KR20020030296A

KR20020030296A - 면역억제제로서의 콜키친의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20020030296A
Application number: KR1020000060859A
Authority: KR
Inventors: 한덕종; 김송철; 조경민; 김태희; 위유미
Original assignee: 한덕종
Priority date: 2000-10-17
Filing date: 2000-10-17
Publication date: 2002-04-25

Abstract

본 발명은 콜키친을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로 함유하여 장기이식시 발생하는 급성 및 만성 거부반응을 억제하는 면역억제제에 관한 것이다.

Description

면역억제제로서의 콜키친의 신규한 용도{A NOVEL USE OF COLCHICINE AS AN IMMUNOSUPPRESSANT}

본 발명은 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 활성성분으로 함유하고 잔기 이식에 따른 면역 거부반응을 억제하는 신규한 면역억제제에 관한 것이다.

장기이식 거부반응, 자기면역증 질환 및 알레르기 등은 인체의 방어를 담당하는 면역체계가 인체에 해롭지 않은 물질에 대하여 방어체계를 작동시켜 이식된 장기나 자기 조직을 파괴하는 등의 인체에 해로운 영향을 미치는 곳에서 일어난다.

일반적으로, 장기이식의 경우 말기 장기부전 환자의 가장 확실한 치료 방법이지만, 수여자와 공여자의 MHC 유전자가 일치하지 않는다면, 인체의 면역계는 이식편을 몸에 해로운 병균으로 인식하여 T 임파구, B 임파구, 대식세포, 천연 킬러 세포(natural killer cell, 이하 NK 세포라 함) 등을 활성화시켜 이식된 장기를 공격하게 된다.

이러한 원하지 않는 방향의 면역 반응을 억제하는 것을 면역억제라고 하며,이에 이용되는 약품을 면역억제제라 한다.

이와 같은 면역억제를 위하여 지금까지 시클로스포린 A(이하, CsA라 칭함) 및 타크로리무스(이하, FK506라 칭함) 등의 면역억제제가 개발되어 왔다. CsA는 1976년에 곰팡이 트릭코더마 폴리스포럼으로부터 분리되었는데, 다른 면역억제제에 비하여 면역세포에 대한 독성이 없이 장기이식 후 박테리아 감염을 줄일 수 있었다. 또한 스트렙토마이세스 추쿠바엔시스로부터 분리된 FK506은 CsA보다 10 내지 100배의 효율이 있다고 보고되어 있다. 그러나, 상기 CsA 및 FK506은 심각한 신장독성 및 간독성 등의 부작용을 포함하고 있어 해결해야할 문제점을 가지고 있다 (Bierer, B.E., Hollander, Fruman, D., and Burakoff, S.J.: Cyclosporin A and FK506: Molecular mechanism of immunosuppression and probes for transplantation biology, Curr. Opin. Immunol. 1993, 5:763-773; Schreiber, S.L. and Crabtree, G.R.: The mechanism of action of Cyclosporin A and FK506, Immunol. Today 1992, 13:136 참조). 따라서, 상기와 같은 부작용을 줄이면서도 효과적으로 면역억제를 할수 있는 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 종래 면역억제제의 문제점을 해결하기 위해 종래에 급성 통풍 및 급성 췌장염 치료의 효과를 갖는 콜키친이 요구되지 않는 면역반응을 탁월하게 억제할 수 있음을 발견하였다. 또한, 콜키친이 말라리아 및 아메바증 치료에 사용되는 클로로카인이 함께 사용될때, 면역억제 효과가 더 높아짐을 확인하였다 (Wallace, SL. Colchicine, Sernin, Arthritis, Rheum, 1974:3:369-381).

본 발명은 콜키친을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 추가로 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제에 관한 것이다.

더 구체적으로는 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로 함유하고 장기이식시 발생하는 급성 및 만성 거부반응을 효과적으로 억제하는 면역억제제에 관한 것이다.

도 1은 리보뉴클레아제 보호 분석(RPA) 결과로 나타난 대조군의 이식 조직에서 다양한 사이토카인의 발현 수준을 나타내는 자동방사선 사진이다.

도 2는 RPA 결과로 나타난 이용한 1군의 이식 조직에서 다양한 사이토카인의 발현정도를 나타내는 자동방사선 사진이다.

