KR100324302B1 - 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서함유하는 면역억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로 함유시켜 장기이식시 발생하는 거부반응 제어작용에 효과적인 면역억제제에 관한 것이다.

본 발명은 현재 임상적으로 안정성이 인정된 상태인 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 사용하는 면역억제제이다. 따라서, 상기 면역억제제는 종래의 면역억제제와 비교하여 다양한 투여 경로를 통해 적은 양을 사용하여 단기간 동안 투여해도 보다 좋은 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 장기이식 후의 생존율도 종래의 면역억제제를 사용한 경우보다 매우 높다.

Description

콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제{AN IMMUNOSUPPRESSANT CONTAINING COLCHICINE, OR COLCHICINE AND CHLOROQUINE AS ACTIVE INGREDIENTS}

본 발명은 콜키친(colchicine) 또는, 콜키친 및 클로로카인(chloroquine)을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로 함유시켜 장기이식시 발생하는 거부반응 제어작용에 효과적인 면역억제제에 관한 것이다.

장기이식 거부반응, 자기면역증 질환 및 알레르기 등은 인체의 방어를 담당하는 면역체계가 인체에 해롭지 않은 물질에 대하여 방어체계를 작동시켜 이식된 장기나 자기 조직을 파괴하는 등의 인체에 해로운 영향을 미치는 곳에서 일어난다. 특히 장기이식의 경우 말기 장기부전 환자의 가장 확실한 치료 방법이지만, 수여자와 공여자의 MHC 유전자가 일치하지 않는다면, 인체의 면역계는 이를 몸에 해로운 병균으로 인식하여 T 임파구, B 임파구, 대식세포, 자연 킬러 세포(natural killer cell, 이하 NK 세포라 함) 등을 활성화시켜 이식된 장기를 공격하게 된다. 이러한 원하지 않는 방향의 면역 반응을 억제하는 것을 면역억제라 하고, 이에 이용되는 약품을 면역억제제라 한다.

이와 같은 면역억제를 위하여 지금까지 시클로스포린 A(이하, CsA라 칭함) 및 타크로리무스(이하, FK506라 칭함) 등의 면역억제제가 개발되어 왔다.

상기 CsA는 1976년에 곰팡이 트릭코더마 폴리스포럼으로부터 분리되었는데, 다른 면역억제제에 비하여 면역세포에 대한 독성이 없이 장기이식 후 박테리아 감염을 줄일 수 있었다. 또한 스트렙토마이세스 추쿠바엔시스로부터 분리된 FK506은 CsA보다 10 내지 100배의 효율이 있다고 보고되어 있다. 그러나, 상기 CsA 및 FK506은 심각한 신장독성 및 간독성을 포함하고 있어 해결해야할 문제점을 가지고 있다.

따라서, 상기와 같은 부작용을 줄이면서도 효과적으로 면역억제를 할 수 있는 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 종래에 급성 통풍 및 급성 췌장염 치료, 경피관상동맥 확장술 시술시 대식세포 등의 세포 증식을 저해하는 효과를 갖는 콜키친과, 말라리아 및 아메바증 치료에 사용되는 클로로카인이 우수한 면역억제능을 가지고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 함유시켜 장기이식시 발생하는 거부반응 제어에 유용한 면역억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 리보뉴클레아제 보호 분석을 이용한 대조군의 이식된 장기내의 사이토카인 mRNA의 발현정도를 나타내는 겔의 자동방사선 사진이다.

도 2는 리보뉴클레아제 보호 분석을 이용한 제 1군의 이식된 장기내의 사이토카인 mRNA의 발현정도를 나타내는 겔의 자동방사선 사진이다.

도 3은 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 TNFα 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 4는 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 TNFβ 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 5는 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 IL-1β 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 6은 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 IL-6 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 7은 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 IL-10 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 8은 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 IL-2 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

도 9는 리보뉴클레아제 보호 분석결과 나타난 대조군과 제 1군의 IFNγ 발현 변화를 나타낸 그래프이다. A : 대조군, B : 제 1군

본 발명은 콜키친을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 추가로 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 면역억제제의 유효성분으로 사용하는 콜키친은 연황색 분말로서, 다음과 같은 화학식을 갖는 N-(5,6,7,9-테트라히드로-9-옥소벤즈[에이]헵탈렌-7-일)-아미드이다.

