RU2215032C2 - Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для лечения или профилактики бактериальной инфекции, модифицированный бактериофаг м13, фармкомпозиция и способ лечения бактериальной инфекции, моноклональное антитело, гибридома (вариант) - Google Patents
Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для лечения или профилактики бактериальной инфекции, модифицированный бактериофаг м13, фармкомпозиция и способ лечения бактериальной инфекции, моноклональное антитело, гибридома (вариант) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2215032C2 RU2215032C2 RU98116471/13A RU98116471A RU2215032C2 RU 2215032 C2 RU2215032 C2 RU 2215032C2 RU 98116471/13 A RU98116471/13 A RU 98116471/13A RU 98116471 A RU98116471 A RU 98116471A RU 2215032 C2 RU2215032 C2 RU 2215032C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriophage
- infection
- bacterial
- treatment
- ecacc
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 31
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 title claims description 7
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 title abstract description 4
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 claims abstract description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 claims description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 claims 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 abstract description 8
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241001590124 Helicobacter pylori 17874 Species 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710192393 Attachment protein G3P Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710169873 Capsid protein G8P Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 description 1
- 101710179596 Gene 3 protein Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000005073 Helicobacter pylori B8 Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000148 Polycarbophil calcium Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 229960000381 omeprazole Drugs 0.000 description 1
- 229940127249 oral antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229950005134 polycarbophil Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000005919 time-dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к бактериофагам для использования в лечении или профилактике бактериальных инфекций, особенно бактериальных инфекций слизистых оболочек. С этой целью была получена конструкция бактериофага, несущего на своей поверхности рекомбинантный белок, содержащий поверхностный белок бактериофага и последовательности вариабельной области ScFv полипептида. Штамм модифицированного бактериофага М13 и конструкция пригодны для лечения или профилактики бактериальной инфекции в составе фармкомпозиции, а штамм, конструкция и фармкомпозиция используются в способе лечения бактериальной инфекции; также были получены моноклональные антитела из гибридом 5F8, 2Н6 и 5D8, которые обеспечивают связывание модифицированного бактериофага М13 с Helicobacter pylori. 8 с. и 9 з.п. ф-лы, 3 табл.
Description
Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для лечения или профилактики бактериальной инфекции, модифицированный бактериофаг М13, фармкомпозиция и способ лечения бактериальной инфекции, моноклональное антитело, гибридома (вариант)
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к бактериофагам, пригодным для лечения бактериальных инфекций, особенно бактериальных инфекций слизистых оболочек, таких как инфекции Helicobacter pylori.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к бактериофагам, пригодным для лечения бактериальных инфекций, особенно бактериальных инфекций слизистых оболочек, таких как инфекции Helicobacter pylori.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Бактериофаги и антибиотикоустойчивость
Устойчивость к антибиотикам - это всеобщая проблема все возрастающего медицинского и экономического значения. Существует настоятельная необходимость в альтернативных способах уничтожения бактерий, которые смогут разрешить проблему такой устойчивости.
Бактериофаги и антибиотикоустойчивость
Устойчивость к антибиотикам - это всеобщая проблема все возрастающего медицинского и экономического значения. Существует настоятельная необходимость в альтернативных способах уничтожения бактерий, которые смогут разрешить проблему такой устойчивости.
Бактериофаг или фаг - это вирус, который специфически инфицирует бактерии. Фаги прикрепляются к своим бактериям-хозяевам и переносят в них гены, кодирующие различные фаговые белки. Для своей репликации они используют белок-синтезирующий комплекс, аминокислоты и тому подобное, а также энергию, обеспечиваемую бактерией-хозяином (Maloy et al. (eds.): Microbial genetics. Jones and Bartlett Publishers, 1994).
Большинство фагов посредством лизиса или других механизмов поражают специфические штаммы бактерий. Настоящее изобретение исходит из положения о том, что генетическая модификация фагов, в частности нитевидных бактериофагов, предоставляет средство для конструирования новых бактерия-специфичных фагов, способных уничтожать определенные бактерии, например Helicobacter pylori, и позволяющих разрешить проблемы, связанные с антибиотикоустойчивостью.
Нитевидные фаги
Клетки Е. coli, несущие подобные волосу F-фимбрии, являются хозяевами для нитевидных фагов, таких как М13, fd и f1. Эти Ff (F фимбрии, нитевидные) фаги очень близки по последовательности и свойствам (Rashed & Oberer (1986) Microbiological reviews 50, 401-427; Kornberg & Baker, in: DNA Replication, p. 557-570, W.H. Freeman and Co., New York 1992). Ff фаги единственные среди бактериальных вирусов не продуцируют литическую инфекцию, они скорее индуцируют состояние, в котором инфицированные клетки-хозяева продуцируют и секретируют фаговые частицы, не подвергаясь лизису.
Клетки Е. coli, несущие подобные волосу F-фимбрии, являются хозяевами для нитевидных фагов, таких как М13, fd и f1. Эти Ff (F фимбрии, нитевидные) фаги очень близки по последовательности и свойствам (Rashed & Oberer (1986) Microbiological reviews 50, 401-427; Kornberg & Baker, in: DNA Replication, p. 557-570, W.H. Freeman and Co., New York 1992). Ff фаги единственные среди бактериальных вирусов не продуцируют литическую инфекцию, они скорее индуцируют состояние, в котором инфицированные клетки-хозяева продуцируют и секретируют фаговые частицы, не подвергаясь лизису.
Однонитевой геном фага М13 кодирует 10 различных белков. ДНК заключена в белковую оболочку, состоящую из приблизительно 2700 копий белка гена 8 (g8p). Жизнеспособный фаг М13 также экспрессирует на своем конце пять копий белка 43 кДа гена 3 (g3p), причем этот белок ответственен за адсорбцию на фимбрии Е. соli. Белок гена 3 прикреплен к вирусной оболочке посредством С-терминальной части полипептидной цепи, в то время как N-терминальный глобулярный домен остается доступным и опосредует прикрепление фага к концу хозяйской F-фимбрии. При электронном микроскопировании комплекс адсорбции выглядит как структура "шишка-на-стебле" на одном конце фага. В ходе инфицирования лидерные последовательности g3p и g8p направляют транспорт этих белков во внутреннюю мембрану бактериальной клетки.
Ff фаги пользуются заслуженной популярностью в качестве векторов клонирования, поскольку они не имеют физических ограничений, лимитирующих длину ДНК, которая может быть упакована, и поэтому они позволяют осуществлять легкую очистку однонитевой ДНК. Фагмида - это вектор, который несет ориджины репликации как М13 (однонитевой), так и плазмиды (двунитевой). Фагмиды могут быть выращены как плазмиды или упакованы как рекомбинантный фаг М13 с помощью хелперного фага, такого как М13К07 (Veira & Messing (1987) Methods in Enzymol. 153, 3-11).
Получение рекомбинантного антитела
Молекулы антитела содержат дискретные фрагменты, которые могут быть выделены посредством расщепления протеазами или могут быть получены с помощью рекомбинантных методов. Одним из таких фрагментов является Fv (вариабельный фрагмент), который состоит только из VL и VH областей антитела. Известна (US 4946778) рекомбинантная версия Fv фрагмента, именуемая как одноцепочечный Fv (ScFv), в котором две вариабельных области искусственно соединены нейтральным линкером и экспрессируются как единственная полипептидная цепь.