도 3a 내지 3g는 각각 RPA 결과로 나타난 대조군 및 콜키친과 클로로카인을 처리한 1군의 이식 조직에서의 TNFα, TNFβ, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-2 및 IFNγ 발현을 나타낸 그래프이다. A: 대조군, B: 1군

도 4는 콜키친이 처리된 실험군 및 비처리 대조군의 Jurkat Tag 세포주에서의 β-갈락토시다제의 발현량(O.D)을 비교한 그래프이다.

도 5는 다양한 농도의 콜키친을 처리한 Jurkat Tag 세포주의 DNA 단편화를 보여주는 자동방사선 사진이다.

도 6은 MLR(Balb/c 마우스 비장의 임파구:C57b/6 마우스 비장의 임파구)에서의 콜키친 농도에 따른 메틸-¹⁴C-티미딘의 혼입량을 도시하는 그래프이다.

도 7a는 항-Cpp-32 모노클로날 항체를 이용하여 콜키친이 처리된 Jurkat Tag세포주의 웨스턴블롯의 결과를 보여주는 자동방사선 사진이다.

도 7b는 Jurkat Tag 세포주에 콜키친을 다양한 시간으로 처리한 후 모노클로날 항체 OKT3로 웨스턴블롯한 결과를 보여주는 자동방사선 사진이다.

도 8은 H&E 염색법에 의해 염색된 대조군에서 이식 조직의 방사선 사진이다.

도 9a 및 9b는 H&E 염색법에 의해 염색된 1군에서 이식 조직의 방사선 사진이다.

본 발명의 면역억제제의 유효성분인 콜키친은 연황색 분말로서, 화학식 I을 갖는 N-(5,6,7,9-테트라히드로-9-옥소벤즈[에이]헵탈렌-7-일)-아미드이다:

(I)

또한, 본 발명의 면역억제제의 유효성분인 클로로카인은 수용성의 백색 결정형 물질로서, 화학식 II을 갖는 7-(클로로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)-퀴놀린·디하이드로클로라이드이다:

(II)

본 발명의 콜키친은 동종 장기이식에 의한 급성 면역반응에 대해 소량의 투여로도 우수한 면역억제 효과를 발휘하였으며, 콜키친과 클로로카인을 복합하여 투여한 경우 보다 큰 면역억제 효과를 가졌다 (실시예 1). 이와같은 면역억제 효과는 이식된 장기 조직에 대해 헤마톡실린과 에오신 염색을 이용한 분석에 의해서도 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역억제제를 투여한 경우, 이식된 장기의 조직이 매우 깨끗하게 보존되고, 면역세포들이 조직 내로 침윤되지 않았다 (실시예 2).

이식된 조직 내에 침윤된 여러 가지 면역세포들에 분비되는 여러가지 사이토카인은 거부반응에 있어서 매우 중요한 지표중의 하나이다. 이러한 사이토카인들의 발현되는 양의 측정은 이식 조직에서 일어나고 있는 면역반응의 종류나 강도를 쉽게 예측할 수 있게 해준다. 본 발명에서는 이식 조직에서의 사이토카인이 발현되는 정도를 정량적으로 알아보기 위하여 리보뉴클레아제 보호 분석법 (RPA)을 이용하였다(실시예 3). 비처리 대조군에서 IL-2가 거의 발현되지 않았으나, 콜키친 및 클로로카인을 투여한 1군에서는 어느 정도의 IL-2가 발현되고 있다 (도 3f의 B 참조).

본 발명자들은 또한 실시예 4의 분자생물학적 분석을 통하여, 상기에서 언급된 IL-2의 발현과 관련된 콜키친의 이식면역 억제기작을 밝혔다. 실시예 4의 결과들로부터, 콜키친은 T 세포에서 2배 가량의 IL-2 발현하게 하여 AICD (Activation- Induced Cell Death)을 유도하여 세포자멸사가 일어나게 하는 것임을 확인할 수 있다. 또한, 콜키친에 의한 T 세포의 세포자멸사는 T 세포 수용체를 경유한 세포자멸사 시그널에 매우 민감하며, T 세포가 콜키친에 노출되어 있는 상태에서의 활성화 시그널은 활성화되는 T 세포 클론을 세포자멸사에 의해 제거시킨다는 것을 알 수 있다. 따라서, 면역억제제로서의 콜키친은 장기이식 초기에 타인의 장기에 의해 활성화되는 즉, 동종반응성의 T 세포들을 세포자멸사에 의하여 제거하여, 장기이식에 뒤따르는 급성 이식 거부반응을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 생각된다.

또한, 본 발명의 콜키친은 동맥벽 절편 이식을 이용한 이식모델에서 확인되듯이 만성 이식 거부반응에도 면역억제 효과를 가졌다 (실시예 5).