또한, 본 발명의 면역억제제의 유효성분으로 사용하는 클로로카인은 수용성 의 백색 결정형 물질로서, 다음과 같은 화학식을 갖는 7-(클로로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)-퀴놀린·디하이드로클로라이드이다.

본 발명에서 있어서, 상기 콜키친 및/또는 클로로카인은 약학적으로 허용 가능한 담체, 통상적인 보강제 및 부형제를 첨가하여 경구투여 또는 비경구 투여 할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 정제 또는 캡슐과 같은 고형으로 제제화할 수 있다. 비경구 투여는 정맥 주사 등의 방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 유효성분을 생리 식염수 등에 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 한다.

콜키친 및/또는 클로로카인의 투여량은 동물 또는 인간, 연령, 체중, 기대되는 치료학적 효과, 투여 경로, 처리 기간 등에 의존하여 변화하지만, 만족스러운 효과는 각각 10 내지 40㎍/㎏과 5 내지 10㎍/㎏, 특히 각각 10 내지 20㎍/㎏와 5 내지 7㎍/㎏의 투여량을 사용하여 얻어질 수 있다.

이와 같은 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1) 심장 이식 후의 생존율

체중이 250g 정도인 8주령의 수컷 루이스 랫(Lewis rat) 15 마리의 심장을 적출하여, 체중이 300g 정도인 8주령의 수컷 위스터 랫(Wister rat) 15 마리에 이식하였다.

상기와 같은 심장 이식 수술 2시간 전에 대조군으로서 위스터 랫 3 마리에 대해서는 아무 약품도 처리하지 않았고, 실험군으로서 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 10㎍/㎏ 및 클로로카인 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고(제 1군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 40㎍/㎏ 및 클로로카인 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고(제 2군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 10㎍/㎏만을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고(제 3군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 40㎍/㎏ 만을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고(제 4군), 나머지에 위스터 랫 3 마리에 대해서는 CsA 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였다(제 5군).

심장 이식 후, 30일 동안 각 실험군의 위스터 랫에 대해서는 수술 전에 투여한 양과 동일한 양의 약제를 정맥주사로 투여하였다.

상기와 같은 심장 이식 수술을 한 날로부터 각 대조군 및 실험군의 심장박동을 손으로 촉진하여 그 정도를 ++++ (강하면서 빠른 박동), +++ (강하거나 빠른 박동), ++ (강하지도 빠르지도 않으나 뚜렷한 박동), + (미약하지만 전반적인 박동),±0 (부분적인 박동)으로 분류하여 심장이 멈출 때까지 관찰하였다.

그 결과, 비처리 대조군에서는 8 내지 9일 뒤 이식된 심장의 거부반응으로 인하여 심장 박동이 멈추는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 거부반응은 이식 초기에 있어서 선천적 면역반응을 담당하는 단핵구/대식세포 등이 이식된 조직 내로 침투하여 조직에 염증을 유발시키고, 이들 침윤된 세포들이 면역체계의 중심역할을 수행하는 T 세포에 항원전달을 수행하여 면역반응을 유발시키기 때문이다.

반면 실험군의 경우에서, 제 1군의 위스터 랫의 경우는 +++ 및 ++++ 정도의 심장박동이 각각 385일 및 372일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었고, 이 경우 생체 검사 결과 어떠한 염증도 일어나지 않았다(표 1 참조). 또한, 제 2군의 위스터 랫의 경우 +++ 및 +의 심장박동이 각각 196일 및 141일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었으며(표 2 참조), 제 3군의 위스터 랫의 경우 ++ 및 ±0 정도의 심장박동이 각각 332일 및 101일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었고(표 3 참조), 제 4군에서는 + 정도의 심장박동이 152일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었다(표 4 참조). 제 5군의 경우에서는 ++의 심장박동이 166일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었다(표 5 참조).

상기 관찰 결과로부터, 제 3군 및 제 4군의 경우와 같이 콜키친 단독으로 투여되는 경우도 어느 정도의 면역억제 효과를 기대할 수 있으나, 콜키친과 클로로카인을 복합하여 투여하는 제 1군 및 제 2군의 경우가 보다 더 큰 효과가 있다는 사실을 알 수 있다. 또한, 상기 제 3군 및 제 4군은 CsA를 투여한 군인 제 5군과 비교해서 소량을 사용하면서도 매우 훌륭한 면역억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.

