KR100339151B1

KR100339151B1 - 인간근세포성장인자

Info

Publication number: KR100339151B1
Application number: KR1019940001145A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 김천형
Original assignee: 주식회사 엘지씨아이
Priority date: 1994-01-22
Filing date: 1994-01-22
Publication date: 2002-11-23
Also published as: KR950023718A

Abstract

본 발명은 인간 근세포 성장인자의 유전자, 그 유전자를 포함하는 플라스미 드 및 그 플라스미드로 형질전환된 형질전환체에 관한 것으로, 본 발명의 형질전 환체를 배양하여 얻어진 인간 근세포 성장인자는 조혈작용의 장애로 인한 빈혈, 백 혈병 등의 치료와 골수 이식 등에 사용될 수 있다.

Description

인간 근세포 성장인자

본 발명은 인간 근세포 성장인자의 유전자, 그 유전자를 포함하는 플라스미 드 및 그 플라스미드로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

조혈 작용(hematopoesis)은 여러가지 혈구세포 즉, 적혈구(red blood cells), 백혈구(white blood cells) 그리고 혈소판(clotformingcells) 등이 만들어지는 복잡한 과정을 가지게 되는데 이 과정의 첫 단계가 근세포(stem cell)로부터 여러가지 전구세포(progenitor cells)들이 생성되며 이 전구 세포들은 일련의 군체 자극인자(colony stimulating factors)들에 의해 자극을 받아 여러가지 혈구세포들이 만들어지게 된다.

지금까지 알려진 군체자극 인자로는 G-CSF(Nicola et al., J. Biol. Chem.258, 9017-9O21(1983)), M-CSF(Standley et al., J. Biol. Chem.242, 4045-4052 (1977)), GM-CSF(Burgess et al., J. Biol. Chem.252, 1991-2033(1977)), 멀티-CSF(IL-3; Burgess et al., Bichem J.185, 341-343(198O)), CSF-1(Kawasaki et al., Science230, 291(1985)), 그리고 EPO(Jacobs et al., Nature313, 806-810(1985)) 등이 있다.

이러한 군체 자극인자들은 골수(bone marrow)에서 전구세포들의 증식에 관여 하며(Hodgson et at., Exp. Hematol.10, 26-35(1982); VanZant, J. Exp. Med., 159-679-690(1984); Zsebo et al., Blood71, 962-968(1988)) 빈혈(anemia) 및 골수성 백혈병(myeloid Leukemia) 치료에 이용될 수 있는 것으로 알려졌다(Eschback et al., N. Engl. J. Med.316, 73-78(1987)); Zsebo et al. Cell63, 195-201(1990)).

190년에 암젠(Amgen)사의 제보(Zsebo) 등은 버팔로 랫트 간세포(Buffalo rat liver cell: BRL-3A)에서 근세포의 증식에 관여하는 단백질을 분리하고 이 단백질의 생화학적, 생물학적 특성을 밝혔으며 이를 근세포 성장인자(stem cell factor; SCF)라 명명하였다(Zsebo et al., Cell63, 195-2O1(1990); EP 0423980A1). 이들은 쥐에 5-플루오로 우라실(5-fluorouracil; 5-FU)을 처리하였을 때 조혈전구세포 (hematopoetic progenitors)들의 증식은 현저히 감소되나 근세포의 증식은 서서히 지속된다는 보고(Hodgson et al., Nature281, 381-382(1979); Lerner et al.,Exp. Hematol.18, 114-118(1990))에 착안하여 근세포 성장을 촉진시킬 수 있는 쥐 로부터 약 28,000-35,000의 분자량을 갖는 당단백질을 분리하는데 성공하였다 (Zsebo et al., Cell63, 195-201(1990); EP 0423980Al). 근세포 성장인자는 쥐에 존재하는 스틸 유전자 위치(Steel locus; S/locus)에서 만들어지는 것이 확인되었고(Zsebo et al., Cell63, 213(199O); Copeland et al., Cell63, 225(1990); Huang et at., cell63, 225(199O)) 화이트 스폿팅 유전자 위치(white spotting locus; W locus)에서 만들어지는 c-kit 티로신 키나제 수용체(tyrosine kinase receptor)의 리간드(ligand) 역할을 하고 있음이 밝혀졌다(Huang et al., Cell63, 225(199O)). S1 및 W 유전자 위치에서 돌연변이가 유도된 쥐에서는 조혈작용 (hematopoesis)이 억제될 뿐 아니라 배우체생성작용(gametogenesis)과 색소생성작용(pigmentation) 또한 억제되는 것으로 보고되었다(McCulloch et al., Soience144, 844-846(1964); McCullorch et al., Blood26, 399-41O(1965); Russell et al., Adv. Genet20, 357-459(1979)).

