KR100229421B1

KR100229421B1 - 대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR100229421B1
Application number: KR1019970001910A
Authority: KR
Inventors: 김천형; 조중명; 이재형
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 1999-12-01
Also published as: KR19980066404A

Abstract

본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(erythropoietin : EPO) 단백질을 대장균에서 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, 인간 적혈구 형성 자극인자(EPO) 유전자의 5´-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형되고, 치환변형된 EPO 유전자의 5´-말단 앞에는 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결된 것을 특징으로 하는 인간 적혈구 형성자극인자의 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 EPO 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 의하면 기존의 방법보다 높은 수율로 대장균에서 EPO 단백질을 생산할 수 있다.

Description

대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자의 대량 생산방법

본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(erythropoietin; 이하 EPO라 함) 단백질을 대장균에서 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EPO 유전자의 5´-말단의 염기서열 일부를 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환시키고 변형된 EPO 유전자의 5´-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결되도록 하여 대장균에서 발현시킴으로써 EPO 단백질을 높은 효율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

EPO는 고등생물에서 적혈구 형성을 촉진하는 호르몬으로서(Carnot, et al., Compt. Rend. 143, 384(1906)) 166개의 아미노산과 여러 종류의 당으로 구성된 당단백질이다. 적혈구는 인체내 모든 조직에 산소를 공급하는 역할을 하는 혈액내 존재하는 세포로서 산소공급의 정도에 따라 그 양이 조절되는데, 이의 교량역할을 하는 것이 EPO이다. 즉, 체내 산소공급이 저하되면 콩팥에 존재하는 특정세포가 이를 감지하여 EPO의 농도를 증가시킴으로써 혈액내 적혈구의 양이 많아지게 되고 이에 따라 산소공급도 증가하게 된다. 이처럼 EPO는 혈액내 적혈구 형성에 필수불가결한 인자로서, 빈혈 등 혈액관련 질병의 진단과 치료에 이용되고 있다.

EPO는 영아의 간, 성인의 신장 및 간에서 생성되며 성인의 골수 및 지라, 영아의 간 세포와 반응한다(Naughton, B. A., et al., Science, 196, 301-302(1976); Krantz. S. B., J. Biol. Chem., 238, 4085-4090(1963); Drystal. G., Expl. Hemat., 11, 649-660(1983)). EPO는 정상인의 경우 혈액 1ml당 약 15 내지 30mU(밀리 유니트) 또는 0.01mM 수준으로 유지되는데(Garcia, J. F., Lab. Clin. Med., 99, 624-635(1982)), 재생 불량성 빈혈 등의 질병을 앓고 있는 환자에서는 정상인 보다 높은 농도의 EPO가 생성되어 이들의 혈액이나 뇨를 EPO 생산에 이용하기도 한다(White, et al., Rec. Progr. Horm., Res., 16, 219(1960); Espada, et al., Biochem. Med., 3, 475(1970); Fisher, Pharmacol. Rev., 24, 459(1972)). 그러나 이러한 방법으로 EPO를 대량생산하기에는 원료 수급에 한계가 있으며, 정상인의 뇨에서는 EPO의 농도가 낮을 뿐만 아니라 활성 저해제가 있어 이를 제거하기 위해서는 고도의 정제가 요구된다는 단점이 있다(미합중국 특허 제4,397,840호; 제4,303,650호 및 제3,865,810호). EPO를 양의 혈장에서 추출하는 방법도 있으나 이는 사람에게 항원으로 작용할 수 있다는 단점이 있다(Goldwasser, Control cell. Dif. Divelop., Part A, 487-494(1981); Alan R. Liss. INC., N. Y.). 수기모토(Sugimoto) 등의 미합중국 특허 제4,377,513호에서는 나말바(Namalva), BALL-1, NALL-1, TALL-1 및 JBL을 포함한 인간 임파구를 동물 체내에서 증식시킴으로서 EPO를 생산하는 방법을 보고한 바 있으나, 이 방법은 인간 종양 세포를 재료로 사용하므로 안전성 확보를 위해서는 더욱 집중적인 조사를 필요로 한다.