제 1군의 위스터 랫	심작박동	이식 후 생존일
# 1	+++	385일 이상
# 2	++++	372일 이상

제 2군의 위스터 랫	심장박동	이식 후 생존일
# 1	+++	196일 이상
# 2	+	141일 이상

제 3군의 위스터 랫	심장박동	이식 후 생존일
# 1	++	332일 이상
# 2	±0	101일 이상

제 4군의 위스터 랫	심장박동	이식 후 생존일
# 1	+	152일 이상

제 5군의 위스터 랫	심장박동	이식 후 생존일
# 1	++	166일 이상

2) 리보뉴클레아제 보호 분석(riboneclease protection assay)

이식된 조직 내에 침윤된 여러 가지 면역세포들에 분비되는 여러가지 사이토카인은 거부반응에 있어서 매우 중요한 지표중의 하나이다. 이러한 사이토카인들 의 발현되는 양의 측정은 이식 조직에서 일어나고 있는 면역반응의 종류나 강도를쉽게 예측할 수 있게 해준다. 상기 사이토카인이 발현되는 정도를 정량적으로 알아보기 위하여 다음과 같은 리보뉴클레아제 보호 분석법(이하, RPA라 칭함)을 이용하였다.

먼저 비처리 대조군을 심장 이식 수술한 후 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15일 순으로 희생시켜, 각각의 이식된 심장조직을 얻은 후 각 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 IL-1α(interleukin-1α), IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα(tumor necrosis factorα), TNFβ그리고 IFNγ(interferonγ) 등의 사이토카인에 대한 프로브(probe)로 교잡한 다음 리보뉴클레아제로 소화한 후, 이들을 겔상에 로드하여 전기 영동법을 이용하여 사이토카인 mRNA의 발현정도를 관찰하였다. 상기 사이토카인 mRNA의 겔 전기영동의 분리 양식을 나타내는 겔의 자동방사선 사진을 도 1에 도시했다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 프로브에 의해서 보호된 부분만이 밴드로 나타나게 된다.

상기 대조군과 동일한 조건으로 실험군 중 제 1군에 대하여 리보뉴클레아제 보호 분석을 실시 하였다. 상기 제 1군에 대한 사이토카인 mRNA의 겔 전기영동의 분리 양식을 나타내는 겔의 자동방사선 사진을 도 2에 도시하였다.

또한, 대조군 및 제 1군의 심장 이식 수술 후 각 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13일째의 IL-1α, TNFα, TNFβ, IL-6, IL-10, IFNγ, IL-2의 상대적인 발현 강도를 조사하여 그래프로 나타냈다(도 3 내지 도 9 참조).

도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군에 대한 RPA를 실행한 결과 TNFα, TNFβ, IL-1β, IL-6 및 IFNγ의 밴드를 관찰할 수 있었다.

상기 TNFα와 TNFβ는 단핵 대식세포 또는 T 세포에 의하여 생성되며, 그 역할은 호중구 또는 내피세포를 활성화하여 염증을 일으키는 역할을 한다(도 3 및 도 4의 A 참조). 따라서, 비처리 대조군에서는 TNFα 및 TNFβ가 많이 발현되는 것은 당연한 결과이며, 거부반응의 초기단계에 있어서 단핵구의 역할의 중요성을 확인시켜준다. IL-1β의 경우도 역시 단핵 대식세포에 의해 발현되며, 이 역시 내피세포를 활성화하여 염증을 유도하고, 응고를 활성화 시킨다(도 5의 A 참조). 또한 IL-6도 단핵 대식세포에 의하여 생성되며, 성숙된 B 임파구 또는 흉선세포의 성장에 영향을 미친다(도 6의 A 참조).

대조군에 대하여 전체적으로 가장 많이 발현되고 있는 사이토카인은 IL-1β로 그 양이 5일째에 가장 많고, 그 후 감소 경향을 보이다가 다시 증가하는 양상을 보인다. 따라서, 상기 IL-1β의 발현에 의하여 단핵구들에 의한 염증이 증가하여 이로 인하여 장기이식 후의 거부반응을 더욱 가속화시키게 된다.

제 1군에 대해서도, 도 2에 나타낸 바와 같이, RPA를 실행한 결과 TNFα, TNFβ, IL-1β, IL-6 및 IFNγ의 밴드 외에도 대조군에서 발현되지 않았던 IL-10 및 IL-2의 밴드를 관찰할 수 있다.

