KR100355251B1 - 텍사피린을사용한rna광절단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광감작성 텍사피린을 사용하여 리보핵산 중합체를 광절단하는 방법을 제공한다. 바람직한 사용 방법은 리보핵산 중합체를 부위-특이적으로 광절단하는 방법이며 바람직한 광감작성 택사피린은 결합 특이성을 갖는 유도체화된 텍사피린, 특히 부위-지시 분자, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 커플링된 텍사피린이다. 광절단에 가능한 기질로는 메신저, 리보좀, 전이, 소형 핵상 및 소형 사이토졸 리보핵산 및 리보핵산 조인자를 포함함으로써 이들 리보핵산을 불활성화시키고 양성 또는 악성 암 세포, 또는 기타 원치 않는 세포 또는 조직을 치료하기 위한 다각적인 접근법을 제공해준다.

Description

텍사피린을 사용한 RNA 광절단 방법

광역학적 치료법(PDT)은 치료 부위에 또는 치료 부위 근처에 국재되고 산소의 존재하에 조사될 때 양성 전구체[예: (O₂(³Σ_g-))]로부터 단일선 산소[O₂(¹△_g)]와 같은 세포독성 물질이 생성되도록 작용하는 광감작성 염료를 사용하는 치료 기술이다. 과산화물, 하이드로퍼옥실 또는 하이드록실 라디칼과 같은 기타 반응성 물질이 이에 포함될 수 있다. 사용된 용량에서, 빛과 약물은 질환 표적들에 대하여 독립적인 활성을 가지지 않는다.

PDT의 효능은 다음 세가지 인자에 기초를 둔다: i) PDT에서 사용된 광감작성 염료는 주변 조직과는 대조적으로 치료 부위에만 국재시키는 능력을 지녀야 한다. ii) 활성화 산소의 높은 반응성과 짧은 유효기간은 이것이 극히 짧은 범위를 지니고 이를 생성시키는 세포로부터 방출되기가 어려워 세포독성이 아마도 세포내 수준 이하로 흡광 조직의 정확한 영역에만 한정적으로 나타난다는 것을 의미한다. iii) 레이저 및 섬유 광학장치의 개발로 인해 강력한 광선이 신체의 수많은 부위에 정확하게 도달할 수 있다.

광역학적 치료법에 관한 고찰을 위해 문헌[미국 특허 제5,252,720호(본 명세서에 참조로 인용됨); Sindelar et al., (1991); Grossweiner, (1991); Henderson및 Dougherty, (1992), 및 Moan 및 Berg, (1992)]을 참조한다. 최근 수년간, 신규한 광감작화제를 합성하고 연구하기 위한 상당한 노력이 있어 왔다[이에 대한 고찰은 브라운(Brown)과 트루스코트(Truscott)(1993)의 문헌에 밝혀져 있다]. 보다 효과적인 광화학치료제에 관한 개발은 생체 조직이 비교적 투명한 스펙트럼 영역(즉, 700 내지 1000nm)에서 흡수하고, 삼중선 양자 수율이 높으며 독성이 최소화된 화합물의 합성을 필요로 한다. 본 발명자들의 텍사피린 분자는 조직이 투명한 730 내지 770nm 범위에서 강력하게 흡수하며; 이러한 반자성 착물은 높은 양자 수율로¹O₂의 생성을 감지하며; 이와 같이 완전하게 합성되는 본 발명의 텍사피린은 목적하는 특성이 혼입되도록 전환시킬 수 있다.

DNA의 광역학적 절단은 공지되어 있다. 프라세우쓰(Praseuth) 등(1986)은 산소의 존재하에 가시광선을 사용하는 합성 수용성 포르피린에 의한 플라스미드 DNA의 절단을 보고하였다. 또한, 필(Fiel)(1989)은 철 포르피린에 의한 광감작화쇄 절단 및 산화-환원성 쇄 분할을 보고하였다. 또 다른 예로, 고바야시(Kobayashi) 등(1993)은 산소의 존재하에 가시광선을 사용하는 나트륨 페오포르바이드(클로로필의 유도체)에 의한 플라스미드 DNA의 절단을 보고하였다. 포르피린-올리고뉴클레오티드 유도체가 DNA 기질을 서열 특이적으로 변형시킨 다음 뜨거운 피페리딘을 사용하여 절단시키는데 사용된다고 보고되었다[참조: Vlassov et al., 1991; Le Doan et al., 1990]. 이들 포르피린 접합체의 흡수 파장은 700nm 아래인데, 이러한 범위는 보다 긴 파장의 빛 만큼이나 효과적으로 조직을 투과하지 않는다. 제WO96/09315호는 텍사피린을 사용한 DNA 광절단에 관한 것이다.

약물 8-메톡시-프조랄렌과 함께 자외선을 사용하여 건선을 치료하는 것은 널리 공지되어 있다. 리(Lee) 등(1988)의 문헌은 프조랄렌-유도체화된 올리고데옥시리보뉴클레오사이드 메틸포스포네이트와 일본쇄 DNA와의 상호작용에 관한 것이다. 피리미딘과 프조랄렌간에 가교결합된 광부가물이 형성되는 것으로 보인다. 이러한 치료 결과 암 세포가 진행될 수 있다. 더욱이, 약 365nm의 단파장에서의 조사는 체내로 투과되지 못하므로 체 표면에서만 유용하다. 프조랄렌을 기재로 하는 치료는 환자를 가시광선에 노출시키기 전에 또는 상기 반응이 피부 표면상에서 지속되기 전에 상기 약물을 체내에서 방출시켜야만 한다.

DNA의 서열 특이적 절단은 금속 착물로 유도체화된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 암 반응에 사용하기 위한 것으로 또한 보고되었다. 이의 몇몇 예로는 올리고뉴클레오티드-EDTA-Fe 착물[참조: Strobel and Dervan, 1989; Lin et al., 1989; Dreyer and Dervan, 1985], 금속 결합 부속기를 갖는 올리고뉴클레오티드-삼양이온성 포르피린[참조: Groves and Farrell, 1989], 올리고뉴클레오티드-펜안트롤린-구리 착물[참조: Chen and Sigman, 1988], 올리고뉴클레오티드-망간-포르피린[참조: Meunier et al., 1993] 및 올리고뉴클레오티드에 연결된 철-포르피린[참조: Le Doan et al., 1986, 1987]이 있다.

현재의 광감작성 분자는 우수한 종양 선택성이 결여되어 있고, 광감작화에 있어서 선행조건인 광여기를 수행하는데 단파장의 빛을 요구하고 있다.

본 발명은 생물학적 시스템에서 RNA의 광절단, 특히 RNA의 광-유도된 광절단에 대한 활성을 갖는 광감작성 분자에 관한 것이다. PDT 및 RNA에 유효한 광감작성 분자는 다음 특성, 즉 입수가 용이하고, 고유 독성이 낮으며, 파장 흡수가 길고, 단일선 산소 생성에 효능적인 광감작화제이며, 수중 용해도가 높고, 죽종 또는 종양 조직과 같은 친지성 조직 내에서 선택적으로 흡수하며, 외막형 바이러스에 대한 친화도가 높고, 사용 후에 신속히 분해 및/또는 제거되며, 화학적으로 순수하고 안정하며, 합성적 변형이 용이하고, 생리학적 온도 및 pH에서 효능이 있으며, 특정 생물학적 기질에 대해 특이적이고, 생물학적 시스템에 대한 투여가 용이하며 부위 지시된 담체 분자와 친화적으로 접합되는 특성을 갖는다.

본 발명자들은 이들 문제점에 역점을 두고 본 명세서에 RNA를 절단할 수 있는 광감작화제를 제공함으로써 광역학적 치료법에 대한 완전히 새로운 범위의 표적을 제공한다. 이들 광감작화제는 종양 국재, 약 800nm 이하의 보다 긴 파장에서의 흡수를 나타낼 뿐만 아니라 무독성이고, 피부 광감작이 결여되며 순수한 형태로의 생성이 용이하다는 것을 입증해 준다.

약어 목록

DCC: 디사이클로헥실카보디이미드

DMF: 디메틸포름아미드

EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산

NHS: N-하이드록시석신이미드

NM: 나노미터

RNA: 리보핵산

TEA: 트리에틸아민

THF: 테트라하이드로푸란

Txp(txph)(TX) : 텍사피린

발명의 요약

본 발명은 리보핵산 중합체의 광 유도된 광절단 방법을 제공한다. 이러한 방법은 리보핵산 중합체를 광감작성 텍사피린과 접촉시키는 단계; 및 이러한 광감작성 텍사피린을 상기 중합체를 절단시키기에 충분한 시간 동안 빛에 노출시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 텍사피린은 작용성 그룹이 부착된 방향족 펜타덴테이트 연장된 포르피린 동족체이다. 이러한 펜던트 그룹은 용해도 또는 생국재를 증진시킬 수 있거나 올리고뉴클레오티드와 같은 부위 지시된 분자에 대한 커플링 부위를 제공할 수 있다.

리보핵산 중합체는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 RNA의 용액 또는 현탁액일 수 있거나 세포내 RNA일 수 있다. RNA를 특이적으로 광절단하는 능력은 각종 질환을 치료하는데 있어서, 즉 레트로바이러스성 RNA, 메신저 RNA, 온코젠 mRNA, 리보좀 RNA, RNA 조인자, 전이 RNA, 소형 핵상 RNA 또는 소형 세포질 RNA를 분해시키는데 있어서 중요한 관계를 가짐으로써, 질환에 걸리거나 암 또는 기타 원치 않는 세포 또는 조직을 제거하기 위한 다각적인 접근 방법을 제공해준다. 목적하는 광절단 부위는 숙주에 해로운 생성물을 암호화하는 RNA이거나 몇몇 방식에 있어서 해로운 정상의 RNA일 수 있다.

본원에서 기술된 RNA의 광절단은 광분해적 절단이다. 이러한 절단은 물 분자가 결합과 교차하여 가해져서 그 결합을 절단시키는 가수분해적 절단이 아닌 것으로 여겨질 뿐 아니라, 또한 빛의 부재하에서 산화성 반응이 결합의 절단을 야기시키는 산화성에만 의존한 광절단도 아닌 것으로 여겨진다.

