KR100448516B1 - 사카로마이세스 세레비제 ｊｙ-209 및 이를 이용한 주류의 제조 방법 - Google Patents

사카로마이세스 세레비제 ｊｙ-209 및 이를 이용한 주류의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 향기 성분을 고생산하는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) JY-209(KFCC-11286) 및 이를 이용한 주류의 제조 방법에 관한 것으로, 사카로마이세스 세레비제 JY-209는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) #168(KFCC-10833)을 돌연변이원인 자외선 또는 에틸메탄설포네이트(EMS)로 처리하여 돌연변이시킴으로써 제조할 수 있으며, 이를 이용하면 향기 성분이 다량 함유된 주류 제품을 생산할 수 있다.

Description

사카로마이세스 세레비제 ＪＹ-209 및 이를 이용한 주류의 제조 방법{SACCHAROMYCES CEREVISIAE JY-209 AND PROCESS FOR PREPARING ALCOHOLIC LIQUORS USING SAME}
본 발명은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) JY-209(KFCC-11286) 및 이를 이용한 주류의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 주류에 관한 소비자의 욕구가 다양화되고, 일반의 희석식 소주 이외에 향미가 우수한 증류식 소주의 제조 및 판매가 늘어가고 있으며, 희석식 소주에 증류식 소주를 첨가한 혼합식 소주가 대중화되었다. 뿐만 아니라, 최근 소비가 늘어나고 있는 약주나 청주의 경우에도 우수한 주질을 나타내기 위해서는 향기 성분이 매우 중요한 요인으로 작용한다. 이러한 주류의 향기에 영향을 미치는 성분에는 부틸알콜(butyl alcohol), 이소아밀알콜(isoamyl alcohol), 페네틸알콜(phenethyl alcohol) 등의 고급 알콜류와 이들의 에스테르 합성물인 에틸아세테이트(ethyl acetate), 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate), 페네틸아세테이트(phenethyl acetate) 등의 초산에스테르류가 있으며, 이외에도 카프론산에틸(ethyl caproate),카프르산에틸(ethyl caprate), 카프릴산에틸(ethyl caprylate) 등의 지방산 에스테르류가 있다.
현재까지 향기가 우수한 증류식 소주의 발효용 효모를 얻기 위해 자연돌연변이나 토양 등으로부터 무작위로 분리한 균주를 발효하여 향기 성분을 분석하는 재래의 방법을 사용했지만 이 방법으로는 많은 시간과 노력이 들어갈 뿐만 아니라 증류식 소주의 발효 특성에 적합한 균주의 선별 또한 매우 어렵다는 단점이 있다.
향기 성분들 중에서 이소아밀알콜과 이의 에스테르물인 이소아밀아세테이트는 과일향과 바닐라향을 내는 물질로서 증류식 소주뿐만 아니라 청주, 약주 등의 주류에서도 중요한 향기 성분으로 알려져 있다. 효모 내에서 이 두 물질은 아미노산의 하나인 류신(leucine)의 합성경로와 같은 경로로 생산된다. 트리플루오로류신(5,5,5-trifluoro-DL-leucine, TFL)은 류신의 유도체로서 트리플루오로류신이 함유된 배지에서 생존이 가능한 효모들은 류신에 의한 피드백조절기작(feedback mechanism)이 극복되어 다량의 이소아밀알콜과 이소아밀아세테이트를 생산하게 된다는 것이 보고되었다(Agric. Biol. Chem., 51(8), 2061-2065, 1987).
또한, 이소아밀알콜로부터 이소아밀아세테이트의 합성에는 알콜아세틸트랜스퍼라제(alcohol acetyltransferase, AATase)가 관여하는데 이 효소는 불포화지방산에 의해 합성이 저해된다고 알려져 있다. 최근 유전자 수준의 연구 결과에 따르면 어떠한 형태로든 AATase의 작용은 효모의 지방대사와 관련이 있을 것으로 생각되고 있다. 즉, 지방산 생합성계에서 중요한 효소인 아세틸코에이카르복실라제(acetylCoA carboxylase, ACC)의 활성 또한 지방산에 의하여 저해되는데 ACC의 기작이 AATase와 비슷하다는 것이다. 한편, 제초제로 사용되는 플루아지폽(fluazifop)은 벼과식물에서 ACC를 특이적으로 저해하는 물질로서 효모의 ACC에서도 작용하므로 이들 약재내성주 중에는 지방산 생합성계의 대사를 제어하는 단백질에 변이가 발생하고 동시에 지방산에 의한 AATase의 조절작용이 변화하여 에스테르의 생성이 우수한 균주를 선별할 수 있다는 것이 보고된 바 있다(J. Brew. Soc. Japan., 93(8), 665-670, 1998).
