KR100380872B1 - 사이클릭 뉴로키닌 α 길항 펩타이드 및 이를 포함하는약제학적 조성물 - Google Patents

사이클릭 뉴로키닌 α 길항 펩타이드 및 이를 포함하는약제학적 조성물 Download PDF

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쿠드락츠엘리자베스엠.
버크스티븐에이치.
하버슨스콧트엘.
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메렐 파마슈티칼스 인크.
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Abstract

본 발명은 사이클릭 헥사펩타이드 및 옥타펩타이드 화합물인 뉴로키닌 A의 길항제에 관한 것이다. 본 발명의 당해 펩타이드의 길항작용은 통상적인 경쟁 결합 및 생화학적 검정뿐만 아니라 통상적인 시험을 사용하여 확인할 수 있으며 또한 본 발명은 뉴로키닌 A와 관련된 다양한 조건하에서의 이들 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

사이클릭 뉴로키닌 Α 길항 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{Cyclic neurokinin A antagonizing peptide and a pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 뉴로키닌 A의 길항제인 신규한 사이클릭 펩타이드 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 목적은 신규하고 유용한 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제공하는 것이다.
뉴로키닌 A 및 관련된 타키키닌, 물질 P 및 뉴로키닌 B는 체조직에 널리 분포하는 일군의 천연 펩타이드이며 무수한 생물학적 효과를 나타낸다. 중추 신경계에서 타키키닌의 역할이 입증되었지만 이들의 다수의 효과는 말초 조직에서 연구되었다. 예를 들면, 뉴로키닌 A는 점액 분비, 혈관확장 및 미세혈관 누출에는 효과가 적은 반면 기도 평활근은 강하게 수축시켜 신규한 항기관지 수축제로서 주로 사용된다. 뉴로키닌 A가 평활근을 수축시키는 기타 조직에는 홍채 괄약근, 위장관 각부분, 혈관계, 요관, 신우 및 방광을 포함한 비뇨생식기가 포함되며 이로 인해 진경제로서 타키키닌 길항제용으로 사용된다.
구조가 제한되어 있어 엑소프로테아제에 대해 안정한 사이클릭 펩타이드의 펩타이드 수용체의 길항제로서의 용도가 본 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 유럽 특허원 제0 190 946호에는 LH-RH-수용체에 대한 길항제로서의 사이클릭 헥사펩타이드가 기재되어 있다. 유럽 특허원 제0 528 312호에는 엔도텔린(endothelin) 수용체에 대한 길항제로서의 사이클릭 헥사펩타이드와 NK-2 수용체에 대한 길항제로서의 펩타이드의 특정 그룹이 기재되어 있다. 또한, WO제92/02546호에는 NK-2 수용체에 대한 억제제로서 유용한 사이클릭 헥사펩타이드(예:사이클로[-Val-trp-trp-Arg-Asp-Tyr-trp-])가 교시되어 있다. 또한, 다음 문헌에는 선택적인 NK-2 수용체 길항제로서의, 물질 P의 C 말단 서열을 기초로 하는 20가지의 사이클릭 펩타이드와 펩타이드 모사체를 함유하는 물질이 교시되어 있다[참조: Williams et al.,J. Med. Chem.,36, 2-10(1993)]. 또한, 다음 문헌에는 NK-2 길항작용에 대한 효과를 결정하기 위해 각각의 아미드 결합이 환원된 아미드 Ψ(CH2NH) 결합으로 연속적으로 치환된 [Leu10]NKA4-10의 동족체의 합성이 교시되어 있다[참조: Harbeson et al.,J. Med. Chem.,35, 3949-3955(1992)]. 펩타이드 Asp-Ser-Phe-Val-β-Ala-LeuΨ(CH2N(CH2)2CH3)-Phe-NH2가 1nm의 IC50을 갖는 것으로 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 환자의 각종 질환을 치료하고 예방하기 위한 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제공하는 것이다. 또한, 타키키닌은 염증 및 면역 기능에 관련된 것으로 여겨지기 때문에 이들은 천식, 알레르기, 기관지염, 비염, 크론 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 편두통, 방광염 및 과민성 반응을 포함한 염증과 관련된 질환의 치료에 매우 유용하다. 타키키닌에 대한 길항 작용은 또한 기침, 통증, 말초 신경증, 후포진성 신경통, 면역학적 역반응, 구토, 혈관확장에 의한 혈류 질환, 결막염과 같은 안 질환및 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 두드러기 등과 같은 피부 질환의 치료에 적합한 치료요법일 수 있다. 불안증, 우울증, 정신병, 정신분열증 및 치매를 포함한 다양한 중추 신경계 질환도 타키키닌 길항제로 치료할 수 있다.
도 1은 사이클릭 펩타이드인 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (MDL 102,882)가 SKLKB82#3 세포에서 NKA 유도된 포스파티딜이노시톤(PI) 턴오버에 대해 투여량 관련 길항작용을 나타내는 능력을 도시한 것이다. 데이타는 기본 수준에 대한 총 이노시톨 포스페이트 축적량의 자극 %로서 나타내며 NKA에 의해 나타나는 최대 반응에 의해 정상화한다. 데이타는 4회 별도 실험에서 수득한 값의 평균±S.E.M이다. 투여량-반응 라인에 대한 실체는 하기 및 도 1에 열거된 바와 같다.
□ NKA(EC50= 5.82 nM)
■ NKA + 30 nM 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
△ NKA + 300 nM 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
▲ NKA + 3 μM 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
◇ 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
본 발명은 화학식 1, 2, 3 및 4의 화합물, 이들의 수화물, 입체이성체 및 동배체, 및 약제학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다. 구체적으로, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식의 사이클릭 헥사펩타이드(서열 1) 또는 이의 수화물, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
상기 화학식 1에서,
R1은 벤질, p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
R2는 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 (CH2)2-CONH2이며,
R3은 C1-4직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
X는 H이거나, R3과 함께 결합하여 -(CH2)3-을 형성하며,
R4는 H, 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 p-하이드록시벤질이고,
R5는 H, 메틸 또는 3-인돌릴메틸이며,
단, R2가 -(CH2)2-CONH2이면 R1은 p-하이드록시벤질이고,
R1이 결합되어 있는 탄소는 (R) 절대 배위이다.
또한, 본 발명에 따라 화학식 2의 신규한 펩타이드(서열 2) 또는 이의 수화물, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
상기 화학식 2에서,
R1은 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
R5은 H 또는 메틸이다.
유사하게 화학식 3의 신규한 펩타이드(서열 3) 또는 이의 수화물, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
상기 화학식 3에서,
B1은 C1-4 직쇄 또는 측쇄 알킬, 벤질, p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
B2는 (CH2)4-NH2, (CH2)3-NH2, (CH2)3-NHC(=NH)NH2또는 3-인돌릴메틸이며,
B3은 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
B4은 H 또는 (CH2)2-CONH2이다.
유사하게, 화학식 4의 신규한 펩타이드(서열 4) 또는 이의 수화물, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
상기 화학식 4에서,
R1은p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
R5는 H 또는 메틸이며,
Q는 p-클로로벤질, p-니트로벤질, p-NH2-벤질, p-메톡시벤질, 3-인돌릴메틸, 또는 화학식,또는의 그룹이고,
X'는 H이며,
Q와 X'는 이들이 각각 결합된 탄소 및 질소와 함께 구조식또는의 그룹을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 호흡 질환을 앓고 있는 환자에게 치료학적 유효량의 화학식5의 화합물(서열 5), 또는 이의 입체이성체, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함하여, 당해 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 화학식 5에서,
R1은 벤질, p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고,
R2는 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 (CH2)2-CONH2이며,
R3은 C1-5직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
X는 H이거나, R3과 함께 결합하여 -(CH2)3-을 형성하며,
R4는 H, 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 p-하이드록시벤질이고,
W는 H, 메틸 또는 3-인돌릴메틸이며,
Z는 H이거나, W와 결합하여 함께 -(CH2)3-을 형성하고,
단, R2가 -(CH2)2-COOH이면 R1은 p-하이드록시벤질이고,
R1이 결합되어 있는 탄소는 (R) 절대 배위이다.
또한, 본 발명은 진통 효과가 필요한 환자에게 진통의 치료학적 유효량의 화학식 1, 2, 3, 4 또는 5의 화합물, 또는 이의 입체이성체, 동배체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함하여, 환자에게 진통 효과를 제공하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬"은 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 나타낸다. 이의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 2급 펜틸, 사이클로펜틸 등이 포함된다.
