ES2275840T3 - Metodo y composiciones para inmunizar con el antigeno v de pseudomonas. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal anti-PcrV o uno de sus fragmentos que reconoce un epítopo en la región de residuos de aminoácidos 144 a 257 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido PcrV.
Description
Método y composiciones para inmunizar con el
antígeno V de Pseudomonas.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno
bacteriano oportunista que es capaz de causar infecciones pulmonares
agudas mortales en individuos críticamente enfermos (1). La
capacidad de la bacteria para dañar el epitelio pulmonar se ha
asociado con la expresión de toxinas que se inyectan directamente
dentro de células eucariotas por medio de un mecanismo de secreción
y translocación mediadas de tipo III (2, 3).
Las proteínas codificadas mediante el aparato de
secreción y translocación de tipo III de P. aeruginosa
manifiestan un alto nivel de identidad de aminoácidos con miembros
del regulón Yop de Yersinia (4-6). De todos
los sistemas de tipo III descubiertos en bacterias
gram-negativas, sólo P. aeruginosa posee un
homólogo al antígeno V de Yersinia, PcrV (véase 6 para
revisión de los sistemas de tipo III). Las proteínas homólogas al
aparato de secreción y translocación se codifican tanto por
bacterias patógenas de plantas como por bacterias patógenas de
animales. Estos organismos incluyen patógenos humanos tales como
Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, E. coli
enteropatógena, Chlamydia spp., y patógenos de plantas tales
como Xanthamonas campestris, Pseudomonas syringae, Erwinia
amylovora y Ralstonia solanacearum. Sin embargo, sólo
P. aeruginosa y Yersinia codifican el antígeno V.
Yahr et al., 1997, describe la secuencia
de operón que codifica PcrV y compara la secuencia con la proteína
LcrV. Así, la secuencia de aminoácidos de PcrV es conocida y está
disponible con el número de acceso AF010149 de GenBank.
El documento WO 00/33872 se refiere a
procedimientos de, y composiciones para, inmunización con el
antígeno V de Pseudomonas. Sawa et al. (1999) Nature
Medicine, 5: 392-398 se refiere a inmunización
activa y pasiva con antígeno V de Pseudomonas.
La presente invención implica procedimientos y
composiciones desarrollados a partir de nuestra observación de que
el antígeno V de Pseudomonas se puede usar para proteger
animales de una infección pulmonar mortal.
La invención proporciona los anticuerpos de
PcrV, los derivados de anticuerpos de PcrV y los fragmentos de
anticuerpos de PcrV. Así, la presente invención proporciona un
anticuerpo monoclonal anti-PcrV o fragmento del
mismo que reconoce un epítopo en la región de residuos de
aminoácidos 144 a 257 en la secuencia de aminoácidos polipeptídica
de PcrV.
La presente invención proporciona también:
- -
- una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
- -
- un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención.
La invención proporciona además el uso de un
anticuerpo o fragmento de la invención en la elaboración de un
medicamento para tratar o prevenir infección por Pseudomonas
aeruginosa en un paciente; reducir la patogenicidad de
infección por Pseudomonas aeruginosa en un paciente; o para
modular la citotoxicidad de Pseudomonas para la(s)
célula(s) humana(s).
La presente invención proporciona además un
procedimiento para modular la citotoxicidad de Pseudomonas
para una célula humana in vitro que comprende poner en
contacto dicha Pseudomonas con el anticuerpo o fragmento de
la invención en presencia de la célula humana.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente invención llegarán a ser evidentes para un experto en la
técnica después de revisión de la memoria descriptiva,
reivindicaciones y dibujos.
Las Figuras 1A y 1B son un gel teñido (Fig. 1A)
y una transferencia Western (Fig. 1B) que ilustran el análisis
fenotípico de PA103\DeltapcrV.
Las Figuras 2A y 2B son un gráfico (Fig. 2A) y
una serie de gráficos de barras (Fig. 2B) que ilustran la
supervivencia y la lesión pulmonar de las cepas parental y mutante
de P. aeruginosa.
Las Figuras 3A y 3B son un gráfico (Fig. 3A) y
una serie de gráficos de barras (Fig. 3B) que ilustran el efecto de
inmunización sobre la supervivencia, lesión pulmonar y colonización
bacteriana.
La Figura 4 es un gráfico del número de animales
que sobreviven en una exposición provocada con 5 x 10^{5}
UFC/ratón de cepa PA103 después de administración pasiva de IgG
policlonal específica para PcrV, ExoU, PopD o IgG control a partir
de una animal no inmunizado.
La Figura 5 es un gráfico (Fig. 5A) y una serie
de gráficos de barras (Fig. 5B) que ilustran supervivencia y
protección frente a lesión pulmonar mediante administración
concomitante de IgG a diferentes antígenos bacterianos y exposición
provocada con bacterias. Análisis de varianza de un sentido para
lesión pulmonar, p = 0,026, y edema pulmonar, p < 0,0005.
Las Figuras 6A y B son copias impresas de SEQ ID
NOs: 1 y 2 con información explicativa adicional. La Figura 6A es
SEQ ID NO: 1. La Figura 6B es SEQ ID NO: 2.
La Figura 7 es una copia impresa de SEQ ID NOs:
3 y 4 con información explicativa adicional.
La Figura 8 es un anticuerpo de cadena simple
recombinante sintético (SCFV-M166) (SEQ ID NOs: 5 y
6).
Los autores de la invención describen en el
presente documento que PcrV tiene un efecto regulador en la
expresión de productos segregados de tipo III, está implicado en la
translocación de toxinas de tipo III y es el primer antígeno que
protege contra la lesión pulmonar inducida por infección de P.
aeruginosa. La vacunación contra PcrV antes de la instilación
del espacio aéreo de IgG anti-PcrV no sólo asegura
la supervivencia de los animales sometidos a exposición provocada
sino que también disminuye la inflamación pulmonar y las lesiones
causada por las bacterias.
LcrV, o el antígeno V, es una proteína
multifuncional que regula la secreción/translocación de las
proteínas efectoras Yop y desempeña una función extracelular en la
patogénesis alterando la respuesta de citoquinas a infección por
Yersinia (7-1). El único homólogo conocido de este
factor patógeno crítico es una proteína extracelular codificada por
P. aeruginosa, llamada PcrV.
Un procedimiento para moderar o inhibir una
infección por Pseudomonas inmunizando un paciente con una
cantidad efectiva del antígeno PcrV. Por "cantidad efectiva"
queremos decir una cantidad de antígeno PcrV efectiva para mostrar
alguna moderación o inhibición de la infección por
Pseudomonas según se compara con sujetos o animales control
quienes no han sido tratados con el antígeno.
Mediante "moderar" los autores quieren
decir que la infección se inhibe en al menos un cincuenta por ciento
comparada con un animal no inmunizado. Preferiblemente, la
infección es prevenida completamente. Una valoración cuantitativa
de la infección incluirá preferiblemente el examen de la cantidad de
bacterias en el torrente sanguíneo o los líquidos pleurales y/o un
examen de parámetros de lesión pulmonar. Por ejemplo, la ausencia
de bacterias en el torrente sanguíneo o los líquidos pleurales
indicarían la prevención de infección. Una reducción en parámetros
de lesión pulmonar indica que la infección es moderada.
La infección se podría valorar cuantitativamente
mediante varios otros indicadores clínicos, incluyendo la reducción
de carga bacteriana en el esputo, la sangre o los líquidos
pleurales, reducción en el tamaño del infiltrado, mejora de la
oxigenación, reducción en el tiempo en ventilación mecánica,
reducción en fiebre y reducción en recuento leucocitario.