본 발명은 면역억제의 유효성분인 콜키친 및 클로로카인은 이미 임상학적으로 그 안정성이 확인된 물질이다. 따라서, 이 물질들을 유효성분으로 하는 본 발명의 면역억제제는 종래의 면역억제제로 인한 부작용없이, 다양한 투여 경로를 통해 소량을 사용하여 단기간 동안 투여해도 보다 우수한 면역억제 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 콜키친 및/또는 클로로카인은 약학적으로 허용가능한 담체, 통상적인 보강제 및 부형제를 첨가하여 경구투여 또는 비경구 투여할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 정제 또는 캡슐과 같은 고형으로 제제화할 수 있다. 비경구 투여는 정맥 주사 등의 방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 유효성분을 생리 식염수 등에 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

콜키친 및/또는 클로로카인의 투여량은 동물 또는 인간, 연령, 체중, 기대되는 치료학적 효과, 투여 경로, 처리 기간 등에 의존하여 변화하지만, 만족스러운 효과는 각각 10 내지 40㎍/㎏과 5 내지 10mg/㎏, 특히 각각 10 내지 20㎍/㎏와 5 내지 7mg/㎏의 투여량을 사용하여 얻어질 수 있다.

실시예

하기의 실시예들은 단지 본 발명의 예시를 목적으로 한다.

실시예 1

동종 심장이식에 따른 면역반응의 억제

체중이 250g 정도인 8주령의 수컷 루이스 랫(Lewis rat) 15 마리의 심장을 적출하여, 체중이 300g 정도인 8주령의 수컷 위스터 랫(Wister rat) 15 마리에 이식하였다.

상기와 같은 심장 이식 수술 2시간 전에 대조군으로서 위스터 랫 3 마리에 대해서는 아무 약품도 처리하지 않았고, 실험군으로서 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 10㎍/㎏ 및 클로로카인 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고 (1군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 40㎍/㎏ 및 클로로카인 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고 (2군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 10㎍/㎏만을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고 (3군), 위스터 랫 3 마리에 대해서는 콜키친 40㎍/㎏ 만을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였고 (4군), 나머지에 위스터 랫 3 마리에 대해서는 CsA 5㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 희석하여 정맥주사로 투여하였다 (5군).

심장 이식 후, 30일 동안 각 실험군의 위스터 랫에 대해서는 수술 전에 투여한 양과 동일한 양의 약제를 정맥주사로 투여하였다.

상기와 같은 심장 이식 수술을 한 날로부터 각 대조군 및 실험군의 심장박동을 손으로 촉진하여 그 정도를 ++++ (강하면서 빠른 박동), +++ (강하거나 빠른 박동), ++ (강하지도 빠르지도 않으나 뚜렷한 박동), + (미약하지만 전반적인 박동), ±0 (부분적인 박동)으로 분류하여 측정하였다.

그 결과, 비처리 대조군에서는 8 내지 9일 뒤 이식된 심장의 거부반응으로 인하여 심장 박동이 멈추는 것을 확인할 수 있었다.

반면 실험군의 경우에서(표 1 참조), 1군의 위스터 랫의 경우는 심장박동이 각각 385일 및 372일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었고, 이 경우 생체 검사 결과 어떠한 염증도 일어나지 않았다. 또한, 2군의 위스터 랫의 경우 각각 196일 및 141일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었으며, 3군의 위스터 랫의 경우 각각 332일 및 101일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었고, 4군에서는 152일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었다. 5군의 경우에서는 166일 이상 계속되는 것을 관찰할 수 있었다.

상기 관찰 결과로부터, 3군 및 4군의 경우와 같이 콜키친 단독으로 투여되는 경우도 면역억제 효과가 있었고, 콜키친과 클로로카인을 복합하여 투여하는 1군 및 2군의 경우가 보다 더 큰 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 3군 및 4군은 CsA를 투여한 군인 5군과 비교해서 소량을 사용하면서도 우수한 면역억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.

	심장박동	이식 후 생존일
1군 (#1)	+++	> 385
1군 (#2)	++++	> 372
2군 (#1)	+++	> 196
2군 (#2)	+	>141
3군 (#1)	++	>332
3군 (#2)	±0	>101
4군	+	>152
5군	++	>166

*. 표 1에서 각각의 심장 박동은 랫들을 희생시키기 바로 전에 측정된 것이다.