용어 "입체이성체"는 공간내 원자 배향만이 상이한 각 분자의 모든 이성체에 대한 일반적 용어이다. 이에는 거울상 이성체(에난티오머), 기하이성체(시스/트란스), 및 화합물의 하나 이상의 키랄 중심을 갖는 서로 거울상이 아닌 이성체(부분입체이성체)가 포함된다. 아미노산의 경우, 표시 D/L 또는 R/S를 사용할 수 있다[참조: IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem. 138: 9-37 (1984)]. 용어 "(R) 절대배위"는 R1이 결합된 탄소를 기재하기 위한 것이다. 글라이신을 제외한 천연 아미노산은 키랄 탄소원자를 함유한다. 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 바람직한 화합물은 L 배위의 광학 활성 아미노산이지만 화학식 1, 2, 3 또는 4의 화합물인 아미노산은 D 또는 L 배위이거나 라세미체 혼합물을 포함하여 D 이성체와 L 이성체의 혼합물일 수 있다. 본원에 사용된 표시 ??????는 입체화학이 지정되지 않은 결합을 지칭한다. 화학식 2 및 4의 아미노산 위치 2 및 화학식 3의 아미노산 위치 14에서의 표시 "D"는 이들 위치에 존재하는 아미노산(글라이신 제외)이 모두 "D" 배위임을 나타낸다. α-아미노산에 대해 인정된 약어를 표 1에 나타낸다.
아미노산 기호
알라닌 Ala
글라이신 Gly
이소류신 Ile
류신 Leu
라이신 Lys
페닐알라닌 Phe
아르기닌 Arg
티로신 Tyr
트립토판 Trp
발린 Val
노르발린 Nva
노르류신 Nle
글루타민산 Glu
프롤린 Pro
오르니틴 Orn
p-클로로페닐알라닌 p-Cl-Phe
p-니트로페닐알라닌 p-NO2-Phe
p-NH2-페닐알라닌 p-NH2-Phe
1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-7-하이드록시-3-카복실산 Tiq(OH)
1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산 Tiq
나프틸알라닌 Nal
플루오레닐글라이신 Flg
디페닐알라닌 Dpa
"동배체"는 결합된 아미노산(-C(O)NH-)들 간의 정상의 펩타이드 결합이 -CH2NH-(환원), C(O)N(CH3)(N-메틸아미드), -COCH2-(케토), -CH2(OH)CH2-(하이드록시), -CH(NH2)CH2-(아미노) 또는 -CH2CH2- (탄화수소)와 같이 변형된 형태이거나 역전(-HN(C=O)-)된 것을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 동배체형이 아닌 것이 바람직하다.
화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 비독성, 유기산 또는 무기산과 함께 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적합한 염을 형성하는 무기산의 예에는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산, 및 오르토인산일수소나트륨 및 황산수소칼륨과 같은 산 금속염이 포함된다. 적합한 염을 형성하는 유기산의 예에는 모노-, 디- 및 트리카복실산이 포함된다. 이러한 산의 예로는, 예를 들면, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산 및 설폰산(예: 메탄 설폰산 및 2-하이드록시에탄 설폰산)이 있다.
본 발명의 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물의 바람직한 양태는 R1이 벤질, p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸(여기서, R1은 D- 또는 L-아미노산인 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 부터 각각 유도된 것이다)이고, R2가 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 (CH2)2-CONH2(여기서, R2는 D- 또는 L-아미노산인 페닐알라닌, 트립토판 또는 글루타민으로부터 각각 유도된 것이다)이며, R3이 C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬이고, X가 H이거나 R3과 X가 서로 결합하여 -(CH2)3-(여기서, R3, 또는 R3과 X의 조합형은 D- 또는 L-아미노산인 글라이신, 알라닌, 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린 또는 프롤린으로부터 각각 유도된 것이다)을 형성하며, R4가 H, 벤질, 3-인돌릴메틸 또는 p-하이드록시벤질(여기서, R4는 D- 또는 L-아미노산인 글라이신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신으로부터 각각 유도된 것이다)이고, R5가 H, 메틸 또는 3-인돌릴메틸(여기서, R5는 D- 또는 L-아미노산인 글라이신, 알라닌 또는 트립토판으로부터 각각 유도된 것이다)이며, B1이 C1-5 직쇄 또는 측쇄 알킬, 벤질, p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸 (여기서, B1은 D- 또는 L-아미노산인 글라이신, 알라닌, 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로부터 각각 유도된 것이다)이고, B2가 (CH2)4-NH2, (CH2)3-NH2, (CH2)3-NHC (=NH)NH2또는 3-인돌릴메틸(여기서, B2는 D- 또는 L-아미노산인 라이신, 오르니틴, 아르기닌 또는 트립토판으로부터 각각 유도된 것이다)이며, B3이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸(여기서, B3은 D- 또는 L-아미노산인 티로신 또는 트립토판으로부터 각각 유도된 것이다)이고, B4가 H 또는 (CH2)2-CONH2(여기서, B4는 D- 또는 L-아미노산인 글라이신 또는 글루타민으로부터 각각 유도된 것이다)이며, Q가 p-클로로벤질, p-니트로벤질, p-NH2-벤질, p-메톡시벤질, 또는 화학식,또는의 그룹이고,
X'가 H이거나, Q와 X'가 이들이 각각 결합된 탄소 및 질소와 함께 화학식또는의 그룹(여기서, Q, 또는 Q와 X'의 조합형은 D- 또는
L-아미노산인 p-클로로페닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, p-NH2-벤질, 메틸티로신, 나프틸알라닌, 플루오레닐글라이신, 디페닐알라닌, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카복실산 또는 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-7-하이드록시-3-카복실산으로부터 각각 유도된 것이다)을 형성할 수 있으며, W가 H, 메틸 또는 3-인돌릴메틸이고, Z가 H이거나 W와 Z가 결합하여 함께 -(CH2)3-을 형성하는 것이다.
바람직한 화학식 1의 화합물은 R1이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고, R2가 3-인돌릴메틸이며, R3이 CH2CH(CH3)2이고, X가 H이며, R4가 3-인돌릴메틸이고, R5가 H 또는 메틸인 화합물이다.
바람직한 화학식 1의 화합물을 나타내는 속기형에는 사이클로 [AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6] 구조(여기서, AA1내지 AA6은 화학식 1에 대해 기재한 바와 같이 각각 라디칼 R1 내지 R6을 갖는 아미노산 잔기에 대한 일반적 기호이다) 또는 사이클릭 구조가 포함된다.
보다 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고, R2가 3-인돌릴메틸이며, R3이 CH2CH(CH3)2이고, X가 H이며, R4가 3-인돌릴메틸이고, R5가 H인 화합물이다.
화학식 2의 화합물은 화학식 1의 화합물의 더욱 더 바람직한 그룹이다. 아미노산 2 내지 5는 모두 고정된 입체화학을 갖는데, 아미노산 2는 (D)배위인 반면, 아미노산 3 내지 5는 모두 (L) 배위이다. 화학식 2의 화합물을 나타내는 속기형에는 사이클로[AA1-trp-Leu-Arg-Trp-AA6] 구조(여기서, trp는 D-트립토판이고, Leu는 L-류신이며, Arg는 L-아르기닌이고, Trp는 L-트립토판이며 AA1및 AA6은 화학식 2에 대해 기재한 바와 같이 라디칼 R1및 R6을 갖는 아미노산 잔기에 대한 일반적 기호이다) 또는 사이클릭 구조가 포함된다.
화학식 1 및 2의 신규한 펩타이드의 대표적인 예에는 약어로 나타낸 다음이 포함된다:
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 6),
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 7),
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 8),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly] (서열 9),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala] (서열 10),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala] (서열 11),
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 12),
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly] (서열 13),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly] (서열 14),
사이클로[tyr-Gln-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 15),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Ala] (서열 16),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Gly-Trp] (서열 17),
사이클로[Tyr-trp-Pro-Arg-Trp-Gly] (서열 18) 및
사이클로[Phe-phe-Pro-Arg-Phe-Gly] (서열 19).
바람직한 화학식 3의 화합물은 B1이 CH2CH(CH3)2또는 p-하이드록시벤질이고, B2가 (CH2)3-NHC(=NH)NH2또는 3-인돌릴메틸인 화합물이다.
바람직한 화학식 3의 화합물의 속기 구조는 사이클로[AA11-AA12-AA13-AA14-Leu-Arg-Trp-Gly] 또는 사이클릭 구조로 나타낼 수 있다.
보다 바람직한 화학식 3의 화합물은 B1이 CH2CH(CH3)2이고, B2가 (CH2)3-NHC(=NH)NH2이며, B3이 3-인돌릴메틸이고, B4가 H이거나 B1이 p-하이드록시벤질이고,B2가 3-인돌릴메틸이며, B3이 p-하이드록시벤질이고 B4가 (CH2)2-COOH인 화합물이다.
화학식 3의 신규한 펩타이드의 대표적인 예에는 약어로 나타낸
사이클로[Leu-Arg-Trp-Gly-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 20) 및
사이클로[Tyr-Trp-Tyr-glu-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 21)이 포함된다.
바람직한 화학식 4의 화합물은 R1이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고, R5가 H 또는 메틸이며, X'가 H이고 Q가 p-클로로벤질, p-니트로벤질, p-NH2-벤
질 또는 화학식의 그룹인 화합물이다.