RNA의 부위 특이적 광절단 방법은 2가지 이상의 특이성 공급원을 수반한다. 상보적 올리고뉴클레오티드는 표적된 기질과 염기 쌍을 형성하여 제1의 특이성 공급원을 제공해주며, 시험관내 또는 생체내에서 적용하기 위한 제2의 특이성 공급원은 레이저 광선을 위치시키는 것이다. 이와 같이 수동적으로 또는 기계적 수단으로 레이저 광선을 위치시키는 것은 문제의 올리고뉴클레오티드 광절단 반응을 특정의 생물학적 병소, 예를 들면, 깊숙히 박힌 종양 부위에 대해 수행해야 하는 경우에 특히 유리할 것이다. 본원에서는, 텍사피린이, 신체 조직이 비교적 투명한 파장(700 내지 900nm)에서 빛을 흡수한다는 사실이 특히 유리하다. 이러한 방법으로, 텍사피린 접합체가 국재되지 않은 기타 조직에 대해서는 비교적 거의 해롭지 않은 광-기재 광감작화를 수반하면서 체내에 깊숙히 박힌 병소에 대해서는 광-기재 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법을 효과적으로 이행할 수 있다.

양성 또는 악성 종양 세포를 지닌 숙주를 치료하는 방법은 본 발명의 추가의 양태이다. 이러한 방법은 양성 또는 악성 종양 세포의 RNA 분자에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 광감작성 텍사피린과의 접합체의 유효량을 상기 숙주에 투여하는 단계; 및 종양 세포에 근접한 광감작성 텍사피린을 광조사하는 단계를 포함한다. 당해 방법은 텍사피린을 참조로 하여 숙주내에 광감작성 텍사피린의 국재 부위를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 추가의 양태는 표적화된 세포내 RNA 광절단 방법이다. 이러한 방법은 표적화된 RNA에 대한 상보적 결합 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드와 커플링된 텍사피린을 특정 세포내로 도입함으로써, 표적화된 RNA의 광절단이 텍사피린에 의해 촉매되도록 하는 것을 포함한다.

텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체를 동물에게 투여함을 포함하여, 메신저 RNA를 파괴함으로써 동물 내에서의 특정 유전자의 발현을 억제시키는 방법은 본 발명의 추가의 양태이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 메신저 RNA 분자 영역, 또는 메신저 RNA의 절단 반응에 관여된 소형 핵상 RNA에 대한 상보적 결합 친화성을 지닌다. 본 발명의 추가의 양태는 특정 조직에 대하여 특이성을 갖는 텍사피린을 동물에게 투여함을 포함하는, 상기 동물의 조직 특이적 메신저 RNA의 억제 방법이다. 이러한 텍사피린에는 표적 메신저 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 부착될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태는 둘 이상의 별개의 텍사피린 착물이 올리고뉴클레오티드에, 하나는 3' 말단에 다른 하나는 5' 말단에 부착되어 있고/있거나 하나 이상은 내부 잔기에 부착되어 있는 텍사피린 접합체에 관한 것이다. 이러한 텍사피린은 금속을 함유하지 않거나 금속을 함유할 수 있다. 각각의 텍사피린 착물의 금속 이온은 동일하거나 상이할 수 있다. 유사하게, 각각의 텍사피린은 상이할 수 있다. 이중 텍사피린 착물-접합체를 사용함으로써, 금속 착물의 예정된 활성으로 인한 증가된 효능을 지니면서 RNA를 광절단시켜야만 한다. 진단 및 치료 목적으로, 반자성 금속 이온을 갖는 하나의 텍사피린 착뚤 및 상자성 금속 이온을 갖는 다른 착물을지닌 상기 접합체를 투여하면, 결합, 영상화 및 광절단 모두가 하나의 접합체에 의해 수행될 수 있다. 이러한 경우, 결합은 올리고뉴클레오티드에 의해 수행되며, 영상화는 상자성 금속 이온의 존재로 인해 MRI에 의해 달성되고 광절단은 반자성 금속 양이온을 함유하는 광감작성 텍사피린에 의해 성취된다. 따라서, 상기 접합체의 생분포도와 세포내 투과를 측정할 수 있다.

본 발명의 추가의 국면은 리보핵산 중합체를 광절단시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서의 광감작성 텍사피린의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 리보핵산 중합체가 메신저 RNA이고 광감작성 텍사피린이 본원에서 제시된 바와 같은 화학식 I 또는 II의 구조를 갖는다.

바람직한 양태의 상세한 설명

본 발명은 리보핵산 중합체를 광유도 절단시키기 위한 광감작성 텍사피린의 용도를 제공해 준다. 이러한 광감작성 텍사피린은 염기를 함유하지 않은 텍사피린이거나 반자성 금속으로 금속화될 수 있다. 바람직한 반자성 금속은 Lu(III), La(III), In(III), Y(III), Zn(II) 또는 Cd(II)이고 보다 바람직한 반자성 금속은 Lu(III) 또는 Y(III)이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "광감작성"은 조사시 텍사피린이 단일선 산소, 하이드록실 라디칼, 과산화물 또는 하이드로퍼옥실 라디칼과 같은 세포독성인 산소 생성물을 발생시켜, 예를 들면, 광감작성 분자의 근처에서 표적화되고 광 유도된 치료 효과를 달성시킴을 의미한다. 본원에서 언급한 바와 같이, 쇄 절단이 광화학적으로 유도된 손상 정도를 정량화하는데 유용하긴 하지만, 이러한 손상 자체(예; 특정 뉴클레오티드의 변형)는 핵산의 생물학적 기능(예를 들면, RNA의 해독, 파아지 감염성)을 억제시키는 것으로 공지되어 있다.

본 발명에 따른 광 의존성 광절단에서는, 이러한 빛의 파장 범위가 약 650 내지 900nm. 바람직하게는 약 700 내지 800nm, 가장 바람직하게는 약 730 내지 770nm일 수 있다.

리보핵산 중합체의 광 유도된 광절단에 사용하기 위한 텍사피린 또는 텍사피린 금속 착물은 다음 화학식 I 또는 II의 구조를 갖는다:

[화학식 I]

[화학식 II]

상기식에서,

M은 H 또는 반자성 금속 양이온이고,

R₁내지 R₄, R₇및 R₈은 독립적으로 수소, 할라이드, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 할로알킬, 니트로, 포르밀, 아실, 하이드록시알킬, 알콕시, 하이드록시알콕시, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 사카라이드, 카복시, 카복시알킬, 카복시아미드, 카복시아미드알킬, 아미노, 아미노알킬, 부위-지시 분자, 촉매적 그룹, 또는 부위-지시 분자 또는 촉매적 그룹에 커플링되는 커플이며,

R₆및 R₉는 독립적으로 R₁내지 R₄, R₇및 R₈그룹으로부터 선택되는데, 단 할라이드는 요오드가 아니며 할로알킬은 요오도알킬이 아니고,

R₅및 R₁₀내지 R₁₂는 독립적으로 수소 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 하이드록시알킬, 알콕시, 하이드록시알콕시, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 카복시알킬, 카복시아미드, 카복시아미드알킬, 아미노, 아미노알킬, 또는 사카라이드, 부위-지시 분자 또는 촉매적 그룹에 커플링되는 커플이며,

n은 5 이하의 정수이고,

R₁₃은 알킬, 알케닐, 옥시알킬, 또는 탄소수가 약 3 이하이고 제1 탄소 결합 주위에 회전 가요성을 지닌 하이드록시알킬이다.

상기 회전 가요성은 나머지 그룹을 텍사피린 평면 밖으로 위치시켜 준다. 따라서, 예를 들면, 바람직한 알케닐은 CH₂-CH=CH₂이다. 가장 바람직한 피롤 질소 치환체는 메틸 그룹이다.

본 발명의 텍사피린은 금속을 함유하지 않거나 금속과의 착물일 수 있다. 상기 화학식 I에서, n은 전형적으로 5 이하의 정수일 것이다. 2가 또는 3가 금속 양이온을 갖는 염기성 매크로사이클과 관련해서는 n이 1 또는 2이지만, 본 명세서를 근거로 하여 당해 분야의 숙련인은 n의 값이 치환체 R₁내지 R₁₂상에 존재하는 전하 및 공유적으로 결합된 부위-지시 분자 상에 존재하는 전하로 인해 변경될 수도 있음을 인식할 것이다. 당해 분야의 숙련인은 본 발명에서 기술된 착물이 금속 이온에 전하 중화 및/또는 배위적 포화를 제공해주는 하나 이상의 추가 리간드를 가진다는 것을 인식해야 한다. 이러한 리간드로는 특히 클로라이드, 니트레이트, 아세테이트 및 하이드록사이드가 있다.

본 발명의 알킬 그룹 치환체로서 유용한 알칸의 대표적 예로는 메탄, 에탄 또는 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난 및 데칸의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 이성체가 있으며 메탄, 에탄 및 프로판이 바람직하다. 약 30개 이하, 또는약 50개 이하의 탄소원자를 갖는 알킬 그룹이 본 발명에서 고려된다. 치환된 알킬의 대표적 예로는 본원에서 기술된 바와 같은 2개 이상의 작용성 그룹에 의해 치환된 알킬이 있다.

알케닐 그룹 치환체로서 유용한 알켄의 대표적 예로는 에텐, 또는 프로펜, 부텐, 펜텐, 헥센, 헵텐, 옥텐, 노넨 및 데센의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 이성체가 있으며 에텐 및 프로펜이 바람직하다. 약 30개 또는 약 50개 이하의 탄소원자를 갖고 약 5개 이하의 이중 결합을 갖거나 더욱 바람직하게는 약 3개 이하의 이중 결합을 갖는 알케닐 그룹이 본 발명에서 고려된다.

알키닐 그룹 치환체로서 유용한 알킨의 대표적 예로는 에틴, 또는 프로필, 부틴, 펜틴, 헥신, 헵틴, 옥틴, 노닌 및 데신의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 이성체가 있으며 에틴 및 프로핀이 바람직하다. 약 30개 또는 약 50개 이하의 탄소원자를 갖고 약 5개 이하 또는 약 3개 이하의 삼중 결합을 갖는 알키닐 그룹이 본 발명에서 고려된다.

아릴은 이의 분자가 벤젠, 나프탈렌, 페난트렌, 안트라센 등의 환 구조 특성을 지닌 화합물, 즉 벤젠의 6-탄소 환 또는 기타 방향족 유도체와의 축합된 6-탄소 환일 수 있다. 예를 들면, 아릴 그룹은 치환되지 않거나 니트로, 카복시, 설폰산, 하이드록시, 옥시알킬 또는 할라이드 치환체에 의해 치환된 페닐 또는 나프틸일 수 있다. 이러한 경우 페닐 또는 나프틸 상의 치환체는 매크로사이클을 형성하는 축합 단계 이후에 합성 단계에서 가할 수 있다.

