre de 1995:

2H6 (ECACC Nº 95121526)

5D8 (ECACC Nº 95121527)

5F8 (ECACC Nº 95121524)

El fago recombinante B8 ha sido depositado bajo el Tratado de Budapest en las National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Escocia, el 20 de Diciembre de 1995 con el número de acceso NCIMB 40779.

TABLA 1

1

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TABLA 2

2

TABLA 3

3

Claims

1. Utilización de un bacteriófago modificado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una infección bacteriana mucosal causada por Helicobacter pylori, en la que el bacteriófago modificado, que es un bacteriófago M13, presenta en su superficie una proteína recombinante que comprende:

(ii): un segundo componente que comprende secuencias de las regiones variables de un anticuerpo para proporcionar un sitio de unión del antígeno bacteriano, haciendo dicho segundo componente que dicho bacteriófago sea capaz de unirse a, y de inhibir de este modo el crecimiento de, las células bacterianas implicadas en la etiología de dicha infección bacteriana,

según lo cual dicho primer componente de dicha proteína recombinante deriva de la proteína g3p responsable de la absorción de la forma no modificada de dicho bacteriófago a los pili bacterianos; dicho segundo componente de dicha proteína recombinante comprende un polipéptido ScFv en forma de una proteína de fusión g3p-ScFv, y las secuencias de las regiones variables del anticuerpo de dicho polipéptido recombinante son secuencias de las regiones variables de un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridomas 5F8 (ECACC Nº 95121524), 2H6 (ECACC Nº 95121526) y 5D8 (ECACC Nº 95121527).

2. Utilización de la reivindicación 1, en la que el bacteriófago es denominado B8 y está depositado en la NCIMB bajo el número de acceso NCIMB 40779, o un derivado del mismo que conserve la capacidad para unirse a, e infectar, Helicobacter pylori.

3. Un hibridoma seleccionado de 5F8 (ECACC Nº 95121524), 2H6 (ECACC Nº 95121526) y 5D8 (ECACC Nº 95121527).

4. Un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas de acuerdo con la reivindicación 3.