화학식 4의 신규한 펩타이드의 대표적인 예에는 약어로 나타낸
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Nal-Gly] (서열 22),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO2-Phe)-Gly] (서열 23),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH2-Phe)-Gly] (서열 24) 및
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly] (서열 25)이 포함된다.
바람직한 화학식 5의 화합물은 R1이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고, R2가 3-인돌릴메틸이며, R3이 CH2CH(CH3)2이고, X가 H이며, R4가 3-인돌릴메틸이고, W가 H 또는 메틸이며, Z가 H이거나 W와 Z가 결합하여 함께 -(CH2)3-을 형성하는 화합물이다.
화학식 5의 바람직한 화합물을 나타내는 속기형에는 사이클로[AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6] 구조(여기서, AA1내지 AA6은 화학식 5에 대해 기재한 바와 같이 라디칼 R1내지 R6을 갖는 아미노산 잔기에 대한 일반적 기호이다) 또는 사이클릭 구조가 포함된다.
보다 바람직한 화학식 5의 화합물은 R1이 p-하이드록시벤질 또는 3-인돌릴메틸이고, R2가 3-인돌릴메틸이며, R3이 CH2CH(CH3)2이고, X가 H이며, R4가 3-인돌릴메틸이고, R5가 H인 화합물이다.
화학식 5의 펩타이드의 대표적인 예에는 약어로 나타낸 다음이 포함된다:
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 6),
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 7),
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 8),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly] (서열 9),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala] (서열 10),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala] (서열 11),
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 12),
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly] (서열 13),
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly] (서열 14) 및
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Pro] (서열 26)
일반적으로, 화학식 1 내지 5의 화합물은 당해 분야에 유사하게 공지된 표준 화학반응에 의해 제조된 상응하는 선형 펩타이드를 폐환시켜 제조할 수 있다. 반응식 1은 화학식 1, 2, 4 및 5의 사이클릭 헥사펩타이드를 제조하기 위한 일반적 합성 반응식을 개략적으로 나타낸 것이지만, 당해 반응식에 따라 화학식 3의 사이클릭 옥타펩타이드를 또한 제조할 수 있다.
반응식 1은 화학식 1 내지 5의 화합물의 제조에 대한 일반적 합성 반응식을 제공한다.
그룹 AA1, AA2, AA3, AA4및 AA5는 구조 1의 아미노산 유도체의 유리 아미노 그룹에 결합될 수 있다. 그룹 AA1, AA2, AA3, AA4및 AA5는 널리 공지된 펩타이드 커플링 기술에 의해 보호되지 않은 유리 아미노 화합물에 결합될 수 있다. 이어서, 이렇게 결합된 직쇄 펩타이드는 널리 공지된 펩타이드 폐환 기술로 폐환시킨다.
일반적으로, 펩타이드는 C 말단 잔기의 α-아민을 탈보호시키고, 다음의 적합하게 보호된 아미노산을, 상기한 방법을 사용하여 펩타이드 결합을 통해 커플링시켜 연장시킨다. 이러한 탈보호 및 커플링 과정을 목적한 서열이 수득될때까지 반복한다. 커플링은 반응식 1에 도시한 대로 단계적으로 구성 아미노산을 사용하거나 단편(2개 내지 수개의 아미노산)을 축합시키거나, 두 방법을 조합하거나 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,1963, 85, 2149-2154]에 따르는 고체상 펩타이드 합성법으로 수행할 수 있다. 고체상 합성법을 사용할 경우, C 말단 카복실산이 불용성 담체(대개 폴리스티렌)에 결합된다. 이러한 불용성 담체는 α-카복실 그룹과 반응하여 연장 조건에 안정한 결합을 형성하지만 나중에 쉽게 절단되는 그룹을 함유한다. 이의 예로는 클로로- 또는 브로모메틸 수지, 하이드록시메틸 수지 및 아미노메틸 수지가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 대다수의 수지는 이미 바람직한 C말단 아미노산이 도입되어 있는 형태로 시판중이다. 본 발명에 사용되는 다수의 적합하게 보호된 아미노산은 시판중이다. 아미노산 디페닐글라이신 및 플루오레닐글라이신은 아직 시판되지 않지만, 이들은, 예를 들면, 문헌[참조: Chassaing, Josien, Lavielle, "Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium" 및 Martin J. O'Donnell and Robin L. Polt,J. Org. Chem.,1982, 47, 2663-2666]에 공지된 방법으로 합성할 수 있다.
또는, 본 발명의 화합물은 자동화 펩타이드 합성장치를 사용하여 합성할 수 있다. 이 이외에도 펩타이드 합성은 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd ed., Pierce Chemical Co.,Rockford, IL(1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology:, Vol 1, 2, 3, 5 and 9, Academic Press, New York, 1980-1987; Bodanszky, "Peptide Chemistry: A Practical Textbook", Springer-Verlag, New York(1988); and Bodanszky, et al. "The Practice of Peptide Synthesis" Springer-Verlag, New York(1984)]에 기재되어 있다.
2개의 아미노산 사이의 커플링, 아미노산과 펩타이드 사이의 커플링 또는 2개의 펩타이드 단편 사이의 커플링은 아지드법, 혼합된 카본산 무수물(이소부틸 클로로포르메이트)법, 카보디이미드(디사이클로헥실 카보디이미드, 디이소프로필 카보디이미드 또는 수용성 카보디이미드)법, 활성 에스테르(p-니트로페닐에스테르, N-하이드록시숙신산 이미도 에스테르)법, 우드워드(Woodward) 시약 K법, 카보닐디이미다졸법, BOP-Cl과 같은 인 시약법 또는 산화-환원법과 같은 표준 커플링법을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법중 몇몇(특히 카보디이미드법)은 1-하이드록시벤조트리아졸을 가해 향상시킬 수 있다. 이러한 커플링 반응은 액체상이나 고체상으로 수행할 수 있다.
구성 아미노산의 작용성 그룹은 커플링 반응동안 보호하여 바람직하지 않은 결합이 생성되지 않도록 해야 한다. 사용할 수 있는 보호 그룹은 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley Sons, New York(1981) 및 "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, New York(1981)]에 나열되어 있다.
C-말단 잔기의 α-카복실 그룹은 보통 절단되어 카복실산을 제공할 수 있는에스테르로 보호한다. 사용할 수 있는 보호 그룹에는 1) 알킬 에스테르(예: 메틸 및 t-부틸), 2) 아릴 에스테르(예: 벤질 및 치환된 벤질) 또는 3) 약한 염기 처리 또는 약한 환원 수단으로 절단될 수 있는 에스테르(예: 트리클로로에틸 및 펜아실에스테르)가 포함된다.
각각의 아미노산의 α-아미노 그룹은 보호해야 한다. 당해 분야에 공지된 어떠한 보호그룹이라도 사용할 수 있다. 이의 예에는 (1) 아실형(예: 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴 및 p-톨루엔설포닐), (2) 방향족 카바메이트형[예: 벤질옥시카보닐(Cbz 또는 Z)과 치환된 벤질옥시카보닐, 1-(p-비페닐)-1-메틸에톡시카보닐 및 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)], (3) 지환족 카바메이트형[예: t-부틸옥시카보닐(Boc), 에톡시카보닐, 디이소프로필메톡시카보닐 및 알릴옥시카보닐], (4) 사이클릭 알킬 카바메이트형(예: 사이클로펜틸옥시카보닐 및 아다만틸옥시카보닐), (5) 알킬형(예: 트리페닐메틸 및 벤질), (6) 트리알킬실란(예: 트리메틸실란) 및 (7) 티올 함유형(예: 페닐티오카보닐 및 디티아석시노일)이 포함된다. 바람직한 α-아미노 보호 그룹은 Boc 또는 Fmoc, 바람직하게는 Fmoc이다. 펩타이드 합성을 위해 적합하게 보호된 다수의 아미노산 유도체가 시판중이다.
α-아미노 보호 그룹은 후속의 아미노산을 커플링시키기 전에 절단한다. Boc 그룹을 사용하는 경우, 순수한 트리플루오로아세트산, 디클로로메탄중의 트리플루오로아세트산 또는 디옥산중의 HCl을 사용하는 방법을 선택한다. 이어서, 생성된 암모늄 염을 커플링시키기 전에 중화시키거나 동일 반응계내에서 수성 완충액과 같은 염기성 용액 또는 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드중의 3급 아민을 사용하여 중화시킨다. Fmoc그룹을 사용하는 경우, 시약으로 디메틸포름아미드중의 피페리딘 또는 치환된 피페리딘을 선택하지만, 2급 아민 또는 수성 염기성 용액을 사용할 수 있다. 탈보호는 0 내지 실온의 온도에서 수행한다.