Por "antígeno PcrV" los autores de la
invención quieren decir la parte o fragmento de la proteína de PcrV
que es necesaria para invocar una respuesta inmune la cual previene
o modera la infección. Se ha usado la proteína PcrV de longitud
total como un antígeno para inducir protección. Adicionalmente, se
ha realizado el mapeo del epítopo protector para el fragmento que
comprende los aminoácidos 144-257 de PcrV. Para
definir el epítopo, los anticuerpos monoclonales que protegieron
contra infección y citotoxicidad se ensayaron para determinar la
unión a formas progresivamente más pequeñas de PcrV recombinante.
(Por "PcrV recombinante" o "rPcrV" los autores quieren
decir la proteína producida a partir de un gen de PcrV que se ha
situado en un huésped no nativo). Esta protección localizó la
región.
El antígeno PcrV se puede obtener más fácilmente
mediante el procedimiento usado por los autores de la invención,
plásmido pet16b de expresión bacteriana disponible comercialmente de
Novagen. El gen de PcrV se clonó primero a partir del cromosoma de
P. aeruginosa como parte de un operón. La región codificante
se amplificó y se insertó dentro de dos vectores diferentes. Un
vector es para expresión a partir de P. aeruginosa como se
muestra en la Figura 1. Este es un vector de Herbert Schweizer
(referencia 19) el cual modificaron los autores de la invención
para contener una secuencia promotora apropiada tal que la expresión
de PcrV se regule coordinadamente con el resto del aparato de
administración e intoxicación de la bacteria. El segundo plásmido,
pET16B, es para propósitos de expresión y purificación en E.
coli.
La ventaja de este sistema es que los autores de
la invención no tienen que preocuparse de proteínas de P.
aeruginosa que contaminen, la proteína se produce en gran
abundancia, y hay un procedimiento de purificación de una etapa. Es
esta situación la región codificante de PcrV se amplifica para
clonarse en fase con una marca de histidina provista en el vector
pET16b. Los residuos de histidina múltiples condensados al extremo
amino terminal de PcrV permiten cromatografía de afinidad usando
una columna de níquel-NTA. Por lo tanto, un antígeno
PcrV preferible es una versión recombinante de la proteína PcrV
natural.
La inmunización se puede realizar por vía
sistémica o intranasal. La inmunización de estos individuos
comenzaría preferiblemente durante los procedimientos de vacunación
normal para otras enfermedades infantiles. Los autores de la
invención predicen protección a largo plazo con dosis de recuerdo
probablemente alrededor de 5 y 10 años.
Se puede usar ADN que codifica la proteína PcrV
o los complementos de este ADN para detectar de forma diagnóstica
infección por P. aeruginosa. Se puede obtener la secuencia de
ADN del antígeno PcrV en GenBank AF010149. La región codificante
para PcrV está en los nucleótidos 626-1510. También
se puede usar un fragmento de esta región codificante o complemento
de este fragmento. Una sonda satisfactoria es una que hibrida
específicamente con el ADN de PcrV y no con otras regiones.
Se puede usar preferiblemente una sonda de
hibridación de al menos 40 nucleótidos continuos en la secuencia de
antígenos de dos cebadores de al menos 25 nucleótidos en la
secuencia. Un experto en la técnica apreciaría que serían adecuadas
muchas formas estándar de técnicas de diagnóstico de ácidos
nucleicos, por ejemplo, hibridación de la sonda de 40 nucleótidos
de cadena simple a ADN o ARN extraídos de un esputo del paciente. En
otro ejemplo, el esputo del paciente se usaría como una fuente de
ADN o ARN bacteriano para servir como molde para la reacción de PCR
o PCR-RT, respectivamente.
Se puede determinar también la infección por
Pseudomonas aeruginosa en un individuo poniendo en contacto
una muestra obtenida del individuo con un anticuerpo específico
para PcrV y correlacionando unión a anticuerpo potenciada comparada
con una muestra control con infección por Pseudomonas
aeruginosa en el individuo.
El ADN que codifica PcrV se puede usar como una
vacuna génica que usa procedimientos biológicos moleculares
normalizados. Por ejemplo, se podría revisar las siguientes
referencias mediante técnicas conocidas por los expertos en la
técnica: Davis, H.L., et al., "ADN vaccine for hepatitis B:
Evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with
other vaccines", Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
7213-7218, 1996; Barry, M.A:, et al.,
"Protection against mycoplasma infection using
expression-library immunization", Nature,
377: 632-635, 1995; Xiang, Z.Q., et al.,
"Immune responses to nucleic acid vaccines to rabies virus",
Virology 209: 569-579, 1995. Por "cantidad
efectiva" de una vacuna génica, los autores de la invención
quieren decir una cantidad de vacuna efectiva para moderar o
eliminar la infección por Pseudomonas o los síntomas de
infección por Pseudomonas.
La proteína o antígeno podría usarse también
para detectar anticuerpos en pacientes y, así, predecir el estado
de infección del paciente. Se pondría en contacto preferiblemente
una muestra obtenida a partir de un individuo sospechoso de
infección por Pseudomonas con la proteína PcrV o fragmento de
la misma y se detectaría unión de proteína/anticuerpo. Se puede
correlacionar después la unión de anticuerpo potenciada (comparada
con una muestra control) con infección por Pseudomonas
aeruginosa en el individuo. Se podría también usar el anticuerpo
de PcrV o fragmentos de anticuerpos de PcrV terapéuticamente.
En otra realización, la invención es el uso de
la secuencia del anticuerpo (que los autores de la invención
describen más adelante y en SEQ ID NOs: 1-4) para
producir anticuerpos de cadena simple recombinantes que pueden
bloquear PcrV y también se podría utilizar la secuencia en
experimentos de administración de genes, donde se administrarían
vectores eucarióticos que conducirían después a la producción de
anticuerpos de cadena simple en animales durante periodos
prolongados. La secuencia se podría utilizar también para humanizar
el anticuerpo monoclonal murino para producir un producto que se
puede utilizar en cuidado de pacientes humanos.
Una vez el anticuerpo es seguro para uso humano,
se podría: (a) administrar sistémicamente y (b) administrar dentro
de los pulmones bien como un tratamiento preventivo o como una
terapia. Con el fin de usar el anticuerpo de PcrV en humanos, el
anticuerpo preferiblemente se "humaniza". En general, una vez
que se obtiene el anticuerpo monoclonal, se clonan las regiones
variables de cadena pesada y ligera. Estos fragmentos clonados se
insertan después dentro de un armazón de anticuerpos humanos
(regiones constantes). Asi, los autores de la invención pueden
controlar la clase de anticuerpo (IgG, IgA, etc.) además de
proporcionar la especificidad de unión.
Para usar en la presente invención, el
anticuerpo de PcrV es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos
pueden ser humanos o humanizados, en particular para aplicaciones
terapéuticas. Los fragmentos o derivados de anticuerpo, tales como
Fab, F(ab')_{2} o Fv, se pueden usar también. Los
anticuerpos de cadena simple, por ejemplo como se describen en
Huston, et al., (Int. Rev. Immunol. 10:
195-217, 1993) pueden también encontrar uso en los
procedimientos descritos anteriormente. Por "cantidad eficaz"
del anticuerpo de PcrV o del fragmento de anticuerpo de PcrV los
autores de la invención quieren decir una cantidad suficiente para
moderar o eliminar la infección por Pseudomonas o los
síntomas de la infección.
Con preferencia, los anticuerpos monoclonales
humanos o humanizados para PcrV se administran para prevenir o
tratar infecciones por P. aeruginosa. En pacientes en alto
riesgo de infección por P. aeruginosa, los anticuerpos se
podrían administrar para prevenir la infección. Además, los
anticuerpos se pueden administrar después de la aparición de
infección para tratar la infección. En este caso, los anticuerpos se
pueden administrar solos o en combinación con antibióticos. La
administración de anticuerpos en combinación con antibióticos puede
permitir la administración de tratamientos más cortos o dosis
menores de antibióticos, disminuyendo de este modo el riesgo de
aparición de organismos con resistencia a antibióticos.
