KR100385366B1 - 생체이용율을 개선한 실리마린 제제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간 질환 예방 및 치료에 응용되는 실리마린 제제의 생체이용율을 개선한 신규의 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다. 즉, 난용성인 실리마린에 체내 흡수를 안전하게 촉진시키는 트로메타민, 폴록사머 407을 적절히 첨가, 제조함으로써 기존 제제보다 수용성을 높이고, 생체이용율을 개선한 것이다. 이와 같은 제제 개선으로 본 발명의 실시예에서와 같이 기존 제제에 비해 용출률이 월등히 개선되었으며, 흰쥐를 이용한 동물실험모델에서 생체이용율이 증대됨을 알 수 있었다. 또한 흰쥐를 이용한 급성독성시험 결과 기존 제제에 비해 독성이 증가하지 않았으며, LD₅₀가 9,756mg/kg 이상으로 매우 안전함을 알 수 있었다.

Description

생체이용율을 개선한 실리마린 제제 조성물{Compositions and preparations of silymarin complex with the improved bioavailability}

본 발명은 간 질환 예방 및 치료 요법에 이용되는 실리마린 제제의 생체이용율을 증가시킨 조성물에 대한 것이다. 실리마린은 약용식물인 Carduus marianus Linne(Silybum marianum)의 학명을 가진 약초에서 추출한 것이다. 이 식물은 기원전 부터 고대 그리스를 위시하여 서방 세계에 중요한 약물로서 알려져 왔다. 1970년대에 우리나라에 간장치료제로 소개된 이후 이 성분을 주성분으로 하는 많은 약제가 시판 중에 있다. 실리마린을 주성분으로 함유하는 제제의 경우 이미 임상적으로 간질환 치료에 널리 응용되고 있지만, 그 주성분인 실리마린은 물에 거의 녹지 않는 난용성 물질로서 경구투여시 체내 흡수율이 낮아 생체이용율이 약 20∼40%에 불과하다. 또한 이러한 난용성의 문제 때문에 응용되고 있는 제형이 정제, 캅셀, 현탁액으로 매우 제한적이다. 따라서 가용성을 높여 생체이용율을 향상시키는 것이 이 약물개발에 있어 중요한 과제가 되고 있다. 본 발명은 난용성인 실리마린에 트로메타민, 폴록사머 407을 적절히 배합, 첨가, 제조함으로써 수용성을 높여 약물의 생체이용율을 높이는 데 그 목적이 있다.