펩타이드 제조 동안 상기한 그룹을 사용하여 측쇄 작용기를 갖는 임의의 아미노산을 보호해야한다. 당해 분야의 숙련가는 펩타이드중의 아미노산 및 기타 보호 그룹의 존재에 따라 측쇄 작용기에 대해 적합한 보호 그룹을 선택하고 사용하는 것을 인지할 것이다. 이러한 보호 그룹의 선택은 탈보호 및 α-아미노 그룹의 커플링 동안 제거되지 않아야 한다는 점에서 중요하다. 예를 들면, α-아미노 보호 그룹으로서 Boc를 사용할 경우 p-톨루엔설포닐(토실)잔기를 사용하여 아미노산(예: Lys 및 Arg)의 아미노 측쇄를 보호할 수 있다. α-아민 보호를 위해 Fmoc를 선택하는 경우 보통 3급-부틸계 보호그룹이 허용가능하다. 예를 들면, Boc는 아르기닌에 대해 사용할 수 있다.
일단 펩타이드의 연장이 종결되면 모든 보호 그룹을 제거한다. 액체상 합성을 사용할 경우, 보호 그룹은 보호 그룹의 선택에 의해 지시된 방법으로 제거한다. 이러한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
고체상 합성을 사용할 경우, 펩타이드는 보통 보호 그룹을 제거하면서 동시에 수지로부터 절단한다. 합성시 Boc 보호 공정을 사용할 경우, 0℃에서 무수 HF 함유 부가제(예: 디메틸 설파이드, 아니졸, 티오아니졸 또는 p-크레졸)로 처리하는 것이 수지로부터 펩타이드를 절단하기에 바람직한 방법이다. 또한, 펩타이드의 절단은 기타 산성 시약(예: 트리플루오로메탄설폰산/트리플루오로아세트산 혼합물)을사용하여 수행할 수 있다. Fmoc 보호 공정을 사용하는 경우, N 말단 Fmoc 그룹은 상기한 시약으로 절단한다. 기타 보호 그룹 및 펩타이드는 트리플루오로아세트산 용액 및 각종 첨가제(예: 아니졸 등)를 사용하여 수지로부터 절단한다.
직쇄 펩타이드를 수지로부터 분리하고 바람직한 임의의 보호 그룹을 제거한 후, 직쇄 펩타이드를, 디메틸포름아미드 중의 트리에틸아민 및 디페닐포스포릴아지드를 사용한 처리와 같은 통상적인 방법을 사용하여 폐환시킨다. 조악한 사이클릭 펩타이드를 크로마토그래피와 같은 통상의 방법으로 정제하기 전에 잔류하는 보호 그룹 및 작용성 그룹 전구체를 제거하거나 바람직한 그룹으로 전환시킨다.
하기 실시예는 전형적인 합성을 나타낸다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어는 다음과 같다: "g"는 그램이고, "mmol"은 밀리몰이며, "mL"은 밀리리터이고, "bp"는 비등점이며, "℃"는 섭씨 온도이고, "mmHg"는 수은(mm)이며, "μL"는 마이크로리터이고, "μg"은 마이크로그램이며, "μM"은 마이크로몰이고, "BrZ"는 브로모벤질옥시카보닐이며, "Tos"는 p-톨루엔설포닐이고, "Bzl"은 벤질이며, "NMP"는 N-메틸피롤리딘온이고, "HOBt"는 1-하이드록시벤조트리아졸이며, "DCC"는 N, N-디사이클로헥실카보디이미드이고, "DCM"은 디클로로메탄이며, "DMF"는 디메틸포름아미드이고, "DPPA"는 디페닐포스포릴아지드이며 "TEA"는 트리에틸아민이다.
실시예 1
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 6)의 제조
A. 선형 펩타이드의 합성
실시예 1의 펩타이드를 어플라이드 바이오 시스템(Applied Biosystems) 430A 자동 펩타이드 합성기와 제조업자에 의해 공급되는 프로토콜을 사용하는 표준 고체상법으로 합성한다. 시판중인 Boc-아미노산을 다음과 같은 측쇄 보호기와 함께 사용한다: Tyr(BrZ), Arg(Tos), Glu(Bzl). 시판중인 Boc-Gly-PAM 수지(0.5mmol, 어플라이드 바이오시스템)를 트리플루오로아세트산(2% 아니졸)으로 보호기를 제거하고 NMP 중에서 Boc-아미노산의 HOBt 에스테르(4당량체)와 커플링한다. Boc-아미노산의 HOBt 에스테르를 Boc-아미노산을 DCC 및 HOBt와 반응시켜 제조한다. 30분 동안 커플링하고 이어서 수지를 NMP 및 DCM으로 세척한다. 모든 반응되지 않은 아민을 아세트산 무수물로 아실화한다. 탈보호화와 커플링을 보호된 펩타이드 수지의 완전한 어셈블리가 이루어질 때까지 반복한다. 아니졸(5%)의 존재하에 0℃에서 30분 동안 동시에 선형 펩타이드를 무수 불화수소(10ml)로 탈보호화하고 수지로부터 제거한다. 펩타이드를 50% 아세트산, 물 및 수성 아세토니트릴로 추출하고 동결건조시킨다.
B. 선형 펩타이드의 폐환
조악한 선형 펩타이드를 DMF(∼5μmol/ml)에 용해하고 DPPA(5당량체)으로 TEA를 폐환하고 pH를 9로 조절한다. 반응이 완결된 후(4 내지 48시간), 용매를 제거하고 조악한 사이클릭 펩타이드를 아세트로니트릴/물로부터 동결건조시킨다. 70% 아세트산 중의 겔 투과법으로 스펙트라겔(Spectragel) GF05 칼럼(2.5 × 55㎝)상에서 사이클릭 펩타이드를 탈염하고, 0.1% 수성 TFA와 아세토니트릴의 다양한 농도 구배를 사용하는 역상 예비 HPLC(Dynamax C18, 21.4×250mm, Rainin)로 정제한다. 정제된 펩타이드를 분석 HPLC(Vydac 218TP54, 4.6×250mm), FAB-MS 및 아미노산 분석으로 특성화한다.
분자량: 861.4
AAA: Tyr 0.95(1); Leu 0.99(1); Arg 1.01(1); Gly 1.05(1).
FAB-MS: 862.4
실시예 2 내지 29를 실시예 1과 동일하거나 유사한 공정으로 합성한다.
실시예 2
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 7)의 제조
분자량: 884.4
AAA: Leu 0.96(1); Arg 0.99(1); Gly 1.05(1).
FAB-MS: 885.4
실시예 3
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 8)의 제조
분자량: 861.4
AAA: Tyr 1.00(1); Leu 0.95(1); Arg 1.00(1); Gly 1.05(1).
FAB-MS: 862.3
실시예 4
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly](서열 9)의 제조
분자량: 838.4
AAA: Tyr 1.91(2); Leu 0.91(1); Arg 1.01(1); Gly 1.17(1).
FAB-MS: 839.4
실시예 5
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala](서열 10)의 제조
분자량: 875.4
AAA: Tyr 0.96(1); Leu 0.94(1); Arg 1.05(1); Ala 1.05(1).
FAB-MS: 876.3
실시예 6
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala](서열 11)의 제조
분자량: 875.4
AAA: Tyr 0.97(1); Leu 0.95(1); Arg 1.03(1); Ala 1.04(1).
FAB-MS: 876.3
실시예 7
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 12)의 제조
분자량: 861.4
AAA: Tyr 0.97(1); Leu 0.99(1); Arg 0.98(1); Gly 1.07(1).
FAB-MS: 862.4
실시예 8
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly](서열 13)의 제조
분자량: 819.4
AAA: Tyr 0.95(1); Arg 0.99(1); Gly 1.05(1); Ala 1.02(1).
FAB-MS: 820.4
실시예 9
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly](서열 14)의 제조
분자량: 861.4
AAA: Tyr 0.96(1); Leu 0.99(1); Arg 1.00(1); Gly 1.06(1).
FAB-MS: 862.3
실시예 10
사이클로[tyr-Gln-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 15)의 제조
분자량: 803.4
AAA: Tyr 0.95(1); Leu 1.01(1); Arg 0.92(1); Gly 1.07(1); Glx 1.04(1).
FAB-MS: 804.5
실시예 11
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Ala](서열 16)의 제조
분자량: 852.4
AAA: Tyr 1.98(2); Leu 0.96(1); Arg 1.05(1); Ala 1.01(1).
FAB-MS: 853.4
실시예 12
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Gly-Trp](서열 17)의 제조
분자량: 861.4
AAA: Tyr 0.83(1); Leu 0.89(1); Arg 1.10(1); Gly 1.19(1).
FAB-MS: 862.3
실시예 13
사이클로[Tyr-trp-Pro-Arg-Trp-Gly](서열 18)의 제조
분자량: 845.4
AAA: Tyr 0.90(1); Arg 1.01(1); Gly 1.10(1); Pro 0.98(1).
FAB-MS: 846.3
실시예 14
사이클로[Phe-phe-Pro-Arg-Phe-Gly](서열 19)의 제조
분자량: 751.4
AAA: Arg 1.03(1); Gly 1.12(1); Pro 1.02(1); Phe 2.82(3).