최근에는 사람의 EPO 유전자를 클로닝하여 동물세포 또는 곤충세포에서 발현시키는 방법들이 개발되었다(대한민국 특허공고 제89-1011호 및 제93-5917호; 대한민국 특허출원 제93-16865호). 본 발명자들은 인간 면역 글로불린의 혼성화 방법을 EPO에 처음으로 적용시킴으로써 EPO의 발현율을 높이는 한편, EPO에 결합된 인간 면역 글로불린이 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여 간단한 정제공정을 개발함으로써 EPO의 대량 생산방법을 보고한 바 있다(대한민국 특허출원 제94-32342호). 그러나 이러한 방법에 의해 발현된 EPO는 당화된 형태로 3차 구조를 연구하기에는 적합하지 않다는 단점이 있다. 따라서 EPO의 3차 구조 연구를 위해 대장균에서 EPO를 발현시키고자 많은 연구가 진행되었으나 순수한 EPO 만을 발현시키는 데는 실패하였다. 즉, 보이셀 등은 EPO의 아미노 말단에 10개의 히스티딘 아미노산을 접합시킴으로써 대장균에서 EPO를 융합 단백질의 형태로 발현시켰으며(Boissel, Jean-Paul, et al., J. Biol. Chem., 268, 15983(1993)), 빌 등은 4가지 대장균 발현벡터를 이용하여 EPO를 발현시키고자 시도하여 EPO 아미노 말단에 글루타티온-S-전이효소가 융합된 형태의 단백질 만을 발현시킨 바 있다(Bill, R. M., et al., Biochem., Biophys. Acta, 1261, 35(1995)). 이와 같이 융합된 형태로 얻어진 EPO는 순수한 EPO와는 구조적인 차이가 있을 뿐만 아니라 융합 단백질로부터 순수한 EPO 단백질 만을 분리하는 공정이 추가로 요구된다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 대장균으로부터 순수한 EPO 단백질 만을 비당화된 형태로 얻을 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구하던 중, trp 프로모터하에서 EPO 유전자의 5´-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환되고 그 변형된 EPO 유전자의 5´-말단 앞에 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열 일부 및 이후의 리보소옴 결합부위와 시작코돈인 ATG 사이에 mRNA 2차 구조가 생기지 않도록 고안된 합성링커를 연결시킨 EPO 유전자 발현벡터를 대장균에서 발현시킴으로써 비당화된 EPO 단백질을 대장균에서 높은 수율로 발현시키는데 성공하였으며, 이에 따라 현재까지 밝혀지지 않은 EPO 단백질의 3차 구조 분석 및 변이체 제조가 가능하게 되었다.

본 발명의 목적은 인간 적혈구 형성 자극인자(EPO) 단백질을 대장균에서 높은 수율로 대량 발현시킬 수 있도록 변형된 재조합 인간 EPO 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 그리고 이를 사용하여 인간 EPO를 높은 수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 EPO 유전자 단편을 함유한 대장균 발현벡터 ptrp 3HS EPO의 제작과정을 나타낸 것이다.

제2도는 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자 단편을 함유하는 대장균 발현벡터 ptrp 3HS REPO의 제작과정을 나타낸 것이다.

제3도는 EPO 유전자 및 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터 ptrp 3HS EPO 및 ptrp 3HS REPO로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

제4도는 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자의 5´-말단 염기 서열을 EPO 유전자의 5´-말단 염기서열과 비교한 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 적혈구 형성 자극인자(EPO) 유전자의 5´-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형되고, 치환변형된 EPO 유전자의 5´-말단 앞에는 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결된 것을 특징으로 하는 인간 적혈구 형성 자극인자의 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균, 그리고 상기 형질전환된 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 단백질의 제조방법을 제공한다.