Молекулы антитела содержат дискретные фрагменты, которые могут быть выделены посредством расщепления протеазами или могут быть получены с помощью рекомбинантных методов. Одним из таких фрагментов является Fv (вариабельный фрагмент), который состоит только из VL и VH областей антитела. Известна (US 4946778) рекомбинантная версия Fv фрагмента, именуемая как одноцепочечный Fv (ScFv), в котором две вариабельных области искусственно соединены нейтральным линкером и экспрессируются как единственная полипептидная цепь.
Метод получения рекомбинантного антитела был разработан McCafferty с соавторами (McCafferty (1990) Nature 348, 552-554; Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293). Этот подход базируется на системе фаг-воспроизведение, в которой VH (вариабельная тяжелая) и VL (вариабельная легкая) гены клонируют в фаговом векторе, после чего фрагменты антител экспрессируются как слитые белки, воспроизводимые на фаговой поверхности. При таком подходе из популяции могут быть отобраны антитела определенной специфичности и афинности. Было предложено называть антитела, выделенные и изготовленные в прокариотических системах, "коликлональными" антителами (Chiswell & McCafferty (1992) Trends in Biotechnology 10, 80-84).
Имеющаяся в продаже фагмида pCANTAB5 сконструирована таким образом, что гены вариабельной области антитела могут быть клонированы между лидерной последовательностью и главным телом М13 гена 3. G3p лидерная последовательность направляет транспорт полученного слитого белка во внутреннюю мембрану и/или периплазму Е. соli, где главный g3р домен присоединяет слитый белок к концу собирающегося фага. Экспрессия конструкции антитело-g3р ген контролируется индуцибельным lас промотором на фагмиде.
Инфекция Helicobacter pylori
Считается, что бактерия Helicobacter pylori является главной причиной язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, ответственной за 84% и 95% соответственно известных случаев (Kuipes, E.L. et al. (1995) Aliment. Pharmacol. Ther. 9 (suppl.2), 59-69). H. pylori колонизирует стенку желудка, защищенную от кислого окружения слоем слизи, который покрывает стенку желудка, а также метаболическим процессом, который дает возможность организму секретировать аммиак для нейтрализации кислоты.
Считается, что бактерия Helicobacter pylori является главной причиной язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, ответственной за 84% и 95% соответственно известных случаев (Kuipes, E.L. et al. (1995) Aliment. Pharmacol. Ther. 9 (suppl.2), 59-69). H. pylori колонизирует стенку желудка, защищенную от кислого окружения слоем слизи, который покрывает стенку желудка, а также метаболическим процессом, который дает возможность организму секретировать аммиак для нейтрализации кислоты.
По-видимому, традиционное лечение антибиотиками оказывает слабое действие на Н. pylori. Это возможно определяется следующими причинами: (1) ограниченный доступ антимикробного агента к организму, поскольку указанный агент непосредственно не попадает в кровообращение; и (2) быстрое прохождение многих пероральных антибиотиков через желудок или разложение таких антибиотиков в кислых условиях желудка.
ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является предложение новых форм лечения для уничтожения бактерий, особенно уничтожения бактерий, ответственных за бактериальные инфекции слизистых оболочек, таких как Helicobacter pylori. В частности, в изобретении предложены нитевидные бактериофаги, генетически модифицированные таким образом, что они обладают специфичностью связывания по отношению к другому бактериальному хозяину, для использования в терапии.
Задачей настоящего изобретения является предложение новых форм лечения для уничтожения бактерий, особенно уничтожения бактерий, ответственных за бактериальные инфекции слизистых оболочек, таких как Helicobacter pylori. В частности, в изобретении предложены нитевидные бактериофаги, генетически модифицированные таким образом, что они обладают специфичностью связывания по отношению к другому бактериальному хозяину, для использования в терапии.
Считается, что способы лечения бактериальных инфекций слизистых оболочек, основанные на рекомбинантных фагах, превосходят традиционное лечение антибиотиками по ряду причин, в том числе следующих:
- они делают возможным уничтожение бактерий, устойчивых к традиционным антибиотикам;
- высокая специфичность рекомбинантного фага в отношении специфических бактериальных видов;
- репродукция фага является самоограничивающейся;
- в случае инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, подвижность Helicobacter pylori могла бы помочь распространить фаг по всем частям слизистой оболочки желудка.
- они делают возможным уничтожение бактерий, устойчивых к традиционным антибиотикам;
- высокая специфичность рекомбинантного фага в отношении специфических бактериальных видов;
- репродукция фага является самоограничивающейся;
- в случае инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, подвижность Helicobacter pylori могла бы помочь распространить фаг по всем частям слизистой оболочки желудка.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании и примерах термины "стандартные протоколы" и "стандартные процедуры" следует понимать как протоколы и процедуры, имеющиеся в обычном лабораторном руководстве, например: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
В настоящем описании и примерах термины "стандартные протоколы" и "стандартные процедуры" следует понимать как протоколы и процедуры, имеющиеся в обычном лабораторном руководстве, например: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Согласно первому аспекту в изобретении предложен модифицированный бактериофаг для использования в лечении или профилактике бактериальной инфекции, причем указанный бактериофаг имеет на своей поверхности рекомбинантный белок, содержащий
(1) первый компонент, полученный из поверхностного белка бактериофага; и
(2) второй компонент, содержащий последовательности вариабельной области антитела, для создания сайта связывания бактериального антигена, причем указанный второй компонент делает указанный бактериофаг способным связываться с бактериальными клетками, вовлеченными в этиологию указанной инфекции, и тем самым ингибировать их рост.
(1) первый компонент, полученный из поверхностного белка бактериофага; и
(2) второй компонент, содержащий последовательности вариабельной области антитела, для создания сайта связывания бактериального антигена, причем указанный второй компонент делает указанный бактериофаг способным связываться с бактериальными клетками, вовлеченными в этиологию указанной инфекции, и тем самым ингибировать их рост.
Указанный модифицированный бактериофаг может, например, представлять собой модифицированный нитевидный фаг, такой как модифицированный М13 фаг.
Указанная бактериальная инфекция может представлять собой, например, бактериальную инфекцию слизистой оболочки, такую как инфекция Helicobacter pylori. Однако настоящее изобретение не ограничено фагами, способными поражать клетки Helicobacter pylori, а скорее включает в себя фаги с измененными свойствами, которые могут быть использованы для поражения широкого круга бактерий. Следует понимать, что фаг по изобретению, который специфичен для некоторых бактериальных видов, может быть получен специалистом на основе настоящего изобретения. Фаги согласно изобретению пригодны для лечения любой бактериальной инфекции слизистой оболочки, доступной внешнему миру. Примерами таких эпителиев слизистых оболочек являются слизистая носа, легкого, желудочно-кишечного тракта, мочевого пузыря и вагины.
Примерами других бактериальных инфекций, которые могут быть излечены фагами по изобретению, являются:
- инфекции мочевых путей, вызываемые E.coli, Staphylococcus saprophyticus, Klebsiella spp, Proteus spp или Pseudomonas aeruginosa:
- вагинальные инфекции, вызываемые Clamydia:
- носовые/тонзиллярные/легочные инфекции, вызываемые Streptococcus, Staphylococcus, Haemophilus influence, Pneumococcus и Mycoplasma pneumonic:
- инфекции желудочно-кишечного тракта, вызываемые Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter jejuni, Campylobacter соli, Helicobacter, Vibrio cholera или E.coli.