이후 마틴(Martin) 등은 버팔로 랫트 간세포(BRL-3A)에서 정제된 근세포 성장인자로부터 얻어진 아미노산 염기서열을 탐침(probe)으로 이용하여 쥐 근세포 성 장인자를 코딩하는 전체 염기서열을 밝힌 후 164 개의 아미노산을 코딩하는 쥐 근세포 성장인자 유전자를 대장균에서, 그리고 162 개의 아미노산을 코딩하는 쥐 근세 포 성장인자 유전자를 포유동물세포인 COS-1 세포에서 발현시키고 발현된 단백질 의 활성을 측정한 결과 쥐로부터 얻은 천연 근세포 성장인자와 같은 활성을 나타내 었음을 보고하였다. 또한 이들은 쥐 근세포 성장인자의 염기서열을 탐침으로인간표피육종세포(human fibrosarcoma cell)에서 근세포 성장인자를 암호화하는 염기 서열이 있음을 확인하고 이 유전자를 분리 동정한 결과 쥐의 근세포 성장 인자와 약 70%의 아미노산 유사성이 있음을 확인하였다(Martin et al., Cell63, 203-211(197O)).

한편, 랑리(Langley) 등은 164 개의 아미노산을 코딩하는 사람 근세포 성장인자와 쥐 근세포 성장인자 유전자를 대장균에서 발현시키고 162 개의 아미노산을 코딩하는 사람 근세포 성장인자와 쥐 근세포 성장 인자 유전자를 포유동물세포인 CHO(chinese hamster overy)세포에서 발현시킨 뒤 대장균 유래의 비당화된 근세포 성장인자와 CHO 세포 유래의 당화된 근세포 성장인자의 활성을 비교한 결과 이 들 모두 천연 근세포 성장인자와 비슷한 활성을 나타냄을 보여 주었다(Langley et al., Arch. Biochem. Biophys.15, 21-28); EP 0423980A1). 또한 이들은 사람 혈 청내에 근세포 성장인자가 있을 것으로 추정하고 효소면역측정 방법(enzyme-linked immunosorbent assay)으로 분석한 결과 약 3.3 ng/㎖의 농도로 근세포 성장인자가 혈청에 존재하는 것을 확인하였고 이를 면역친화 크로마토그래피를 이용하여 부분 정제한 뒤 특성을 조사한 결과 수용성이며 165 개 아미노산을 가지고 있고 N-및 0-당화가 되어 있는 당단백질인 것으로 보고되었다(Langley et al., Blood81, 656-660(1993)).

그러나 상기의 방법으로 생산된 대장균 유래의 164 개 아미노산을 갖는 근세 포 성장인자나 포유동물 세포 유래의 162 개 아미노산을 갖는 근세포 성장인자의 경우(Langley et al., Arch. Biochem. Biophys.15, 21-28(1992); EP 0423980A1)사람의 혈청내에 존재하는 165 개 아미노산으로 구성된 천연 근세포 성장인 자(Langley al., Blood81, 656-660)(1993))와는 아미노산에 차이가 있기 때문에 활성면에 있어 차이가 있을 것으로 추정된다.