여기에서, 본 발명에 따라 치환변형된 EPO 유전자의 5´-말단 염기서열은 다음과 같은 것이 바람직하다 :

이하, 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명자들의 선출원인 대한민국 특허출원 제86-11712호와 제93-16865호로부터 EPO 단백질을 코딩하는 EPO 유전자의 5´-말단과 3´-말단에 대응하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR이라 함)용 프라이머를 고안 합성한다. 5´-말단에 대응하는 프라이머는 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인지부위가 존재하고, EPO 유전자의 5´-말단 앞에서는 연어 성장 호르몬의 시작코돈(ATG)에서 37개 염기쌍 부위와 리보소옴 결합부위, 그리고 연어 성장 호르몬의 합성을 중지시키기 위한 종료코돈(TAA)이 삽입된 바이시스트로닉용 프라이머로 만들며, 이에 대응되는 3´-말단 프라이머에는 종료코돈과 제한효소 인지부위를 삽입하여, 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.

발현벡터 pVL1393 L-EPO(대한민국 특허출원 제93-16865호)를 주형으로하여 상기 프라이머들을 이용하여 PCR 반응에 의해 변형된 EPO 유전자를 증폭한다. 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 대장균 발현벡터 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP)의 BGHRAN 유전자와 치환하여 발현벡터 ptrp 3HS EPO를 제조한다.

이때 본 발명에 따라 EPO의 발현율을 증가시키기 위하여, EPO 유전자의 5´-말단 일부가 아미노산 서열에는 변화없이 염기서열만이 무작위로 변형되도록 EPO 유전자의 5´-말단에 대응하는 PCR용 프라이머를 고안 합성한다. 이에 대응되는 프라이머는 소성장 호르몬 발현벡터인 ptrp HS BGH 1-13의 Amp 유전자에 위치하며 제한효소 PvuI 인지부위를 포함하도록 고안 합성한다. 발현벡터 ptrp 3HS EPO를 주형으로 하고 상기 프라이머들을 이용하여 PCR 반응에 의해 변형된 EPO 유전자를 증폭한다. 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 ptrp 3HS EPO의 EPO 유전자와 치환하여 발현벡터 ptrp 3HS REPO를 제조한다.

이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인할 수 있으며, 생성된 단백질은 배양된 대장균 또는 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[바이시스트로닉 시스템을 이용한 EPO의 발현]

[단계 1 : 연어 성장 호르몬의 5´-말단 일부의 유전자를 포함한 EPO 유전자의 합성]

본 출원인의 선출원 명세서 중에 기재된 플라스미드 ptrp HS BGH 1-13의 염기서열 정보(대한민국 특허출원 제86-11712호) 및 기존의 EPO 염기서열 정보(대한민국 특허출원 제93-16865호)로부터 다음과 같은 프라이머를 합성하였다 :

(이 프라이머는 EPO 유전자의 5´-말단에 대응하는데, 제한효소 NdeI 인지부위를 가지고 있고, 밑줄친 부분은 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열을 나타내며 박스내 AGGA는 리보소옴 결합부위, 박스내 TAA는 연어 성장 호르몬 일부 유전자 종료코돈을 나타낸다. 그 이후의 24개 염기쌍은 시작코돈(ATG)과 EPO 유전자의 시그날 서열 이후의 염기서열을 나타낸다).

(이 프라이머는 EPO 유전자의 3´-말단에 대응하며, 해독이 종료되도록 종료코돈을 가지고 있고, 동시에 제한효소 SalI 인지부위를 갖는다).

반응 튜브에 플라스미드 pVL1393 L-EPO(대한민국 특허출원 제93-16865호) 1ng을 주형으로하여 프라이머 P3HSEPO 2㎍과 프라이머 PSALEPO 2㎍을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 1.0% 트리톤 X-100), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP 및 2mM dTTP), 2.5단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕가 되도록 하여, 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(어닐링단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리하여 약 590 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 젤로 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘단편 HSEPO’라 칭한다.