FAB-MS: 752.3
실시예 15
사이클로[Leu-Arg-Trp-Gly-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 20)의 제조
분자량: 1024.6
AAA: Leu 2.00(2); Arg 1.90(2); Gly 2.10(2).
FAB-MS: 1025.4
실시예 16
사이클로[Tyr-Trp-Tyr-glu-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 21)의 제조
분자량: 1152.5
AAA: Tyr 1.94(2); Leu 1.00(1); Arg 0.97(1); Gly 1.03(1); Glx(1).
FAB-MS: 1153.5
실시예 17
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Nal-Gly](서열 22)의 제조
분자량: 872.5
AAA: Tyr 0.94(1); Leu 0.98(1); Arg 1.01(1); Gly 1.08(1).
FAB-MS: 873.4
실시예 18
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO 2 -Phe)-Gly](서열 23)의 제조
분자량: 867.4
AAA: Tyr 0.95(1); Leu 0.97(1); Arg 1.02(1); Gly 1.08(1).
FAB-MS: 868.4
실시예 19
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH 2 -Phe)-Gly](서열 24)의 제조
분자량: 837.4
AAA: Tyr 0.97(1); Leu 0.98(1); Arg 1.00(1); Gly 1.06(1).
FAB-MS: 838.4
실시예 20
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly](서열 25)의 제조
분자량: 857.4
AAA: Tyr 0.97(1); Leu 0.98(1); Arg 1.00(1); Gly 1.05(1).
FAB-MS: 857.3
실시예 21
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](I)(서열 29)의 제조
분자량: 896.5
AAA: Tyr 0.96(1); Leu 0.99(1); Gly 1.06(1).
FAB-MS: 897.5
실시예 22
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](II)(서열 30)의 제조
분자량: 896.5
AAA: Tyr 0.94(1); Leu 1.01(1); Gly 1.06(1).
FAB-MS: 897.5
실시예 23
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](I)(서열 31)의 제조
분자량: 898.5
AAA: Tyr 0.97(1); Leu 1.04(1); Gly 1.00(1).
FAB-MS: 899.5
실시예 24
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](II)(서열 32)의 제조
분자량: 898.5
AAA: Tyr 1.00(1); Leu 1.04(1); Gly 0.97(1).
FAB-MS: 899.4
실시예 25
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Me-Tyr)-Gly](서열 33)의 제조
분자량: 852.4
AAA: Leu 0.97(1); Arg 0.99(1); Gly 1.04(1).
FAB-MS: 853.4
실시예 26
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Tiq)-Gly](서열 34)의 제조
분자량: 834.4
AAA: Tyr 0.96(1); Leu 0.98(1); Arg 1.00(1); Gly 1.06(1).
FAB-MS: 835.5
실시예 27
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(tiq)-Gly](서열 35)의 제조
분자량: 834.4
AAA: Tyr 0.91(1); Leu 0.96(1); Arg 1.03(1); Gly 1.10(1).
FAB-MS: 835.5
실시예 28
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Tiq-OH)-Gly](서열 36)의 제조
분자량: 850.4
AAA: Tyr 0.85(1); Leu 0.97(1); Arg 1.00(1); Gly 1.18(1).
FAB-MS: 851.4
실시예 29
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Pro](서열 26)의 제조
분자량: 901.5
AAA: Tyr 0.94(1); Leu 0.94(1); Arg 1.07(1); Pro 1.04(1).
FAB-MS: 902.5
추가의 실시양태에서, 본 발명은 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물 치료학적 유효량을 호흡기 질환을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는 이들 환자의 치료법을 제공한다. "호흡기 질환"이란 용어는 기관지 수축 및 점액 과분비를 특징으로 하는 질병 또는 상태를 말하는 것이다. 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물로 호흡기 질환을 치료하는 것은 특히 천식, 기관지염, 비염, 감기 및 객출에 유용하다. 호흡기 질환의 치료에 특히 바람직한 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 다음을 포함한다:
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 6)
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 7)
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 8)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly](서열 9)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala](서열 10)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala](서열 11)
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 12)
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly](서열 13)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly](서열 14)
사이클로[tyr-Gln-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 15)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Ala](서열 16)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Gly-Trp](서열 17)
사이클로[Tyr-trp-Pro-Arg-Trp-Gly](서열 18)
사이클로[Phe-phe-Pro-Arg-Phe-Gly](서열 19)
사이클로[Leu-Arg-Trp-Gly-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 20)
사이클로[Tyr-Trp-Tyr-glu-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 21)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Nal-Gly](서열 22)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO2-Phe)-Gly](서열 23)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH2-Phe)-Gly](서열 24)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly](서열 25) 및
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Pro](서열 26)
"치료학적 유효량"이란 용어는 환자에게 1회 투여 또는 수회 투여시 호흡기 질환과 관련된 증상을 경감시키기에 유효한 양을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 호흡기 질환의 "증상의 경감"은 치료를 받지 않았을 때 예기되는 심각성의 감소를 말하는 것으로 반드시 질환의 완전한 제거나 치료를 나타내는 것은 아니다. 치료학적 유효량 또는 투여량을 결정함에 있어서, 포유 동물의 종, 크기, 연령 및 평상시의 건강 상태, 관련된 특정 질병, 질병의 중증도, 개별적인 환자들의 반응, 투여된 특정 화합물, 투여 양태, 투여된 제제의 생물 유용성, 선택된 투여 섭생, 부수적인 약물의 사용 및 기타 관련 환경을 포함하나, 이로 제한되지는 않으면서, 전문의에 의해 많은 변수가 고려된다.
화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물의 치료학적 유효량은 1일에 체중당 약 0.1mg(mg/kg/day)에서 약 100mg/kg/day까지 다양할 것으로 예상된다. 바람직한 양은 약 0.5 내지 약 10mg/kg/day까지 다양할 것이라고 예상된다.
또한, 본 발명은 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물의 치료학적 유효 진통량을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게 진통 효과를 제공하는 방법을 제공한다. 환자가 만성 통증 또는 급성 통증을 앓는 경우 진통 효과가 필요하다. 진통 효과를 필요로 하는 이러한 환자들은 이러한 기술 분야의 숙련인들의 능력과 지식의 범위 안에서 잘 확인될 수 있다. 특히 진통 효과를 제공하기에 바람직한 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 다음을 포함한다.
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 6)
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 7)
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 8)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly](서열 9)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala](서열 10)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala](서열 11)
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 12)
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly](서열 13)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly](서열 14)
사이클로[tyr-Gln-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 15)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Ala](서열 16)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Gly-Trp](서열 17)
사이클로[Tyr-trp-Pro-Arg-Trp-Gly](서열 18)
사이클로[Phe-phe-Pro-Arg-Phe-Gly](서열 19)
사이클로[Leu-Arg-Trp-Gly-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 20)
사이클로[Tyr-Trp-Tyr-glu-Leu-Arg-Trp-Gly](서열 21)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Nal-Gly](서열 22)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO2-Phe)-Gly](서열 23)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH2-Phe)-Gly](서열 24)
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly](서열 25) 및
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Pro](서열 26)
"치료학적 유효 진통량"이란 용어는 환자에게 1회 투여 또는 수회 투여시, 진통 효과를 제공하기에 유효한 양을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 "진통 효과"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 중증의 감소를 말하는 것으로 반드시 질환의 완전한 제거나 치료를 나타내는 것은 아니다. 성공적인 치료는 또한 환자를 치료할 때 예를 들면, 수술 전 과정에서와 같이 환자가 곧 만성 통증 또는 급성 통증으로 고통을 받게 되는 경우의 예방을 포함하는 것으로 이해된다. 치료학적 유효 진통량 또는 투여량을 결정함에 있어서, 포유 동물의 종, 크기, 연령 및 평상시의 건강 상태, 관련된 특정 질병, 질병의 중증도, 개별적인 환자들의 반응, 투여된 특정 화합물, 투여 양태, 투여된 제제의 생물 유용성, 선택된 투여 섭생, 부수적인 약물의 사용 및 그 밖의 관련 환경을 포함하나, 이에 한정되지는 않으면서, 전문의에 의해 많은 변수가 고려된다.
화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물의 치료학적 유효 진통량은 1일에 체중당 약 0.1mg(mg/kg/day)에서 약 100mg/kg/day까지 다양하다. 바람직한 양은 약 0.5내지 약 10mg/kg/day까지 다양할 것이라고 예상된다.