Los autores de la invención prevén al menos tres
tipos de pacientes hipotéticos: (1) un individuo sano en riesgo de
herida o quemadura grave (bombero, personal militar, policía) sería
inmunizado con la vacuna mediante una metodología (bien mediante
inyección o bien intranasal) que daría protección a largo plazo. Se
daría un recuerdo en la admisión (inyección intramuscular) en el
hospital después de una herida. (2) Un paciente que se somete a
ventilación mecánica. (3) Un paciente al que se ha diagnosticado
genéticamente fibrosis quística.
Además de anticuerpos de PcrV y fragmentos de
anticuerpo de PcrV, también se hace referencia a peptidomiméticos o
no peptidomiméticos de molécula pequeña los cuales se pueden diseñar
para imitar la acción de los anticuerpos de PcrV en inhibir o
modular la infección por Pseudomonas, presumiblemente
interfiriendo con la acción de PcrV. Los procedimientos para
diseñar tales imitadores de molécula pequeña se conocen bien (véase,
por ejemplo, Ripka and Rich, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:
441-452, 1998; Huang, et al., Biopolymers 43:
367-382, 1997; al-Olbeidí, et
al., Mol. Biotechnol. 9: 205-223, 1998). Los
inhibidores de moléculas pequeñas que se diseñan basados en el
anticuerpo de PcrV se pueden rastrear por la determinar la capacidad
para interferir con la interacción de la unión de anticuerpos de
PcrV-PcrV. Las moléculas pequeñas candidatas que
presentan actividad en un análisis tal se pueden optimizar mediante
procedimientos que se conocen bien en la técnica, incluyendo por
ejemplo, ensayos de rastreo in vitro, y ensayos in
vivo adicionalmente refinados para inhibición o modulación de
infección por Pseudomonas mediante cualquiera de los
procedimientos descritos en el presente documento o que se conocen
bien en la técnica. Tales inhibidores de molécula pequeña de acción
de PcrV serían útiles en el procedimiento para inhibir o modular
una infección por Pseudomonas.
La proteína PcrV se puede usar para identificar
un receptor de PcrV que puede estar presente en las células
huésped, particularmente en las células humanas, más particularmente
en células epiteliales humanas o macrófagos. La identificación de
un receptor de PcrV permite el rastreo de genotecas de moléculas
pequeñas, por ejemplo genotecas de combinación, para candidatos que
interfieren con la unión de PcrV. Tales moléculas pueden ser
también útiles en un procedimiento para inhibir o modular una
infección por Pseudomonas.
Los primeros intentos de los autores de la
invención en identificar del receptor serán para usar PcrV en
experimentos de unión con extractos proteicos. PcrV se condensará a
glutatión-S-transferasa (GST) y se
anclará a matriz de columna para cromatografía de afinidad de
extractos celulares solubilizados. Las proteínas que se unan
específicamente a PcrV se eluirán y se someterán a secuenciación del
extremo amino terminal para identificación. En experimentos
paralelos se someterá PcrV a análisis de dos híbridos de levaduras.
En este caso se condensará PcrV en fase con el dominio de unión a
ADN de Gal4. Una vez que se obtiene el clon se transformará en una
cepa huésped de levadura adecuada. La cepa de levadura que contiene
la construcción de Gal4PcrV se transformará con un banco de ADNc de
células Hela clonado en fase con el dominio de activación de Gal4.
Los transformantes dobles que complementan la capacidad para
utilizar histidina y producir beta-galactosidasa
(proteínas que interactúan con PcrV) se analizarán genéticamente y
a nivel de secuencia de nucleótidos. En el caso de que el receptor
sea un glucolípido celular utilizaremos una técnica de revestimiento
donde los glucolípidos se separan mediante cromatografía en capa
fina y después se colocan sondas con bacterias radiomarcadas. La
unión a componentes específicos se controlará mediante
autorradiografía. De forma similar, las proteínas epiteliales y de
macrófagos se separarán mediante SDS-PAGE, se
someterán a transferencia sobre nitrocelulosa y se revestirán con
bacterias radiomarcadas o PcrV marcado. De nuevo, los componentes de
proteína a los cuales se une la bacteria se identifican después
mediante autorradiografía.
Las especies de Pseudomonas se conocen
por infectar un amplio espectro de huéspedes en el reino animal e
incluso en el reino vegetal. Como será evidente para un experto
medio en la técnica, las composiciones y procedimientos descritos
en el presente documento pueden tener uso sobre un amplio intervalo
de organismos en inhibir o modular enfermedades o afecciones que se
originan por infección de una especie de Pseudomonas. Las
composiciones y procedimientos de la presente infección se
describen en el presente documento particularmente para aplicación
a Pseudomonas aeruginosa pero está dentro de la competencia
de un experto medio en la técnica aplicar los procedimientos
enseñados en el presente documento a otras especies.
Para determinar la función de PcrV en
regulación/secreción mediadas de tipo III, los autores de la
invención construyeron un alelo no polar de PcrV y usaron la
construcción reemplazando el alelo de tipo salvaje en la cepa PA103
de P. aeruginosa, una cepa que es altamente citotóxica in
vitro (3) y causa lesión epitelial pulmonar in vivo (12,
13). La citotoxicidad y lesión pulmonar se deben a la producción de
una citotoxina específica, ExoU (3).
PA103\DeltapcrV se caracterizó por la
expresión de varios productos extracelulares que se secretan por el
sistema de tipo III de P. aeruginosa el cual incluye la
citotoxina ExoU (3), PcrV (5) y una proteína requerida para la
translocación de toxinas, PopD (14). La electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida de sobrenadantes de cultivo
concentrados indica que la cepa parental, PA103 se induce por
producción y secreción de las proteínas tipo III mediante
crecimiento en medio que contiene un quelante de calcio, ácido
nitrilotriacético (NTA) (Fig. 1). Cuando un clon de expresión que
codifica PcrV se proporcionó en trans en la cepa parental, la
producción de proteína extracelular en respuesta a la presencia o
ausencia de NTA es normal. PA103\DeltapcrV presenta un
fenotipo ciego al calcio; la producción de proteína extracelular
está fuertemente inducida tanto en presencia como en ausencia de
NTA. Estos resultados sugieren que el sistema secretor es totalmente
funcional pero desrregulado. Este fenotipo desrregulado se comunica
en contraste con el fenotipo de calcio independiente por una cepa
deficiente en LcrV que falla en producir el Yops extracelular,
crece a 37ºC sin importar la presencia o ausencia de calcio y
presenta sólo inducción parcial del Yops (7). Complementar
PA103\DeltapcrV con un clon que expresa PcrV de tipo
salvaje restauró la regulación normal de producción de proteína
extracelular en respuesta a inducción de NTA.
Para ensayar la contribución de PcrV a
patogénesis por P. aeruginosa, se usan dos modelos de
infección. En un modelo in vitro la cepa parental y varias
cepas derivadas mutantes se compararon en su capacidad para causar
citotoxicidad en un ensayo de infección de células CHO (3). Los
controles negativos en este experimento incluyeron
PA103popD::\Omega, que se ha mostrado previamente que es
deficiente en la translocación de determinantes de virulencia de
tipo III (14) y PA103\DeltaexoU, que no es citotóxica
debido a la ausencia de producción de ExoU (3, 15).