실리마린 제제는 현재 중독성 간질환, 만성간염 및 간경화 등의 간 질환 치료의 보조 요법으로 이용되고 있다. 주성분인 실리마린은 실리빈(silybin)의 네 가지 구조적 이성질체 즉, 실리빈(silybin), 이소실리비닌(isosilybinin), 실리크리스틴(silicristin), 실리디아닌(silidianin)을 포함하는데, 물에 잘 녹지 않아 경구 투여시 체내 흡수율이 매우 낮은 것이 단점이다. 따라서 실리마린 제제의 생체이용율을 높이려는 시도가 많이 진행되었다. 과거에는 적당한 화학제로 처리 또는 이와 반응시켜 이들이 우수한 수용성을 가진 유도체로 전환되도록 분자의 변환을 유도하고자 하는 시도가 이루어 졌다. 대한민국 등록특허공보 (등록번호: 제0138574호)에서는 생체이용률을 증가시키기 위한 제제를 개발하기 위하여 폴리에틸렌글리콜과 에탄올을 혼합한 후 다시 폴리소르베이트를 가하였으나, 이러한 경우에 실리마린의 용해도는 크게 증가하지 못하였고, 제제의 부피가 커지는 단점이 있다. 또한, 최근에는 실리마린을 계면활성제, 공계면활성제 및 오일에 용해시켜 자발유화 마이크로에멀젼형 연질캅셀 제제가 특허출원 되었다(대한민국 공개특허공보 특2001-8804호). 그러나 이 공개특허공보에서의 자발유화 마이크로에멀젼 제제는 다량의 계면활성제를 사용하기 때문에 위염이나 위궤양 등과 같은 위장장애가 있는 복용자에게는 자극을 더 일으킬 수 있으며, 제제의 부피가 커져서 복용하기가 불편할 뿐만 아니라 설사, 복통 등 바람직하지 않은 부수 반응을 유발시킬 수도 있다. 또한 공개특허공보 특2001-8804호에서는 실험동물에서의 생체이용률 비교 시험에서 약물의 혈중농도를 측정하기 위해 일반적으로 널리 사용되는 경동맥의 캐뉼러 삽입을 통한 시험법으로 실험하지 않고 실험동물의 심장에서 직접 채혈하는 방법을 사용하였다. 이에 반해 본 발명에서는 실리마린과 외인성 화합물이 결합되어 있지 않으면서 높은 생체이용율 및 수용성을 제공함과 동시에 다량의 계면활성제를 사용하지 않기 때문에 바람직하지 못한 부작용을 최소화할 수 있고 약물 복용 회수를 감소시키는 편리성을 제공하는 장점을 지니고 있다. 또한 본 특허에서는 약물의 혈중 농도를 측정하는 경우 가장 일반적으로 사용되고, 개체차이에 따른 실험오차를 최소화함으로써 정확한 실험결과를 얻을 수 있는 실험방법으로 경동맥에 캐뉼러 삽입(cannulation)을 통해 약물의 농도를 측정하였다.

본 발명은 난용성인 실리마린의 용해성을 증가시키기 위한 연구로서 체내에서 흡수력을 높이기 위한 방향으로 실리마린 화합물의 화학구조를 정밀히 검토한 결과이다. 실리마린은 도 1에서와 같은 주성분, 즉 분자량은 같으나 구조가 다른 구조 이성질체인 실리빈(Silybin), 실리크리스틴(Silicristin), 실리디아닌 (Silidianin)을 함유하고 있으며 식물의 추출성분 중에는 도 1에서와 같이 실란드린(Silandrin), 실리헤르민(Silihermin)도 함유할 수 있다. 이 중 주성분인 실리빈의 구조상으로 보면 페놀성 하이드록실(hydroxyl)기를 가진 세 부분의 산성 물질 구조(Resorcinol, Maltol, Guaiacol, 도 1참조)를 가지고 있으며 이 산성구조는 알칼리성 물질과 결합하면 용해도가 크게 증가할 수 있고 생체 이용율도 상승할 수 있지만 체내에 투여되면 산성물질인 위액으로 다시 중화되어 난용성으로 돌아감으로 물질구조상 적절한 알칼리성 물질이 필요하다. 그러므로 본 발명에서는 3∼4 당량의 알칼리성 물질인 트로메타민(Tromethamine, 도 1)를 사용함으로써 위액에서도 용해도가 크게 변하지 아니하고 생체흡수 이용율이 높다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 이 트로메타민의 사용은 강한 알칼리성 물질로 중화시키거나, 호박산(Succinic acid)으로 에스테르 화합물을 만드는 것과 같이 외인성 유도체 화합물로 제조한 것은 아니며, 일반적인 공지의 방법과 같이 다량의 계면활성제를 사용하지는 않고 수용성 및 생체이용율을 증가시키고자 한 발명이다. 즉, 실리마린 원료에 적량의 체내 흡수촉진제를 첨가, 제조함으로써 생체이용율을 증가시키고, 복용의 편리성을 증가시키며 부작용 발생을 피할 수 있는 발명인 것이다.

도 1은 실리마린의 주요 성분과 관련 물질의 구조를 나타낸 것이다.

도 2는 흰쥐에서의 생체이용율(시간별 실리빈의 혈중 농도 곡선)을 비교한 것이다.