- инфекции мочевых путей, вызываемые E.coli, Staphylococcus saprophyticus, Klebsiella spp, Proteus spp или Pseudomonas aeruginosa:
- вагинальные инфекции, вызываемые Clamydia:
- носовые/тонзиллярные/легочные инфекции, вызываемые Streptococcus, Staphylococcus, Haemophilus influence, Pneumococcus и Mycoplasma pneumonic:
- инфекции желудочно-кишечного тракта, вызываемые Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter jejuni, Campylobacter соli, Helicobacter, Vibrio cholera или E.coli.
Указанный первый компонент рекомбинантного белка, упомянутый выше, предпочтительно может быть получен из белка, ответственного за адсорбцию немодифицированной формы указанного бактериофага на бактериальной фимбрии, например белка g3р из М13 фага.
Указанный второй компонент указанного рекомбинантного белка может, в частности, содержать рекомбинантный одноцепочечный Fv (ScFv) полипептид. Следовательно, указанный рекомбинантный белок может представлять собой, например, g3р-ScFv слитый белок.
В предпочтительной форме бактериофаг согласно изобретению представляет собой бактериофаг для использования в лечении или профилактике инфекции Helicobacter pylori, в котором последовательности вариабельной области антитела указанного рекомбинантного полипептида являются последовательностями вариабельной области моноклонального антитела, выбранного из моноклональных антител гибридомных клеточных линий 5F8 (ЕСАСС 95121524), 2Н6 (ЕСАСС 95121526) и 5D8 (ЕСАСС 95121527).
Таким образом, бактериофаг согласно изобретению может, в частности, представлять собой модифицированный М13 бактериофаг, обозначенный как В8, депонированный в NCIMB под вступительным номером NCIMB 40779, или его производное, которое сохраняет способность связываться с Helicobacter pylori и инфицировать ее.
Фаги с желаемыми свойствами могут быть получены, например, одним из следующих способов:
(а) Скрининг встречающихся в природе фагов или фаговых библиотек, содержащих фаги, экспрессирующие множество вариабельных фрагментов антител. Фаговые библиотеки могут быть получены, например, из иммунных клеток от большого числа индивидуумов. Из-за огромной генетической вариабельности такие большие фаговые библиотеки, очевидно, содержат желаемые специфические фаги, нацеленные на бактерии, действию которых предварительно подвергались индивидуумы.
(а) Скрининг встречающихся в природе фагов или фаговых библиотек, содержащих фаги, экспрессирующие множество вариабельных фрагментов антител. Фаговые библиотеки могут быть получены, например, из иммунных клеток от большого числа индивидуумов. Из-за огромной генетической вариабельности такие большие фаговые библиотеки, очевидно, содержат желаемые специфические фаги, нацеленные на бактерии, действию которых предварительно подвергались индивидуумы.
(б) Осуществление мутаций существующих фагов. Мутации происходят во всех живущих организмах, включая фаги. Частота мутаций может быть увеличена, например, химическим путем или посредством облучения коротковолновым электромагнитным излучением.
(в) Направленная генетическая модификация одной или более чем одной аминокислоты или другие модификации, например, углеводных или липидных компонентов области связывания фага для усиления желаемых свойств природного или рекомбинантного фага. Пример такого подхода описан далее в экспериментальном разделе. Бактериофаг согласно изобретению, таким образом, может быть получен способом, при котором (а) выделяют антитело против бактериальной клетки; (б) выделяют ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой и легкой цепей указанного антитела: и (в) вводят указанную ДНК в фаговую ДНК таким образом, что указанные области антитела будут экспрессироваться на поверхности фага.
Согласно другому аспекту в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая бактериофаг согласно изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
Примеры пригодных средств введения фагов согласно изобретению включают в себя:
- спрей для назального и легочного применения:
- предварительная обработка омепразолом, а затем - фагами, суспендированными в бикарбонатных буферах, для лечения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта;
- смеси слизисто-адгезивных гелей (например гелей на основе целлюлозы, поликарбофила, полоксамера и так далее) для слизистой оболочки желудка и вагинальной слизистой оболочки;
- бикарбонатные буферы для использования в мочевом пузыре.
- спрей для назального и легочного применения:
- предварительная обработка омепразолом, а затем - фагами, суспендированными в бикарбонатных буферах, для лечения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта;
- смеси слизисто-адгезивных гелей (например гелей на основе целлюлозы, поликарбофила, полоксамера и так далее) для слизистой оболочки желудка и вагинальной слизистой оболочки;
- бикарбонатные буферы для использования в мочевом пузыре.
Количество фагов, подлежащее введению, может быть определено специалистом. В зависимости от типа инфекции количество фагов, подлежащих введению, может лежать в интервале от 104 до 1010.
Согласно еще одному аспекту в изобретении предложен способ лечения бактериальной инфекции у млекопитающего, при котором вводят бактериофаг или фармацевтическую композицию согласно изобретению. Указанные бактериальные инфекции могут представлять собой, в частности, бактериальные инфекции слизистых оболочек, такие как Helicobacter pylori инфекции. В изобретение включено также использование бактериофага согласно изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики бактериальной инфекции слизистых оболочек, в частности инфекций Helicobacter pylori.
Дополнительными аспектами изобретения являются гибридома, выбранная из 5F8 (ЕСАСС 95121524), 2Н6 (ЕСАСС 95121526) и 5D8 (ЕСАСС 95121527), а также моноклональное антитело, выбранное из моноклональных антител, продуцируемых указанными гибридомами. Гибридомная технология, в которой продуцирующие антитело В-клетки от иммунизированных животных сливают с клетками миеломы и выбирают полученные в результате гибридомные клеточные линии, продуцирующие желаемое антитело, хорошо известны из уровня техники.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Получение моноклональных антител против Н. Pylori
1.1 Препарат антигена
Штаммы Н. pylori 17874, 25, 66, 253 и 1139 (получены из Astra Hassle, Sweden) культивируют на колумбийском агаре, обогащенном 8,5% лошадиной крови, 10% лошадиной сыворотки, 1% изовиталекса, в микроаэрофильных условиях 1 в установке Anaerocult С при +37oС.
ПРИМЕР 1: Получение моноклональных антител против Н. Pylori
1.1 Препарат антигена
Штаммы Н. pylori 17874, 25, 66, 253 и 1139 (получены из Astra Hassle, Sweden) культивируют на колумбийском агаре, обогащенном 8,5% лошадиной крови, 10% лошадиной сыворотки, 1% изовиталекса, в микроаэрофильных условиях 1 в установке Anaerocult С при +37oС.
Для получения поверхностного белка Н. pylori следуют известной (Ма J-Y et al. (1994) Scand. J. Gastroenterol. 29, 961-965) методике. А именно общее количество, равное 4 г, пяти штаммов Н.pylori инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре в 100 мл 0,2 М глицин-НСl (рН 2,2). рН нейтрализуют 1 М NaOH. Препарат антигена центрифугируют при 10000хg в течение 10 минут при +4oС. Осадок отбрасывают, а супернатант диализируют в течение ночи против дистиллированной воды при +4oС и затем используют как "Н.pylori антигенный препарат" или "Н.pylori поверхностные белки".
1.2. Получение моноклонального антитела
Процедуру иммунизации проводят по существу так, как описано (Саbеrо, J. L. et al. (1992) Acta Physiol. Scand. 144, 369-378). А именно 2 мг/мл поверхностного белка Н. pylori эмульгируют с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (Freund's) при +4oС. Двух самок DBA/1 мышей инъецируют в задние стопы разовой дозой 50 мкл эмульсии антигена. Через 11 дней после иммунизации лимфоциты из подколенных лимфатических узлов сливают с клетками мышиной миеломы (sp2 линия), используя 50% (мас.) ПЭГ 4000. Суспензию слитых клеток распределяют затем по пяти титрационным микропланшетам. Все клетки выращивают в DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла) культуральной среде, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки плюс 50 мкг/мл гентамицина.