Después de una infección de 3 horas, las células
CHO fueron incapaces de excluir azul de tripano con la cepa de tipo
salvaje y la cepa \DeltapcrV complementada con una
construcción plasmídica que expresa PcrV. La tinción no ocurre
cuando las células CHO se infectaron con las cepas de control
negativo o con PA103\DeltapcrV (datos no mostrados). Estos
resultados sugieren que la expresión de PcrV se requiere para
citotoxicidad. El PcrV purificado recombinante no fue citotóxico
cuando se añadió exógenamente a células de cultivo tisular. Dado
que la secreción de las proteínas de tipo III requerida para
translocación no fue afectada por la deleción de pcrV (Figs.
1A y B), PA103\DeltapcrV parece ser deficiente en
translocación de ExoU.
Las Figuras 1A y 1B son un gel teñido (Fig. 1A)
y transferencia Western (Fig. 1B) que ilustran los análisis
fenotípicos de PA103\DeltapcrV. La cepa parental y las derivadas
\DeltapcrV, con y sin un plásmido que expresa PcrV en
trans, se cultivaron en ausencia o presencia del inductor de
secreción de tipo III en P. aeruginosa, ácido
nitrilotriacético (NTA). El perfil de proteína extracelular (Fig.
1A) se analizó en un gel de SDS-poliacrilamida
(10%) teñido con azul de Coomasie. La migración de las proteínas de
tipo III codificadas por Pseudomonas aeruginosa se indica a
la izquierda y la migración de los marcadores de peso molecular se
indica a la derecha. La Figura 1B es una transferencia Western de
un gel duplicado que usa anticuerpos específicos de ExoU, PcrV, y
PopD y proteína A marcada con ^{125}I para detectar IgG
unida.
Las cepas de Pseudomonas aeruginosa de
tipo salvaje y mutantes se ensayaron en un modelo de infección
pulmonar agudo que usa dosis de exposición provocada altas y bajas
de bacterias. Las medidas de supervivencia indican que PcrV y PopD
se requieren para inducir una infección mortal (Fig. 2A). En
experimentos que utilizaron tres medidas independientes de lesión
pulmonar (el flujo de albúmina marcada desde los espacios aéreos del
pulmón al flujo sanguíneo, el flujo de albúmina marcada de los
espacios aéreos del pulmón a los líquidos pleurales, y la relación
húmedo/seco, que miden el edema pulmonar) el grado de lesión causada
por PA103\DeltapcrV, la cepa control de vector
(PA103\DeltapcrVpUCP18), y PA103popD::\Omega no
fueron diferentes de los animales control no infectados (Fig. 2B).
La complementación de PA103\DeltapcrV con pcrV en
trans restauró los niveles de lesión pulmonar a aquellos
medidos con la cepa parental, PA103. Tomados conjuntamente estos
datos indican que la expresión de PcrV se requiere para la
virulencia de P. aeruginosa en el modelo de infección
pulmonar agudo y que parte de la función de PcrV parece estar
ligada a la capacidad para translocar las proteínas efectoras de
tipo III dentro de células eucariotas.
Las Figuras 2A y 2B son un gráfico (Fig. 2A) y
un grupo de gráficos de barras (Fig. 2B) que ilustran la
supervivencia y el lesión pulmonar de cepas parental y mutante de
P. aeruginosa. En referencia a la figura 2A, los ratones
expusieron de forma provocada con 5 x 10^{5} UFC de cada una de
las cepas indicadas y la supervivencia se valoró durante una
semana. En referencia a la Figura 2B, la lesión pulmonar se valoró
mediante el flujo de albúmina marcada desde los espacios aéreos del
pulmón a la sangre (daño epitelial pulmonar), al líquido pleural
(líquido pleural) o midiendo la relación húmedo/seco (edema
pulmonar). Se usaron dos dosis infecciosas bacterianas según se
indicó por las barras sólidas y discontinuas. Se determinaron
diferencias significativas (*p<0,001) entre grupos control y de
prueba mediante análisis de varianza de un sentido y pruebas de
comparación múltiple de Dunnet. Se usaron las siguientes
abreviaturas: PA103, cepa de tipo salvaje parental;
\DeltapcrV, PA103\DeltapcrV;
\DeltapcrVpUCPpcrV, PA103\DeltapcrV
complementada con un plásmido que expresa PcrV;
\DeltapcrVpUCP, PA103\DeltapcrV con un vector de
control; popD::\Omega, PA103popD::\Omega, una cepa
defectiva en translocación.
Para determinar si la inmunización con PcrV
protegió animales de una infección pulmonar mortal, se purificaron
PcrV recombinantes (rPcrV) o ExoU (rExoU) como proteínas de fusión
marcadas con histidina y usadas como antígenos. Los ratones se
inmunizaron y se expusieron de forma provocada subsiguientemente a
través de sus espacios aéreos con una dosis mortal de la cepa
PA103. Cuando se valoró la supervivencia, ambas vacunas protegieron
a los ratones (Fig. 3A). Cuando se valoró la lesión pulmonar, sólo
los animales vacunados con PcrV tuvieron lesiones epiteliales
significativamente menores y edema pulmonar (Fig. 3B). Los animales
inmunizados con la vacuna de PcrV también tuvieron
significativamente menos bacterias en sus pulmones, sugiriendo que
un bloqueo del antígeno V de Pseudomonas puede facilitar
eliminación rápida de bacterias del pulmón, protegiendo a los
animales de lesión epitelial grave (Fig. 3B).
Las Figuras 3A y 3B son un gráfico (Fig. 3A) y
una serie de gráficos de barras (Fig. 3B) que ilustran el efecto de
inmunización en supervivencia, lesión pulmonar y colonización
bacteriana. En referencia a la Figura 3A, los ratones se
inmunizaron (PcrV, n = 10; ExoU, n = 5; control, n = 10) como se
indica y se expusieron provocadamente a la cepa PA103 a 5 x
10^{5} UFC/animal. El porcentaje de animales supervivientes se
determinó durante una semana; p < 0,05 mediante la prueba de
orden logarítmico de Mantel-Cox. En referencia a la
Figura 3B, la valoración de lesión pulmonar y la colonización
bacteriana de animales vacunados 4 horas después de instilación de
PA103. La lesión epitelial pulmonar, el edema pulmonar y la carga
bacteriana; PcrV, n = 9; ExoU, n = 4; y control, n = 8. El número
final de bacterias en el pulmón se indica como el número en el eje Y
x 10^{4} UFC. Diferencias significativas (*) para lesión pulmonar
(p < 0,01), edema pulmonar (p < 0,05) y número de bacterias
(p < 0,05) según se determinan mediante prueba de comparación de
Dunnet. Análisis de varianza de un sentido para lesión pulmonar, p
= 0,0005; edema pulmonar, p = 0,0437; carga bacteriana, p =
0,0075.
Para determinar si la intervención terapéutica
era posible, los ratones se inmunizaron pasivamente con IgG de
conejo preinmunizado o IgG de conejo específica para rPcrV, rExoU o
rPopD una hora antes de instilación del espacio aéreo con PA103 a
una concentración de 5 x 10^{5} UFC/ratón. Los anticuerpos para
rPcrV proporcionaron protección completa para una infección mortal
(Fig. 4). IgG Anti-rExoU proporcionó supervivencia
parcial, la cual fue significativamente diferente de la
administración de IgG control, aunque todos los animales
supervivientes parecieron gravemente enfermos durante la prueba. La
supervivencia no se incrementó mediante la transferencia pasiva de
anticuerpos a otra de las proteínas de translocación de tipo III,
PopD. A partir de estos resultados concluimos que los anticuerpos
para PcrV son altamente protectores en el modelo de infección
pulmonar aguda y que PcrV puede exponerse sobre la superficie
bacteriana o en una forma soluble que está disponible para
interacciones antígeno-anticuerpo.