도 3은 흰쥐에서의 생체이용율(시간별 이소실리비닌의 혈중 농도 곡선)을 비교한 것이다.

도 4는 흰쥐에서의 생체이용율(시간별 토탈 실리빈의 혈중 농도 곡선)을 비교한 것이다.

실시예 1. 본 발명의 실리마린 제제의 원료 제조

실리빈(silybin) 34.3% 이상 함유하는 실리마린과 트로메타민(미국약전 수재품)을 중량비로 1:1 혼합하고 혼합물 중량의 2.5%에 해당하는 폴록사머407을 넣고 혼합하였다. 이 혼합물 중량의 10배에 해당하는 95.0% 에탄올을 가해 용해시키고 용매를 감압유지하였다. 잔사를 40℃이하에서 진공감압건조하고 분쇄하였다.

실험예 1. 물, 인공위액, 인공장액, pH 4.0에서의 용출율 비교

기존제제 원료(A) 및 실시예 1에 따라 제조된 실리마린 제제 원료(B)를 각각 총 실리빈으로서 60밀리그람 해당량을 취한 뒤 젤라틴 경질 캅셀에 충진하였다. 각각의 제제를 대한약전(7개정) 제2법(패들법)에 따라 싱커를 사용하여 교반속도 50rpm, 온도 37℃에서 용출시험을 하였다. 용출액으로는 인공 위액 (pH 1.2 염산염 완충액), 인공장액 (pH 6.8, 50mM 인산염 완충용액), pH 4.0 완충액 (50mM 인산염 완충용액) 및 물을 각각 900mL씩 사용하였다. 용출시험 시작 후 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 용출액 약 5mL 취한 후 이를 여과하여 처음 약 3mL는 용출용기에 다시 보충하고, 다음 여액 약 2mL 채취하여 검액으로 하였다. 용출율의 계산시 이를 보정하여 계산하였다. 검액을 고속액체크로마토그래피법으로 정량하였다. 컬럼은 안지름 4.6mm, 길이 250mm인 스테인레스관에 5㎛의 액체크로마토그래피용 옥타데실실리화한 실리카겔을 충진한 것을 사용하였으며, 이동상으로 아세토니트릴과 pH3.0,10mM 인산염 완충액의 혼액 (45:55)을 사용하였다. 유속은 1.0mL/min, 자외/가시광선 검출기로 288nm에서 분석하였으며, 검액과 컬럼의 온도는 40℃로 하였다. 검액주입량은 20㎕로 하였다. 실리빈 및 이소실리비닌의 유지시간은 각각 5.1분 및 5.5분 이었다. A처방과 B처방 모두 용출시작 후 약 30분 까지 용출율이 급격히 증가하다가 45분 이후에는 용출율의 변화가 거의 없었다. 표 1에서 보는 것처럼 신규 제제가 기존 제제보다 용출율이 약 1.8배에서 4.3배까지 향상되었다.

용출시험결과

	pH1.2	pH4.0	pH6.8	물
2시간 용출율(%)	기존 제제(A)	19.6±1.5	15.8±1.8	43.3±2.3	23.5±0.4
	신규 제제(B)	48.8±1.2	57.0±5.0	77.7±1.8	100.8±2.0
용출율 비율(B/A)	2.5	3.6	1.8	4.3