한편 유비퀴틴은 1975 년에 발견된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서 진핵세 포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되었 다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.72, 11(1975)). 지금까지 동물세 포로부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci., 10,343(1985)). 효모의 유비퀴틴보다 시스템에서 76 개의 아마노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴보다 세 포내에서 절단공정이 매우 빠르며 알지닌-글리신-글리신 다음에 아주 효율적으로 절단되는 것으로 알려져 있다(Oxkahnak., et al., Nature,312, 663-666(1987)). 또한 세포내에서 존재하는 효소가 유비퀴틴에 결합된 외래유전자를 알지닌-글리 신-글리신 다음에 아주 정확하게 절단한다고 하였다(Bachmair, et al., Science,234, 179-186(1986)). 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비 퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세 포내에서 단백질 분해 효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴 이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다. 최근에 효모에서 UBP 1이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비귀틴 융합단백질로부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질만을 얻을 수 있게 되었다(Tobias, J.W. et.at., J. Biological Chemistry266, 12021-12028(1991)). 따라서, 본 발명의 한 예로서 본 발명의 유전자를 유비퀴틴을 포함하는 플라스미드와 연결함으로써 발현 및 정제효율을 높일 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 사람의 혈청 내에 존재하는 165 개 아미노산으로 구성된 천연 근세포 성장인자와 같은 아미노산 크기를 갖는 근세포 성장인자를 암호화하는 유전자와, 그 유전자를 포함하는 플라스미드 및 그 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 근세포 성장인자는 제 1 도에 도시한 바와 같은 아미노산 서 열을 가지며 단백질의 활성 및 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산으로 치환된 아미노산 서열도 포함한다.

본 발명의 근세포 성장인자를 코딩하는 DNA는 공지 방법에 따라 cDNA 라이브러리로부터 근세포 성장인자의 cDNA를 분리한 후 이를 이용하여 대장균선호 코돈을 갖도록 서열을 변형시키거나 화학적 방법으로 전체 서열을 합성할 수 있으며, 양 방법을 병용할 수도 있다. 화학적 합성방법은 마테우치(Matteucci) 등의 포스포아미다이트(phosphoamidite) 고체 지지방법(J. Am. Chem. Soc.103, 3185(1981))등 알려진 여러 방법들 중 어느 것을 사용해서도 할 수 있다. 또한 알려진 인간 섬유신경세포 성장인자의 cDNA 서열을 이용하여 여러가지 중복되는 프라이머를 합성한후 PCR로 전체 서열을 가진 DNA를 얻을 수도 있다.

일반적으로 코돈의 축퇴(degeneracy)로 인하여 하나의 아미노산에 해당하는 코돈이 다수 존재하므로 대장균/효모 선호 코돈을 유지하는 범위내에서 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열은 부분적으로 약간씩 다를 수 있다. 유비퀴틴 유전자는 기존에 클로닝된 것 또는 화학적 합성 방법으로 합성된 것등을 사용할 수 있다. 유비퀴틴 유전자와 근세포 성장인자 유전자의 연결 방법은 제한효소, 리가제, PCR, DNA 합성 등 여러 공지된 방법을 선택 조합하여 사용할 수 있다.

먼저 근세포 성장인자에 대한 165 개의 아미노산 서열(Martin et al., Cell 63, 203-211(1990))로 부터 효모 및 대장균에서 발현이 많이되는 아미노산을 코딩 하는 핵산 염기서열로 바꾼 후 전사(transcription) 되었을 때 생성될 수 있는 안정한 2차 구조를 최소화 하기 위해 티코노 등(Ticono et al., nature New Biol.246, 40(1973))의 규칙에 따라 역 반복되는 핵산의 자유에너지(G) 값이 전체 염기 서열에 걸쳐 -7 Kcal/mol 이하가 되도록 염기 서열을 변형시켜 최종 근세포 성장인 자 유전자의 염기서열을 고안한다. 5′-말단에는 제한효소 SacII 인지부위를 갖는 것과 제한효소 NdeI 인지 부위를 갖는 것을 각각 합성하고 3′-말단에는 서로 다른 두개의 종료코돈인 TAG, TAA와 제한효소 SalI 인지부위를 가지는 염기서열을 완성 한다(제 1 도). 한편 상기 유전자를 합성하기 위해 윗가닥 6개, 아랫가닥 6개의 올리고뉴클레오티드를 합성하고(제 2 도 참조), 이를 이용하여 중합효소 연쇄 반응으로 근세포 성장인자를 증폭한다.