[단계 2 : 바이시스트로닉 시스템을 이용한 EPO의 발현벡터 제조 및 대장균 형질전환]

본 출원인의 선출원 명세서 중에 기재된 플라스미드 ptrp 3H BGHRAN(KCTC 0143BP, 대한민국 특허출원 제94-40025호) 2㎍을 NEB 완충용액 3(10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 제한효소 SalI으로 완전절단한 뒤 제한효소 NdeI으로 부분절단하고, 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 2.4kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘단편 ptrp 3H-N/L’이라 한다. 한편, 상기 단계 1에서 얻은 ‘단편 HSEPO’를 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 NdeI과 SalI으로 완전절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하고 20㎍의 TE 용액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용존시켰다. 이를 ‘단편 HSEPO-N/L’이라 한다. 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 ‘단편 ptrp 3H-N/L’과 100ng의 단편 ‘HSEPO-N/L’, 2㎍의 10배 접합 반응용액(0.5M 트리스-HCl, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml BSA, pH 7.8), 및 10단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝나면 대장균 W3110(ATCC 37339)에 형질전환시킨 후, 형질전환된 균체로부터 ‘단편 HSEPO’를 함유하는 대장균 발현벡터 ‘ptrp 3HS EPO’를 얻었다.

[단계 3 : 바이시스트로닉 시스템을 이용한 EPO 유전자의 발현 유도]

상기 단계 2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/mL의 앰피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml을 300ml의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/ml Vit. B1, 40㎍/ml 앰피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간 동안 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도가 650nm에서 약 0.3정도가 될 때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/ml가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한 지 약 4시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정하고 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물들을 램리의 방법(Laemmii, Nature, 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 발현을 측정하였다.

제3도의 제11열에는 EPO 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과가 나타나 있는데, 여기에서 보면 EPO 단백질이 거의 발현되지 않았음을 알 수 있다.

[실시예 2]

[변형된 EPO 유전자의 증폭 및 발현]

[단계 1 : 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자의 합성]

기존의 EPO의 염기서열 정보(대한민국 특허출원 제86-11712호 및 대한민국 특허출원 제93-16865호)로부터 EPO 유전자의 염기서열을 아미노산의 변화없이 대장균에서 선호하는 염기코돈으로 치환, 변형시키기 위해 다음과 같은 무작위 프라이머를 고안 합성하였다 :

(이 프라이머는 EPO 유전자의 5´-말단으로부터 16개 아미노산에 대해서는 아미노산 변화없이 염기서열 만을 변형시킨 것으로, 이때 제한효소 XhoI의 인지부위는 17번째 아미노산과 18번째 아미노산 위치에 존재하며 EPO 염기서열 TTGGAA를 CTCGAG로 치환함으로써 아미노산 변화없이 제한효소 인지부위를 만들 수 있다).

(이 프라이머는 EPO 유전자의 19번째 아미노산부터 25번째 아미노산과 동일한 염기서열을 포함하며, 17번째 아미노산과 18번째 아미노산 위치의 EPO 염기서열 TTGGAA를 CTCGAG로 치환함으로써 아미노산 변화없이 형성시킨 제한효소 XhoI의 인지부위를 포함한다).

(이 프라이머는 플라스미드 ptrp HS BGH 1-13(대한민국 특허출원 제86-11712호)의 Amp 유전자에 위치하며, 제한효소 PvuI의 인지부위를 포함한다).

반응튜브 A에는 프라이머 PEPORAN 2㎍, 프라이머 PPBR3720 2㎍을 넣고, 반응튜브 B에는 프라이머 PXEPO 2㎍, 프라이머 PSALEPO 2㎍을 넣은 다음, 각각의 튜브에 상기 실시예 1의 단계 2에서 얻은 플라스미드 ptrp 3HS EPO 1ng을 주형으로 넣고 10㎕의 10배 중합 완충용액, 10㎕의 2mM dNTP, 2.5단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(어닐링단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리한 결과, 반응튜브 A에서는 약 1000 염기쌍의 핵산, 반응튜브 B에서는 약 460 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리아크릴아미드 젤로부터 분리 정제하였다. 이하 이 단편을 각각 ‘단편 REPO’및‘단편 XLEPO’라 칭한다.

[단계 2 : 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자의 발현벡터 제조 및 대장균 형질전환]

상기 실시예 1의 단계 2에서 얻은 플라스미드 ptrp 3HS EPO 2㎍을 NEB 완충용액 3조건하에서 제한효소 BglII와 PvuI으로 완전절단한 후, 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 1.8kb 단편을 분리정제하였다. 이하, 이 단편을 ‘ptrp 3H-B/P’라 칭한다.