이에 본 발명가들은 고온 발효 효모 균주인 사카로마이세스 세레비제 #168을 돌연변이원으로 처리하여 돌연변이시킴으로써 사카로마이세스 세레비제 JY-209를 제조하고 이를 이용하여 향기 성분이 향상된 증류식 소주를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 향기 성분을 고생산하는 사카로마이세스 세레비제 돌연변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이주의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 돌연변이주를 이용하여 향기 성분의 함량이 높은 주류의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) JY-209(KFCC-11286)는 사카로마이세스 세레비제 #168(KFCC-10833)에 돌연변이원인 자외선 또는 EMS를 처리하여 돌연변이시킴으로써 얻을 수 있다.
자외선 조사에 의한 돌연변이는 16 ㎝ 거리에서 260 ㎚의 자외선을 120초 내지 200초 동안 조사함으로써 실시하고, EMS에 의한 돌연변이는 균주의 배양액에 EMS의 최종 농도가 30 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖이 되게 첨가하여 25 ℃ 내지 30 ℃에서 30분 내지 1시간, 바람직하게는 40분 동안 배양한 후 식염수로 수회 세척함으로써 실시한다.
돌연변이원을 처리한 균액은 0.5 ｍΜ 내지 1.5 ｍΜ의 트리플루오로류신 및 100 ppm 내지 300 ppm의 플우아지폽을 포함하는 선별용배지(포도당 15 ｇ 내지 20 ｇ, 효모니트로젠베이스(yeast nitrogen base) 0.5 ｇ 내지 1.0 ｇ, 한천 15 ｇ 내지 20 ｇ, 증류수 1 ℓ정용)에 도말하여 25 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는 30 ℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 3일 동안 배양하여 콜로니가 큰 것을 선별하여 트리플루오로류신과 플우아지폽에 동시에 내성을 갖는 복합내성균주를 얻는다. 선별된 돌연변이체들은 상기와 같은 방법을 반복하여 트리플루오로류신과 플우아지폽에 대한 내성이 더 증가한 균주를 얻는다.
선별된 돌연변이체들을 YBM 배지(딥코사, 미국)에 접종하고 25 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는 30 ℃에서 12시간 내지 24시간, 바람직하게는 18시간 동안 종배양을 실시한다. 종배양액을 다시 국배지(그늘에서 건조한 백국(가와찌사, 일본)에 멸균수 200 %를 가한 배지)에 접종하여 20 ℃ 내지 35 ℃, 바람직하게는 25 ℃에서 5일 내지 9일, 바람직하게는 7일 동안 정치배양한다. 배양액을 원심분리하여 얻은상층액을 헤드스페이스 가스 크로마토그래피(head-space gas chromatography, 퍼킨엘머사)로 분석하여 향기 성분의 함량이 가장 높은 주류를 생산하는 돌연변이체를 선별하고 이들 중 가장 우수한 변이체를 사카로마이세스 세레비제 JY-209이라고 명명하였다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제 JY-209를 이용하여 통상의 주류 제조 방법에 따라 향기 성분이 강화된 증류식 소주, 약주, 청주 등을 제조할 수 있다.
사카로마이세스 세레비제 JY-209는 증류식 소주 제조에 사용할 경우 소주 1 ℓ당 40 ppm 내지 50 ppm, 바람직하게는 45 ppm 정도의 지방산 에스테르류의 향기 성분을 포함하는 소주를 제조할 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 돌연변이주의 선별
돌연변이주를 얻기 위해 사카로마이세스 세레비제 #168(KFCC-10833)을 YBM 배지(딥코사, 미국)에서 18시간 동안 배양한 후 배양액을 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 멸균한 증류수로 2회 세척한 후에 다시 멸균한 증류수로 10배 희석하였다. 증류수로 희석한 균체는 16 ㎝의 거리에서 260 ㎚의 자외선을 170초 동안 조사하여 자외선에 의한 돌연변이를 유발시켰다. 한편, EMS에 의한 돌연변이는 균주 현탁액에 EMS를 최종 농도가 30 ㎎/㎖이 되게 첨가하여 25 ℃에서 40분 동안 배양한 후 식염수로 수회 세척하였다.
돌연변이원을 처리한 균액은 0.5 ｍΜ내지 1.5 ｍΜ의 트리플루오로류신과100 ppm 내지 300 ppm의 플우아지폽을 포함하는 선별용배지(포도당 20 ｇ, 효모니트로전베이스 1 ｇ, 한천 20 ｇ, 증류수 1 ℓ정용)에 도말하여 30 ℃에서 3일 동안 배양하여 콜로니의 크기가 큰 것을 선별하여 트리플루오로류신과 플우아지폽에 대해 복합내성을 지닌 균주를 얻었다. 선별된 돌연변이체들을 상기와 같은 방법을 반복하여 트리플루오로류신과 플우아지폽에 대한 내성이 더욱 증가한 균주를 얻었다.