La Figura 4 es un gráfico del número de animales
que sobrevivieron a una exposición provocada con 5 x 10^{5}
UFC/ratón de cepa PA103. Los animales se trataron previamente con
100 \mug de IgG inmune o IgG control de un conejo inmunizado
(rPcrV, suero preinmune). N = 10 para cada grupo; *p<0,05 contra
grupo control para tratamiento con preparaciones de IgG
anti-PcrV e IgG anti-ExoU mediante
prueba de orden logarítmico de Mantel-Cox.
Si PcrV es accesible para neutralización,
entonces la administración concomitante del inóculo bacteriano con
IgG anti-rPcrV protegería completamente contra la
lesión pulmonar y mortalidad. Las preparaciones de IgG se mezclaron
con el inóculo (dosis 10 veces mayor que el inóculo mortal) antes de
instilación de la bacteria dentro del pulmón y se midió la
supervivencia. Sólo IgG anti-PcrV fue protectora
contra esta infección extrema (Fig. 5A). La lesión pulmonar se
midió en animales infectados con la dosis mortal normal de 5 x
10^{5} bacterias. La salida de albúmina marcada desde los
espacios aéreos del pulmón fue sólo un 3% más que en los controles
no infectados (Fig. 5B) cuando se incluyó coadministración de IgG
anti-rPcrV. La salida disminuida de proteína
marcada desde el pulmón a los líquidos pleurales fue la misma que en
los controles no infectados cuando se incluyó
anti-PcrV con el inóculo. Curiosamente el edema
pulmonar, según se mide por la relación húmedo/seco, se redujo
significativamente por la adición bien de anti-rPcrV
o bien de anti-rPopD (Fig. 5B). Asi, la
administración concomitante de IgG anti-rPcrV con
las bacterias fue incluso más eficaz para normalizar todos los
parámetros de lesión pulmonar que la vacunación. Estos datos
sustentan la accesibilidad de PcrV para neutralización mediada por
anticuerpos y documentan una disminución clínicamente relevante en
la lesión pulmonar; los anticuerpos para PcrV pueden servir como
reactivos terapéuticos en el tratamiento de neumonía nosocomial
grave causada por Pseudomonas aeruginosa.
La Figura 5 es un gráfico (Fig. 5A) y una serie
de gráficos de barras (Fig. 5B) que ilustran supervivencia y
protección de lesión pulmonar mediante administración concomitante
de IgG y exposición provocada bacteriana. Se mezcló IgG (5 \mug)
bien con 5 x 10^{6} (para ensayos de supervivencia, n = 10 por
grupos) o bien con 5 x 10^{5} (para la medida de lesión pulmonar,
n = de 4 a 6 animales por grupo) de cepa PA103 de P.
aeruginosa. Esta mezcla se instiló dentro de los pulmones y se
valoró la supervivencia (Fig. 5A) o lesión pulmonar (Fig. 5B). Para
supervivencia, *p<0,05 contra IgG control para
anti-PcrV mediante la prueba de orden logarítmico
de Mantel-Cox; para la lesión epitelial pulmonar y
edema pulmonar *p<0,05 contra IgG control mediante prueba de
comparación múltiple de Dunnet. Análisis de varianza de un sentido
para lesión pulmonar, p = 0,026 y edema pulmonar, p <
0,0005.
En infecciones agudas con P. aeruginosa,
el efecto neto de intoxicación mediada de tipo III puede ser
promover la diseminación de la bacteria más allá del epitelio que
conduce a la infección de los líquidos pleurales, bazo, hígado y
torrente sanguíneo. Las infecciones transmitidas por la sangre por
P. aeruginosa bien desde neumonía aguda asociada a
ventilador o bien desde infecciones de heridas de quemaduras pueden
dar como resultado un intervalo de mortalidad del
40-80% a pesar del tratamiento antibiótico agresivo
(16). El PcrV debe ser un componente del complejo de translocación
de tipo III en P. aeruginosa, ya que mutantes deficientes en
la producción de esta proteína son incapaces de intoxicar células
CHO o de causar lesión epitelial pulmonar incluso aunque sean
capaces de producir y segregar los efectores de tipo III y proteínas
requeridas para translocación. Al contrario que PopD, el cual
también es necesario para translocación, PcrV es accesible para
neutralización mediada por anticuerpos que sugiere que los
anticuerpos pueden ser agentes terapéuticamente útiles en
infecciones agudas.
Construcción de una inserción no polar en
PcrV y complementación. Un fragmento de restricción de
EcoRI-NsiI de 5,0 kb que codifica pcrGVHpopBD
y secuencias flanqueantes se clonó dentro del vector de reemplazo
alélico pNOT19 (17). Se retiraron dos sitios NotI (uno en
pcrG y uno en popB) de las secuencias insertadas
usando el sistema de mutagénesis Sculptor (Amersham). Se eliminó un
fragmento de restricción de SStI interno de pcrV,
dando como resultado una deleción en fase de residuos
17-221 (pNOT\DeltapcrV). Para seleccionar
para la integración del plásmido, se clonó un gen que codifica
resistencia a tetraciclina (Tc\Omega) dentro del sitio
HindIII del vector (pNOT\Omega\DeltapcrV). Se añadió el
módulo MOB (17) como un fragmento NotI. La selección de
merodiploides, la resolución de secuencias plasmídicas y la
confirmación de reemplazo alélico se llevó a cabo como se describe
previamente (18). Se usó un plásmido lanzadera (pUCP, 19) para
construir un clon para complementar la deleción de pcrV. La
secuencia codificante para PcrV se amplificó y clonó detrás del
control de la región del promotor ExoS (20). La transcripción de
ExoS se regula coordinadamente con los operones que controlan la
secreción y translocación de tipo III en P. aeruginosa (2).
La secuencia nucleotídica se confirmó para cada construcción de ADN
que implica mutagénesis específica de sitio, amplificación de PCR o
deleción en fase.
Análisis por SDS-PAGE y
transferencia Western de productos segregados. Se cultivó P.
aeruginosa bajo condiciones inductoras (+NTA) o no inductoras
(-NTA) para expresión de los productos segregados de tipo III (18).
Los cultivos se cosecharon en base a medidas de densidad óptica a
540 nm y las fracciones sobrenadantes se concentraron mediante la
adición de una disolución saturada de sulfato de amonio hasta una
concentración final del 55%. Cada carril de un gel de
SDS-poliacrilamida (11%) se cargó con 3 \mul de un
sobrenadante concentrado 20 veces y teñido con azul de Coomassie.
Un gel idéntico se sometió a análisis de transferencia Western como
se describe previamente (3-5) usando un cóctel de
antisuero de conejo, el cual reconoce específicamente ExoU, PopD y
PcrV. La proteína A marcada con ^{125}I se usó como un reactivo
secundario para identificar IgG unido.
Modelos de infección y valoraciones de la
lesión pulmonar. Se usaron células de ovario de hámster chino
(CHO) en un modelo de infección in vitro diseñado para medir
la citotoxicidad y translocación de tipo III (21). Brevemente, se
preparó un inóculo bacteriano en medio de cultivo tisular sin suero.