이렇게 증폭된 유전자들을 제한 효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 플라스미드에 연결하고 이 플라스미드로 미생물을 형질전환시킨다(제 3 도). 이 때 플라스미드나 숙주 균주로는 본 발명의 유전자와 적합성을 갖는 어떠한 것도 제한없이 사용할 수 있다.

특히, 본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제 92-10039 호, ATCC 68642, 1991. 7. 1 일자 기탁)의 CORE14 유전자와 치환하여 발현 벡터를 제조할 수도 있고 이 유전자 단편을 본 출원인이 선출원한 플라스미드 prtpH-HGH(대한민국 특허출원 제 88-18190 호, KFCC-10667)의 HGH 유전자와 치환하여 발현벡터를 제조할 수 있다.

이렇게 얻어진 발현 벡터로 대장균과 같은 미생물을 형질 전환시켜 본 발명 에 따른 형질전환체를 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하기 실시예들은 본 발명을 예시하려는 것이고, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

참조예 1) 제한효소를 사용한 DNA의 절단

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충 용액을 50㎕내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃ 에서 1 내지 2 시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃ 에서 15 분간 열처리하고, 내열 성인 제한효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1: 1OOmM 비스 트리스 프로판-HCl, 100mM MgCl₂,

10mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT),

pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2: 100mM 트리스-HCl, 1OOmM MgCl₂, 500mM NaCl,

1OmM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3: 1OOmM 트리스-HCl, 1OOmM MgCl₂, 1000mM NaCl,

10mM DTT, pH 7.0

1O배 NEB 완충용액 4: 200mM 트리스-아세테이트, 1OOmM 마그네슘

아세테이트, 500mM 포타슘 아세테이트,

10mM DTT, pH 7.0

참조예 2) 페놀 추출과 에탄올 침전

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵 산을 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심 분리(15,000xG, 5분)시켜 상층액을 새튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로포름과 이소부탄올 비율 24:1(v/v))으로 상층액을 추출하여 0.1 부피의 3M 소듐 아세테이트와 2.5 부피의 1OO% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃에서 30 분간 또는 -20℃에서 약 2 시간이상 정치한 후 원심분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

참조예 3) 연결 반응(ligation)

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10 단위 체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA의 연결에는 1OO 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃ 에서 적어도 5 시간이상 또는 4℃ 에서 14 시 간 이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃ 에서 15 분간 가열하여 연결효소를 불 활성화시켰다.

참조예 4) 대장균 형질전환

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W311O 또는 JM105)를 100 ㎕의 액체 LB 배 지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm 에서의 광학밀도(0.D.) 값이 0.25 내지 0.5에 달할때까지 37 ℃에서 배양하였다. 그후 원심분리(2,500xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖ 의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척하였다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하고 여기에 50㎖의 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂, 용액을 가하여 얼음위에서 30 분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖ 에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃ 에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖ 에 연결 반응 용액 10㎕ 를 가하여 0℃ 에서 40 분간 정치시킨 후 42℃ 에서 1 분동안 열처리하였다. 이를 2.O㎖ 의 액체 LB 배지에 가하여 37℃ 에서 1 시간동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. M13 벡터 DNA 는 열처리 한 후 100㎕ 의 JM105 세포, 15㎕ 의 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎕ 의 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃ 로 미리 데워놓은 3㎖ 의 2 배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지 (1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토 아가)위에 도말하였다.

참조예 5) 올리고머의 합성

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C18 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴:물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260mm에서 흡광도틀 측정하여 농도를 결정하였다.