한편, 상기 단계 1에서 얻은 ‘단편 REPO’를 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 XhoI과 PvuI으로 완전절단한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 ‘단편 REPO-X/P’라 한다. 또한, 상기 단계 1에서 얻은 ‘단편 XLEPO’를 NEB 완충용액 3(10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 제한효소 XhoI과 BglII로 완전절단한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다. 이를 ‘단편 XLEPO-X/B’라 한다. 이어서, 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 REPO-X/P과 100ng의 단편 XLEPO-X/B, 100ng의 단편 ptrp 3H-B/P, 2㎕의 10배 접합 반응용액, 10단위체의 T4 DNA 리가제, 그리고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 접합반응이 끝나면 대장균 W3110(ATCC 37339)에 형질전환시킨 후, 형질전환된 균체로부터 ‘단편 REPO’를 함유하는 대장균 발현벡터 ‘ptrp 3HS REPO’를 얻었다.

[단계 3 : 대장균에서 변형된 염기서열을 갖는 EPO 유전자의 발현]

상기 단계 2에서 얻은 재조합 대장균 200여개의 콜로니를 50㎍/ml의 앰피실린이 함유된 액체 루리아 배지에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml를 300ml의 M9 배지로 옮겨서 37℃에서 약 4시간 동안 진탕배양하였다. 배양액의 흡광도가 650nm에서 약 0.3정도가 될 때 IAA를 최종농도가 50㎍/ml가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한 지 약 4시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정하고 원심분리기를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법에 따라 SDS의 존재하 15% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 발현을 확인하였으며, 상기 실시예의 대조군에 비해 발현이 증가된 클론을 선별하여 각각 ‘ptrp 3HS REPO #3’,‘ptrp 3HS REPO #5’,‘ptrp 3HS REPO #7’,‘ptrp 3HS REPO #17’및‘ptrp 3HS REPO #18’이라 명명하였다.

상기 형질전환된 대장균 W3110/ptrp 3HS REPO #3, 5, 7, 17, 18을 1996년 12월 27일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 0291BP호로서 기탁하였다.

제3도는 EPO 유전자 및 본 발명에 따라 변형된 염기서열을 갖는 REPO 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터 ptrp 3HS EPO 및 ptrp 3HS REPO로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 제3, 5, 7, 17 및 18열은 각각 플라스미드 ptrp 3HS REPO #3, 플라스미드 ptrp 3HS REPO #5, 플라스미드 ptrp 3HS REPO #7, 플라스미드 ptrp 3HS REPO #17 및 플라스미드 ptrp 3HS REPO #18을 함유한 대장균을 나타낸 것이고, 제10열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균, 제11열은 플라스미드 ptrp 3HS EPO를 함유한 대장균, 제M열은 표준 분자량 표지 단백질을 나타낸 것이고, 나머지 열들은 플라스미드 ptrp 3HS REPO를 함유한 대장균을 나타낸 것이다. 여기에서 보면 EPO 유전자를 함유한 발현벡터로 형질전환된 대장균에서는 EPO 단백질이 거의 발현되지 않은데 비해, 본 발명에 따라 변형된 REPO 유전자를 함유한 발현벡터로 형질전환된 대장균, 특히 ptrp 3HS REPO #3, ptrp 3HS REPO #5, ptrp 3HS REPO #7, ptrp 3HS REPO #17 및 ptrp 3HS REPO #18의 경우에는 EPO 단백질의 발현율이 월등히 높은 것을 알 수 있다.

[단계 4 : 변형된 EPO 말단의 염기서열 확인]