Las células CHO, que se propagaron en medio que contiene suero, se
lavaron e infectaron con diversas cepas de P. aeruginosa a
una multiplicidad de infección de 5:1. Los cultivos se incubaron
bajo condiciones de cultivo tisular durante 3 horas (37ºC, CO_{2}
al 5%), se lavaron y se tiñeron con azul de tripano. La
permeabilidad a la tinción se determinó a partir de fotografías de
contraste de fase. La infección por la cepa PA103 parental, la cual
expresa ExoU, da como resultado tinción con azul de tripano de
aproximadamente el 80% de la monocapa después de 3 horas de
incubación y destrucción completa de la monocapa a
4-5 horas de incubación. Las infecciones de ratones
y la valoración de la lesión pulmonar se llevaron a cabo como se
describe previamente (16). Brevemente, se adquirieron ratones
BALB/c libres de patógenos de 8 a 12 semanas de edad machos de
Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) y se alojaron en condiciones de
barrera. Los ratones se anestesiaron brevemente con Metofane
(metoxifurano, Pitman-Moore, Mundelein, IL)
inhalado y se situaron boca arriba, a un ángulo de aproximadamente
30ºC. Se instilaron cincuenta microlitros del inóculo bacteriano
lentamente dentro del lóbulo izquierdo usando una aguja de
alimentación animal de calibre 24 modificada (Popper & Sons,
Inc., New Hyde Park, NY) insertada dentro de la tráquea por la
orofaringe. Cuando se midieron las valoraciones de lesión pulmonar,
se añadieron al instilado 0,5 \muCi de seroalbúmina humana
marcada con ^{131}I (Merck-Frosst, Quebec,
Canadá), 0,05 \mug de azul de Evans anhidro en 1 ml de lactato de
Ringer con albúmina de ratón al 5%. Después de 4 horas de infección,
los ratones se anestesiaron, la sangre se recogió mediante una
punción arterial de la carótida y se llevaron a cabo esternotomías
en la línea media. Se recogieron los pulmones, líquidos pleurales,
tráqueas, orofaringes, estómagos e hígados, y se midió la
radiactividad. El porcentaje de albúmina radiactiva que queda en los
pulmones instilados y entra en la circulación o los líquidos
pleurales se calculó multiplicando los recuentos medidos en los
tiempos de muestras de sangre terminales (por ml) multiplicado por
el volumen de sangre (peso corporal x 0,07). Las relaciones
húmedo/seco de los pulmones se determinaron añadiendo 1 ml de agua a
los pulmones y homogeneizando la mezcla. Los homogeneizados se
situaron en moldes de aluminio precalentados y se secaron hasta peso
constante en una estufa a 80ºC durante 3 días. Los homogeneizados
pulmonares también se diluyeron secuencialmente y se cultivaron en
agar con sangre de cordero para la valoración cuantitativa de las
bacterias.
Producción de antisuero de conejo para PcrV,
PopD y ExoU. Se produjeron rPcrV, rPopD, y rExoU como proteínas
de fusión marcadas con histidina en pET16b y se purificaron mediante
cromatografía de níquel como se describe previamente (22). Se
inyectaron a los conejos intradérmicamente (10 sitios) 300 \mug de
proteína recombinante emulsionada en coadyuvante completo de
Freund, se reforzaron con antígeno en coayuvante incompleto de
Freund y se tomaron muestras de sangre periódicamente a intervalos
de 7 días. Para la inmunización pasiva, se aisló la fracción IgG
usando cromatografía en columna de Proteína A (Pierce Chemicals,
Rockford, IL). Los ratones se inyectaron con 100 \mug de IgG
(inyección intraperitoneal) 1 hora antes de la exposición provocada
con 5 x 10^{5} UFC de cepa PA103. Para la inmunización activa con
rPcrV y rExoU, se extrajo endotoxina de preparaciones proteicas
mediante extracción con Tritón X-14 al 1% (23). Tras
las extracciones, se eliminó Tritón X-114 mediante
cromatografía de Sephacryl S-200. Todas las
preparaciones de vacuna contenían menos de 1 ng de endotoxina por
40 \mug de proteína recombinante como se determinó usando un
ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (BioWhittaker,
Walkersville, MD). Los ratones BALB/c se inyectaron subcutáneamente
con 10 \mug de proteínas recombinantes en coadyuvante completo de
Freund. En el día 30 se administró a los ratones un recuerdo de 10
\mug de antígeno en coadyuvante incompleto de Freund. En el día 51
los ratones se expusieron de forma provocada a instilación de P.
aeruginosa dentro de sus pulmones izquierdos.
Los ratones se inmunizaron con 10 \mug de PcrV
recombinante, libre de LPS, purificada, en coadyuvante completo de
Freund y se les administró un recuerdo dos semanas más tarde con la
misma dosis de antígeno emulsionado en coadyuvante incompleto de
Freund. Se llevaron a cabo inmunizaciones subcutáneamente. Los bazos
de los ratones se extirparon una semana después de las dosis de
recuerdo de PcrV en coadyuvante incompleto de Freund.
Se colocó un único bazo en 5 ml de medio de
cultivo de tejido sin suero, se cortó en trozos y se homogeneizó
suavemente. Los trozos grandes de tejido se dejaron asentar aparte
del homogeneizado y el sobrenadante, se retiró suspensión de
células individuales y se sometió a centrifugación a 1200 rpm
durante 10 minutos. Las células sedimentadas se resuspendieron en
10 ml de una disolución lisando glóbulos rojos durante 5 minutos y
posteriormente subyacieron con 10 ml de suero bovino fetal. El
material se centrifugó a 1200 rpm durante 8 minutos, se descartó el
sobrenadante y las células se suspendieron en 30 ml de medio.
Las células esplénicas y las células de mieloma
(P3x63Ag8,53) se recogieron mediante centrifugación a 1200 rpm
durante 10 minutos y cada sedimento se suspendió por separado en 10
ml de medio de cultivo tisular. Se mezclaron 10^{8} células del
bazo y 2 x 10^{7} células de mieloma y se sedimentaron de forma
conjunta mediante centrifugación a 1200 rpm durante 6 minutos. El
sobrenadante se eliminó mediante aspiración y se añadió 1 ml de
polietilenglicol al 35% (PEG). Las células se suspendieron
suavemente en esta disolución y se centrifugaron a 1000 rpm durante
3 minutos. En algunos experimentos se eliminó la centrifugación.
Exactamente 8 minutos después de la adición de
PEG, se añadieron 25 ml de medio y las células se resuspendieron
suavemente. Tras una etapa de centrifugación a 1200 rpm de 5
minutos, el sedimento celular se suspendió a una densidad de 1 x
10^{6} por ml en medio condicionado al 30% y medio completo al 70%
(con suero). Las células se incubaron durante toda una noche a
37ºC. El día siguiente las células se recogieron mediante
centrifugación y se suspendieron en 200 ml de medio condicionado al
30% y medio completo al 70% con hipoxantina, aminopterina y
timidina (HAT).
Se añadieron aproximadamente 0,2 ml de esta
suspensión celular por pocillo a diez placas de 96 pocillos (12 ml
por placa de 96 pocillos). La densidad de las células restantes se
ajustó a 2,5 x 10^{5} por ml y las células se cultivaron en el
formato de 96 pocillos. Las placas se rastrearon microscópicamente
en busca de colonias individuales y los sobrenadantes se ensayaron
posteriormente para determinar la producción de anticuerpos
mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas usando PcrV
recombinante como antígeno. Los clones que producen anticuerpos
reactivos a PcrV se subcultivaron en placas de cultivo mayores y
después se isotiparon.
La unión de anticuerpos se ensayó en un ensayo
de inmunoabsorción ligado a enzimas usando PcrV recombinante como
antígeno (proteína marcada con histidina) recubriendo los pocillos.
Los anticuerpos monoclonales se ensayaron también en reacciones de
transferencia Western usando un sobrenadante de P. aeruginosa
que contiene PcrV nativo sin la marca de histidina.
Los autores de la invención obtuvieron
aproximadamente trescientas líneas celulares que produjeron
anticuerpos que unieron el PcrV marcado. Estas líneas celulares
iniciales se conservaron en nitrógeno líquido para mantenerlas de
forma segura. Se realizó un pase por todas las líneas para aislar
clones estables. En combinación con el aislamiento de clones
estables los autores de la invención desarrollaron en ensayo in
vitro a modo de correlacióno para la protección contra la
intoxicación en modelos de infección animal.
