KR100341798B1

KR100341798B1 - 방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법

Info

Publication number: KR100341798B1
Application number: KR1019990032025A
Authority: KR
Inventors: 김정봉; 김종범; 조강진; 황영수; 박노동
Original assignee: 대한민국 (관리청:특허청장, 승계청:농촌진흥청장)
Priority date: 1999-08-04
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2002-06-26
Also published as: KR20010016848A

Abstract

본 발명은 방아잎(Agastache rugosa, giant hyssop)을 음건 또는 동결건조시키고 분쇄한 분말로부터 추출액을 수득하여 이를 여과시키고, 흡착 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 실시하는 공정을 포함하는 로즈마린산을 분리하는 방법에관한 것이다. 본 발명의 로즈마린산 분리방법은 방아잎을 건조시키고 분쇄하는 공정; 분쇄된 방아잎 중량에 대하여 2배 내지 6배의 물을 가하고 추출하여, 방아잎 추출액을 수득하는 공정; 추출액을 여과하고 흡착 크로마토그래피를 실시한 다음, 활성분획을 농축시켜 로즈마린산 농축액을 수득하는 공정; 및, 전기 농축액으로 겔 크로마토그래피를 실시하고, 로즈마린산을 함유한 분획을 건조시켜 고순도의 로즈마린산을 분리하는 공정을 포함한다. 본 발명에 의하면, 로즈마린산의 손실을 효과적으로 줄이면서, 간단한 공정에 의하여 고순도 로즈마린산을 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명이 로즈마린산을 유효성분으로 하는 항산화물질을 개발하는데 효과적으로 기여할 수 있는 바, 로즈마린산을 식품이나 의약품의 첨가물로 이용하는 등 로즈마린산의 산업적 활용도를 높일 수 있다.

Description

방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법{Method for Isolating of Rosmarinic Acid from Agastache rugosa}

본 발명은 방아잎(Agastache rugosa, giant hyssop)으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 방아잎을 음건 또는 동결건조시키고 분쇄한 분말로부터 추출액을 수득하여 이를 여과시키고, 흡착 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 실시하는 공정을 포함하는 로즈마린산을 분리하는 방법에 관한 것이다.

방아잎은 방앗잎, 방아, 배초향 또는 중개풀과 같은 명칭들로 불리는 식물로서 우리나라 야산에서 자생하며, 약간의 큐틴질의 잎을 지닌 방아풀(Isodon japonicusBurm. Hara)과는 구별된다. 방아잎은 꿀풀과의 다년초로서, 3월 하순에파종하여 6월 중순부터 꽃이 피기 시작하여, 8월 중순에 만개하며, 키가 1.5m 내외로 들깨와 비슷한 모양을 하고 있다. 주요산지는 일본, 만주, 중국, 시베리아, 타이완 그리고 우리나라의 전지역으로 기록되어 있는데, 실제로는 전라도 동남부에서부터 부산, 그리고 경남북 일대에 이르는 지역의 논과 밭가에서 주로 자생한다.

지금까지 방아잎은 독특한 향 때문에 주로 전이나 된장국, 영양탕 등의 조리에 첨가되거나 생선찌개의 비린내를 없애주는 등, 식료품의 좋은 향료로서 이용되어 왔다. 또한, 방아잎에 포함된 유효성분 중의 로즈마린산(rosmarinic acid)은 식용유지 또는 식품에 포함된 지방질 성분의 산화를 방지하는 강력한 항산화활성을 가진 물질로 알려져 있으며, 그 외에도 의약적으로 함염증 효과 또는 보체의 활성화 등 면역반응에도 관여하는 것으로 보고되어 왔다.