할라이드 치환체 중에서, 염소, 브롬, 불소 및 요오드가 본 발명의 실시에서고려되는데, 단 R₆및 R₉의 경우에는 요오드가 제외된다. R₆및 R₉는 염소, 브롬 또는 불소 치환체를 가질 수 있다. 본 발명에서 사용된 할로알킬의 대표적 예로는 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난 및 데칸의 할라이드가 있으며, 이증에서 메탄, 에탄 및 프로판의 할라이드, 바람직하게는 클로라이드 또는 브로마이드가 바람직하다.

"하이드록시알킬"은 알킬 그룹의 알콜을 의미한다. 1개 내지 20개의 하이드록실을 갖는 하이드록시알킬 그룹이 바람직하고 1개 내지 10개의 하이드록실을 갖는 하이드록시알킬이 더욱 바람직하다. "하이드록시알킬"에는 글리콜 및 폴리글리콜; 알킬의 디올, 바람직하게는 C_1-10알킬의 디올, 보다 바람직하게는 C_1-3알킬의 디올; 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜 뿐만 아니라 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌의 배합물을 함유하는 폴리알킬렌 글리콜이 포함된다.

옥시알킬의 대표적 예로는 에테르 결합을 지닌 본원에서 기술된 바와 같은 알킬 그룹이 있다. "옥시알킬"은 하나 이상의 작용성 그룹을 갖는 폴리에테르를 포함한다. 하나의 치환체 내에서 반복되는 옥시알킬의 수는 200 이하, 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 7 가장 바람직하게는 2 내지 3이다. 바람직한 옥시알킬은 O(CH₂CH₂O)_xCH₃(여기서, x는 1 내지 120, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1 내지 5이다)이다.

옥시하이드록시알킬은 에테르 또는 에스테르 결합, 하이드록실 그룹, 치환된하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 치환된 카복실 그룹 등을 갖는 알킬 그룹을 의미한다.

티오알킬의 대표적인 예로는 에탄의 티올, 또는 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난 및 데칸의 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 이성체의 티올이 있으며, 이중에서 에탄의 티올(에탄티올, C₂H₅SH) 또는 프로판의 티올(프로판티올, C₃H₇SH)이 바람직하다. 설페이트-치환된 알킬로는 하나 이상의 설페이트 그룹에 의해 치환된 상기한 바와 같은 알킬이 있으며 이의 대표적 예는 디에틸 설페이트((C₂H₅)₂SO₄)이다.

포스페이트의 대표적인 예로는 포스페이트 또는 폴리포스페이트 그룹이 있다. 포스페이트 치환된 알킬의 대표적인 예로는 하나 이상의 포스페이트 또는 폴리포스페이트 그룹에 의해 치환된 상기한 바와 같은 알킬이 있다. 포스포네이트 치환된 알킬의 대표적인 예로는 하나 이상의 포스포네이트 그룹에 의해 치환된 상기한 바와 같은 알킬이 있다.

카복시 그룹의 대표적인 예로는 상기한 바와 같은 알킬의 카복실산, 및 벤조산과 같은 아릴 카복실산이 있다. 카복시아미드의 대표적인 예로는 1급 카복시아미드(CONH₂). 2급 카복시아미드(CONHR') 및 3급 카복시아미드(CONR'R")[여기서, R' 및 R" 각각은 본원에서 언급된 바와 같은 작용성 그룹이다]가 있다.

유용한 아민의 대표적인 예로는 상기한 바와 같은 알킬의 1급, 2급 또는 3급 아민이 있다.

"카복시아미드알킬"은 2급 또는 3급 아미드 결합 등을 갖는 알킬 그룹을 의미한다. "카복시알킬"은 하이드록실 그룹, 카복실 또는 아미드 치환된 에테르, 에스테르 결합, 에테르로부터 제거된 3급 아미드 결합 등을 갖는 알킬 그룹을 의미한다.

용어 "사카라이드"는 산화, 환원 또는 치환된 사카라이드: D-글루코즈, D-만노즈 또는 D-갈락토즈 등의 헥소즈; D-리보즈 또는 D-아라비노즈 등의 펜토즈; D-리불로즈 또는 D-프럭토즈 등의 케토즈; 슈크로즈, 락토즈 또는 말토즈 등의 디사카라이드; 아세탈, 아민 및 포스포릴화 당 등의 유도체; 올리고사카라이드 뿐만 아니라 각종 당의 개환 형태 등을 포함한다. 아민 유도체화된 당의 예는 갈락토사민, 글루코사민, 시알산, 및 1-아미노-1-데옥시솔비톨 등의 D-글루카민 유도체이다.

본 발명의 한 양태에서 텍사피린은 부위-지시 분자와 추가로 커플링되어 표적화된 생체내 운반용 접합체를 형성시킨다. "부위-지시"란 표적화된 부위에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. "표적화된 부위에 대한 특이성"이란 텍사피린-접합체를, 예를 들면, 이온 강도, 온도, pH 등의 생리학적 조건하에서 표적화된 부위와 접촉하였을 때, 특이적 결합이 형성되는 것을 의미한다. 이러한 상호작용은 접합체의 특정 잔기와 표적의 특이적 잔기와의 특이적 정전, 소수성, 엔트로피성 또는 기타 상호작용으로 인해 발생하여 상기 상호작용을 촉진시키기에 유효한 조건하에서 안정한 복합체를 형성시킬 수 있다. 부위-지시 분자는 치료하고자 하는 부위에 국재하기 위한 결합 특이성을 가질 수 있다. 본 발명에서 고려된 부위-지시 분자의 예로는 폴리데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 폴리리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 및 이들의 동족체; 생물학적 수용체에 대한 친화성을 갖는 펩티드를 포함하는 폴리아미드; 항체 등의 단백질; 스테로이드 및 스테로이드 유도체: 에스트라디올 또는 히스타민 등의 호르몬; 몰핀 등의 호르몬 유사체; 및 사피린 및 루비린 등의 매크로사이클이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 부위-지시 분자가 절단시키고자 하는 RNA의 일정 부분에 상보적인 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드인 광감작성 텍사피린-부위 지시 분자 접합체를 사용하여 리보핵산 중합체를 부위 특이적으로 광절단시키는 것을 포함한다.

실시예 5의 데이터는 반자성 금속-텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체가 RNA 안티센스 시약으로 발전될 수 있음을 입증해준다. 이러한 안티센스 전략은 새로운 약물을 개발하는데 있어 명확하고도 합리적인 방법을 제공해주는데, 이는 상기 전략에는 한가지 필수조건, 즉 안티센스 프로브가 이의 표적 분자와 하이브리드화한다는 조건이 있기 때문이다. 이러한 하이브리드화 필수조건은 상보적 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 형성을 통하여 매우 잘 인식되고 있다. 수천가지의 화합물의 스크리닝과 X선 결정 구조 분석을 요구하는 당해 분야의 현행 방법과는 달리, 안티센스 기술에 요구되는 정보는 표적의 서열이다. 본래의 RNA를 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체로 처리하면, 부착된 올리고뉴클레오티드를 통하여 상보적 RNA 서열과의 접합체 결합이 형성된다. 이어서, 반자성 금속 텍사피린 착물은 특이적 부위에 가장 근접한 RNA를 절단시킨다. 2개의 텍사피린 분자가 접합된 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있는데, 이는 광절단 활성을 증진시킨다. 또한, 올리고뉴클레오티드에 부착된 상당수의 텍사피린은 안티센스 시약이 종양에 대한 선택적 국재화와 같은, 텍사피린의 약물역학적 및 생분포 특성을 더욱 더 띄도록 해줄 것이다.

당해 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체는 항바이러스 및 항박테리아 치료법 뿐만 아니라 암(예를 들면, 온코젠 메신저 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드) 및 특정 단백질의 과발현에 의해 야기되는 염증성 반응에 즉각적으로 적용할 수 있다. 안티센스 기술은 미국 특허 제5,194,428호, 제5,110,802호 및 제5,216,141호(이들 모두는 본원에 참조문헌으로 인용됨)에서 논의되었다.

올리고뉴클레오티드는 이들의 표적 부위에 대한 특이성이 상당히 정확하고 작제가 용이하다는 측면에서 전통적인 약물에 비해 몇몇 이점을 지닌다. 올리고뉴클레오티드는 염기, 당, 쇄 말단 또는 주쇄의 포스페이트 그룹에서 유도체화되어 생체내 안정성을 증진시킬 수 있다. 분해를 최소화하기 위하여 CpG 서열을 유도체화할 수 있으며; 유도체화는 알킬화일 수 있고 바람직하게는 메틸화이다. 포스페이트 결합이 뉴클레아제 활성에 민감하기 때문에 본 발명의 한 양태에서는 포스페이트 그룹의 변형이 바람직하다. 바람직한 유도체는 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포르아미데이트이다. 유도체는 또한 교호하는 포스포로티오에이트 및 변형되지 않은 결합, 교호하는 메틸포스포네이트 및 변형되지 않은 결합, 또는 교호하는 포스포로티오에이트 및 메틸포스포네이트 결합을 함유할 수 있다. 부가적으로, 포스페이트 결합은 아미드 결합과 같은 비-포스페이트 결합으로 완전하게 치환될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 쇄의 말단에 대한 부속기는 또한 엔도뉴클레아제 내성을 제공해준다. 5' 또는 3' 말단은 포스포르아미데이트 결합, 3'-3' 결합을 통하여 올리고뉴클레오티드에 접합된 역위된 뉴클레오티드, 아미노아크리딘 잔기 또는 폴리-L-리신으로 유도체화하거나 "캡핑"시킬 수 있다.

당 변형체는 리보뉴클레오티드내 리보즈 잔기의 산소에 부착된 할로, 알킬, 알케닐 또는 알콕시 그룹과 같은 그룹을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 그룹은 리보즈의 2' 산소에 부착될 것이다. 특히, 플루오로 등의 할로겐 잔기가 사용될 수 있다. 알콕시 그룹은 메톡시, 에톡시 또는 프로폭시일 수 있다. 알케닐 그룹은 바람직하게는 알릴이다. 알킬 그룹은 바람직하게는 메틸 그룹이고 이러한 메틸 그룹은 리보즈의 2' 산소에 부착된다. 기타 알킬 그룹은 에틸 또는 프로필일 수 있다. O-메틸화 유도체화는 리보뉴클레오티드가 분해되지 않도록 보호해 준다.

본 명세서 및 청구의 범위에서 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 천연 및 합성 뉴클레오티드, 폴리- 및 올리고뉴클레오티드, 및 이들의 동족체 및 유도체, 예를 들어 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포르아미데이트 등을 의미한다.