상기와 같은 방법으로 선별된 돌연변이체들을 121 ℃에서 15분 동안 멸균한 YBM 배지(딥코사, 미국) 에 백금니를 이용하여 접종하고 30 ℃에서 18시간 동안 종배양을 실시하였다. 0.5 ㎖의 종배양액을 국배지(그늘에서 자연 건조한 백국(가와찌사, 일본) 15 ｇ, 멸균수 30 ㎖)에 접종하여 25 ℃에서 7일 동안 정치배양하였다. 이 발효액을 2,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 상층액을 회수한 후 헤드스페이스 가스 크로마토그래피(퍼킨엘머사, 미국)를 실시하여 향기 성분을 정량분석하여 초산 에스테르의 생산능이 우수한 균주를 얻었다. 헤드스페이스 가스 크로마토그래피의 조건은 표 1에 나타낸 것과 같다.
헤드스페이스 가스 크로마토그래피의 조건
검출기 FID
컬럼 크기: 0.53 ㎜ ×30 ｍ ×1.2 ㎛
컬럼 충전제 종류: PEG 입수처: Alltech
컬럼 온도 45 ℃(5분)-->180 ℃(3분)
주입기 온도 250 ℃
검출기 온도 300 ℃
캐리어가스 및 유량 헬륨(80 kpa)
향기 성분의 생산이 가장 우수한 돌연변이체를 선별하여 사카로마이세스 세레비제 JY-209으로 명명하였으며, 2001년 11월 16일자로 한국종균협회 한국미생물보존센터에 기탁번호 제 KFCC-11286 호로 기탁하였다.
실시예 2: 사카로마이세스 세레비제 JY-209 배양액의 향기 성분의 정량분석
사카로마이세스 세레비제 JY-209를 발효시켜서 얻은 배양액의 향기 성분을 정량분석하기 위해 실시예 1과 같은 방법으로 발효배양액을 얻은 후 헤드스페이스 가스 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과를 모균주와 비교하여 표 2에 나타내었다.
성분균주 이소아밀알콜(ppm) 이소아밀아세테이트(ppm)
#168 51 0.11
JY-209 144 1.19
상기 표 2에서와 같이, 사카로마이세스 세레비제 JY-209와 모균주인 사카로마이세스 세레비제 #168에 의해 생산된 향기 성분의 생산량을 비교한 결과, 사카로마이세스 세레비제 JY-209은 이소아밀알콜을 144 ppm으로서 모균주보다 약 3배, 이소아밀아세테이트을 1.19 ppm으로서 모균주보다 약 10배 정도 고생산하였다.
실시예 3: 지방산 함유 배지에서의 발효액 향기 성분의 정량분석
사카로마이세스 세레비제 JY-209를 YBM 배지(딥코사, 미국)에서 30 ℃에서 18시간 동안 종배양하였다. 지방산이 함유된 발효배지(효모니트로젠베이스6.7 ｇ, 카자미노산 10 ｇ, 리놀릭산 0.5ｍМ, 이소아밀알콜 80 ppm, 증류수 1ℓ)에 젓산을 가하여 수소이온농도를 4.0으로 조정하였다. 이 발효배지에 종배양액 0.5 ㎖를 접종하여 25 ℃에서 7일 동안 정치배양하였다. 얻어진 발효액을 2,000 rpm으로 2분동안 원심분리하여 상층액을 회수한 후, 헤드스페이스 가스 크로마토그래피를 실시하여 향기 성분을 정량분석하였다. 그 결과는 표 3에 나타낸 것과 같다.
성분균주 이소아밀알콜(ppm) 이소아밀아세테이트(ppm)
#168 2.0 -
JY-209 33.2 11.3
상기 표 3에서와 같이, 본 발명의 사카로마이세스 세레비제 JY-209를 이용하여 제조된 소주는 향기 성분인 지방산에스테르류의 함량이 증가되어 풍미가 뛰어나다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) JY-209를 이용하면 향기 성분의 함량이 증가하여 풍미가 우수한 주류를 생산할 수 있다.

Claims (6)

  1. 향기 성분의 생산성이 우수한 돌연변이주 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) JY-209(KFCC-11286).
  2. 사카로마이세스 세레비제 #168(KFCC-10833)에 돌연변이원인 자외선 또는 에틸메탄설포네이트를 처리하여 돌연변이시키고, 이 균주를 트리플루오로류신 및 플우아지폽을 함유하는 배지에서 배양하여 트리플루오로류신 및 플우아지폽에 대한 복합내성 균주를 선별하는 것을 포함하는 사카로마이세스 세레비제 JY-209의 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    선별용 배지가 포도당, 효모니트로베이스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 사카로마이세스 세레비제 JY-209를 이용하여 곡물을 발효시키는 것을 특징으로 하는, 향기 성분의 함량이 증가된 주류의 생산 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    주류가 증류식 소주, 약주 또는 청주인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    향기 성분이 이소아밀알콜 또는 이소아밀아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
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