Процедуру иммунизации проводят по существу так, как описано (Саbеrо, J. L. et al. (1992) Acta Physiol. Scand. 144, 369-378). А именно 2 мг/мл поверхностного белка Н. pylori эмульгируют с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (Freund's) при +4oС. Двух самок DBA/1 мышей инъецируют в задние стопы разовой дозой 50 мкл эмульсии антигена. Через 11 дней после иммунизации лимфоциты из подколенных лимфатических узлов сливают с клетками мышиной миеломы (sp2 линия), используя 50% (мас.) ПЭГ 4000. Суспензию слитых клеток распределяют затем по пяти титрационным микропланшетам. Все клетки выращивают в DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла) культуральной среде, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки плюс 50 мкг/мл гентамицина.
1.3. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
Иммунологические планшеты сенсибилизируют 50 мкл 0,05 М Nа2СО3/NаНСО3 буфера, рН 9,8, содержащего указанный антиген (10 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при +4oС. Свободные сайты связывания блокируют с помощью ЗФР, содержащего 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) при 37oС в течение 1 часа. Добавляют первичный супернатант антитела и инкубируют при +37oС в течение 1 часа. Конъюгат козий анти-мышиный lgG-пероксидаза используют в качестве вторичного антитела. Связанную пероксидазу определяют с помощью 0,04% (мас./об.) OPD и 14 мМ перекиси водорода в смеси 0,1 М лимонная кислота/О,2 М NaHPO4, рН 5. Планшеты анализируют при 492 нм после остановки реакции добавлением 2 М H2SO4. Между каждой инкубацией проводят три промывания ЗФР-Т.
Иммунологические планшеты сенсибилизируют 50 мкл 0,05 М Nа2СО3/NаНСО3 буфера, рН 9,8, содержащего указанный антиген (10 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при +4oС. Свободные сайты связывания блокируют с помощью ЗФР, содержащего 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) при 37oС в течение 1 часа. Добавляют первичный супернатант антитела и инкубируют при +37oС в течение 1 часа. Конъюгат козий анти-мышиный lgG-пероксидаза используют в качестве вторичного антитела. Связанную пероксидазу определяют с помощью 0,04% (мас./об.) OPD и 14 мМ перекиси водорода в смеси 0,1 М лимонная кислота/О,2 М NaHPO4, рН 5. Планшеты анализируют при 492 нм после остановки реакции добавлением 2 М H2SO4. Между каждой инкубацией проводят три промывания ЗФР-Т.
1.4. Начальный скрининг
45 гибридомных клонов, полученных после слияния клеток лимфатических узлов и клеток миеломы, были позитивными против Н. pylori поверхностных белков при проведении ELISA. 8 из них отчетливо окрашивали Н.pylori, взятый из культуры на агаровой пластинке, посредством иммуногистохимии. Гибридомные клоны, обозначенные как 2Н6 (ЕСАСС 95121526), 5D8 (ЕСАСС 95121527) и 5F8 (ЕСАСС 95121524), давали более сильную реакцию против Н.pylori, чем остальные клоны, и они были отобраны для дальнейших исследований.
45 гибридомных клонов, полученных после слияния клеток лимфатических узлов и клеток миеломы, были позитивными против Н. pylori поверхностных белков при проведении ELISA. 8 из них отчетливо окрашивали Н.pylori, взятый из культуры на агаровой пластинке, посредством иммуногистохимии. Гибридомные клоны, обозначенные как 2Н6 (ЕСАСС 95121526), 5D8 (ЕСАСС 95121527) и 5F8 (ЕСАСС 95121524), давали более сильную реакцию против Н.pylori, чем остальные клоны, и они были отобраны для дальнейших исследований.
ПРИМЕР 2: Получение рекомбинантного фага М13 против Н.pylori
2.1. Материалы
QuickPrep mRNA purification kitТМ, Mouse ScFv Module kitТМ, Expression Module kitТМ, Detection Module KitТМ, Sfil, Notl, T4 ДНК лигаза и анти-М13 овечье антитело получили от Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). DNTPs смесь, 10хПЦР буфер и AmpliTaq ДНК полимераза были закуплены у Perkin Elmer. Бакто-дрожжевой экстракт, бакто-триптон, бакто-агар были закуплены в Difco Laboratories (Detroit, Michigan USA). Пластины колумбийского агара и бруцеллярный бульон были получены из отдела микробиологии (Linkoping University, Sweden). Anaerocult® был получен от Merck (Germany). SlowFadeТМ набор против обесцвечивания был получен из Milecular Probes Inc. (U.S.A).
2.1. Материалы
QuickPrep mRNA purification kitТМ, Mouse ScFv Module kitТМ, Expression Module kitТМ, Detection Module KitТМ, Sfil, Notl, T4 ДНК лигаза и анти-М13 овечье антитело получили от Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). DNTPs смесь, 10хПЦР буфер и AmpliTaq ДНК полимераза были закуплены у Perkin Elmer. Бакто-дрожжевой экстракт, бакто-триптон, бакто-агар были закуплены в Difco Laboratories (Detroit, Michigan USA). Пластины колумбийского агара и бруцеллярный бульон были получены из отдела микробиологии (Linkoping University, Sweden). Anaerocult® был получен от Merck (Germany). SlowFadeТМ набор против обесцвечивания был получен из Milecular Probes Inc. (U.S.A).
2.2. Конструирование библиотеки фаговых антител
Для экспрессии фрагментов антител как слитых белков, проявляющихся на фаговой поверхности, использовали the Recombinant Phage Antibody SystemТМ (Pharmacia).
Для экспрессии фрагментов антител как слитых белков, проявляющихся на фаговой поверхности, использовали the Recombinant Phage Antibody SystemТМ (Pharmacia).
Общую мРНК выделяли из гибридомных клеточных линий (2Н6, 5D8 и 5F8) и очищали посредством афинной хроматографии на олигo(dТ)-целлюлозе, используя QuickPrep mRNA Purification KitТМ (Pharmacia).
С помощью Mouse ScFv Module KitТМ осуществляют следующие стадии:
- Первую нить кДНК синтезируют с гибридомной мРНК с помощью обратной транскриптазы и смесей праймеров из Mouse ScFv Module KitТМ.
- Первую нить кДНК синтезируют с гибридомной мРНК с помощью обратной транскриптазы и смесей праймеров из Mouse ScFv Module KitТМ.
- К-ДНК, соответствующую вариабельным областям тяжелых и легких цепей mAbs (моноклональных антител), амплифицируют с различными праймерами (VH и VL праймеры цепи, из набора) посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). VH и VL цепи анализируют посредством электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Получали отдельные полосы правильного размера для VH (340 пн) и VL (325 пн) цепи.
- Амплифицированные VH и VL цепи очищают и выделяют посредством электрофореза в 1%-ном агарозном геле, а затем собирают в одноцепочечный Fv (ScFv) ген с помощью ДНК линкерного фрагмента из набора. Линкерный фрагмент сконструирован таким образом, что один конец отжигается к 3'-концу тяжелой цепи, в то время как другой конец гибридизуется с 5'-концом легкой цепи. После электрофореза наблюдали отдельную полосу правильного размера для ScFv гена (750 пн).