용어 "텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체"는 올리고뉴클레오티드가 텍사피린에 5' 결합, 3' 결합, 또는 텍사피린이 접합체내의 내부 잔기로 존재하도록 해주는 이들 양 결합 형태로 부착되는 것을 의미한다. 상기 용어는 올리고뉴클레오티드의 내부 염기에 연결되는 텍사피린을 지칭할 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 또는 기타 부위-지시 분자는 텍사피린에 직접적으로 부착되거나 링커 또는 가변 길이의 커플을 통하여 텍사피린에 부착될 수 있다. 촉매 작용 동안, 예를 들면, 텍사피린 금속 착물-올리고뉴클레오티드 접합체의 텍사피린 부분을 표적화된 핵산 기질에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합시 RNA 기질 근처에 놓아 둔다. "사피린-올리고뉴클레오티드 접합체"는 텍사피린 분자가 사피린 분자로 대체된 것을 제외하고는 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체에 대해 앞서 언급한 바와 동일한 방식으로 지칭된다.

텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체를 세포내로 운반하는 예시적 방법은 표적화된 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 운반하기 위한 글리코-접합체를 사용하는 것이다. 양 말단이 보호되고 글리코-접합체에 대한 디설파이드 브릿지를 통하여 연결된 올리고뉴클레오티드가 표적 부위에 도달하는데 있어서 상응하는 유리 올리고뉴클레오티드보다 상당히 더 유효하다. 폴리-L-리신은 세가지 성분, 즉 인식 시그날로서의 당, 치료학적 올리고뉴클레오티드 요소 및 중화 및 가용화제로서의 글루콘산에 의해 치환될 수 있다. 이러한 유형의 중성이고 고도로 수용성인 글리코실화 중합체가 이에 부착된 당의 성질에 따라서 약물을 세포내로 운반시키는데 효능있는 담체이다.

유용한 스테로이드의 대표적인 예로는 다음 5가지 범주에 속하는 스테로이드 호르몬이 있다: 프로게스테론 등의 프로게스타겐; 코르티솔 등의 글루코코르티코이드; 알도스테론 등의 미네랄코르티코이드; 테스토스테론 또는 안드로스텐디온 등의 안드로겐; 및 에스트론 또는 에스트라디올 등의 에스트로겐.

"생물학적 수용체에 대한 친화성을 갖는 펩티드"는 상기 펩티드를, 예를 들면, 이온 강도, 온도, pH 등의 적당한 조건하에서 생물학적 수용체와 접촉하였을때, 특이적 결합을 형성시키는 것을 의미한다. 이러한 상호작용은 펩티드의 당분해 잔기의 특정 아미노산과 수용체의 당분해 잔기의 특이적 아미노산 또는 당분해 잔기와의 특이적 정전, 소수성, 엔트로피성 또는 기타 상호작용으로 인해 발생되어 상기 상호작용을 촉진시키기에 유효한 조건하에서 안정한 복합체를 형성시킬 수 있다. 이러한 상호작용은 이에 관여된 펩티드 또는 수용체 중의 어느 하나 또는 둘 다의 3차원적 형태와 기능 또는 활성을 변경시킬 수 있다. 생물학적 수용체에 대한 친화성을 갖는 펩티드는 엔드로핀, 엔케팔린, 성장 인자(예: 상피 성장 인자), 폴리-L-리신. 호르몬, 단백질의 펩티드 영역 등의 천연 또는 합성 펩티드를 포함할 수 있다. 이의 구체적인 예로는 인슐린, 리보뉴클레아제 또는 β-엔돌핀이 있다.

텍사피린 착물 또는 텍사피린 착물-부위 지시 접합체에 부착된 "촉매적 그룹"이란 일반적 산, 브론스테드 산, 일반적 염기, 브론스테드 염기, 구핵체, 또는 반응에 대한 활성화 장벽을 저하시키거나 기질의 바닥 상태 에너지를 증가시키는 기타 어떠한 수단으로서 작용할 수 있는 화학적 작용성 그룹을 의미한다. 본원에서 고려된 촉매적 그룹의 예로는 이미다졸: 구아니딘; D-글루코사민, D-만노사민, D-갈락토사민, D-글루카민 등의 치환된 사카라이드; L-히스티딘 및 L-아르기닌과 같은 아미노산; 히스타민과 같은 아미노산의 유도체; 폴리-L-리신, (LysAla)_n, (LysLeuAla)_n(여기서, n은 1 내지 30, 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 7이다) 등의 아미노산의 중합체; 이들의 유도체; 및 텍사피린 금속 착물이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

텍사피린 또는 텍사피린-접합체에 "부착된"이란 용어는 촉매적 그룹이 텍사피린에 직접적으로 부착되거나 링커 또는 가변 길이의 커플을 통하여 접합체에 부착되는 것을 의미한다.

커플은 링커, 즉 텍사피린 매크로사이클로부터의 일정 거리에서 또다른 분자를 공유적으로 부착시키도록 고안된 반응성 그룹의 반응에 의해 형성된 공유 생성물로서 기술될 수 있다. 링커 또는 커플의 예로는 아미드, 아민, 디설파이드, 티오에스테르, 티오에테르, 에테르, 에스테르 또는 포스페이트 공유 결합이 있다. 가장 바람직한 양태에서, 접합체 및 부착된 그룹은 탄소-탄소, 탄소-질소, 탄소-황 또는 탄소-산소 결합, 더욱 바람직하게는 탄소-산소 또는 탄소-질소 결합을 통하여 텍사피린에 공유적으로 결합된다.

바람직한 작용화는 R₆및 R₉가 수소가 아닌 경우, R₅및 R₁₀은 수소 또는 메틸이고; R₅및 R₁₀이 수소가 아닌 경우, R₆및 R₉는 수소, 하이드록실 또는 요오드가 아닌 할라이드이다. 기타 바람직한 작용화는 R₆및 R₉가 수소인 경우, R₅, R₁₀, R₁₁및 R₁₂는 저급 알킬 또는 저급 하이드록시알킬이다. 저급 알킬은 바람직하게는 메틸 또는 에틸, 더욱 바람직하게는 메틸이다. 저급 하이드록시알킬은 바람직하게는 탄소수가 1 내지 6이고 하이드록시 그룹이 1개 내지 4개이고, 더욱 바람직하게는 3-하이드록시프로필이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, R₁, R₂, R₃, R₇및 R₈중의 하나 이상은 부위-지시 분자, 또는 부위-지시 분자에 커플링되는 커플이다. 더욱 바람직한 양태에서, R₁, R₂, R₃, R₇및 R₈중의 하나 이상은 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드에 커플링되는 커플이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, R₁은 (CH₂)₂CH₂OH이고 R₂및 R₃은 CH₂CH₃이며 R₄는 CH₃이고 R₈은 부위-지시 분자, 또는 부위-지시 분자에 커플링되는 커플이고 R₇은 H이다.

또 다른 바람직한 텍사피린에서, 치환체 R₁는 (CH₂)₂CH₂OH이고 R₂및 R₃은 CH₂CH₃이며 R₄는 CH₃이고 R₇은 O)(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃, H 또는 OCH₃이며 R₈은 부위-지시분자, 또는 부위-지시 분자에 커플링되는 커플이다.

올리고뉴클레오티드에 커플링되는 커플은 O(CH₂)_nCO-올리고뉴클레오티드(여기서 n은 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 3이다)로서 추가로 기술될 수 있다.

추가의 바람직한 양태에서, R₁은 (CH₂)₂CH₂OH이고 R₂및 R₃은 CH₂CH₃이며 R₄는 CH₃이고 R₇및 R₈은 O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃이다.

본 발명의 바람직한 텍사피린 화합물에서, R₁내지 R₄, R₇및 R₈은 표 1에서 텍사피린 A1 내지 A22에 대해 나타낸 바와 같고 R₅, R₆및 R₉내지 R₁₂는 H이고 M은 위에서 정의한 바와 같다. 그러나, 위에서 기술된 텍사피린 화합물이 본 발명에서 사용하는데 바람직한 화합물이긴 하지만, 본 발명은 이에 제한되지 않으며 어떠한광감작성 텍사피린도 본 발명을 실시하는데 유용할 수 있다.

[표 1]

본 발명의 텍사피린 매크로사이클에 대한 대표적인 치환체

텍사피린 금속 착들은 지질이 풍부한 부위, 예를 들면, 간, 신장, 종양 및죽종에 국재시키는, 미국 특허 제5,252,720호에 기술된 바와 같은 고유의 생국재화 특이성을 보유한다. 중요하게는, 하이드록실화 텍사피린은 친지성 부위에 국재시키는데 최적인 지질-물 분포 계수를 갖지만, 조작이 용이할 정도로 충분히 수용성이다. "수용성"이란 수성 유체에서 약 1mM 이상으로 가용성인 것을 의미한다. "친지성 부위에 대한 국재화"는 주변을 둘러싸고 있는 비-지질이 풍부한 조직 또는 물질보다도 지질이 풍부한 조직 또는 물질에 대한 친화도가 더 높은 것을 의미하고 현탁액중의 바이러스의 경우, 상기 용어는 바이러스의 막 코트(coat)에 대한 친화성을 갖는 것을 의미한다. "지질이 풍부한"이란 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 지방산 등의 양이 보다 많다는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "텍사피린을 참조하여" 텍사피린의 국재화 부위를 결정한다는 것은 텍사피린이 상자성 금속을 함유하는 경우에는 자기 공명 영상화, 금속이 감마-방출성인 경우에는 감마선 검출 등의 국재화에 의해서 또는 단색 X선 광자 공급원 또는 형광 분광법을 사용하여 상기 부위를 발견할 수 있다는 것을 의미한다. 방사성면역진단용 감마-방출성 금속은 본원에 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,252,720호에 기술되어 있다. 바람직한 감마-방출성 금속은¹¹¹In(III)이다. 금속화되지 않은 형태의 텍사피린은 특히, 텍사피린의 검출 수단으로서 형광법이 바람직한 경우에 사용될 수 있다.

금속을 함유하지 않은 텍사피린 화합물 및 반자성 금속화 텍사피린 화합물, 이들의 제조방법 및 이들의 사용방법은 미국 특허 제4,935,498호, 제5,162,509호,제5,252,720호; 제5,256,399호; 제5,272,142호; 제5,292,414호; 제5,369,101호; 제5,432,171호; 제5,439,570호; 제5,451,576호; 제5,457,183호; 및 제5,475,104호: 및 계류중인 미국 특허원 제08/098,514호, 제08/196,964호, 제08/227,370호 및 제 08/207,845호에 기술되어 있으며 상기 문헌 모두는 본원에서 참조문헌으로 인용된다. 사피린 화합물은 미국 특허 제5,041,078호; 제5,159,065호; 제5,120,411호; 제5,302,714호 및 제5,457,195호에 기술되어 있으며 이들 특허 각각은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.