참조예 6) 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

주형 DHA(10ng 내지 100ng), 10㎍ 의 10배 Taq 중합효소 완충용액(1OmM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕ 의 dNTP혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕ 의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수틀 가하여 총부피를 100㎕ 로 하였다. 여 기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕ 의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기 (Pertain Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃ 에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2 분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃ 에서 1O 분간 추가반응시켰다.

실시예 1: 근세포 성장인자의 염기서열 고안 및 유전자 합성

단계 1)

알려진 165 개의 아미노산 서열(Martin et at., Cell 63, 203-211(199O))로부터 효모 및 대장균에서 많이 발현되는 아미노산을 코딩하는 핵산 염기서열로 바꾼 후 전사(transcription)되었을 때 생성될 수 있는 안정한 2차 구조를 최소화 하기 위해 티코노 등(Ticono et al., Nature New Biol.246, 40(1973))의 규칙에 따라 역 반복되는 핵산의 자유에너지(G) 값이 전체 염기서열에 걸쳐 -7 Kcal/mol 이하가 되도록 핵산 서열을 변형시켜 최종 근세포 성장인자 유전자의 염기서열을 고안하였다. 5′-말단에는 제한효소 SaclI 인지부위를 갖는 것과 제한효소 NdeI 인지부위를 갖는 것을 각각 합성하였으며 3′말단에는 서로 다른 두개의 종료코돈인 TAG, TAA와 제한효소 SalI 인지부위를 가지도록 합성할 염기서열을 완성하였다(제 1 도).

상기의 유전자를 합성하기 위하여 15개 정도의 염기가 상보적으로 중첩되는 윗가닥 6개, 아래가닥 6개의 핵산 염기를 핵산 합성기(Applied Biosystem, 380B,U.S.A.)로 합성(제 2 도)한 후 변성 아크릴아마이드 젤에서 전기영동으로 분리한 후(C18 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc, U.S.A.) 컬럼으로 순수 정제하였다. 정제된 유전자들은 260nm에서 흡광도를 측정하여 농도가 5 0.D.(optical density)되도록 하였다.

(단계 2)

반응 튜브 A에 0.8 ㎍의 1 번 가닥 핵산, 0.8 ㎍의 4번 가닥 핵산, 1.6ng 의 2 번 가닥 핵산, 1.6ng 의 3 번 가닥 핵산을 넣고 10㎕ 의 10 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6과 같이 95℃ 에서 30초, 55℃ 에서 30초, 72 ℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction 이하 PCR이라 함)을 25회 실시하였다(Saiki, R.K. et. al., Science, 239: 487(1988)). 이렇게 해서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 잴에서 분리한 결과 약 205 염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드젤로 분리정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 A라 칭한다.

(단계 3)

반응 튜브 B에 0.8 ㎍의 5 번 가닥 핵산, 0.8 ㎍의 8 번 가닥 핵산, 1.6 ng의 6 번 가닥 핵산, 1.6 ng의 7 번 가닥 핵산을 넣고 1O㎕ 의 1O 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6과 같이 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25 회 실시하였다. 이렇게 해서 얻는 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 약 195 염기쌍의 DNA 가 증폭되었으며 동일조건이 폴리아크릴 아마이드 젤로 분리정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 B 라 칭한다.

(단계 4)

반응 튜브 C에 0.8㎍ 의 9 번 기닥 핵산, 0.8㎍ 의 12 번 가닥 핵산, 1.6n g의 10 번 가닥 핵산, 1.6ng 의 11 번 가닥 핵산을 넣고 10㎕ 의 10 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6과 같이 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25 회 실시 하였다. 이렇게 해서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크린 아마이드 젤에서 분리한 결 과 약 155염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드젤로 분리정제하였다. 이하 이 DNA단편을 단편 C 라 칭한다.