- ДНК фрагмент собранного антитела ScFv амплифицируют с набором олигонуклеотидных праймеров (из набора), посредством чего вводят Notl и Sfil сайты. Рестрикции. Фрагмент очищают на стеклянной колонке (из набора) для удаления линкеров, dNTPs и Taq ДНК полимеразы. ScFv фрагмент расщепляют с помощью Notl и Sfil для получения липких концов для лигирования с pCANTAB5 вектором.
С помощью Expression Module KitТМ осуществляют следующие стадии:
- ScFv фрагмент лигируют с фагмидным вектором pCANTAB5 (из набора), предварительно обработанным Notl и Sfil для получения липких концов. Для соединения концов фрагмента с соответствующими концами фагмиды используют Т4 ДНК лигазу. Затем ScFv фрагмент ориентируют в правильном направлении так, чтобы он примыкал к М13 гену 3 и был с ним в одной рамке считывания, для экспрессии ScFv-g3р слитого белка.
- ScFv фрагмент лигируют с фагмидным вектором pCANTAB5 (из набора), предварительно обработанным Notl и Sfil для получения липких концов. Для соединения концов фрагмента с соответствующими концами фагмиды используют Т4 ДНК лигазу. Затем ScFv фрагмент ориентируют в правильном направлении так, чтобы он примыкал к М13 гену 3 и был с ним в одной рамке считывания, для экспрессии ScFv-g3р слитого белка.
- Клетки E.coli TG1 клетки (из набора) делают компетентыми и трансформируют рекомбинантной фагмидой, содержащей lас промотор и маркер устойчивсти к ампициллину. Трансформированные клетки выращивают при +30oС в среде, содержащей глюкозу и ампициллин. Получили 3,2 х 104 ScFv клонов. Колонии, устойчивые к ампициллину, переносят в среду для получения библиотечной биомассы.
- Клетки, устойчивые к ампициллину, инфицируют хелперным фагом М13К07 (из набора), несущим маркер устойчивости к канамицину, и выращивают в глюкозо-дефицитной среде, содержащей ампициллин и канамицин. В отсутствие глюкозы lас промотор, присутствующий в фагмиде, больше не репрессируется. В результате продуцируются и высвобождаются из клеток фаговые частицы, несущие фрагменты рекомбинантного антитела на своих концах.
- Антитела, присутствующие на фаге, способные связываться с Н. pylori антигеном, отбирают путем пэннинга против антигена. Культуральную колбу сенсибилизируют 5 мл поверхностного белка Н.pylori (15 мкг/мл в 50 мМ буфере из карбоната натрия, рН 9,6) в течение ночи. После трех промывок ЗФР колбу, содержащую 10 мл 1%-ного БСА (мас./об.) в ЗФР, инкубируют при +37oС в течение 2 часов в фаговом супернатанте (среда, содержащая фаг). Затем колбу промывают 20 раз ЗФР, содержащим 0,1% (мас./об.) Твин-20, и 20 раз - ЗФР. Связанные фаговые частицы затем элюируют добавлением 1 мл 100 мМ триэтиламина при осторожном перемешивании в течение 10 минут и немедленно нейтрализуют 0,5 мл 1 М Трис-HCI, рН 7,4.
Элюированный фаг используют для инфицирования клеток E.coli TG1 в лог-фазе на SOBAG агаре, содержащем 2% бакто-триптона, 0,2% бакто-дрожжевого экстракта, 0,05% NaCl, 0,1 М MgCl2, 0,01% глюкозы и 0,01% ампицилина. Колонии отбирают, переносят, выращивают и снова "спасают" с помощью М13К07.
После первого раунда селекции путем подсчета 100 клонов 6% "спасенных" клонов из титрационного микропланшета были позитивными против антигенного препарата Н. pylori в тесте ELISA. В третьем раунде селекции из "спасенных" на титрационном микропланшете 95% фаговых антител из отдельных клонов реагировали с Н.pylori антигенами.
В фаговом тесте ELISA с использованием Н. pylori антигенного препарата в качестве антигена рекомбинантный фаг В8 имеет титр, в 10 раз более высокий, чем хелперный фаг (широкий фаг). Фаг В8 (NCIMB 40779) был выбран для дальнейших анализов.
ПРИМЕР 3: ELISA
Фаго-проявляемые рекомбинантные антитела выявляют и идентифицируют в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) с использованием Detection Module KitТМ.
Фаго-проявляемые рекомбинантные антитела выявляют и идентифицируют в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) с использованием Detection Module KitТМ.
96-луночные титрационные микропланшеты сенсибилизируют 200 мкл Н.pylori антигена (10 мкг/мл в 50 мМ Nа2СО3/NаНСОз, рН 9,6) и инкубируют в течение ночи при +4oС. Лунки три раза промывают ЗФР, содержащим 0,05% Твин 20 (ЗФР-Т) и затем блокируют 300 мкл ЗФР, содержащего 1% БСА, в течение 1 часа при +37oС. Антитела рекомбинантного фага разбавляют равным объемом 1% БСА/ЗФР и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывки добавляют 5х1010 фаговых трансдуцирующих единиц (200 мкл/лунку) и инкубируют 2 часа при +37oC.
Лунки три раза промывают ЗФР-Т и затем добавляют НRР(пероксидаза из хрена)/анти М13 конъюгат из Detection Module kit, разведенный 1:5000 в 1% БСА/ЗФР, и инкубируют в течение 1 часа при +37oС. Лунки три раза промывают ЗФР-Т и затем добавляют 2'2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) диаммоний (ABTS) и H2O2 в качестве субстрата для пероксидазы и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Регистрируют абсорбцию при 405 нм с помощью компьютеризированного ELISA датчика. В качестве контрольного антигена добавляют овальбумин (10 мкг/мл в ЗФР). Хелперный фаг используют в качестве негативного контроля. Результаты подтвердили, что рекомбинантный фаг В8 специфически связан с Н.pylori поверхностным антигеном.
ПРИМЕР 4: Иммуноблоттинг
Белки Н.pylori антигенного препарата разделяют посредством электрофореза в полиакриламидном геле в ДДС-ПААГ (10 мкг белков/ лунку) и затем переносят на нитроцеллюлозную бумагу в мини транс-блот электрофоретическом переносчике клеток (BioRad, Richmond, CA, USA). Нитроцеллюлозную бумагу блокируют 10%-ным БСА в ЗФР, содержащем 0,1% Твин 20, в течение 1 часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Затем добавляют фаг В8 (1011 трансдуцирующих единиц/мл) и инкубируют вместе с нитроцеллюлозной бумагой в течение ночи при осторожном перемешивании при +4oС. Отсутствие первичного антитела используют в качестве негативного контроля. После промывания ЗФР-0,1% Твин 20 нитроцеллюлозную бумагу инкубируют с конъюгатом НRТ/анти-М13 (1:5000 разведение в блокирующем буфере) в течение 1 часа при перемешивании. Выявление связывания осуществляли с помощью ELC Detection Kit (Amersham, UK).