본원 명세서 및 참조문헌으로 인용된 특허, 특허원 및 공개 공보의 관점에서 유기 합성 분야의 숙련인은 각종 치환체를 갖는 광감작성 텍사피린을 생성시키기 위한 상기 기본적 합성 화학법을 확대시키고 상세히 논할 수 있다. 예를 들면, 폴리에테르-결합된 폴리하이드록실화 그룹, 사카라이드가 아세탈-유사 글리코시드 결합을 통하여 부착된 사카라이드 치환물, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드가 마찬가지로 텍사피린에 결합될 수 있다. 카복실 그룹이 아릴 에테르 또는 작용화된 알킬 치환체를 통하여 텍사피린 코어에 결합되는 이중으로 카복시화된 텍사피린은 에스테르 결합이 추가의 하이드록실 함유 치환체를 부착시키는 작용을 하는 각종 에스테르화 생성물로 전환될 수 있다. 폴리하이드록시화 텍사피린 유도체는 2급 아민 결합을 사용함으로써 합성할 수 있다. 사카라이드 잔기는 아미드 결합을 통하여 부착시킬 수 있다. 측쇄 폴리하이드록실(폴리올) 아단위를 함유하는 폴리하이드록시화 텍사피린 유도체는 아릴 에테르 또는 에스테르 결합을 통하여 텍사피린 코어에 부착될 수 있다.

카복실화 텍사피린을 티오닐 클로라이드 또는 p-니트로페놀 아세테이트로 처리하면 모노클로날 항체 또는 기타 관심있는 생분자에 부착시키기에 적절한 활성화 아실 화합물이 생성된다. 동일 반응계 내에서의 표준 커플링 방법(예: 1,1'-카보닐디이미다졸)을 사용하여 상기 접합을 수행할 수 있다.

다음 구조는 매크로사이클의 외곽 주변의 원자 위치에 대한 IUPAC 명명법과 본 발명의 R 그룹의 위치와의 상관관계를 보여준다.

매크로사이클의 B(벤젠 환) 영역 상의 R₆및 R₉위치에서의 치환체는 매크로분자의 3 및 6 위치에서 오르토-페닐렌디아민에 부착됨으로써 매크로사이클에 혼입된다. 매크로사이클의 T(트리피란) 영역 상의 R₅및 R₁₀위치에서의 치환체는 치환된 오르토-페닐렌디아민으로 축합되기에 앞서 합성 단계에서 트리피란의 5 위치에서 카복실 그룹의 적당한 작용화에 의해 혼입된다.

방향족이 아닌 텍사피린은 치환체 R₁내지 R₁₂가 본원에서 기술된 바와 같은

축합시킴으로써 용이하게 제조한다. 바람직한 합성 방법에서, 브론스테드 염기는 트리에틸아민 또는 N,N,N',N'-테트라메틸-1,8-디아미노나프탈렌("양성자 스폰지")이고 산화제는 유기 용매를 포화시키는 공기, 산소, 산화백금, o-클로라닐 또는 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논이다. 환류 단계에서 교반 또는 가열하는 것은 상기 혼합물을 환류하면서 24시간 이상 동안 교반 또는 가열하는 것을 포함하고 유기 용매는 메탄올, 메탄올과 클로로포름, 메탄올과 벤젠, 또는 메탄올과 디메틸포름아미드를 포함할 수 있다.

치환체 R₂, R₃, R₇또는 R₈이 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드에 커플링되는 커플인 텍사피린 올리고뉴클레오티드 접합체, 특히 텍사피린 분자의 합성에 대한 참조문헌으로서 PCT 국제공개공보 제WO 94/29316호가 본원에 인용된다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 커플의 대표적인 예로는 아미드, 에스테르 및티오에스테르가 있다. 5' 말단, 3' 말단 또는 내부적으로 당 또는 염기 잔기에서 아민으로 작용화된 올리고뉴클레오티드는 텍사피린 착물의 활성화 카복실산 에스테르 유도체를 사용하여 합성 후에 변형시킬 수 있다. 또다른 방법으로는, 하나 이상의 티오포스페이트 또는 티올을 함유하는 올리고뉴클레오티드 동족체를 텍사피린 착물의 알킬 할라이드 유도체를 사용하여 황 원자에서 선택적으로 알킬화시킬 수 있다. 생성된 올리고뉴클레오티드-착물 접합체는 표적 핵산과 결합된 텍사피린 사이에 최적의 촉매적 상호작용이 제공되도록 고안될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 아마도 상보적 핵산의 약 8개 뉴클레오티드 이상이 결합되기에 충분히 클수 있다.

DNA, RNA 및 이들의 동족체의 합성에 관한 개괄적인 고찰은 본원에 참조문헌으로서 인용된 문헌[Oligonucleotides and Analogues, F. Eckstein, Ed., 1991, IRL Press. New York; Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait, Ed., 1984, IRL Press Oxford, England; Caracciolo et al., 1989; Bioconjugate Chemistry, Goodchild, J. 1990]. 또는 프스포네이트 합성의 경우에는 문헌[Matteucci, MD. et al., Nucleic Acids Res, 14:5399, 1986]을 참조한다.

일반적으로, 통상적인 5'-3' 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성에 관하여 통상적으로 사용되는 3가지 고상 기본 접근 방법이 있다. 이들은 포스포르아미다이트 방법, 포스포네이트 방법 및 트리에스테르 방법이다.

올리고머성 DNA를 합성하는데 현재 통상적으로 사용되고 있는 방법에 관해 간단히 기술하면 다음과 같다: 잔기의 길이가 약 100개 이하인 올리고머를 포스포르아미데이트 화학을 이용하는 시판용 합성기[예: Applied Biosystem Inc. (ABI) model 392]로 제조한다. 프스포르아미다이트로 불리우는 고도의 반응성 인(III) 시약을 연속적으로 첨가함으로써 DNA를 3'에서 5' 방향으로 합성한다. 초기 3' 잔기를 중합체의 조작을 상당히 촉진시켜 주는 제어된 다공성 실리카 고체 지지체에 공유적으로 부착시킨다. 각 잔기를 연장되고 있는 중합체 쇄에 커플링시킨 후 인(III)을 요오딘 용액으로 단기간 동안 처리함으로써 보다 안정한 인(V) 상태로 산화시킨다. 반응되지 않은 잔기를 아세트산 무수물로 캡핑시키고, 5'-보호 그룹을 약산을 사용하여 제거한 다음, 목적하는 DNA 중합체가 합성될 때까지 추가의 잔기를 가하여 이와 같은 주기를 반복할 수 있다. 완전한 길이의 중합체를 염기에 노출시킴으로써 고체 지지체로부터 방출시키는데, 이때 잔여 보호 그룹을 동시에 제거한다. 통상의 프로토콜은 포화된 에탄올성 암모니아를 사용한다.

포스포네이트 기재 합성은 커플링시키고자 하는 위치에서 포스포네이트 잔기를 함유하는 적합하게 보호된 뉴클레오티드를 적합한 활성화제의 존재하에서 유리 하이드록실 그룹을 갖는 고체 상-유도체화된 뉴클레오티드 쇄와 반응시킴으로써 수행하여 산에 안정한 포스포네이트 에스테르 결합을 수득한다. 따라서, 포스페이트 또는 티오포스페이트로의 산화는 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 또는 올리고뉴클레오티드의 합성을 완료한 후 어느 시점에서도 수행할 수 있다. 포스포네이트를 사염화탄소의 존재하에서 1급 또는 2급 아민과 반응시킴으로써 포스포르아미데이트 유도체로 전환시킬 수도 있다.

티오에스테르 합성에서는, 보호된 포스포디에스테르 뉴클레오티드를 커플링제의 존재하에 고체 지지체에 대해 유도체화된 연장되고 있는 뉴클레오티드 쇄의 유리 하이드록실 그룹과 축합시킨다. 이러한 반응으로, 옥시메이트 용액으로 처리되어 보호되지 않은 올리고뉴클레오티드를 형성시킬 수 있는 보호된 포스페이트 결합이 생성된다.

상기 3가지 접근법을 총괄적으로 나타내자면, 도입되는 뉴클레오티드는 "활성화된" 포스파이트/포스페이트 그룹을 갖는 것으로 간주된다. 통상적으로 사용되는 고체 상 합성 기술을 이용하는 것 이외에도, 디에스테르 합성과 같은 용액 상 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성할 수도 있다. 이러한 방법은 실행가능하지만, 일반적으로 실제적인 어떠한 길이의 올리고뉴클레오티드에 대해서도 효능이 덜하다.

생체내 가수분해에 대해 내성인 바람직한 올리고뉴클레오티드는 각 염기에서의 포스포토티오에이트 치환을 함유할 수 있다[참조: J. Org. Chem., 55:4693-4699. 1990 및 Agrawal, 1990]. 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 포스포로티오에이트 동족체는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem) 380B DNA 합성기(제조원: Applied Biosystem. Inc.. Foster City, CA)을 사용하여 합성할 수 있다.

상기 언급한 용도를 위하여, 텍사피린을 약제학적 제제로서 제공한다. 텍사피린의 약제학적 제제는 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단일 용량으로 또는 수회분 용량으로 나누어 투여할 수 있다. 적합한 약제학적 담체로는 불활성 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수용액 및 각종 유기 용매가 있다. 이어서, 본 발명의 텍사피린을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 형성된 약제학적 조성물을 각종 투여 형태로 용이하게 투여한다. 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 경구 또는 국소적으로 투여할 수 있으며, 국소 및 정맥내 투여가 바람직하고 정맥내 투여가 보다 더 바람직하다.

참깨유 또는 땅콩유, 수성 프로필렌 글리콜, 또는 멸균 수용액중의 텍사피린 용액을 사용할 수 있다. 이러한 수용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하고 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코즈를 사용하여 등장성이 되도록 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서의 관점에서 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있을 것이다. 국소용 크림, 유체, 용제 등이 신체의 표면 영역에 적용하기 위한 것으로 고려된다. 국소 적용은 또한 이온삼투요법에 의할 수 있다.

안티센스 적용의 경우에는, 올리고뉴클레오티드 안정성을 보존시켜 주는 부형제 및 방부제를 선택한다. 올리고뉴클레오티드 주쇄의 고도로 음전하된 포스페이트 또는 황 그룹은 상피 또는 기타 표면 세포에 자극적일 수 있다. 자극을 방지하기 위한 제형화를 위해 짝이온을 사용할 수 있다.