(단계 5)

반응 튜브 D 에 주형으로 2ng 의 단편 A 와 2ng 의 단편 B 를 넣고, 0.8㎍ 의 1 번 가닥 핵산, 0.8㎍ 의 8 번 가닥 핵산, 10㎕ 의 10 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6 과 같이 95℃에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이렇 게 해서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 약 385 염 기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드젤로 분리정제하였다 .이하 이 DNA 단편을 단편 D 라 칭한다.

(단계 6)

반응 튜브 E에 주형으로 2ng 의 단편 D 와 2ng 의 단편 C 를 넣고, 0.8㎍ 의 1 번 가닥 핵산, 0.8㎍ 의 12번 가닥 핵산, 10㎕ 의 10 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6 과 같이 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25 회 실시하였다. 이 렇게 해서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 약 535 염 기쌍의 DNA 가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드젤로 분리정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 UBSCF 라 칭한다.

한편 반응 튜브 F에 주형으로 2ng 의 단편 D 와 2ng 의 단편 C 를 넣고 0.8㎍ 의 1A 번 가닥 핵산, 0.8 ㎍ 의 12 번 가닥 핵산, 10㎕ 의 10 배 중합효소 완충용액, 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100 ㎕ 로 한 후 참조예 6과 같이 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25 회 실시하였다. 이렇게 해서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결 과 약 535 염기쌍의 DNA 가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드젤로 분리 정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 SCF라 칭한다.

단계 7: 합성된 유전자의 염기서열 분석

플라스미드 M13mp18 을 NEB 완충용액 2 의 조건하에서 제한 효소 Eco RV 로완전절단한 후 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 약 7.3 kb 단편을 분리정제하였 다. 이하 이 단편을 단편 M13mp18-RV라 칭한다. 반응 튜브에 실시예 2 에서 얻은 단편 SCF 를 100mg 을 넣고 50ng 의 단편 M13mp18-RV, 2㎕ 의 1O 배 농도 연결반응용액, 10 단위체 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕ 가 되도록 증류수를 가한다음 16℃ 에서 12 시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 대장균 JM105(ATCC 47016)에 하나한의 방법(J. Mol. Biol. 116, 557(1983))으로 형질 전환시켰다. 형질전환된 대장균에 7.5㎕ 의 0.2M IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, USB, U.S.A.)를 넣고 3㎖ 의 2XYT 소프트 아가(16g bactotrypton, 1Og yesat extract, 5g NaCl, 6g bactoagar per 1 liter)와 25㎕ 의 4% X-gal 용액을 혼합한 뒤 Min A 아가 플레이트(1O.5g K₂HPO₄, 4.5g KH₂PO₄, 1g(NH₄)₂S0₄, 1g(NH₄)₂S0₄, 0.5g Na-citrate, 12g bactoagar, 1ml 20% MgS0₄, 0.5ml 1% Vitamin B, 10ml 50% glucose per liter)위에 도포하였다. 여기서 나온 무색 플라크로부터 단일가닥 핵산을 추출한 후 시쿼네이즈(sequanase; USB, U.S.A.)를 이용한 다이디옥시 핵산 염기서열 분석방법(dideoxy DNA sequencing; tabor et at., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 4767(1987))으로 재조합 합성 근세포 성장인자 유전자의 염기서열을 분석하였고 제 1 도의 염기배열의 유전자를 갖는 플라스미드 M13mp18-SCF를 얻었다.

실시예 2: 대장균 발현 벡터의 제조

본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제 92-10039 호, ATCC 68642, 1991. 7. 1 일자 기탁) 2㎍ 을 제한 효소 Sac II와 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전절단한 후 0.7% 아가로스 젤에서 분리하여 약 2.7 Kb 단편을 분리정제하였다. 이하 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L이라 칭한다. 한편 실시예 1의 단계 6에서 얻은 2 ㎍의 단편 UBSCF를 제한효소 Sac II와 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전 절단반응을 한 후 튜브에 절단된 DHA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 1O 배 농도접합 반응용액, 10 단위체 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 E.coli W3110(ATCC 37339)에 형질전환시켜 형질전환체(Escherichia Coli W3110(ptrp-UB-SCF)를 얻어 1992년 12월 30일자로 한국유전자은행에 기탁하였다(KCTC O063BP)(제 3 도).