또한, 본 발명의 화합물은 타키키닌 길항작용, 특히 뉴로키닌 A 길항작용과 같은 이의 약리학적 활성 면에서 유용하다. 본 발명의 목적은 신규하고 유용한 뉴로키닌 A의 길항제를 제공하는 것이다. 본 발명의 화합물이 타키키닌 길항제이므로 천식, 알레르기, 기관지염, 비염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 편두통, 방광염 및 과민성 반응과 같은 염증과 관련된 질병의 치료에 유용하다. 타키키닌 길항작용은 또한 통증, 말초 신경증, 구토, 만성 기침, 후 포진성 신경통, 면역학적 역반응, 혈관확장으로 인한 혈류장애, 결막염과 같은 안 질환 및 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 두드러기 등과 같은 피부질환의 치료를 위한 처방에 적합하다. 불안증, 우울증, 정신병, 정신분열증 및 치매를 포함하는 다양한 중추신경계 장애 역시 타키키닌 길항제로 치료할 수 있다.
본 발명의 화합물은 뉴로키닌 A에 매우 효능있는 길항제이며 NK1수용체에 비해 NK2수용체를 선호하는 선택적인 작용을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 NK2수용체의 길항작용을 통해 이의 억제효과를 나타내고 이로 인해 만성 통증과 급성 통증 뿐만 아니라 천식과 다른 폐렴을 포함하지만 이에 제한되지 않는 뉴로키닌 A-매개 질환을 경감시키는 것으로 사료된다. 그러나, 본 발명은 최종 용도로 적용할 때의 효율을 설명하기 위한 특정 이론이나 제안된 매카니즘에 의해 제한되지 않는다.
위에서 언급한 질병을 앓고 있는 환자를 효과적으로 치료할 때, 화학식 1,2, 3, 4 및 5의 화합물은 유효량에서 화합물이 생물 유용할 수 있도록 하는 어떤 형태 또는 방식(예: 경구식, 분무식 및 비경구식)으로도 투여될 수 있다. 예를 들면, 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 경구적으로, 분무, 피하내, 근육내로, 정맥내로, 경피적으로, 비강내로, 직장내로, 국부적으로 및 그 밖의 방법으로 투여될 수 있다. 경구 또는 분무 투여가 일반적으로 바람직하다. 제형 제조 분야의 숙련인은 선택된 화합물의 특성, 치료되어야 할 질병의 상태, 질병의 단계 및 기타 적절한 환경에 따라 적당한 투여 형태나 방식을 용이하게 선택할 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co.(1990)].
화합물은 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합된 약제학적 조성물 형태(이의 비율과 성질은 용해도와 선택된 화합물의 화학적 성질, 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다)로 투여될 수 있다. 그 자체로 효율적인 본 발명의 화합물은 안전성, 용이한 결정화, 용해도의 증가 등을 위해 이의 약제학적으로 허용되는 염(예: 산부가염)의 형태로 제형화되고 투여될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물을 혼합된 형태로 또는 하나 이상의 불활성 담체와 연합된 형태로 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들면, 검정 표준, 벌크 선적을 위한 간편한 방법 또는 약제학적 조성물로서 유용하다. 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물을 검정할 수 있는 양은 표준 검정 과정 및 널리 공지되어 있고 이 분야의 숙련인들에 의해 인정받고 있는 기술에 의해 용이하게 측정할 수 있는 양이다. 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물을 검정할 수 있는 양은 일반적으로 조성물의 약 0.001중량% 내지 약 75중량%까지 다양하다. 불활성 담체는 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물을 분해시키지 않으면서 이들과 공유적으로 반응하는 임의의 물질일 수 있다. 적절한 불활성 담체의 예는 물; 일반적으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에서 유용한 수성 완충제; 유기 용매(예: 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 헥산 등) 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제이다.
더욱 특히 본 발명은 화학식 1, 2, 3, 4 또는 5의 화합물의 치료학적 유효량을 혼합된 형태로 또는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 연합된 형태로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 약제학 분야에서 잘 공지되어 있는 방법으로 제조된다. 담체 또는 부형제는 활성 성분을 위해 비히클 또는 매질로서 작용할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 이 분야에 잘 공지되어 있다. 약제학적 조성물은 경구, 비경구 또는 국소적 용도로 채택될 수 있고 환자에게 정제, 캅셀제, 좌제, 용제, 현탁제 등의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 경구적으로, 예를 들면 불활성 희석제 또는 식용 담체와 함께 투여될 수 있다. 이는 젤라틴 캅셀제 안에 봉입될 수 있고 정제로 압착될 수 있다. 치료학적 경구 투여의 목적을 위해, 화합물은 부형제와 함께 혼입되고 정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭시르제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제, 츄잉껌 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 제제는 본 발명의 화합물 4% 이상과 활성 성분을 함유해야 하나, 특정 형태에 따라서 다양할 수 있으며 통상적으로 단위 중량의 4% 내지 약 70%이다. 조성물에 존재하는 화합물의 양은 적절한 투여량이 수득되는 양이다. 본 발명에 따르는 바람직한 조성물과 제제는 경구 투여단위 형태가 본 발명의 화합물을 5.0 내지 300 mg 함유하도록 제조된다.
정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 또한 하나 이상의 다음과 같은 보조제를 함유할 수 있다: 결합제(예: 미세 결정형 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴), 부형제(예: 전분 또는 락토오즈), 붕해제(예: 알긴산, 프리모겔, 옥수수 전분 등), 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스), 활주제(예: 콜로이드성 이산화규소) 및 감미제(예: 슈크로스 또는 사카린) 또는 방향제(예: 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미료)가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캅셀제일 때, 이는 상기 형태 이외에 액체 담체(폴리에틸렌 글리콜 또는 지방 오일)를 함유할 수 있다. 다른 투여 단위 형태는 투여 단위의 물리적 형태를 개질시키는 다른 다양한 물질(예, 제피제)을 함유할 수 있다. 따라서, 정제 또는 환제는 슈가, 쉘락 또는 다른 장용피제로 제피될 수 있다. 시럽제는 본 발명의 화합물 이외에 감미제와 같은 슈크로스와 소정 방부제, 염료 및 착색제와 향미제를 함유할 수 있다. 이렇게 다양한 조성물을 제조하는 데에 사용되는 물질은 약제학적으로 순수하고 사용량에 있어서 무독성이어야 한다.
치료학적 비경구 투여의 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 용제 또는 현탁제에 혼입될 수 있다. 이러한 제제는 본 발명의 화합물을 0.1% 이상 함유하여야 하나, 이의 중량의 0.1 내지 약 50%로 다양할 수 있다. 조성물에 존재하는 화합물의양은 적합한 투여량이 수득되는 양이다. 본 발명에 따르는 바람직한 조성물과 제제는 비경구 투여단위 형태가 본 발명의 화합물을 5.0 내지 100 mg 함유하도록 제조된다.
본 발명의 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 또한 분무식으로 투여된다. 분무식이란 용어는 콜로이드 특성으로부터 압축된 패키지 형태로 이루어진 시스템까지의 다양한 시스템을 의미한다. 전달은 기체를 액화시켜서 또는 압착시켜서 수행하거나 활성 성분을 분사시키는데 적합한 펌프 시스템으로 수행한다. 화학식 1의 화합물의 연무제는 활성성분을 전달하기 위해 단일상, 2상 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 연무제의 전달은 필요한 용기, 활성화기, 밸브, 보조용기 등을 포함한다. 바람직한 연무제는 이 분야의 숙련인들에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 화학식 1, 2, 3, 4 및 5의 화합물은 또한 국소적으로 투여될 수 있고 이렇게 수행되는 경우, 담체가 적절히 용제, 연고 또는 겔 기제를 포함할 수 있다. 기제는 예를 들면, 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 물과 알콜과 같은 희석제 및 유화제와 안정화제를 하나 이상 포함한다. 국소 제제는 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약 0.1 내지 약 10%w/v(단위 부피당 중량) 함유한다.
용제 또는 현탁제는 또한 무균 희석제(예: 주사용 물, 염수용액, 불휘발성유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매), 항균제(예:벤질 알콜 또는 메틸 파라벤), 산화방지제(예: 아스코르브산 또는 이황화나트륨), 킬레이트제(예: 에틸렌 디아민테트라아세트산), 완충제(예: 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트) 및 보강제(예: 염화나트륨 또는 덱스트로스)를 하나 이상 포함한다. 비경구 제제는 앰풀제, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱 재질의 다중 투여 바이엘에 밀봉될 수 있다.
본원에서 사용하는 "환자"라는 용어는 특정 염증 질환을 앓고 있는 포유류와 같은 온혈동물을 말한다. 이는 기니아 피그, 개, 고양이, 래트, 마우스, 말, 소, 양 및 사람이 이 용어의 의미에 포함되는 동물의 예라고 이해된다.