약제학적 형태로는 멸균 수용체 또는 현탁제, 및 멸균 주사용 용제 또는 현탁제로 즉시 사용가능한 멸균 산제가 있다. 모든 경우에 있어서, 이러한 형태는 멸균성이어야만 하고 주사기 사용이 용이한 정도로 유체 상태여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된 상태를 유지해야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면, 코팅(예: 테시틴)을 사용함으로써, 분산제의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써 또한 계면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 티메로잘 등에 의해 이루어질 수 있다. 수많은 경우에서, 등장제, 예를 들면, 만니톨, 덱스트로즈 또는 염화나트륨과 같은 당을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 보다 바람직한 등장제는 약 2 내지 8% 농도, 가장 바람직하게는 약 5% 농도의 만니톨 용액이다. 주사용 조성물의 장기간에 걸친 흡수는 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 달성할 수 있다.

멸균 용제는 당해 활성 화합물을 필요에 따라 앞서 열거된 각종 기타 성분들과 함께 적당한 용매에 필요량으로 혼입한 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조한다. 일반적으로, 분산제는 각종 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 기타 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사용 용제를 제조하기 위한 명균 산제의 경우에 있어서, 바람직한 제조방법은 활성 성분과 앞서의 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 추가의 어떠한 바람직한 성분의 산제를 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 투과 증진제 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제등을 포함한다. 약제학적 활성 성분에 대한 이러한 매질과 제제의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 비혼화성인 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에 있어서의 이의 용도가 고려된다. 보충의 활성 성분을 또한 당해 조성물에 혼입시킬 수 있다.

텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 RNA 광절단 효능에 대한 신뢰할 만한 분석법은 실시예 5에 기술한 바와 같은 상보적 리보핵산의 광절단에 대한 분석이다. 접합체에 의한 광절단은 이러한 접합체가 의도하는 효능 및 활성을 갖는다는 것을 입증해 줄 것이다.

RNA를 1μM LuB2T2로 처리하면 빛의 부재 및 존재하에서 가수분해 생성들이 수득된다[참조: PCT 공개특허공보 제WO 94/29316호]. 따라서. 이와 같은 RNA와의 반응은 광유도된 것이 아니고 본 발명의 광절단 생성물과는 상이한 생성물을 생성시킨다. 광산화적으로 손상된 생성물은 구아닌의 위치 9에서의 반응을 수반하는 것을 포함하는데, 이로써 일반적으로 탈퓨린화되고, 쇄 절단되며 각각 포스포릴화 말단을 함유하는 2개의 보다 작은 생성물이 생성된다. 한편, 가수분해로 인해, 생성된 2개의 단편 중의 한 단편상에는 유리 리보즈가 잔존하고 다른 단편에는 포스페이트 말단이 잔존하게 된다.

다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 제시된 것이다. 본 기술이 본 발명의 실시에 있어서 충분히 작용하는, 본 발명자에 의해 밝혀진 대표적 기술을 수행하는 본 실시예에 기술되어 있으므로, 이러한 기술은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당해 분야의 숙련인은 인지해야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련인은 본 명세서를 근거로 하여, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 기술된 구체적인 양태에서 유사한 결과를 또한 수득하게 해주는 많은 변화가 이루어질 수 있음을 인지할 수 있다.

실시예 1

루테튬 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 합성

본 실시예는 상보적 RNA의 부위-지시된 광절단에 유용한 루테튬 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 합성을 제공해 준다(반응식 A 참조).

4-아미노-1-[1-(에틸옥시)아세틸-2-옥시]-3-니트로벤젠 1_B(n=1). 탄산칼륨(14.0g, 101mmol) 및 4-아미노-3-니트로페놀 1_A(10.0g, 64.9mmol)를 무수 아세토니트릴 150ml에 현탁시킨다. 에틸-2-요오도아세테이트(10ml, 84.5mmol)(또는 n이 3인 경우에는 에틸 요오도부티레이트를 사용할 수 있다)를 주사기를 통해 가하고 이 현탁액을 주위 온도에서 약 21시간 동안 교반한다. 클로로포름(약 375ml)을 가하고 이를 사용하여 상기 현탁액을 별도의 깔대기에 옮긴 다음, 이를 물(2 x 약 100ml)로 세척한다. 이어서, 수 세척물을 CHCl₃(약 100ml)로 세척하고 합한 CHCl₃추출물을 물(약 100ml)로 세척한다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하고 잔사를 CHCl₃(약 500ml)에 재용해시킨 다음, 헥산(1.5L)으로 침전시킨다. 2일 동안 정치시킨 후, 침전물을 조악한 프릿트형 깔대기를 사용하여 여과하고 진공하에 건조시켜 화합물 1_B(n=1)을 14.67g(94.1%) 수득한다. TLC: R_f=0.43, CHCl₃.

4-아미노-1-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-3-니트로벤젠 1_C[(n=1). 4-아미노-1-[1-(에틸옥시)아세틸-2-옥시]-3-니트로벤젠 1_B, n=1(10.00g, 37.3mmol)을 테트라하이드로푸란(100ml)에 용해시키고 수산화나트륨(1M 수용액. 50ml)을 가하고 이 용액을 주위 온도에서 약 21시간 동안 교반한다. 테트라하이드로푸란을 회전 증발기상에서 제거하고 물(100ml)을 가한다. 용액을 CHCl₃(약 200ml)로 세척한 다음, 염산(1M 용액. 50ml)을 가함으로써 중화시킨다. 형성된 침전물을 수 분간 정치시킨 후에 여과시키고, 물로 세척하며, 진공하에 건조시켜 화합물 1_C(n=1)를 8.913g(99.5%) 수득한다. TLC: R_f=0.65, 10% 메탄올/CHCl₃.

16-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-9.24-비스(3-하이드록시프로필)-4,5-디에틸-10,23-디메틸-13,20,25,26,27-펜타아자펜타사이클로[20,2,1,1^3.6..1^8.11.0^14.19]헵타코사-3,5,8,10,12,14(19),15,17,20,22,24-운데카엔 1_E(n=1). 4-아미노-1-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-3-니트로벤젠 1_C(n=1)(1.800g, 8.49mmol)을 1L 들이 플라스크에서 메탄올(100ml)에 용해시킨다. 탄소상 팔라듐(10%, 180mg)을 가하고 플라스크 내부 대기를 주위압하에서 수소로 대체시킨다. 약 3시간 후에 회색 침전물이 형성되고 상등액이 청정해진다. 산소에 노출되지 못하게 주의하면서 메탄올을 진공하에 제거하고, 상기 화합물을 진공하에 밤새 건조시킨다. 이소프로필 알콜(500ml) 및 HCl(12M, 400μl)을 가하고 현탁액을 약 15초 동안 교반한다.

[반응식 Aa]

[반응식 Ab]

2,5-비스[(3-하이드록시프로필-5-포르밀-4-메틸피롤-2-일)메틸]-3,4-디에틸피롤 1_D(n=1)(4.084g, 8.49mmol)를 가하고 반응물을 3시간 동안 아르곤하에 실온에서 교반한다. 염산(12M, 400μL)을 다시 가하고 상기 반응물을 추가 3.5시간 동안 재교반한다. 생성된 적색 용액을 셀라이트를 통해 여과하고 여액이 무색이 될 때까지 여과 케이크를 이소프로필 알콜로 세척한다. 회전 증발기를 사용하여 용매의 용량이 약 50ml로 감소되면, 이때 용액을 신속하게 교반하고 있는 Et₂O(약 700ml)내로 침전시킨다. 여과시키고 진공하에 건조시켜 화합물 1_E(n=1)를 적색 고체(5.550g, 98.4%)로서 수득한다. TLC: R_f=0.69. 20% 메탄올/CHCl₃(획선, I₂를 함유하는 플레이트상에서 녹색이 된다).

16-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-9,24-비스(3-하이드록시프로필)-4,5-디에틸-10,23-디메틸-13,20,25,26,27-펜타아자펜타사이클로[20.2.1.1^3.6.1^8.11.0^14.19]헵타코사-1,3,5,7,9,11(27),12,14(19),15,17,20,22(25),23-트리데카엔의 루테튬 착물 1_F(M=Lu, n=1). 약 등몰량의 양성자화 형태의 매크로사이클, 16-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-9,24-비스(3-하이드록시프로필)-4,5-디에틸-10,23-디메틸-13,20,25,26,27-펜타아자펜타사이클로[20.2.1.1^3.6.1^8.11.0^14.19]헵타코사-3,5,8,10,12,14(19),15,17,20,22,24-운데카엔 하이드로클로라이드 1_E(n=1) 및 루테튬 아세테이트 펜타하이드레이트를 메탄올 중의 트리에틸아민과 합하고 공기하에서 5.5시간 동안 환류 가열한다. 이 반응물을 실온으로 냉각시키고 -20℃에서 밤새 저장한다. 용매를 회전 증발기상에서 제거하고, 아세톤을 가하고 현탁액을 회전 증발기 상에서 2시간 동안 교반한다. 현탁액을 여과하고 침전물을 진공하에 간단히 건조시켜, 용액을 메탄올(약 250ml) 및 물(25ml) 중에서 형성시킨다. HCl(1M)을 사용하여 pH를 4.0으로 조정하고 HCl-세척된 제올라이트 LZY54(약 5g)를 가하고 현탁액을 회전 증발기 상에서 약 6시간 동안 교반한다. 앰버라이트^TM(Amerlite) IRA-900 이온 교환 수지(NaF 처리됨. 약 5g)를 가하고, 현탁액을 1시간 더 교반한다. 이 현탁액을 여과하고, 수지를 메탄올(약 100ml)로 세척하고 여액을 HCl(1M)을 사용하여 pH 4.0으로 조정한다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하고 에탄올(무수)을 사용하여 미량의 물을 제거한다. 진공하에 건조시킨 후, 화합물을 메탄올(25ml)에 용해시키고 신속하게 교반하고 있는 Et₂O(300ml)내로 침전시킨다. 여과하고 진공하에 건조시킨 후에, 화합물 1_F(M=Lu, n=1)를 침전물로서 수득한다. 메탄올(25ml)에 용해된 화합물 1_F(n=1) 50mg을 아세트산-세척된 제올라이트로 처리한 다음, 아세트산-세척된 앰버라이트로 약 1시간 동안 처리함으로써 분석용 샘플을 제조한다. 메탄올을 최소 용량으로 감소시킨 후, 용액을 신속하게 교반하고 있는 Et₂O(70ml)내로 침전시키고, 여과시킨 다음, 진공하에 건조시킨다.