한편, 본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-HGH(대한민국 특허출원 제 88-18190 호, KFCC-10667) 2㎍을 제한효소 Nde I와 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전절단한 후 0.7% 아가로스 젤에서 분리 하여 약 2.5 Kb 단편을 분리정제하였다. 이하 이 단편을 ptrpH-N/L 이라 칭한다. 한편 실시예 1의 단계 6에서 얻은 2 ㎍의 단편 SCF를 제한효소 NdeI와 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1과 같이 완전절단반응을 한 후 튜브에 절단된 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-N/L, 2㎕의 10 배 농도 접합반응 용액, 10 단위체 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 E. coli W3110(ATCC 37339)를 형질전환시켜 단편 SCF를 함유한 형질전환체(Escherichia coli, W3110 (pTrp-SCF)를 얻었다(제 3 도). 이 미생물은 1992. 12. 30. 자로 한국유전자 은행에 기탁되었다(기탁번호: ATCC 69512).

실시예 3: 근세포 성장인자 유전자의 발현 유도 및 확인

상기 실시예 2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12 시간동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH4Cl 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. Bl, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서 37℃ 에서 약 4 시간동안 진탕 배양하여 박테리아의 흡광도가 650 nm 의 파장에서 약 0.3 정도가될 때 인돌아크릴산을 최종 농도 50㎍/㎖ 이 되게 첨가하였다. IAA 를 첨가한지 약 4 시 간 후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000 rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포침전물을 수집하였다. 상기에서 얻은 세포침전물들을 Laemmli의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하 였다.

제 4 도에서 A의 1 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균을 나타낸 것이고, 2 열은 ptrpH-UB-SCF 로 형질전환된 대장균을 나타낸 것이다.

제 4 도에서 B의 1 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균을 나타낸 것 이고, 2 열은 ptrpH-SCF 로 형질전환된 대장균을 나타낸 것이다.

제 4 도에서 A는 ptrpH-UB-SCF 로 형질전환된 대장균을 나타낸 것으로서 유비퀴틴과 융합된 근세포 성장인자 분자량 약 26,000 달톤의 크기로 대량 발현(전 체 단백질의 25%)되었음을 볼 수 있고 제 4 도의 B에서는 ptrpH-SCF로 형질전환된 대장균을 나타낸 것으로서 약 19,000 달톤의 근세포 성장인자가 발현(전체 단백질의 10%)되었음이 확인되었다.

본 발명을 통해 사람 체내에 존재하는 천연의 근세포 성장인자와 같은 아미 노산 크기를 갖는 근세포 성장인자를 생산함으로써 불안정한 조혈작용으로 인한 질 병 즉, 빈혈 및 백혈병 등의 치료와 골수 이식 수술시 성공률을 높이는데 기여할 수 있게 되었다.

제 1 도는 인간 근세포 성장인자 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 나 타낸 것이고,

제 2 도는 합성한 인간 근세포 성장인자 유전자들의 접합 전략 및 발현 벡 터를 도시한 설명도이고,

제 3 도는 인간 근세포 성장인자 유전자의 발현을 SDS 폴리 아크릴 아마이 드 젤 전기영동 사진이다.

Claims

인간 근세포 성장인자를 암호화하며, 염기서열 전체에 걸쳐 핵산의 자유 에 너지 값(G)이 -7 Kcal/mol 이하임을 특징으로 하는 제 1도에 표시된 근세포 성장인자의 유전자.
제 1 항의 유전자를 포함하는 플라스미드.
제 2 항에 있어서,

플라스미드 ptrpH-UB-SCF 또는 ptrpH-SCF.
제 1 항의 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물.
제 4 항에 있어서,

대장균 W3110(ptrp-UB-SCF)(KCTC 0063BP) 또는 대장균 W3110(ptrp-SCF)(ATCC 69512)임을 특징으로 하는 형질전환체.