상기에서 얻은 ptrp 3HS REPO #3, ptrp 3HS REPO #5, ptrp 3HS REPO #7, ptrp 3HS REPO #17 및 ptrp 3HS REPO #18 클론으로부터 EPO의 5´-말단 염기서열을 확인하기 위하여 생거 등의 방법(Sanger, F., PNAS, U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 다음과 같이 행하였다. 먼저 각각의 플라스미드 2㎍을 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 BglII와 EcoRI로 완전절단하였으며, 이를 7% 폴리아크릴아미드 젤로 분리하여 약 450 염기쌍의 핵산절편을 분리정제하였다. 이하, 이 핵산 절편들을 각각 ‘단편 REPO3-B/R’,‘단편 REPO5-B/R’,‘단편 REPO7-B/R’,‘단편 REPO17-B/R’및‘단편 REPO18-B/R’이라 한다. 한편, 플라스미드 M13mp18 2㎍을 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 BamHI와 EcoRI로 완전절단하였으며, 이를 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 7kb의 핵산절편을 분리하였다. 이하, 이 핵산절편을 ‘단편 M13-B/R’이라 한다. 각각의 접합반응 용기에 상기에서 얻은 단편 REPO3-B/R, 단편 REPO5-B/R, 단편 REPO7-B/R, 단편 REPO17-B/R 및 단편 REPO18-B/R을 각각 100ng씩 넣은 뒤 각각의 튜브에 100ng의 단편 M13-B/R, 2㎕의 10배 접합반응 용액, 및 10단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 이들 각각을 이용하여 대장균 JM105(ATCC 47016)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 8㎕의 0.2M IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 용액을 넣은 후 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3ml의 2XYT 상층아가(Soft Agar : 16g 박토트립톤, 10g 효모 추출물, 5g NaCl, 5g 박토아가/ℓ)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하여 Min A 플레이트(10.5g KHPO, 1g (NH₄)₂SO, 0.5g 구연산나트륨, 12g 박토아가, 1ml 20% MgSO₄, 0.5ml 1% Vit. B, 10ml의 50% 글루코즈/ℓ)위에 고르게 도포한 다음 37℃서 12시간 동안 배양하였다. 생성된 투명한 플라크를 이쑤시개로 찍어서 2ml의 2XYT 액체 배지에서 37℃, 5시간 동안 배양한 후 원심분리하여 얻은 상층액에 1/4 부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨)을 넣고 M13 파아지를 수거해서 단일가닥 핵산을 추출한 후 변형된 EPO의 5´-말단 염기서열을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 기존의 EPO 유전자의 경우 대장균에서 매우 낮은 발현율을 보이는데 비해, 본 발명에 따라 인간 적혈구 형성 자극인자(EPO) 유전자의 5´-말단 염기서열이 아미노산 변화없이 대장균 선호코돈으로 치환변형되고, 치환변형된 EPO 유전자의 5´-말단 앞에는 연어 성장 호르몬의 5´-말단 염기서열 일부와 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 연결된 것을 특징으로 하는 인간 적혈구 형성자극인자의 유전자를 이용한 경우, 현저히 향상된 발현율을 얻을 수 있었다. 따라서 본 발명의 생산방법에 따르면 EPO 단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있으며, 이를 이용하여 현재까지 밝혀지지 않은 EPO 단백질의 3차 구조 분석 및 변이체 제조에 기여할 수 있다.

Claims

(1) 프로모터와 인간 적혈구 형성 자극인자 유전자의 5´-말단 서열 사이에 연어 성장호르몬 또는 그 일부를 암호화하는 코돈, 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 위치하고, (2) 인간 적혈구 형성 자극인자의 5´-말단 부위에 사일런트 체인지가 도입됨을 특징으로 하는 인간 적혈구 형성 자극인자의 융합 유전자.
제1항에 있어서, 상기 연어 성장호르몬 또는 그 일부를 암호화하는 코돈, 리보소옴 결합부위 및 종료코돈이 하기 서열인 인간 적혈구 형성 자극인자의 융합 유전자 :
제1항에 있어서, 상기 사일런트 체인지가 도입된 인간 적혈구 형성 자극인자 유전자의 5´-말단 염기 서열이 하기 서열들로 구성된 그룹에서 선택되는 인간 적혈구 형성 자극인자의 융합 유전자 :
제1항의 융합 유전자를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 발현벡터.
제4항에 있어서, 발현벡터 ptrp 3HS REPO #3, ptrp 3HS REPO #5, ptrp 3HS REPO #7, ptrp 3HS REPO #17 및 ptrp 3HS REPO #18.
제4항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제6항에 있어서, 대장균 W3110/ptrp 3HS REPO #3, 5, 7, 17, 18(KCTC 0291BP).
제6항의 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 단백질의 제조방법.