루테튬 텍사피린 착물 1_F(n=1)을 이용한 올리고뉴클레오티드-아민 1_G의 합성 후 변형. 16-[1-(하이드록시)아세틸-2-옥시]-9,24-비스(3-하이드록시프로필)-4,5-디에틸-10,23-디메틸-13,20,25,26,27-펜타아자펜타사이클로[20.2.1.1^3.6.1^8.11.0^14.19]헵타코사-1,3,5,7,9,11(27),12,14(19),15,17,20,22(25),23-트리데카엔의 루테튬 착물 I_F(M=Lu. n=1)(약 30μmol) 및 N-하이드록시석신이미드(43μmol)를 함께 진공하에 밤새 건조시킨다. 상기 화합물들을 트리메틸포름아미드(무수, 500μL)에 용해시키고 디사이클로헥실카보디이미드(10mg, 48μmol)를 가한다. 이로써 생성된 용액을 8시간 동안 빛을 차단시키면서 아르곤하에 교반한 다음 110μl 분취량을 1.6ml 들이 에펜도르프 튜브로 0.4M 중탄산나트륨 완충액 350μl 용적 중의 올리고데옥시뉴클레오티드 1_G(87mmol) 용액에 가한다. 단시간 진탕시킨 후, 빛을 차단하면서 상기 용액을 23시간 동안 정치시켜 둔다. 이 현탁액을 0.45μm 나일론 마이크로필터퓨즈 튜브를 통하여 여과하고 에펜도르프 튜브를 150μl 멸균수로 세척한다. 합한 여액을 2개의 에펜도르프 튜브에 나누고 글리코겐(20mg/ml, 2μl) 및 나트륨 아세테이트(3M, pH 5.4. 30μL)를 각 튜브에 가한다. 진탕시킨 후, 에탄올(무수, 1ml)을 각 튜브에 가하여 DNA를 침전시킨다. 에탄올을 원심분리시켜 제거하고 DNA를 추가의 에탄올 1ml 분취량으로 세척한 다음 공기 건조시킨다. 펠렛을 50% 포름아미드 겔 부하 완충액(20μl)에 용해시키고, 90℃에서 약 2초 동안 변성시킨 다음, 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 부하한다. 접합체 1_H(M=Lu, n=1)에 상응하는 밴드를 겔로부터 절단하고, 파쇄한 다음, 1X TBE 완충액(약 7ml)에 1 내지 2일 동안 침지시켜 둔다. 이 현탁액을 나일론 필터(0.45μm)를 통하여 여과시키고 Sep-pak^TM역상 카트릿지를 사용하여 탈염시킨다. 접합체를 40% 아세토니트릴을 사용하여 카트릿기로부터 용출시키고, 밤새 동결건조시킨 다음, 1mM HEPES 완충액(pH 7.0. 500μL)에 용해시킨다. 용액 농도를 UV/가시광선 분광법을 사용하여 측정한다.

실시예 2

아민-, 티올- 또는 하이드록시-연결된 올리고뉴클레오티드와 접합된 텍사피린 또는 텍사피린 금속 착물의 합성

아미드, 에테르 및 티오에테르는 올리고뉴클레오티드와 같은 부위-지시 분자를 텍사피린 또는 텍사피린 금속 착물에 커플링시키는데 사용될 수 있는 대표적인 연결체이다. PCT 국제공개공보 제WO 94/29316호는 이들 유형의 결합 또는 커플을 갖는 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 합성을 제공하기 위해 본원에 참조문헌으로 인용된다.

아민 작용기를 갖는 부위-지시 분자, 또는 5' 말단, 3' 말단에서, 또는 내부적으로 당 또는 염기 잔기에서 아민으로 작용화된 올리고뉴클레오티드를, 텍사피린 또는 텍사피린 금속 착물의 활성화된 카복실산 에스테르 유도체를 사용하여 합성후에 변형시킨다. FeBr₃과 같은 루이스산의 존재하에, 브롬 유도체화된 텍사피린은 올리고뉴클레오티드의 하이드록실 그룹과 반응하여 텍사피린 링커와 올리고뉴클레오티드 간에 에스테르 결합을 형성한다.

또다른 방법으로는, 하나 이상의 티오프스페이트 또는 티올 그룹을 함유하는 올리고뉴클레오티드 동족체를 텍사피린 착물의 알킬 할라이드 유도체로 황 원자에서 선택적으로 알킬화시킨다. 올리고데옥시뉴클레오티드-착물 접합체는 표적화된 RNA 포스포디에스테르 주쇄와 텍사피린간에 최적의 촉매적 상호작용을 제공하도록 고안된다.

본 발명에서는, 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상보적 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 또는 실질적으로 상보성인 서열을 함유하는 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 선택적으로 결합시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상보성인 서열은 뉴클레오티드가 상보적 뉴클레오티드와 일반적으로 염기 쌍을 형성하고 염기쌍 부정합이 거의 발생하지 않는 서열이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 아마도 상보적 핵산의 9개 이상의 뉴클레오티드를 결합하기에 충분히 클 수 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체가, 예를 들면, 안티센스 능력면에서 화학치료제로서 사용될 수 있는 것으로 예상한다.

실시예 3

올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착된 텍사피린을 갖는 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 합성

각 12개 염기를 갖는 2개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 3' 말단 포스페이트에서 알킬아민을 함유하도록 이를 합성한다(Keystone Labs, Menlo Park, California). 올리고뉴클레오티드를 사용하기에 앞서 이를 HPLC 정제시키고 LiCl을 사용하여 침전시킨다. 카복실산 작용화된 금속 텍사피린 착물[예: Lu(III) 텍사피린 착물 1_F(여기서, M은 Lu(III)이고 n은 1이다)]을 카보디이미드 및 N-하이드록시석신이미드를 반응시켜 상응하는 활성화 에스테르를 생성시키고, 이를 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드 아민의 용액에 직접 가한다. 생성된 텍사피린 금속 착물-올리고뉴클레오티드 접합체를 전기영동시켜 정제한다.

이들 3'-접합체는 본 발명의 특정 양태에서 특히 중요할 수 있는데, 이는 큰 그룹(예를 들면, 본 발명에 따른 텍사피린 착물)을 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착시키면 올리고뉴클레오티드가 세포내 엑소뉴클레아제에 대하여 내성을 띠게 되기 때문이다.

유사한 방식으로, 본 발명의 한 양태는 텍사피린에 접합된 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 특정의 리간드를 부가하는 것에 관한 것이다. 3'리간드의 기능은 상기 접합체가 세포내로 흡수되는 것을 보조하는 것이다. 이러한 리간드는 당해 분야에 공지되어 있으며 이의 예로는 콜레스테롤 및 폴리리신이 있지만 이에 제한되지는 않는다.

텍사피린 또는 텍사피린 금속 착물-올리고뉴클레오티드 접합체를 사용하여 RNA를 광절단시키는데 있어서의 본 발명의 추가의 양태는 2개의 접합체 세트를 사용하는 것인데, 이중 하나는 올리고ㅁ의 5' 말단에 접합된 텍사피린을 갖고 다른 하나는 올리고머의 3' 말단에 접합된 텍사피린을 가지며 이러한 올리고머는 하나가 다른 하나의 바로 하부에 위치한, 동일한 RNA 기질에 상보적이어서 양 텍사피린이 표적화된 광절단 부위에 가장 근접하게 위치된다. 2개의 촉매적 그룹간의 거리는 각종 길이의 올리고머-5'-접합체의 한 세트를 제조하고 RNA 주형에 대한 2개의 접합체의 자발적 결합시 발생되는 광절단 효능을 비교함으로써 측정할 수 있다.

실시예 4

텍사피린-올리고뉴클레오티드 이중 접합체의 합성

12개 염기를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 3' 말단 및 5' 말단 모두에서 알킬아민을 함유하도록 이를 합성한다(Keystone Labs, Menlo Park, California). 이러한 올리고머를 과량의 카복실산 작용화된 금속 텍사피린 착물과 반응시킨 다음, 실시예 3의 과정을 수행하여 12량체의 3' 말단 및 5' 말단 모두에 텍사피린 금속 착물을 갖는 이중 접합체를 수득한다.

동일한 올리고뉴클레오티드의 각 말단에 접합된 2개의 텍사피린의 사용은 금속 착물의 협조된 활성으로 인한 증가된 효능을 지니면서 RNA를 광절단시켜야만 한다. 이러한 양태에서, 텍사피린이 금속화된 경우에는, 텍사피린 착물 둘다가 동일한 금속, 바람직하게는 반자성 금속 양이온, 더욱 바람직하게는 루테튬(III)을 함유하는 것이 바람직하다.

추가로, 이중 접합체는 이러한 한 분자에 의해 성취될 수 있는 기능면에 있어서 다양함을 제공해준다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 결합 특이성을 제공해주고, 하나의 텍사피린 금속 착물은 영상화를 제공해 줄수 있는 반면(금속 이온으로서, 예를 들면, Gd(III)을 가짐) 다른 하나의 텍사피린 금속 착물은 RNA 광절단을 제공해준다. 이러한 이중 접합체는 한 분자가 2가지 기능, 즉 영상화와 광절단을 수행할 수 있게 해준다.

실시예 5

LuTxp-올리고뉴클레오티드 접합체에 의한 RNA의 부위-특이적 광-의존적 절단

본 실시예는 4가지의 상이한 루테튬 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체에 의한 RNA의 부위-특이적 광-의존적 절단을 제공한다. 텍사피린 올리고뉴클레오티드접합체에 의한 상응하는 DNA 기질의 광절단은 대조군 연구로서 제시되고 광절단이 RNA 및 DNA 기질의 구아닌 잔기에서 이루어진다는 것을 입증해준다.

반응식 B 및 C에 나타낸 바와 같은 루테튬 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체, 4X 완충액(5μL), 캐리어 DNA(1μL) 및 물로부터 제조한 용액에 5'-³²P-표지된 RNA 36량체 또는 DNA 36량체 기질 약 100,000cpm을 가함으로써 최종 용적이 20μl로 되는 반응 혼합물을 제조한다. 최종 접합체 농도는 50nM이다. 4X 완충액은 400mM NaCl. 200mM HEPES, pH 7.5, 100μM EDTA이다.

[반응식 B]

[반응식 C]

모든 샘플을 대상으로 하여 분말 밀도 150mW/cm²을 사용하여 732nm로 된 염색 레이저(Coherent. Palo Alto. CA)를 사용하여 주위 온도에서 15분 동안 조사한다. 조사 후에, 표준 방법을 이용하여 에탄올로 RNA 또는 DNA를 침전시킨다.