Белки Н.pylori антигенного препарата разделяют посредством электрофореза в полиакриламидном геле в ДДС-ПААГ (10 мкг белков/ лунку) и затем переносят на нитроцеллюлозную бумагу в мини транс-блот электрофоретическом переносчике клеток (BioRad, Richmond, CA, USA). Нитроцеллюлозную бумагу блокируют 10%-ным БСА в ЗФР, содержащем 0,1% Твин 20, в течение 1 часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Затем добавляют фаг В8 (1011 трансдуцирующих единиц/мл) и инкубируют вместе с нитроцеллюлозной бумагой в течение ночи при осторожном перемешивании при +4oС. Отсутствие первичного антитела используют в качестве негативного контроля. После промывания ЗФР-0,1% Твин 20 нитроцеллюлозную бумагу инкубируют с конъюгатом НRТ/анти-М13 (1:5000 разведение в блокирующем буфере) в течение 1 часа при перемешивании. Выявление связывания осуществляли с помощью ELC Detection Kit (Amersham, UK).
После окрашивания нитроцеллюлозной бумаги амидо черным главные полосы соответствовали белкам 64 кДа, 36 кДа, 31 кДа и 27 кДа. Объединенные MAbs (2H6, 5D8 и 5F8, соответствующие гибридомам, использованным для конструирования фагов) взаимодействуют с полосами 32 кДа и 64 кДа. Аналогичное окрашивание было получено при иммуноблоттинге с фаговым антителом В8. Этот результат свидетельствует о том, что гены вариабельных тяжелых и легких цепей, соответствующих H. pylori специфическим моноклональным антителам, правильно экспрессировались на фаге.
ПРИМЕР 5: Действие рекомбинантного фага на бактерии
В следующих экспериментах бактерии культивируют при +37oС в бруцеллярном бульоне, содержащем 5% фетальной телячьей сыворотки, в атмосфере, содержащей 10% СО2 и 5% O2.
В следующих экспериментах бактерии культивируют при +37oС в бруцеллярном бульоне, содержащем 5% фетальной телячьей сыворотки, в атмосфере, содержащей 10% СО2 и 5% O2.
Эксперимент начинают ("время 0"), когда 20 мкл из бактериального запаса смешивают с 10 мл бульона. В указанные моменты времени определяют количество КОЕ (колониеобразующие единицы) на 1 мл культуры путем разведения аликвот культур в ЗФР и распыления разведений по поверхности агаровых пластинок. Пластинки инкубируют два дня при +37oC и подсчитывают количество колоний на каждой пластинке.
5.1. Зависящее от времени действие
Зависящее от времени действие рекомбинантного фага В8 на рост штамма 17874 H.pylori исследуют путем измерения КОЕ в течение трех дней при наличии фага и без него (Таблица 1). К 10 мл среды в момент "время 0" добавляют 106 фагов ("+фаг"). В контроле фаги не добавляют ("-фаг").
Зависящее от времени действие рекомбинантного фага В8 на рост штамма 17874 H.pylori исследуют путем измерения КОЕ в течение трех дней при наличии фага и без него (Таблица 1). К 10 мл среды в момент "время 0" добавляют 106 фагов ("+фаг"). В контроле фаги не добавляют ("-фаг").
Спустя 3 дня, КОЕ увеличивалось примерно на 5 порядков величины в отсутствие рекомбинантного фага. Спустя сутки в присутствии фага, имело место снижение КОЕ примерно на один порядок величины, и культуральный бульон изменял свой вид от мутного до менее мутного раствора.
5.2. Действие на различные бактериальные штаммы
Лабораторные штаммы Н. pylori 17874, 1139 и 244, а также Staphylococcus aureus, ATCC 29213 и E.coli TG1 культивируют с фагом (106 фагов на 10 мл среды) или без него в течение 24 часов. КОЕ анализируют в момент "время 0" и через 24 часа (Таблица 2). Рекомбинантный фаг снижал КОЕ трех Н.pylori тестировавшихся штаммов, но не влиял на Staphylococcus или e.coll. Хелперный фаг М13К07, используемый в качестве контроля, не влиял на H.pyldri 17874.
Лабораторные штаммы Н. pylori 17874, 1139 и 244, а также Staphylococcus aureus, ATCC 29213 и E.coli TG1 культивируют с фагом (106 фагов на 10 мл среды) или без него в течение 24 часов. КОЕ анализируют в момент "время 0" и через 24 часа (Таблица 2). Рекомбинантный фаг снижал КОЕ трех Н.pylori тестировавшихся штаммов, но не влиял на Staphylococcus или e.coll. Хелперный фаг М13К07, используемый в качестве контроля, не влиял на H.pyldri 17874.
5.3. Действие на штаммы Н. pylori
Во втором эксперименте (Таблица 3) штаммы Н.pylori 17874, 1139, 253, 25 и 66 тестируют вместе со Streptococcus (Raf M87). Без фага КОЕ возрастало в течение 24 часов инкубации у всех тестировавшихся бактерий. Однако в культуре с присутствующим рекомбинантным фагом (106 фагов на 10 мл среды в момент "время 0") значения КОЕ штаммов Н.pylori 17874, 1139 и 25 снижались по количеству, а скорость роста штаммов 253 и 66 была сильно понижена по сравнению с контролем. Таким образом, тестировавшиеся штаммы Н.pylori были подвержены действию фагов.
Во втором эксперименте (Таблица 3) штаммы Н.pylori 17874, 1139, 253, 25 и 66 тестируют вместе со Streptococcus (Raf M87). Без фага КОЕ возрастало в течение 24 часов инкубации у всех тестировавшихся бактерий. Однако в культуре с присутствующим рекомбинантным фагом (106 фагов на 10 мл среды в момент "время 0") значения КОЕ штаммов Н.pylori 17874, 1139 и 25 снижались по количеству, а скорость роста штаммов 253 и 66 была сильно понижена по сравнению с контролем. Таким образом, тестировавшиеся штаммы Н.pylori были подвержены действию фагов.
ПРИМЕР 6: Иммунофлуоресцентное окрашивание Н.pylori
Фаговое антитело В8 концентрируют ПЭГ осаждением и проводят флуоресцентное окрашивание на Н.pylori (17874 штамм), взятый из культуры.
Фаговое антитело В8 концентрируют ПЭГ осаждением и проводят флуоресцентное окрашивание на Н.pylori (17874 штамм), взятый из культуры.
Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания готовят следующие запасные реагенты:
Реагент А: 1012 трансдуцирующих единиц/мл фаговых антител разбавляют 1:1 с помощью 1% БСА/ЗФР;
Реагент Б: овечий анти-М13 IgG, разведенный 1% БСА/ЗФР;
Реагент В: анти-овечий IgФИТЦ конъюгат, разведение 1:100 в БСА/ЗФР;
Реагент Г: 1 мг (мас./об.) проназы в ЗФР.
Реагент А: 1012 трансдуцирующих единиц/мл фаговых антител разбавляют 1:1 с помощью 1% БСА/ЗФР;
Реагент Б: овечий анти-М13 IgG, разведенный 1% БСА/ЗФР;
Реагент В: анти-овечий IgФИТЦ конъюгат, разведение 1:100 в БСА/ЗФР;
Реагент Г: 1 мг (мас./об.) проназы в ЗФР.
Через три дня культивирования Н. pylori (5 различных штаммов), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) и Streptococcus (Raf M 87) по-раздельности суспендируют в ЗФР, содержащем 1% БСА. На стеклянные предметные стекла наносят по 20 мкл суспензии каждой бактерии. Бактерии сушат на воздухе и фиксируют в нейтральном формалине в течение 2 минут, затем промывают путем шестикратного погружения предметных стекол в воду и сушат на воздухе при комнатной температуре. Короткая обработка в реагенте Г увеличивала соотношение сигнала к помехам при сравнении предметных стекол с образцами с контролем. Предметные стекла последовательно инкубируют с 30 мкл реагентов А, Б и В в течение 30 минут каждый раз, и между инкубациями промывают в ЗФР. Предметные стекла сушат на воздухе и перед покрытием добавляют 1 каплю SlowFade. Все инкубации проводят при комнатной температуре. Негативные контроли готовят путем исключения первичного антитела.