지금까지 주로 사용되고 있는 로즈마린산의 분리방법은 일리시터(elicitor)와 같은 조직배양기법을 통해서 로즈마린산을 분리하는 방법으로서, 대량생산의 이점은 있으나(참조: Sumaryono et al., Biotechnology in Agriculture and Forestry, 24:287-298(1993)), 분리단계가 복잡하고, 분리된 로즈마린산의 순도가 낮으며, 또한 본래의 항산화활성이 감소되는 단점을 내포하고 있었다. 이에 따라, 로즈마린산의 항산화활성을 상실하지 않으면서, 보다 간단한 공정을 이용해서 고순도로 로즈마린산을 분리할 수 있는, 경제적이면서 산업적인 로즈마린산의 분리방법을 개발하려는 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 간단한 공정에 의하여 고순도의 로즈마린산을 분리할 수 있는 기술을 확립하고자 예의 노력한 결과, 방아잎을 음건 또는 동결건조시키고 분쇄한 분말로부터 환류냉각방식으로 추출액을 수득하고, 추출액을 여과시킨 다음, 이를 흡착 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하였을 때, 95% 이상의 순도를 나타내는 로즈마린산을 수득할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 방아잎으로부터 고순도의 로즈마린산을 간단한 공정으로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 방아잎으로부터 분리한 로즈마린산을 HPLC를 이용하여 분석한 그림이다.

본 발명의 로즈마린산 분리방법은 방아잎을 건조시키고 분쇄하는 공정; 분쇄된 방아잎 중량에 대하여 2배 내지 6배의 물을 가하고 추출하여, 방아잎 추출액을 수득하는 공정; 추출액을 여과하고 흡착 크로마토그래피를 실시한 다음, 활성분획을 모으고 농축시켜 로즈마린산 농축액을 수득하는 공정; 및, 전기 농축액으로 겔 크로마토그래피를 실시하고, 로즈마린산 함유 분획을 건조시켜 고순도의 로즈마린산을 분리하는 공정을 포함한다.

이하, 본 발명의 방아잎으로부터 로즈마린산의 분리방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 방아잎의 건조 및 분쇄공정

방아잎을 건조시키고 분쇄한다. 이때, 방아잎의 건조는 음지건조 또는 동결건조가 로즈마린산의 손실을 줄일 수 있는 방법이며, 방아잎은 2개월 이상 재배된 식물체를 선택하여 꽃을 포함한 지상부의 전부위를 건조시킬 수 있다. 건조는 건조 후 수분 함량이 6wt% 이하로 되도록 하며, 바람직하게는 5wt% 이하로 되도록 한다. 분쇄는 통상적으로 당업계에서 사용되는 분쇄기를 사용할 수 있으나, 방아잎에 포함되어 있는 로즈마린산을 신속하고 효과적으로 분리하기 위해서는 분쇄효과가 뛰어난 핀밀(pin mill) 또는 볼밀(ball mill) 분쇄기를 사용하여 20 내지 120매쉬의 분말이 되게 한다.

제 2공정: 방아잎 추출액의 수득공정

분쇄된 방아잎 중량에 대하여 2배 내지 6배의 물을 가하고 추출하여, 방아잎 추출액을 수득한다. 이때, 증류수의 pH는 2.5 내지 4.5로 조절된 산성의 물을 사용하는데, 이는 추출시 로즈마린산의 손실을 줄이기 위한 것이다. 다음으로 이를 추출하는데, 추출은 환류냉각추출, 가열추출 또는 초음파추출 등의 통상적인 추출방법에 의하여 추출액이 모두 얻어질 때까지 수행함으로써 방아잎 추출액을 수득한다. 추출은 1회에 걸쳐 하여도 되지만, 방아잎에 포함된 로즈마린산을 최대한 효과적으로 모으기 위하여는 반복추출을 할 수도 있는 바, 수득된 방아잎 추출액은 별도로 여과(Whatman paper No.4, U.S.A.)시켜 저장하고, 여과하고 남겨진 잔사를 같은 방법으로 반복추출하여 여액을 수득한다.

제 3공정: 로즈마린산 농축액의 수득공정

추출액을 여과하고 흡착 크로마토그래피를 실시한 다음, 활성분획을 모으고 농축시켜 농축액을 수득한다: 이때, 흡착크로마토그래피는 앰버라이트(Amberlite, Supelco Inc., U.S.A.) XAD-2, XAD-4 또는 XAD-7 수지로 충진시킨 컬럼에 제 2공정에서 수득한 추출액을 주입시킨 다음, pH 2.5내지 4.5의 증류수로 세척하여 불순물을 제거시킨다. 흡착된 로즈마린산은 20 내지 100%의 메탄올 또는 에탄올을 이동상으로 하여 용출시키며, 이를 모아서 회전농축기(Heidolph VV2011, Germany)또는 통상적으로 사용하는 동결건조기로 농축시킨다.