방사성 표지된 DNA를 함유하는 샘플을 10% 피페리딘 수용액(50μL)에 용해시키고 90℃에서 30분 동안 가열한다. 방사성표지된 RNA를 함유하는 샘플을 1:1:8 아닐린/아세트산/물(50μL)에 용해시키고 58℃에서 30분 동안 가열한다. 물(500μL)을 모든 샘플에 가한 다음, 스피드백(Speedvac) 상에서 건조시킨다. 모든 샘플을 50% 포름아미드 부하 완충액에 재현탁시키고 60℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시켜 분석한다. 방사선 자동 사진은 적당한 상보적 15량체 LuTx 접합체를 함유한 레인에서만 실질적인 광절단이 이루어졌음을 나타낸다. 비-상보적 올리고뉴클레오티드에 접합된 텍사피린은 기질의 광절단에 영향을 미치지 못하였다. 반응식 B 및 C에서, 화살표는 관찰된 광절단 부위를 지시한다. Lu-Tx-매개된 광절단 밴드는 대조군으로서 수행된 구아닌-특이적 서열화에서 디메틸설페이트에 의해 발생된 밴드와 함께 이동한다. 광절단 강도는 LuTx 착물의 예상된 위치에 근접한 부위에서 보다 크다. 이러한 관찰은 LuTx 접합체가 이들의 RNA 또는 DNA의 상보적 서열과 하이브리드화함으로써 구아닌 잔기에서 부위-특이적 광변형을 유발시키고 염기성 조건하에서의 정밀검사시 부위-특이적 광절단을 야기시키는 특정 모델의 시험 결과와 일치한다.

2'-O-메틸 RNA 올리고규클레오티드 접합체와 2'-O-메틸 DNA 올리고뉴클레오티드 접합체를 비교하는데 있어서, 겔 상의 보다 낮은 위치에서 보다 큰 정도의 광 절단이 이루어지는 것으로 밝혀졌는데, 이는 안티센스 접합체와 표적간에 형성된 이중체의 대부분의 홈을 따라 그리고 이를 가로지르는 부위에서의 광변형에 상응한다. 이와 같은 광절단 패턴의 차이는 명백하게 2'-O-메틸 RNA-유도된 이중체와 DNA-유도된 이중체 간의 구조적 차이에 관한 것이며, 이때 2'-O-메틸 RNA 접합체가 전반적으로 보다 큰 광절단 효능을 유발시킨다.

DNA 기질에 대한 광절단 효능은 70 내지 90%의 범위이다. RNA 기질의 광절단 패턴은 이들의 DNA 동족체의 광절단 패턴과 유사하긴 하지만, 후자의 경우가 수율이 더 낮다. 이는 또한, 보다 약한 아닐린 처리에 의해 광유도된 병변에 대한 효능있는 노출이 덜하다는 것을 반영해 주고 있다(RNA는 알칼리성 조건하에서 보다 더 불안정하기 때문에 피페리딘 처리하지 않았다). 서열 4의 기질과 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체 표지된 서열 2는 상보적 접합체를 함유하는 다른 레인과 비교하여 비교적 광절단이 거의 이루어지지 않고 있음을 보여준다. 이는 이러한 RNA 서열에 대한 DNA-LuTx 접합체의 보다 불량한 결합을 지시할 수 있으며 본원에 사용된 바와 같은 2'-O-메틸 RNA 접합체의 우수성을 추가로 입증해 준다.

본 발명자들이 DNA 중합체에 대한 광절단 활성을 지닌 텍사피린을 인지하고 있다 할지라도(WO 96/09315), RNA가 또한 광절단될 것이라는 것은 명확하지 않았다. 2' 부위는 RNA내의 하이드록실 그룹에 의해 보호되고, 중합체의 형태가 DNA와는 상이하며 구아닌의 C9 위치로부터의 전자 효과가 DNA에서와 상이하다. 본 실시예에서 입증된 이와 같은 광절단이 올리고뉴클레오티드에 접합된 텍사피린을 사용하여 이루어진다 할지라도, 본 발명자들은 접합되지 않은 텍사피린도 역시 광절단에 효과적일 수 있는 것으로 예상하지만, 이는 본원에서 사용된 것보다 고농도로 사용된다.

실시예 6

진핵 세포 내에서의 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체의 형광성 국재화

본 발명자들은 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체가 형광성 국재화에 의해 관찰된 바와 같이 진핵 세포에 의해 흡수된다는 것을 입증하였다.

HL-60 세포(사람 전골수구성 백혈병 세포주)를 Y(III) 금속 이온 또는 Lu(III) 금속 이온으로 착화된 텍사피린-올리고뉴클레오티드 접합체(여기서, 올리고뉴클레오티드는 15개 염기를 갖는 포스포로티오에이트이다)의 용액과 함께 배양한다. 상기 세포를 최소 10분 내지 약 60분까지 배양한 후에, 세포를 세척한다. 488nm에서 여기되는 공촛점 아르곤 레이저를 사용하여 형광성을 측정한다. 텍사피린에 의해 발생된 형광성을 관찰하기 위하여, 컷-오프 필터를 사용하여 700nm 아래의 파장을 제거한다. 생성된 형광 영상은 집중된 형광성의 국부적 "핫 스폿(hot spot)"의 몇몇 증거와 함께 확산 세포질성 형광성을 나타낸다.

본원에서 기술되고 청구된 모든 조성물 및 방법들은 본 명세서의 측면에서 과도한 실험을 수행하지 않고서도 제조하고 실시할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태로 기술되긴 하였지만, 당해 분야의 숙련인에게는 각종 변형이 본 발명의 개념, 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 본원에서 기술된 조성물, 방법, 및 방법의 단계 또는 단계 순서에 적용할 수 있음이 명백할 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 화학적이고도 물리적으로 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성시키면서도 본원에서 기술된 제제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련인에게 명백한 이와 같은 유사한 치환 및 변형 모두는 첨부된 청구의 범위로 한정된 바와 같은 본 발명의 요지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

다음 문헌은 본원에 예증된 이유로 인해 이의 적절한 부분이 참조문헌으로 인용된다.

Claims (10)

1. 리보핵산 중합체를 광감작성 텍사피린과 접촉시키는 단계 및

   상기 중합체가 광절단되기에 충분한 시간 동안 광감작성 텍사피린을 빛에 노출시키는 단계를 포함하는, 인간의 질병을 치료 및 진단하는 방법으로 제외한 리보핵산 중합체의 광 유도된 광절단 방법.
2. 제1항에 있어서, 광감작성 텍사피린이 화학식 I 또는 II의 구조를 갖는 방법.

   화학식 I

   

   화학식 II

   

   상기식에서,

   M은 H 또는 반자성 금속 양이온이고,

   R₁내지 R₄, R₇및 R₈은 독립적으로 수소, 할라이드, 하이드록실, C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, C₂-C₁₀-알키닐, 1 내지 3환-아릴, 할로-C₁-C₁₀-알킬, 니트로, 포르밀, 아실, 하이드록시-C₁-C₁₀-알킬, O(CH₂CH₂O)_xCH₃(x=1∼120)의 알콕시, 하이드록시알콕시, 하이드록시-C₂-C₁₀-알케닐, 하이드록시-C₂-C₁₀-알키닐, 사카라이드, 카복시, 카복시-C₁-C₁₀-알킬, 카복시아미드, 카복시아미드-C₁-C₁₀-알킬, 아미노, 아미노-C₁-C₁₀-알킬, 부위-지시 분자, 촉매 그룹, 또는 부위-지시 분자 또는 촉매 그룹에 커플링되는 커플이며,

   R₆및 R₉는 독립적으로 R₁내지 R₄, R₇및 R₈그룹으로부터 선택되는데, 단 할라이드는 요오드가 아니며 할로-C₁-C₁₀-알킬은 요오도-C₁-C₁₀-알킬이 아니고,

   R₅및 R₁₀내지 R₁₂는 독립적으로 수소, C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, C₂-C₁₀-알키닐, C₆-C₂₀-아릴, 하이드록시-C₁-C₁₀-알킬, O(CH₂CH₂O)_xCH₃(x=1∼10)의 알콕시, 하이드록시알콕시, 하이드록시-C₂-C₁₀-알케닐, 하이드록시-C₂-C₁₀-알키닐, 카복시-C₁-C₁₀-알킬, 카복시아미드, 카복시아미드-C₁-C₁₀-알킬, 아미노, 아미노-C₁-C₁₀-알킬, 또는 사카라이드, 부위-지시 분자 또는 촉매 그룹에 커플링되는 커플이며,

   R₁₃은 C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, O(CH₂CH₂O)_xCH₃(x=1∼10)의 옥시알킬, 또는 탄소수가 약 3 이하이고 제1 탄소 결합 주위에 회전 가요성을 지닌 하이드록시알킬이고,

   n은 5 이하의 정수이다.
3. 제2항에 있어서, 부위-지시 분자가 올리고뉴클레오티드, 항체, 호르몬, 생물학적 수용체에 대한 친화성을 지닌 펩티드, 또는 사피린 분자인 방법.
4. 제2항에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₇및 R₈중의 하나 이상이 부위-지시 분자, 또는 부위-지시 분자에 커플링되는 커플인 방법.
5. 제2항에 있어서, R₁이 (CH₂)₂CH₂OH이고 R₂및 R₃이 CH₂CH₃이며 R₄가 CH₃이고 R₇이 O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃, H 또는 OCH₃이며 R₈인 부위-지시 분자에 커플링되는 커플인 방법.
6. 제2항에 있어서, R₁이 (CH₂)₂CH₂OH이고 R₂및 R₃이 CH₂CH₃이며 R₄가 CH₃이고 R₇및 R₈이 O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃인 방법.
7. 제2항에 있어서, R₁내지 R₄, R₇및 R₈이 표 1에서 텍사피린 A1 내지 A22에 대해 나타낸 바와 같은 방법.
8. 제2항에 있어서, M이 Lu(III), La(III), In(III), Y(III), Zn(II) 및 Cd(II)로 이루어진 그룹에서 선택된 반자성 금속 양이온인 방법.
9. 제1항에 있어서, 빛의 파장 범위가 약 700 내지 800nm인 방법.
10. 제1항에 있어서, 리보핵산 중합체가 치료 대상으로 표적화된 세포의 메신저 리보핵산이고 광감작성 텍사피린이 당해 메신저 리보핵산과 서열 상보적인 올리고뉴클레오티드에 접합되는 방법.