실시예 29
NK1과 NK2수용체에 결합하는 요오드화 타키키닌에 대한 추정 길항제에 의한 길항작용
조악한 조직막에서 수용체 결합 검정을 수행한다. 제안된 타키키닌 길항제의 NK-1 수용체 결합 친화도를 기니아 피그 폐에서 측정한다(Keystone Biologicals, Cleveland, OH, 사용할 때까지 -80℃로 동결됨). NK-2 수용체에 대한 친화도를 사람 공장(空腸)의 NK-2 수용체를 발현하는 마우스 3T3 섬유아세포인 HSKR-1 세포에서 측정한다. 조직 또는 세포를 폴리트론으로 120mM NaCl과 5mM KCl을 함유하는 15용적의 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4, 4℃)에서 파쇄하고 4℃에서 12분 동안 48,000×g로 4℃에서 원심분리한다. 펠렛을 10mM EDTA와 300mM KCl을 함유하는 15용적의 50mM Tris-HCl 완충액에 재현탁하고 이어서 30분 동안 빙상에 놓는다. 현탁액을 위와 같이 원심분리하고 펠렛을 50mM Tris-HCl 완충액중(pH7.4, 4℃)에 재현탁시키고 원심분리하여 추가로 2회 세척한다. 최종 펠렛을 배양 완충액에 농도 20mg/ml로 재현탁하고 이어서 사용하기 전에 15분 이상 동안 실온으로 유지시킨다. 250㎕ 막 제제(최종 단백질 농도: 폐＝286㎍/튜브, HSKR-1 세포＝100㎍/튜브)를 0.1nM의 다음의 방사리간드에 2회 가함으로써 수용체 결합이 개시된다: NK-1 수용체 검정에서는,125I-Bolton-Hunter Lys-3으로 표지된 물질 P(New England Nuclear, 특이 활성, 2200Ci/mmol); NK-2 수용체 검정에서는, 50mM Tris-HCl(pH 7.4, 실온), 0.1% 소 혈청 알부민, 2mM MnCl2, 40㎍/ml 바시트라신, 4㎍/ml 류펩틴 및 키모스타틴을 함유하는 500㎕의 완충액 최종 용적 중의125요오드히스티딜-1-뉴로키닌 A(Amersham, 비활성, 2000Ci/mmol), 1μM 티오르판 및 다양한 투여량의 타키키닌 길항제. 배양은 실온에서 90분 동안(NK-1 수용체 검정) 또는 2시간 동안(NK-2 수용체 검정) 수행하고, 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4, 4℃)를 가하고 0.1% 폴리에틸렌이민(NK-1 수용체 검정) 또는 0.5% 소 혈청 알부민(NK-2 수용체 검정)으로 예비침지된 GF/B 여과기를 통해 진공하에 여과함으로써 결합을 종결시킨다. 비특이적 결합은 1μM 물질 P(NK-1 수용체 검정) 또는 뉴로키닌 A (NK-2 수용체 검정)의 존재하의 결합으로서 정의된다(Peptides International, Inc., Louisville, KY). 특이적 결합은 전체 결합으로부터 비특이적 결합을 공제하여 계산되며 전체 결합의 70 내지 90%에 상응한다. 테이타를 분석하고 반복 곡선 적합 프로그램(iterative curve fitting program)(GraphPAD Inplot, San Diego, CA)을사용하는 비선형 회귀에 의해 IC50값을 구한다. 단백질을 로우리(Lowry)법으로 검사한다.
화합물의 타키키닌 수용체 결합 친화도를 표 2에 나타낸다. 사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6을 포함하여 제공된 몇몇 화합물은 NK-2 수용체에 대해 높은 친화도와 선택성을 나타낸다.
NK-1 NK-2 수용체 결합 친화도
펩타이드 서열 IC50(nM)
NK-1 NK-2
사이클로[Tyr-Trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 10,000 305 ±31
사이클로[Tyr-trp-Ala-Arg-Trp-Gly] 56.7 ±5.45
사이클로[tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 10,000 4.97 ±0.42
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Gly] 10,000 18.9 ±1.58
사이클로[tyr-Gln-Leu-Arg-Trp-Gly] 407 ±52
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-ala] 7.99 ±1.02
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-trp-Gly] 10,000 193 ±11.5
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Ala] 9.90 ±0.90
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Pro] 5167±507 30 ±2.52
사이클로[Leu-Arg-Trp-Gly-Leu-Arg-Trp-Gly] 768 ±75
사이클로[Trp-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 4833±297 4.7 ±0.15
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Tyr-Ala] 206 ±15
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Gly-Trp] 360 ±21
사이클로[Tyr-Trp-Tyr-gln-Leu-Arg-Trp-Gly] 10,000 27.0 ±0.82
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 6187±277 6.79 ±0.69
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH2-Phe)-Gly] 10,000 20.2 ±2.03
사이클로[Tyr-trp-Pro-Arg-Trp-Gly] 10,000 5.13 ±0.36
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO2-Phe)-Gly] 10,000 11.7 ±0.44
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly] ~10,000 13.3 ±1.31
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](II) 2766 ±16.5 993 ±36.5
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](II) 4691 ±11 878 ±162
사이클로[Phe-phe-Pro-Arg-Phe-Gly] 9314 ±2074 674 ±57
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](I) 3642 ±425 123 ±1.86
사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](I) 12,077 ±2044 2903 ±371
데이타는 2 내지 72회 실험의 평균±S.E.M.이다.
실시예 30
NK-2 수용체 매개된 포스파티딜이노시톨 턴오버에 대한 길항작용
배양된 SKLKB82#3(마우스 섬유아세포주로 형질감염된 소 위장 NK-2 수용체) 세포를 검정에 앞서 2 내지 3일 전에 24-웰 플레이트에 125,000세포/웰로 시딩한다. 세포에 0.2μM 미오[2-3H(N)] 이노시톨(American Radiolabeled Chemicals Inc., 비활성, 20Ci/mmol) 0.5㎖를 검정하기에 앞서 20 내지 24시간 전에 로딩한다. 배양된 세포를 5% CO2대기에서 37℃로 유지한다. 검정일에, 배지를 흡인시키고 세포를 바시트라신 40㎍/㎖, 각각의 류펩틴 및 키모스타틴 4㎍/ml, 0.1% 소 혈청 알부민 및 1μM 티오르판과 10mM LiCl을 함유하는 D-MEM/F-12 배지에서 배양한다. 15분 후에, 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6(농도 0.3nM 내지 10μM의 범위)을 0.1㎖의 용적으로 세포에 가한다. NKA 또는 배양 완충액(대조구)을 15분 후에 다양한 농도(0.1nM 내지 10μM, 용적＝0.1㎖)로 가하고, 60분 동안 최종 용적이 1㎖가 되도록 배양한다. 반응을 종결시키기 위하여, 배지를 흡인시키고 메탄올 0.1㎖를 모든 웰에 가한다. 메탄올 0.5㎖의 두 개의 분취액을 웰에 가하여 세포를 클로로포름 내성 튜브로 수거한다. 클로로포름(1㎖)을 메탄올/세포 현탁액을 함유하는 각각의 튜브에 가하고 이어서 ddH2O 0.5㎖를 가한다. 이어서 튜브를 15초 동안 와동시키고 10분 동안 1700×g으로 원심분리한다. 수성상의 분취액 0.9㎖를 제거하고 ddH2O 2㎖를 함유하는 클로로포름 내성 튜브에 넣는다. 샘플을 와동시키고 50% Bio-Rad AG 1-X8(포르메이트 형태, 100 내지 200메시) 교환 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 1㎖에 로딩한다. 이어서 컬럼을 1) ddH2O10㎖, 2) (5mM 사붕소화이나트륨)/(60mM 포름산나트륨) 5㎖ 및 3) (1M 포름산암모늄)/(0.1M 포름산) 2㎖으로 순서대로 세척한다. 세 번째 용출액을 수거하고 섬광계수 유체 9㎖에서 계수한다. 유기상(기저부)의 분취액 50㎕을 제거하고, 섬광계수 용기에서 건조시킨 후 섬광계수 유체 7㎖에서 계수한다.
유기상 분취액(혼입된 전체 [3H]-이노시톨) 50㎕ 중의 DPM에 대한 수성상 분취액(전체 이노시톨 포스페이트) 중의 DPM의 비를 각각의 샘플에 대해 계산한다. 데이타를 기본 수준상에 효능제-유도된 [3H]-이노시톨 포스페이트의 축적량의 백분율로 나타낸다. 길항제 활성은 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6의 존재하에 타키키닌에 대한 투여반응 곡선의 우측 이동에 의해 명백해진다. 세개 이상의 길항제 농도를 사용하는 쉴드 회귀 분석이 pA2와 기울기값을 유도하는 데에 사용된다.
투여반응 곡선을 작성하고 타키키닌 유도성 포스파티딜이노시톨(PI) 턴오버를 억제하기 위한 시험 화합물의 효능을 컴퓨터 프로그램(Gr-aphPad Inplot) 보조하에 브리스토우 방법[Bristow et al., Br. J. Pharmacol., 90: 211-21(1987)]을 사용하여 결정한다. 도 1은 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] (서열 6)가 SKLKB82#3 세포에서 NKA 유도성 PI 턴오버에 대한, 투여량 관련 길항작용을 발생시키는 효능을 나타낸다. 데이타는 기본 수준상에서 전체 이노시톨 포스페이트 축적의 자극 백분율로서 나타나고 NKA에 의해 발생되는 최대 반응까지 정상화한다. 이러한 데이타는 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6이 어떠한 효능제 활성도가지고 있지 않으며(화합물의 높은 투여량으로도 PI 턴오버를 자극하는데 실패한 것으로써 알 수 있음) NK-2(SKLKB82#3상의) 수용체[pA2＝8.45(95% 신뢰도＝8.22 내지 8.69)와 기울기＝-0.85(95% 신뢰도＝-0.94 내지 -0.75)]에서의 NKA의 작용을 길항한다는 것을 나타낸다.