실험예 2. 흰 쥐에서의 생체이용율 비교 시험

기존제제 원료 및 실시예 1에 따라 제조된 실리마린 제제 원료를 각각 총 실리빈으로서 43mg 해당량을 취해 1% 카르복시메칠셀룰로스 나트륨 1mL용액에 현탁시킨 뒤 경구로 흰쥐에 투여하였다. 미리 24시간 전부터 절식시킨 흰쥐를 마취한 후 수술을 하여 경동맥 캐뉼러 삽입을 하였고, 스트레스를 최소화하기 위하여 충분히 휴식시간을 갖게 한 후 각각의 약물을 투여하였다. 각 실험군의 n수는 정확한 통계처리를 위하여 각각 n=9로 하였다. 약물의 투여 직전, 투여 후 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480분에 혈액 약 0.2mL씩을 채혈하였고 이것을 원심분리 한 뒤 혈장 100㎕를 취해 검체로 하였다. 검체 100㎕에 pH 4.5, 1M 초산나트륨 완충액 100㎕와 β-glucuronidase 40unit를 가하여 혼합하고, 60rpm으로 2시간 이상 교반하여 혈장 속의 포합체를 모두 유리형태로 분해하였다. 이후 내부표준물질인 나링게닌(naringenin) 표준품을 0.05mg/ml의 농도로 함유하고 있는 pH 8.0, 0.5M 인산염 완충액 200㎕ 정밀히 가하여 혼합하고 이곳에 디에틸에테르 1.0㎖를 가하여 진탕한 후 디에틸에테르 층을 취하여 질소로 모두 증발, 건조 시킨 후 남은 잔사에 이동상 1㎖를 가하여 이를 검액으로 하였다. 검액의 분석은 액체크로마토그래피법으로 하였다. 컬럼은 안지름 4.6mm, 길이 250mm인 스테인레스관에 5㎛의 액체크로마토그래피용 옥타데실실리화한 실리카겔을 충진한 것을 사용하였으며, 이동상으로 아세토니트릴과 pH 3.0,10mM 인산염 완충액의 혼액 (38.5:61.5)을 사용하였다. 유속은 1.0mL/min, 검출기는 자외/가시광선 검출기로 288nm에서 분석하였으며, 컬럼의 온도는 40℃로, 검액주입량은 100㎕로 하였다. 실리빈, 이소실리비닌 및 내부표준물질의 유지시간은 각각 약 5.8분, 6.4분, 7.0분이었다. 생체이용율의 평가는 AUC(시간-혈중농도 곡선하면적), Tmax (최고혈중농도 도달시간), 및 Cmax (최고혈중농도)로 하였으며, AUC는 사다리꼴방식으로 계산하였다. 두 제제간의 생체이용율 차이에 대한 유의성 검정은 paired-t test, 단측검정으로 하였다.

흰쥐에서의 생체이용율 파라미터(Total silybin의 혈중농도)

	AUC(㎍·min/mL)	Cmax(㎍/mL)	Tmax(min)
기존제제	2211.8±588.7	9.1±3.7	93.3±23.6
신규제제	2912.5±651.7	23.8±7.7	36.7±13.2

AUC면에서 기존 제제는 2211.8±588.7㎍·min/mL, 신규 제제는 2912.5 ±651.7㎍·min/mL로 나타나 신규 제제가 기존 제제 보다 약 1.32배 높은 생체이용율을 나타내었다(p=0.0222, n=9)(표 2). Cmax는 신규 제제 및 기존 제제가 각각 23.8 ±7.7㎍/mL, 9.1 ±3.7㎍/mL로 나타나 신규 제제가 기존 제제보다 약 2.63배 높은 최고 혈중 농도를 나타내었다(p=0.00296, n=9)(표 2). Tmax는 신규 제제 및 기존 제제가 각각 36.7 ±13.2분, 93.3 ±23.6분(표 2)으로 나타나 신규 제제가 기존 제제보다 최고혈중농도 도달시간이 약 1시간 정도 빨랐다(도 2,3,4).