제 4공정: 고순도의 로즈마린산의 분리공정

전기 농축액으로 겔 크로마토그래피를 실시하고, 로즈마린산 함유 분획을 수득해서 건조시켜 고순도의 분말형태의 로즈마린산을 수득한다. 이때, 제 4공정에서 수득한 농축액은, 다시 한번 세파덱스(Sephadex, Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) LH-20 또는 LH-60으로 충진시킨 컬럼을 사용하여 고순도로 정제될 수 있다. 전개용매로는, 통상적으로 당업계에서 사용되는 아세토니트릴, 아세트산 등의 극성용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 아세토나이트릴과 2%의 아세트산을 22:78의 비율(v/v)로 혼합한 것을 사용하며, 50 내지 90%의 메탄올을 이동상으로 하여 1㎖/min의 유속으로 용출시켜서 분획을 수득한다. 수득된 분획을 역상 C₁₈분석용 컬럼(Partisil 10 ODS, U.S.A., 25㎝)을 장착시킨 HPLC(Shimadzu, Japan)로 분석하여 320nm 파장에서 활성을 나타내는 분획을 찾고, 이를 농축 및 건조시킴으로써 고순도의 로즈마린산을 정제할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 방아잎의 건조 및 분쇄

노지에서 2개월 이상 재배된 방아잎의 꽃을 포함한 지상부 전부위를 채집하여 액체질소에서 15분 동안 급속냉동시킨 다음, 12시간 동안 동결건조시켰다. 건조시킨 시료는 볼분쇄기로 분쇄시켜 분말을 수득하고, 이를 50매쉬의 체를 사용하여 분리하였을 때 통과된 분말을 사용하였다.

실시예 2: 방아잎 추출액의 수득

건조된 방아잎 분말 1kg과 증류수 3ℓ를 플라스크에 넣고, 환류냉각방식으로 추출하여 방아잎 추출액을 수득하였다. 이때, 증류수의 pH는 3.0으로 조절하였으며, 12시간 동안 환류냉각하였다.

실시예 3: 로즈마린산 농축액의 수득

전기 추출액을 여과지(Whatman paper No.4, U.S.A.)에 여과시킨 다음, 흡착제(Amberlite XAD-2)로 충진한 유리컬럼(9.7㎝×90㎝)에 추출액을 100㎖/min의 유속으로 흘려보내서 컬럼내 흡착제에 흡착시키고, 40ℓ의 증류수(pH 3.0)로 세척하여 불순물을 제거하였다. 이때, 흡착된 로즈마린산을 40% 메틸알콜을 이동상으로 하여 용출시키고, 수득된 15ℓ의 로즈마린산이 포함된 용출액을 회전농축기로 농축시켰다.

실시예 4: 고순도의 로즈마린산의 분리

전기 농축액 10㎖을 Sephadex LH-20 개방컬럼(95cm × 5cm)에 주입한 후 70% 메탄올을 이동상으로 하여 용출시켜서 8㎖씩 200개의 분획을 수득한 다음, 320nm 파장에서 활성을 나타내는 분획을 찾고, 이를 농축 및 건조시킴으로써 고순도의 로즈마린산을 수득하였다. 수득된 분획은 HPLC(Shimadzu, Japan)로 분석되었는데, 컬럼은 역상 C₁₈(Partisil 10 ODS, U.S.A., 25㎝) 분석용 컬럼을 사용하였고, 전개용매로는 아세토나이트릴과 2%의 아세트산을 22:78의 비로 혼합한 것을 사용하였으며, 1㎖/min의 유속으로 전개하여, 320nm 파장에서 활성을 보이는 분획을 수득하였다(참조: 도 1). 도 1에서 보듯이, 수득된 로즈마린산 분획의 HPLC 크로마토그램상에서 로즈마린산을 제외한 다른 불순물의 피크는 확인되지 않았으며, 이로부터 본 발명의 분리방법에 의하여 최소한 95wt% 이상의 고순도 로즈마린산을 수득할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 방아잎에서 추출한 로즈마린산의 항산화활성 검정