실시예 31
의식있는 기니아 피그에서의 NKA 및 캡사이신 유도 호흡 효과에 대한 길항작용
수컷 던컨 하틀리 기니아 피그(Duncan Hartley guinea pigs, 250-350g)을 사용하여 생체내 실험을 수행한다. 4마리의 동물에게서의 의식적인 호흡패턴의 변화를 각각의 발리딘(Validyne) DP 45-16 차압 변환기를 통해 자신의 참조 상자에 연결되어 있는 4개의 작은 수지유리 상자로 이루어진 변형된 전신 혈량측정법을 사용하여 동시에 모니터한다. 4개의 상자에 공기 공급 라인(또한 분무 운반 장치에도 사용됨)과 배기 라인을 설치한다. 공급 라인과 배기 라인은 동일한 길이와 좁은 구경으로 되어 있으며 통상적인 공급 챔버로부터 시작하여 통상적인 배기 침버에 구멍을 뚫는다. 이러한 시스템은 공기 공급시의 파동과 대기압을 현상유지하고 순수한 신호로부터 차압 변환기를 사용하여 확실히 제거하기 위해 사용한다. 아날로그 압력 신호를 데이타 해독(Data Translation) DT2921 A 내지 D 판을 통해 디지탈화한다. 데이타를 100샘플/초/동물의 비율로 수집한다. 각각의 압력변화 주기를 최소 압력과 최대 압력 사이에서 결정되는 상승 기울기 및 하강 기울기, 초기 통과압력과 피이크 주기 압력 사이의 변화 크기와 같은 인자를 사용하여 분석한다. 이러한 밸브를 사용하면서(그리고 동물을 관찰하면서), 압력 주기를 System V UNIX 작동 시스템을 구동하는 PCAT 286으로 정상 호흡, 강화된 호식(呼息)[뚜렷한 복식 호흡장애], 중요 호흡기 질환(SREs; 과도 현상을 특징으로 하는 일반적인 해소, 간헐적인 재채기 또는 가쁜 호흡, 소음으로 구별할 수 있는 극대 압력 증가) 및 운동/소음으로 특성화한다. 호흡곤란이란 동물에 있어서 무리한 호흡으로의 관찰가능한 이동과 관련된 혈량측정 압력이 상당히 지속적으로 증가되는 것으로 정의된다.
다양한 기관지 수축제에 대한 기도의 반응성이 검사되는 전형적인 실험과정 중에, 연무제를 초음파 분무기(DeVilbiss Ultraneb 99)를 사용하여 19분(0.33㎖/min) 동안 운반하고 이 시간 동안 동물을 모니터한다. 분무화에 앞서서, 1분 동안의 여유있는 호흡을 조절하여 기본 압력을 설정한다. 예비적인 실험에서, 기관지 수축제의 다양한 농도를 측정하고 호흡곤란을 나타내는 동물의 수를 최대화하면서도 반응의 중증도를 최소화하는 농도를 선택한다. 이어서, 뉴로키닌 A 를 최종 농도 0.05%로 전달하고 캡사이신을 0.001%로 전달한다. 모든 기관지 수축제의 분무화를 위한 비히클은 자체로는 호흡 효과를 발휘하지 않는 인산염 완충된 식염수(pH 7.4)이다. 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6은 연무제 노출의 발현 20분 전에 투여된다(정맥내로).
표 3은 NKA 또는 캡사이신 연무제에 의해 유도된 다양한 호흡 효과에 대한 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6의 효과를 나타낸다. 정맥내 투여량 5㎎/㎏으로서, 화합물은 의식있는 기니아 피그에 있어서 NKA 연무제로 유도된 호흡 효과를 완전히 억제한다. 사이클릭 펩타이드의 더 적은 투여량(0.5-2.5㎎/㎏, 정맥내)은 호흡곤란과 타키키닌에 의해 발생되는 SREs의 발현을 지연시킨다. 이러한 데이타는 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6이 기니아 피그 생체 내의 기도에서 NK-2 수용체 길항제라는 것을 제시한다.
사이클릭 펩타이드, 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6는 또한 캡사이신 연무제에 의해 유리되는 내인성 타키키닌에 반응하여 발생되는 호흡 효과를 억제한다(표 3). 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6으로 캡사이신 유도성 호흡곤란의 발생빈도가 단지 20% 감소되지만, 호흡곤란의 발현이 거의 두배 지연되고, 화합물의 기침 해소성을 나타내면서 캡사이신에 반응하여 발생하는 SREs의 수 또한 감소하며 이들의 발현이 증가된다.
의식있는 기니아 피그에 있어서 NKA 또는 캡사이신 연무제로 유도된 호흡 효과에 대한 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]의 영향
NKA 연무제
전처리 호흡곤란 발생빈도 호흡곤란 발현(초) SRE No. SRE 발현 (초)
대조구 100% 403±37 8.17±1.92 435±28
펩타이드
5㎎/㎏, 정맥내 0%* - 0*
2.5㎎/㎏, 정맥내 100% 725±80* 8.00±0.82 791±70*
1㎎/㎏, 정맥내 100% 729±66* 6.33±0.88 816±65*
0.5㎎/㎏, 정맥내 100% 521±29 7.75±2.21 602.5±32
데이타는 처리당 4 내지 18마리 동물 값의 평균±S.E.M.이다. SRE＝일반적인 기침, 간헐적인 재채기 또는 가쁜 호흡과 같은 주요 호흡기 질환. *표시는 대조구와 상당히 상이함을 나타낸다(p<0.05). 펩타이드＝사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
캡사이신 연무제
전처리 호흡곤란 발생빈도 호흡곤란 발현(초) SRE No. SRE 발현 (초)
대조구 100% 204±30 14.9±2.88 288±39
펩타이드
5㎎/㎏, 정맥내 80% 470±78* 8.11±1.22* 352±92
데이타는 처리당 10마리 동물값의 평균±S.E.M.이다. SRE＝일반적인 기침, 간헐적인 재채기 또는 가쁜 호흡과 같은 주요 호흡기 질환. *표시는 대조구와 상당히 상이함을 나타낸다(p<0.05). 펩타이드＝사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly]
실시예 32
마우스에 있어서 아세트산 유도된 비틀림의 억제
본 발명의 화합물의 진통 효능을 변형된 휘틀의 방법(Whittle, Br. J. Pharmacol. 22:2246, 1964)을 사용하여 측정한다. 5 내지 10마리의 수컷 마우스 그룹은 용적 5㎕의 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6(0.013-4㎍) 또는 에탄올/염수 비히클의 초내 주입을 받는다. 5분 후에, 마우스는 아세트산 0.4㎖(0.25% v/v)의 복막내 주입을 받는다. 5분 후에, 마우스의 비틀림의 출현(복부 비틀림)을 15분 동안 관찰하고 각각의 마우스의 경련의 횟수를 계산한다. ED50(마우스 50%에 진통을 일으키는 투여량)을 계산하기 위하여, 화합물의 4회 이상의 투여량을 시험하고 그 결과를 적당한 컴퓨터 프로그램으로 정량 분석한다.
사이클릭 펩타이드, 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Trp-Gly] 서열 6은 마우스의 아세트산 유도된 비틀림을 ED50＝0.18㎍(95% 신뢰도＝ 0.03 - 0.58)으로 억제한다.
본 발명의 사이클릭 헥사펩타이드 및 옥타펩타이드는 뉴로키닌 A의 길항제로서 뉴로키닌 A의 수용체에 대해 친화성을 갖는다.

Claims (4)

  1. 사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-Nal-Gly] (서열 22),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NO2-Phe)-Gly] (서열 23),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-NH2-Phe)-Gly] (서열 24),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(p-Cl-Phe)-Gly] (서열 25),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](I) (서열 29),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Flg)-Gly](II) (서열 30),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](I) (서열 31),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Dpa)-Gly](II) (서열 32),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Me-Tyr)-Gly] (서열 33),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Tiq)-Gly] (서열 34),
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(tiq)-Gly] (서열 35), 및
    사이클로[Tyr-trp-Leu-Arg-(Tiq-OH)-Gly] (서열 36)로부터 선택되는 사이클릭 뉴로키닌 A 길항 펩타이드.
  2. 제1항에 따른 사이클릭 뉴로키닌 A 길항 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 호흡기 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 호흡기 질환이 천식인 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 따른 사이클릭 뉴로키닌 A 길항 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 진통 효과를 갖는 약제학적 조성물.
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