실험예 3. 급성독성시험

실시예에 의거 제조한 실리마린 제제의 급성독성 시험을 위해 수컷 흰쥐(220∼240g)에 1% 카르복시메칠셀룰로스 나트륨 현탁액을 경구투여 하였다. 투여용량은 실험군별로 다음과 같다. 제1군: 4,878mg/kg(실리빈 1,000mg/kg, n=5),제2군: 7,317mg/kg(실리빈 1,500mg/kg, n=5), 제3군: 9,756mg/kg(실리빈 2,000mg/kg, n=5), 제4군: 12,195mg/kg(실리빈 2,500mg/kg, n=5), 제5군: 14,634mg/kg(실리빈 3,000mg/kg, n=5). 투여군들 모두 1주일간 관찰하였으며, 체중 변화를 측정하고, 실험 마지막 날 부검하여 장기들의 변화를 육안으로 관찰하였다. 제1군 및 제2군에서는 실험동물의 치사, 독성 효과가 발견되지 않았으나, 과용량인 9,756mg/kg 이상 투여군인 제3군, 제4군, 제5군에서는 용량이 높아짐에 따라 치사율이 상승하였으며, 일시적인 체중 감소, 운동량 감소, 식사량 감소 등 여러 가지 독성효과가 관찰되었다. 따라서 최고 무독성 용량은 2군의 7,317mg/kg이며 최저 독성 발현 용량은 4군의 9,756mg/kg이다. LD₅₀은 9,756mg/kg(실리빈 2,000mg/kg) 이상으로 나타나 기존 제제에 비해 독성이 증가하지 않았으며 이 제제가 경구 투여시 안전한 것으로 판단되었다.

제제예 1 내지 제제예 4 실리마린 함유 캅셀제의 제조

1)실리마린(함량 80.0이상, 실리빈41.8% 함유) 150mg

트로메타민 150mg

폴록사머 407 7.5mg

마그네슘 스테아레이트 적당량

탈크 적당량

2)실리마린(함량 80.0이상, 실리빈41.8%) 150mg

트로메타민 150mg

폴리소르베이트 80 7.5mg

마그네슘 스테아레이트 적당량

탈크 적당량

3)실리마린(함량 80.0이상, 실리빈41.8%) 150mg

트로메타민 150mg

황산라우릴나트륨 0.3mg

마그네슘 스테아레이트 적당량

탈크 적당량

4)실리빈(함량 92.4%) 150mg

트로메타민 150mg

황산라우릴나트륨 0.3mg

마그네슘 스테아레이트 적당량

탈크 적당량

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법으로 혼합한 후 젤라틴 경질캅셀에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

이상 설명하고 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 난용성인 실리마린에 체내 흡수를 안전하게 촉진시키는 트로메타민, 폴록사머 407을 적절히 첨가, 제조함으로써 기존 제제보다 수용성을 높이고, 생체이용율을 개선한 것으로, 기존 제제에 비해 용출률이 월등히 개선되었으며, 흰쥐를 이용한 동물실험모델에서 생체이용율이 증대됨을 알 수 있었다. 또한 흰쥐를 이용한 급성독성시험 결과 기존 제제에 비해 독성이 증가하지 않았으며, LD₅₀가 9,756mg/kg 이상으로 매우 안전하다.

Claims (5)

1. 난용성 물질인 실리마린의 생체 이용율을 증가시키기 위하여 체내 흡수 촉진제로 트로메타민을 실리마린에 대하여 1:0.5 내지 1:2 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 생체 이용율이 증가된 실리마린 제제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 실리마린과 트로메타민의 배합비율이 1:1 중량비 임을 특징으로 하는 생체 이용율이 증가된 실리마린 제제 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 실리마린과 트로메타민의 혼합물에 폴록사머 407을 0.05-5중량% 혼합한 다음 95% 에탄올로 용해하고 40℃이하에서 감압 건조하여 제조하는 것임을 특징으로 하는 생체 이용율이 증가된 실리마린 제제 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 폴록사머 407 대신 황산라우릴나트륨을 0.01-1.0중량% 혼합하는 것을 특징으로 하는 생체 이용율이 증가된 실리마린 제제 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 실리마린 제제의 제형이 경질 캅셀제인 것을 특징으로 하는 생체 이용율이 증가된 실리마린 제제 조성물.