Los hibridomas que eran estables en el pase y
aún produjeron anticuerpos reactivos a PcrV en ELISA
(aproximadamente 80 líneas celulares) se ensayaron posteriormente
en un Clasificador de Células Activado de Fluorescencia usando las
siguientes técnicas y supuestos: los autores de la invención
pensaron que si el anticuerpo está bloqueando el sistema de
intoxicación de tipo III, después en presencia de un anticuerpo
monoclonal que bloquea, se matarán menos células con las toxinas de
los autores de la invención. Los autores de la invención expusieron
las células a cada uno de los 80 anticuerpos monoclonales,
añadieron bacterias tóxicas, incubaron y después añadieron una
tinción que sólo es permeable para ADN de células muertas (yoduro de
propidio). El exceso de colorante se eliminó mediante lavado y las
células se recogieron, se fijaron y se analizaron mediante FACS. Las
células muertas serían fluorescentes dado que la tinción se filtra
en y tiñe el ADN en el núcleo.
Los autores de la invención encontraron que si
las células se incubaban con anti-PcrV policlonal de
conejo, anti-PcrV policlonal de ratón o mab166 y
bacterias, morían menos células que en los controles con anticuerpo
policlonal irrelevante (anti-PopD) o los otros 78
anticuerpos monoclonales.
Se encontró específicamente que Mab 166 se unía
a factor de tipo III segregado codificado por bacterias llamado
PcrV. PcrV media la interacción de P. aeruginosa y células
pulmonares facilitando la translocación de toxinas bacterianas que
causan muerte celular. Esta reacción se postula para eliminar
células pulmonares que están implicadas en la respuesta inmune
innata a P. aeruginosa. La matanza de estas células deja el
epitelio del huésped abierto para la colonización con P.
aeruginosa y la extensión a los líquidos pleurales y el torrente
sanguíneo. La resistencia a antibióticos codificada por P.
aeruginosa hace poco probable el tratamiento efectivo una vez
la bacteria ha entrado en el torrente sanguíneo.
La protección proporcionada por mab 166 antes y
después de la instilación bacteriana en modelos animales de
infección pulmonar aguda con P. aeruginosa es significativa.
Para diseñar modalidades de tratamiento para intervención en
infecciones por P. aeruginosa humanas será necesario producir
bien un anticuerpo monoclonal humano o bien inmunizar a pacientes
de riesgo con el epítopo protector de PcrV definido por mab 166. El
objeto del trabajo descrito más adelante es definir la secuencia de
aminoácidos de PcrV unida por mab 166.
Los autores de la invención usaron una
aproximación genética molecular definiendo los residuos de
aminoácido unidos por mab 166. PcrV posee 294 aminoácidos. La
aproximación consistía en eliminar partes de la molécula al nivel
de secuencia de nucleótidos usando la reacción en cadena con
polimerasa. Cada producto se clonó en un vector de expresión de
proteínas en fase con un gen que codifica la proteína glutatión S
transferasa. Esta estrategia aseguró que las deleciones que
codifican números pequeños de aminoácidos de PcrV se pudieron
detectar usando técnicas de transferencia Western o técnicas de
transferencia por puntos. Los lisados de bacterias control que
codifican sólo glutatión S transferasa no mostraron ninguna
reactividad bien a nuestro anticuerpo policlonal
anti-PcrV o bien al anticuerpo monoclonal mab
166.
Se construyeron, expresaron y ensayaron en su
reactividad frente a antisueros anti-PcrV
policlonales de conejo un total de 66 (con un plásmido de expresión
de PcrV de longitud total) clones. Todos menos un clon se unieron a
anticuerpo de conejo anti-PcrV verificando que las
proteínas expresadas estaban en fase con PcrV. El único clon no
reactivo se eliminó del análisis. Ninguna de las deleciones
C-terminales (n = 5 construcciones) se unió a mab
166 sugiriendo que el epítopo estuvo en la mitad
C-terminal de la proteína. Sólo una de las proteínas
de truncación N-terminal (n = 8 construcciones) que
codificó aminoácidos (aa) de PcrV 139-294 se unió a
mab 166. Este experimento verificó la hipótesis de los autores de
la invención de que el epítopo de mab 166 está codificado por la
mitad carboxi terminal de la proteína. Las restantes 51
construcciones codificaron diversas deleciones internas de la
molécula. El análisis de unión tabulado en la Tabla 1, más adelante,
demostró que el epítopo más pequeño reconocido por mab 166 consiste
en aminoácidos 144-257 de PcrV
\vskip1.000000\baselineskip
Extracción de ARN marcado con Poli A: La
línea celular de hibridoma m166 se cultivó en medio esencial mínimo
de Dulbecco completo con D-glucosa a 4,5 g/l, HEPES
10 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM,
L-glutamina 3 mM, y suero de ternero fetal
inactivado por calor al 10%, 100 u/ml de penicilina y sulfato de
estreptomicina a 100 \mug/ml. Después de que las células
alcanzaran estado confluyente en un matraz de 75 cm^{3}, las
células se cosecharon por centrifugación a 600 rpm durante 5
minutos. El sedimento de las células se homogeneizó en 2 ml de
reactivo de TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg. MD) y se
extrajo ARN total (100 \mug) después de fraccionamiento con
cloroformo, precipitación con isopropanol y lavado con etanol al
70%. Se extrajo ARN marcado con Poli A (4 \mug) con columna
giratoria de ARNm oligotex (Qiagen, Valencia, CA).
Adición de un remate de ARN por
oligorribonucleótidos: Se incubó ARNm (250 ng) con fosfatasa
intestinal de ternero a 50ºC durante 1 hora desfosforilando ARN no
mensajero o ARNm truncado. Después de la reacción, se llevó a cabo
extracción con fenol-cloroformo y precipitación con
etanol y el ARN desfosforilado se incubó con pirofosfatasa ácida de
tabaco a 37ºC durante 1 hora retirando la estructura del remate en
5' del ARN de longitud total. Después de las extracciones con
fenol/cloroformo y de la precipitación con etanol, el oligo de ARN
sintético (GeneRacer ARN Oligo, Invitrogen, Carlsbad, CA) se ligó al
ARN desprovisto de remate con ARN-ligasa de T4 a
37ºC durante 1 hora. Después de la extracción con fenol/cloroformo y
de la precipitación con etanol, el ARN se resuspendió en 13 \mul
de agua tratada con dietilpirocarbonato.
Transcripción inversa del ARNm: El ARN
ligado a oligo, ARNm de longitud total (13 \mul) se transcribió de
forma inversa con 54 bases del par cebador que contiene una cola de
dT de 18 nucleótidos (GeneRacer Oligo dT, Invitrogen) y
transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar a 42ºC
durante 1 hora en 20 \mul de reacción. Después de la reacción, la
muestra se diluyó 4 veces con agua estéril.
Amplificación de extremos de ADNc mediante
reacción en cadena con polimerasa (PCR): Se usó un microlitro
del ADNc para PCR. Se usaron el cebador 5' a partir de la secuencia
de oligo de ARN sintética (GeneRacer 5’ Primer, Invitrogen) y el
cebador específico de la región CH1 de la cadena gamma 2b de
inmunoglobulina murina o el cebador específico de la región CL de
la cadena kappa de inmunoglobulina murina. Los parámetros cíclicos
usados para la reacción de PCR fueron: 1) 94ºC, 2 minutos, 1 ciclo,
2) 94ºC, 30 segundos y 72ºC, 1 minuto, 5 ciclos, 3) 94ºC, 30
segundos, 70ºC, 30 segundos, y 72ºC, 1 minuto, 5 ciclos, 4) 94ºC, 30
segundos, 68ºC, 30 segundos, y 72ºC, 1 minuto, 20 ciclos, 5) 72ºC,
10 minutos.