방아잎에서 분리정제한 로즈마린산의 항산화활성을 검정하기 위하여, 표준 항산화물질인 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytolune, 이하 `BHT`라 함)과 α-토코페롤(tocopherol)을 기준으로 항산화활성 검정을 하였다: 먼저, 자유라디칼을 기질로 이용하여 항산화력 검정을 하였는 바, BHT, α-토코페롤 및 정제된 로즈마린산 5, 19, 20 및 40㎍/㎖과, 자유라디칼인 DPPH를 에탄올에 녹인 DPPH 용액 80㎍/㎖을 반응시킨 다음, 자유라디칼을 50% 감소시키는 데 필요한 각 항산화제의 농도(scavenging concentration, SC₅₀)를 측정하였다(참조: 표 1). 이때, 자유라디칼의 농도는 517nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 간접적으로 알 수 있었다. 또한, 기질로서 돈지, 팜유 및 들기름을 사용하여, 각각의 유지2.5g에 BHT, α-토코페롤 및 정제된 로즈마린산을 각각 0.005%(w/w)가 되게 첨가한 다음, 110℃를 유지하면서 기질의 산화를 유도하였다. 이때의 전기전도율을 Ranciman(Metrohm Herisau, Switzerland)으로 측정해서, 각 시료의 산화유도기간을 항산화제를 첨가하지 않은 대조시료의 산화유도기간으로 나눈 값을 항산화활성의 정도로 나타내었다(참조: 표 2).

표 1 및 표 2에서 보듯이, 정제된 로즈마린산은 다른 항산화제인 BHT 및 α-토코페롤과 비교하였을 때, 항산화활성이 월등히 뛰어남을 알 수 있었다. 결과적으로, 전기의 방법에 의해서 방아잎으로부터 분리된 로즈마린산이 높은 항산화활성을 나타내는 것을 확인하였다.

표준 항산화물질과 정제된 로즈마린산의 항산화활성 비교

시 료	항산화활성(SC₅₀*, ㎍/㎖)
BHT	89
α-토코페롤	49
로즈마린산	7.7

* : 프리라디칼을 50% 감소시키는 항산화제의 농도

표준 항산화물질과 로즈마린산의 항산화력 비교

시료	시료의 산화유도기간/대조시료의 산화유도기간
시료	돈지	팜유	들기름
BHT	1.35	1.39	0.93
α-토코페롤	1.35	1.63	0.80
정제된 로즈마린산	2.21	2.17	0.86

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 방아잎으로부터 고순도의 로즈마린산을 높은 항산화활성을 유지하면서, 간단한 공정으로 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 로즈마린산의 손실을 효과적으로 줄이면서, 간단한 공정에 의하여 95wt% 이상의 고순도 로즈마린산을 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명이 로즈마린산을 유효성분으로 하는 항산화물질을 개발하는데 효과적으로 기여할 수 있는 바, 로즈마린산을 식품이나 의약품의 첨가물로 이용하는 등 로즈마린산의 산업적 활용도를 높일 수 있다.

Claims

(ⅰ) 방아잎을 수분함량이 6wt% 이하가 되도록 건조시키고 분쇄하는 공정;

(ⅱ) 전기 분쇄된 방아잎에 방아잎 중량에 대하여 2배 내지 6배의 pH가 2.5 내지 4.5인 물을 가하고 추출하여, 방아잎 추출액을 수득하는 공정;

(ⅲ) 전기 추출액을 여과하고, 앰버라이트 XAD-2, XAD-4 또는 XAD-7 수지로 충진시킨 컬럼을 이용하여 흡착 크로마토그래피를 실시한 다음, 활성분획을 모으고 농축시켜 로즈마린산 농축액을 수득하는 공정; 및,

(ⅳ) 전기 농축액으로 세파덱스 LH-20 또는 LH-60으로 충진시킨 컬럼을 이용하여 겔 크로마토그래피를 실시한 다음, 로즈마린산 함유 분획을 건조시켜 로즈마린산을 분리하는 공정을 포함하는

방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법.
제 1항에 있어서,

음지건조 또는 동결건조시키는 것을 특징으로 하는

방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법.
제 1항에 있어서,

분쇄는 핀밀 또는 볼밀 분쇄기를 이용하여 20매쉬 내지 120매쉬의 분말이

되도록 수행하는 것을 특징으로 하는

방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서,

추출은 가열추출, 초음파추출 또는 환류냉각추출인 것을 특징으로 하는

방아잎으로부터 로즈마린산을 분리하는 방법.
삭제
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