Результаты показывают, что Н.pylori позитивно окрашивается фаговым антителом. Результаты свидетельствуют о хорошем согласовании со значениями КОЕ, полученными из культуральных экспериментов. Таким образом, экспрессия специфического антигена на поверхности бактерий, очевидно, является предпосылкой для осуществления биологического действия фагом В8.
ХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Согласно Будапештскому договору в Европейской коллекции культур животных клеток (ЕСАСС), Salisbury, Wiltshire, U.K., 15 декабря 1995 года были депонированы следующие гибридомные клоны:
2Н6 (ЕСАСС No. 95121526);
5D8 (ЕСАСС No. 95121527);
5F8 (ECACC No. 95121524).
Согласно Будапештскому договору в Европейской коллекции культур животных клеток (ЕСАСС), Salisbury, Wiltshire, U.K., 15 декабря 1995 года были депонированы следующие гибридомные клоны:
2Н6 (ЕСАСС No. 95121526);
5D8 (ЕСАСС No. 95121527);
5F8 (ECACC No. 95121524).
Рекомбинантный фаг В8 был депонирован согласно Будапештскому договору в Национальных коллекциях промышленных и морских бактерий (NCIMB), Aberdeen, Scotland, 20 декабря 1995 года под вступительным номером NCIMB 40779.
Claims (17)
1. Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для использования в лечении или профилактике бактериальной инфекции, при этом на поверхности указанного бактериофага выставлен рекомбинантный белок, содержащий 1) первый компонент, полученный из поверхностного белка бактериофага, и 2) второй компонент, содержащий ScFv полипептид, включающий последовательности вариабельной области антитела, предоставляющие сайт связывания бактериального антигена, придавая указанному бактериофагу способность связываться с бактериальными клетками, вовлеченными в этиологию указанной инфекции, и тем самым ингибировать их рост, при этом нуклеиновая кислота бактериофага изменена таким образом, что к ее участку, кодирующему часть указанного поверхностного белка, используемую в указанном первом компоненте и ответственную за связывание с фаговой частицей, примыкает участок нуклеиновой кислоты, кодирующий вариабельные части антитела, специфичные по указанной бактериальной инфекции.
2. Конструкция по п. 1, в которой второй компонент содержит последовательность вариабельной области антитела, предоставляющего сайт связывания антигена бактериальной инфекции слизистой оболочки.
3. Конструкция по п. 2, в которой второй компонент содержит последовательность вариабельной области антитела, представляющего сайт связывания антигена Helicobacter pуlori.
4. Конструкция по любому из пп. 1-3, которая является модифицированным бактериофагом М13.
5. Конструкция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанный первый компонент указанного рекомбинантного белка получен из белка, ответственного за адсорбцию немодифицированной формы указанного бактериофага на бактериальной фимбрии.
6. Конструкция по любому из пп. 1-5, которая является модифицированным бактериофагом М13, в котором указанный первый компонент указанного рекомбинантного белка получен из g3р белка.
7. Конструкция по п. 6, отличающаяся тем, что указанный рекомбинантный белок является белком слияния g3p - ScFv.
8. Конструкция по любому из пп. 1-7 для использования в лечении или профилактике инфекции Helicobacter pуlori.
9. Конструкция по п. 8, отличающаяся тем, что последовательности вариабельной области антитела указанного рекомбинантного полипептида являются последовательностями вариабельной области моноклонального антитела, выбранного из моноклональных антител гибридомных клеточных линий 5F8 (ЕСАСС 95121524), 2Н6 (ЕCАСС 95121526) и 5D8 (ЕСАСС 95121527).
10. Конструкция по любому из пп. 1-9 для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики бактериальной инфекции слизистой оболочки.
11. Модифицированный бактериофаг М13, обозначенный как В8, депонированный в Национальной Коллекции Промышленных и Морских Бактерий (NCIMD, Абердин, Шотландия) под вступительным номером NCIMB 40779, обладающий способностью связываться с Helicobacter pуlori и инфицировать ее и используемый для лечения или профилактики бактериальной инфекции.
12. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики бактериальной инфекции путем связывания с бактериальными клетками, вовлеченными в этиологию указанной инфекции, содержащая бактериофаг по любому из пп. 1-10 или штамм по п. 11, в связи с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
13. Способ лечения бактериальной инфекции у млекопитающего, при котором вводят в эффективном количестве бактериофаг по любому из пп. 1-10, штамм по п. 11 или фармацевтическую композицию по п. 12.
14. Моноклональное антитело для лечения или профилактики бактериальной инфекции, выбранное из моноклональных антител, продуцируемых гибридомами 5F8 (ЕСАСС 95121524), 2Н6 (ЕСАСС 95121526) и 5D8 (ЕСАСС 95121527), содержащее вариабельные участки, специфичные к антигенам Н. pylory, и обеспечивающие способность бактериофага по п. 11 связывать и инфицировать Н. pylory.
15. Гибридома 5F8 (ЕСАСС 95121524) для продуцирования моноклонального антитела по п. 14 против инфекции Н. pylori.
16. Гибридома 2Н6 (ЕСАСС 95121526) для продуцирования моноклонального антитела по п. 14 против инфекции Н. pylori.