상기 IL-10은 단핵구 및 단핵세포의 억제효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 IL-10이 대량으로 발현한다(도 7의 B 참조)는 것은 콜키친 및 클로로카인의 투여에 의해 단핵구나 대식세포의 활성화가 억제된다는 것을 알 수 있다.

또한, 주목할 것은 IL-2의 발현이다(도 8의 B 참조). 대조군에서 IL-2가 거의 발현되지 않았으나, 콜키친 및 클로로카인을 투여한 제 1군에서는 어느 정도의 IL-2가 발현되고 있다. 또한 IFNγ의 발현과 관련하여, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이 3일째와 5일째에 IFNγ가 가장 많이 발현되고 있는데, 이는 IL-2와 마찬가지로 상당히 의외의 결과였다. IL-2나 IFNγ 모두 T 세포에 의해 만들어지며 T 세포의 증식이나 면역세포들의 활성화, 또 MHC 종 I, II 분자의 발현양을 증가시키는 사이토카인임에도 불구하고 생체 내에서 면역억제효과가 있는 것으로 나타난 콜키친 및 클로로카인 처리한 제 1군에서 발현된다는 것은 매우 흥미로운 일이 아닐 수 없다. 특히, IFNγ는 3, 5일째 최고치를 나타낸 후 7일째에 갑자기 감소하였다가, 서서히 다시 증가하는 양상을 보였다. 이러한 양상은 콜키친 및 클로로카인의 효과에 의해 IL-2와 IFNγ를 만드는 T 세포 또는 NK 세포 극도로 활성화되어 이에 의한 피드백 조절에 의해 사이토카인의 양이 급격히 줄어들 가능성과 T 임파구나 NK 세포의 과도한 활성화로 인하여 세포자멸사를 일으켜 많은 종류의 사이토카인들이 줄어들며, 이로 인해 면역억제효과가 나타날 가능성이 있는 것으로 보인다.

3) 조직분석

조직상의 변화를 관찰하기 위하여 다음과 같은 헤마톡실린과 에오신 (Hematoxiline & Eosin) 염색을 시행하였다.

대조군 및 제 1군의 조직을 파라핀 포매한 다음 2 내지 3㎛의 슬라이드편으로 제조하였다. 상기 각 슬라이드편을 60℃에서 30분간 방치하여, 대조군 및 제 1군의 조직이 염색과정 동안 슬라이드로부터 떨어지지 않게 부착한 다음, 각 슬라이드편을 히스토클리어(histoclear)로 파라핀을 제거하였다. 이어서, 상기 각 슬라이드편을 100%, 95% 및 90% 알콜로 순차적으로 처리하고, 함수시킨 후, 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxiline)으로 5분간 핵 염색을 시행하였다. 핵 염색된 각 슬라이드편에 대해 산성 알콜을 사용하여 과잉 염색된 부분을 탈색시키고, 암모니아수를 이용하여 매염한 다음 에오신으로 세포질을 염색하였다. 이를 다시 90%, 95% 및 100% 알콜로 순차적으로 처리하고 탈수시킨 다음, 히스토클리어로 치환시켜 퍼마운트(Permount)로 봉입한 후, 광학 현미경 아래에서 이식된 심장의 조직상의 변화를 관찰하였다.

이 결과, 대조군에서는 혈전증 및 근육조직의 섬유화가 심하게 진행되어 있었고, 또한 각종 임파구 및 대식세포 등이 조직내로 침투하여 심한 조직 손상을 일으키고 있었다. 그러나, 콜키친과 클로로카인을 처리한 제 1군의 경우는 위스터 랫의 심장조직이 매우 깨끗하게 보존되었으며, 조직 내로 침투한 나머지 면역세포들이 매우 적음을 확인 할 수 있었다.

본 발명은 현재 임상적으로 안정성이 인정된 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 사용하는 면역억제제이다. 따라서, 상기 면역억제제는 종래의 면역억제제와 비교하여 다양한 투여 경로를 통해 적은 양을 사용하여 단기간 동안 투여해도 보다 좋은 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 장기이식 후의 생존율도 종래의 면역억제제를 사용한 경우보다 매우 높다.

Claims (3)

1. 콜키친을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제.
2. 제 1항에 있어서, 추가로 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 것인 면역억제제.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역억제제는 장기이식 거부반응에 사용되는 것인 면역억제제.