Subclonado y secuenciación de ADN: Los
productos de la PCR (el fragmento derivado de la región CH1 de la
cadena gamma 2b de inmunoglobulina murina y el fragmento derivado
de región CL de la cadena kappa de inmunoglobulina murina) se
subclonaron dentro del vector pCRII (TOPO cloning, Invitrogen) y se
sometieron a UCSF Molecular Bioresource Center analizando la
secuencia de ADN.
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN de ARNm de
cadena pesada de m166, SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos
de la cadena pesada de m166 (IgG II_{b}), SEQ ID NO: 3 es la
secuencia de ADN de la cadena ligera de m166, y SEQ ID NO: 4 es la
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de m166. Las Figuras
6A, 6B y 7 examinan las secuencias y proporcionan más detalle.
Se podría usar la secuencia de anticuerpos para
producir anticuerpos de cadena simple recombinantes que pueden
bloquear PcrV y se podría también utilizar la secuencia en
experimentos de liberación de genes, en los que se suministrarían
vectores eucariotas que conducirán después a la producción de
anticuerpos de cadena simple en animales durante periodos
prolongados. Finalmente, la secuencia se podría utilizar humanizando
el anticuerpo monoclonal murino produciendo un producto que puede
utilizarse en cuidado de pacientes humanos. Un experto en la
técnica prevería procedimientos convencionales tales como injertar
las regiones determinantes de complementariedad de unión de
antígeno (CDR) a partir de dominios variables de anticuerpos de
roedores sobre dominios variables humanos con el fin de crear un
anticuerpo humanizado.
Se multiplicaron el gen VH y el gen VL mediante
reacción en cadena con polimerasa (PCR) con cebadores específicos
para cada gen. Los fragmentos de VH y VL multiplicados se
ensamblaron con un engarce usando PCR con cebadores. El gen de
anticuerpo de cadena simple ensamblado (genes VH y VL de scFv::m166
con engarce) se transfirió dentro del vector de clonación pCR4 Topo
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Después, la secuencia codificante de
scFv::m166 se subclonó dentro del vector de expresión de E.
coli pBAD/gIII (Invitrogen) en LMG194 como la E. coli
huésped.
Para inducción de proteínas, en medio RM que
contiene glucosa al 0,2% y 100 \mug de ampicilina, la E.
coli transformada se cultivó durante toda una noche a 37ºC en
un agitador orbital (200 rpm) y el día siguiente, se transfirieron
5 ml de E. coli cultivadas en 500 ml del mismo medio y se
incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente a 100 rpm. Después
de añadir L-arabinosa a la concentración del 0,004%,
la E. coli se cultivó durante toda una noche. El tercer día,
la proteína se recogió del espacio periplásmico de la E. coli
mediante procedimientos de choque osmótico. La disolución que
incluye proteína periplásmica derivada de choque osmótico se dializó
durante toda una noche contra el tampón de lisis. Durante el cuarto
día, la disolución dializada se aplicó sobre una columna de
níquel-NTA purificando el anticuerpo de cadena
simple marcado con hexahistidina. La disolución eluída de la
columna de níquel se dializó contra disolución salina tamponada con
fosfato durante toda una noche. En el quinto día, la disolución
dializada se aplicó a un concentrador de centrífuga para preparar
una concentración mayor de scFv::m166.
El anticuerpo de cadena simple purificado
(scFv::m166) se ensayó usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima contra PcrV recombinante y mediante inmunotransferencia
(transferencia Western) tanto contra proteína PcrV recombinante
como contra PcrV de P. aeruginosa PA 103.
El anticuerpo de cadena simple permitirá a los
autores de la invención humanizar el anticuerpo utilizando técnicas
de presentación mediante fago y mejorar la afinidad del anticuerpo
usando estas técnicas. El anticuerpo de cadena simple se puede
utilizar como una herramienta diagnóstica (para histología) pero no
se utilizará como terapia. Sin embargo, el gen para el anticuerpo
de cadena simple se puede utilizar en terapia génica, tal que los
animales producirían anticuerpos de cadena simple durante un
intervalo, los cuales podrían conducir a protección contra
infecciones por P. aeruginosa.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método y composiciones para
inmunizar con el antígeno de Pseudomonas V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 650053.91487
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/770.916
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-01-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/448,339
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/109.952
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-11-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/126,794
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(1466)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(89)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(179)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (180)..(194)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (195)..(236)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(284)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (285)..(380)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (381)..(425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (426)..(458)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_C
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (459)..(1466)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 979
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)..(745)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)..(103)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (104)..(172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (173)..(205)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (206)..(250)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (251)..(271)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (272)..(367)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (368)..(394)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_V
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (455)..(487)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región_C
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (428)..(745)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal de gen III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unión-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(441)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada m166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (442)..(486)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador-scFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (487)..(810)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena ligera m 166
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (811)..(816)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unión-2
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (817)..(846)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> epitopo Myc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (847)..(861)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unión-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (862)..(879)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta hexahistidine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(879)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<400> 6
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Claims (15)
1. Un anticuerpo monoclonal
anti-PcrV o uno de sus fragmentos que reconoce un
epítopo en la región de residuos de aminoácidos 144 a 257 en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido PcrV.
2. Un anticuerpo monoclonal
anti-PcrV o fragmento según la reivindicación 1 que
reconoce un epítopo que incluye los residuos de aminoácidos 144 a
257 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido PcrV.
3. Un anticuerpo monoclonal
anti-PcrV o uno de sus fragmentos según la
reivindicación 1 ó 2 que comprende los CDR de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de cadena ligera de SEQ ID NO: 4 y los
CDR de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada
de SEQ ID NO: 2.
4. Un anticuerpo monoclonal
anti-PcrV o fragmento según la reivindicación 3
que:
- (a)
- comprende las regiones CDR y FR de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena ligera de SEQ ID NO: 4; y
- (b)
- comprende las regiones CDR y FR de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de SEQ ID NO: 2.
5. El anticuerpo o fragmento según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es humanizado o
humano.
6. Un anticuerpo monoclonal
anti-PcrV o uno de sus fragmentos según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, que es:
- (a)
- mab 166 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4 y la cadena pesada de SEQ ID NO: 2;
- (b)
- una versión humanizada de (a); o
- (c)
- un fragmento de (a) o (b) capaz de unirse a PcrV.
7. Una composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 7 que comprende el anticuerpo o fragmento en una
cantidad eficaz para tratar o prevenir infección por Pseudomonas
aeruginosa en un paciente o para reducir la patogenicidad de
infección por Pseudomonas aeruginosa en un paciente.
9. Uso de un anticuerpo o fragmento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un
medicamento para: tratar o prevenir infección por Pseudomonas
aeruginosa en un paciente; reducir la patogenicidad de infección
por Pseudomonas aeruginosa en un paciente; o para modular la
citotoxicidad de Pseudomonas para la(s)
célula(s) humana(s).
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
medicamento es para administrarse por inoculación.
11. Uso según la reivindicación 9, en el que el
medicamento es para administrarse por vía sistémica.
12. Uso según la reivindicación 9, en el que el
medicamento es para administración a los pulmones.
13. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en el que el paciente es un paciente
humano.
14. Un procedimiento para modular la
citotoxicidad de Pseudomonas para una célula humana in
vitro que comprende poner en contacto dicha Pseudomonas
con el anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en presencia de la célula humana.
15. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo
o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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