17. Гибридома 5D8 (ЕСАСС 95121527) для продуцирования моноклонального антитела по п. 14 против инфекции Н. pylori.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9600434-6 | 1996-02-06 | ||
| SE9600434A SE506771C2 (sv) | 1996-02-06 | 1996-02-06 | Fusionsprotein, bakteriofag uttryckande proteinet, dessas användning samt hybridoma celler och monoklonaler producerade av cellerna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98116471A RU98116471A (ru) | 2000-10-20 |
| RU2215032C2 true RU2215032C2 (ru) | 2003-10-27 |
Family
ID=20401289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98116471/13A RU2215032C2 (ru) | 1996-02-06 | 1997-02-05 | Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для лечения или профилактики бактериальной инфекции, модифицированный бактериофаг м13, фармкомпозиция и способ лечения бактериальной инфекции, моноклональное антитело, гибридома (вариант) |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0889955B1 (ru) |
| JP (1) | JP4015195B2 (ru) |
| KR (1) | KR100459638B1 (ru) |
| CN (1) | CN1125174C (ru) |
| AT (1) | ATE266091T1 (ru) |
| AU (1) | AU712767B2 (ru) |
| CA (1) | CA2244792A1 (ru) |
| DE (1) | DE69728975T2 (ru) |
| ES (1) | ES2221033T3 (ru) |
| HU (1) | HUP9901242A3 (ru) |
| IL (2) | IL125645A0 (ru) |
| NO (1) | NO323359B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ331580A (ru) |
| RU (1) | RU2215032C2 (ru) |
| SE (1) | SE506771C2 (ru) |
| WO (1) | WO1997029185A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503716C1 (ru) * | 2012-09-27 | 2014-01-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИОФАГА, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ Staphylococcus aureus, ВКЛЮЧАЯ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000006717A2 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Genentech, Inc. | Improved transformation efficiency in phage display through modification of a coat protein |
| GB9908195D0 (en) | 1999-04-09 | 1999-06-02 | Microbiological Res Authority | Treatment of intracellular infection |
| EP1187914B1 (en) | 1999-06-14 | 2005-05-25 | Genentech, Inc. | A structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage |
| DE60113851T2 (de) * | 2000-07-25 | 2006-07-20 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Bakteriophage mit breitem wirtsspektrum |
| US6914123B2 (en) | 2001-04-17 | 2005-07-05 | Genentech, Inc. | Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto |
| KR20040036176A (ko) * | 2002-10-23 | 2004-04-30 | (주)엘피스바이오텍 | 단백질의 특이적 결합을 매개로 한 박테리오파아지의선택적 숙주감염을 이용한 단백질간의 상호작용을분석하는 방법 |
| CN102296051B (zh) * | 2011-03-07 | 2014-09-17 | 江苏省农业科学院 | 一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌噬菌体及其应用 |
| GB201308745D0 (en) * | 2013-05-15 | 2013-06-26 | Imp Innovations | Bacteriophage |
| CN106198523A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-12-07 | 哈尔滨贝贝凯尔科技发展有限公司 | 微量元素检测试纸及其制备方法 |
| US20200271657A1 (en) | 2017-10-04 | 2020-08-27 | Opko Pharmaceuticals, Llc | Articles and methods directed to personalized therapy of cancer |
| CN112739416B (zh) * | 2018-12-27 | 2024-09-06 | 国立大学法人东海国立大学机构 | 宿主细菌特异性纳米粒子 |
| CN109679981A (zh) * | 2019-02-21 | 2019-04-26 | 武汉大学 | 一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9015198D0 (en) * | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| SE9304060D0 (sv) * | 1993-12-06 | 1993-12-06 | Bioinvent Int Ab | Sätt att selektera specifika bakteriofager |
-
1996
- 1996-02-06 SE SE9600434A patent/SE506771C2/sv not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-02-05 WO PCT/SE1997/000172 patent/WO1997029185A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-05 HU HU9901242A patent/HUP9901242A3/hu unknown
- 1997-02-05 CA CA002244792A patent/CA2244792A1/en not_active Abandoned
- 1997-02-05 AU AU16817/97A patent/AU712767B2/en not_active Ceased
- 1997-02-05 AT AT97902815T patent/ATE266091T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-05 JP JP52844697A patent/JP4015195B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-05 ES ES97902815T patent/ES2221033T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-05 KR KR10-1998-0705761A patent/KR100459638B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-05 IL IL12564597A patent/IL125645A0/xx active IP Right Grant
- 1997-02-05 CN CN97192116A patent/CN1125174C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-05 EP EP97902815A patent/EP0889955B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-05 DE DE69728975T patent/DE69728975T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-05 NZ NZ331580A patent/NZ331580A/en unknown
- 1997-02-05 RU RU98116471/13A patent/RU2215032C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-27 NO NO19983456A patent/NO323359B1/no unknown
- 1998-08-03 IL IL125645A patent/IL125645A/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503716C1 (ru) * | 2012-09-27 | 2014-01-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИОФАГА, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ Staphylococcus aureus, ВКЛЮЧАЯ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU712767B2 (en) | 1999-11-18 |
| WO1997029185A1 (en) | 1997-08-14 |
| NO983456L (no) | 1998-10-06 |
| KR19990082041A (ko) | 1999-11-15 |
| EP0889955B1 (en) | 2004-05-06 |
| SE506771C2 (sv) | 1998-02-09 |
| CA2244792A1 (en) | 1997-08-14 |
| JP4015195B2 (ja) | 2007-11-28 |
| NO323359B1 (no) | 2007-04-10 |
| CN1125174C (zh) | 2003-10-22 |
| IL125645A0 (en) | 1999-04-11 |
| EP0889955A1 (en) | 1999-01-13 |
| AU1681797A (en) | 1997-08-28 |
| DE69728975D1 (de) | 2004-06-09 |
| DE69728975T2 (de) | 2005-05-04 |
| NO983456D0 (no) | 1998-07-27 |
| NZ331580A (en) | 1999-09-29 |
| ATE266091T1 (de) | 2004-05-15 |
| KR100459638B1 (ko) | 2005-02-24 |
| HUP9901242A2 (hu) | 1999-07-28 |
| JP2000505648A (ja) | 2000-05-16 |
| SE9600434L (sv) | 1997-08-07 |
| SE9600434D0 (sv) | 1996-02-06 |
| ES2221033T3 (es) | 2004-12-16 |
| HUP9901242A3 (en) | 2000-03-28 |
| CN1210558A (zh) | 1999-03-10 |
| IL125645A (en) | 2006-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2215032C2 (ru) | Конструкция модифицированного нитевидного бактериофага для лечения или профилактики бактериальной инфекции, модифицированный бактериофаг м13, фармкомпозиция и способ лечения бактериальной инфекции, моноклональное антитело, гибридома (вариант) | |
| Cao et al. | Helicobacter pylori-antigen-binding fragments expressed on the filamentous M13 phage prevent bacterial growth | |
| Cai et al. | A smooth-type, phage-resistant Klebsiella pneumoniae mutant strain reveals that OmpC is indispensable for infection by phage GH-K3 | |
| Thorns et al. | Detection of a novel fimbrial structure on the surface of Salmonella enteritidis by using a monoclonal antibody | |
| EA018030B1 (ru) | Связывающие молекулы человека, имеющие убивающую активность против стафилококков, и их применения | |
| US20020044922A1 (en) | Recombinant phages | |
| Leavitt et al. | Bacteriophage P22 SieA-mediated superinfection exclusion | |
| US6497874B1 (en) | Recombinant phages | |
| CN104531730B (zh) | 产气荚膜梭菌α毒素人源化单链抗体8B | |
| JPS58212781A (ja) | 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法 | |
| Labadie et al. | Selection of cell wall antigens for the rapid detection of bacteria by immunological methods | |
| CN109206484B (zh) | 一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段 | |
| AU5328599A (en) | Gastrointestinal bacterial antibody factories | |
| Ojobor | The Noncontractile Phage Tail-Like Bacterial Killing Nanomachines–Characterizing the Specificity Determinants of the F-Pyocins of Pseudomonas aeruginosa | |
| EP4342538A1 (en) | Simultaneous production of structural proteins from heterologous bacteriophage in cell-free expression system | |
| Dowah | Identification of the receptor binding proteins for Clostridium difficile Bacteriophages | |
| Kan | WIP1 Phage Specificity for B. Anthracis | |
| CN118344443A (zh) | 一种增强噬菌体对肠黏膜黏附能力的蛋白a | |
| CN118480121A (zh) | 一种特异性结合金黄色葡萄球菌蛋白a的抗体及其应用 | |
| Magnan | Investigating the Determinants of Host Range Specificity of Pseudomonas aeruginosa Phage | |
| Seetharaman Srinivasan | Using Phage Display to Identify Peptides that Bind to the Surface of Helicobacter pylori | |
| Narasanna et al. | Experimental protection of ESBL producing Salmonella typhi bacteremic induced mice model by φGRCST; a therapeutic approach | |
| Petrenko et al. | Phage Landscape Libraries as a Source of Substitute Antibodies for Detection Platforms | |
| JPS60118188A (ja) | 新規な組み換え体ｄνａ | |
| Karlström | Identification of a putative IS element in Streptococcus equi subspecies equi |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080206 |