실시예 2

이식된 기관의 조직 관찰

이식된 장기 조직상의 변화를 관찰하기 위하여 다음과 같은 헤마톡실린과 에오신 염색을 시행하였다.

10% 포르말린이 염착제로 시용되었다. 대조군 및 1군의 조직을 파라핀 포매한 다음 2㎛의 슬라이스편으로 제조하였다. 크실렌 및 알콜을 사용하여 슬라이스편으로부터 파라핀을 제거한 후, 슬라이스편을 핵 염색을 위해 헤마토실린으로 배양하고 헹구었다. 슬라이스편을 재빨리 1% 산성 알콜로 적시어 파라핀을 제거하고, 슬라이스편이 밝은 청색으로 염색될 때까지 암모니아수에 적셨다. 세포질 염색을 위해 슬라이스편을 에오신에서 배양하고 물로 헹구었다. 탈수 및 세척 후에 슬라이스편을 커버 슬립위에 고정시켰다. 결과적으로 생성되는 슬라이스편이 있는 슬라이드를 현미경으로 관찰하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 대조군에서는 혈전증 및 근육조직의 섬유화가 심하게 진행되어 있었고, 또한 각종 임파구 및 대식세포 등이 조직내로 침윤하여 심한 조직 손상을 일으키고 있었다. 그러나, 콜키친과 클로로카인을 처리한 1군의 경우는 위스터 랫의 심장조직이 매우 깨끗하게 보존되었으며, 조직 내로 침투한 나머지 면역세포들이 매우 적음을 확인 할 수 있었다 (도 9a 및 9b 참조).

실시예 3

리보뉴클레아제 보호 분석(RPA)

먼저 비처리 대조군을 심장 이식 수술한 후 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15일 순으로 희생시켜, 각각의 이식된 심장조직을 얻은 후 각 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, TNFβ그리고 IFNγ 등의 사이토카인에 대한 프로브와 혼성화시킨 후 리보뉴클레아제로 소화하고, 이들을 겔상에 로드하여 전기영동시켜 사이토카인 mRNA의 발현정도를 관찰하였다. 상기 사이토카인 mRNA의 겔 전기영동의 분리 양식을 나타내는 자동방사선 사진을 도 1에 도시했다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 프로브에 의해서 보호된 부분만이 밴드로 나타나게 된다.

상기 대조군과 동일한 조건으로 실험군 중 1군에 대하여 리보뉴클레아제 보호 분석을 실시하였다. 상기 1군에 대한 사이토카인 mRNA의 겔 전기영동의 분리 양식을 나타내는 자동방사선 사진을 도 2에 도시하였다.

또한, 대조군 및 1군의 심장 이식 수술 후 각 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13일째의 IL-1β, TNFα, TNFβ, IL-6, IL-10, IFNγ, IL-2의 상대적인 발현 강도를 조사하여 그래프로 나타냈다 (도 3a 내지 도 3g 참조).

도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군에 대한 RPA를 실행한 결과 TNFα, TNFβ,IL-1β, IL-6 및 IFNγ의 밴드를 관찰할 수 있었다. 상기 TNFα와 TNFβ는 단핵 대식세포 또는 T 세포에 의하여 생성되며, 그 역할은 호중구 또는 내피세포를 활성화하여 염증을 일으키는 역할을 한다. IL-1β의 경우도 역시 단핵 대식세포에 의해 발현되며, 이 역시 내피세포를 활성화하여 염증을 유도하고, 응고를 활성화 시킨다. 또한 IL-6도 단핵 대식세포에 의하여 생성되며, 성숙된 B 임파구 또는 흉선세포의 성장에 영향을 미친다. 따라서, 비처리 대조군에서 TNFα, TNFβ, IL-1β 및 IL-6가 발현되는 것은 당연한 결과이며, 거부반응의 초기단계에 있어서 단핵구의 역할의 중요성을 확인시켜준다. 대조군에 대하여 전체적으로 가장 많이 발현되고 있는 사이토카인은 IL-1β로 그 양이 5일째에 가장 많고, 그 후 감소 경향을 보이다가 다시 증가하는 양상을 보인다. 따라서, 상기 IL-1β의 발현에 의하여 단핵구들에 의한 염증이 증가하여 이로 인하여 장기이식 후의 거부반응을 더욱 가속화시키게 된다.

1군에 대한 RPA에서는(도 2), TNFα, TNFβ, IL-1β, IL-6 및 IFNγ의 밴드 외에도 대조군에서 발현되지 않았던 IL-10 및 IL-2의 밴드를 관찰할 수 있다.

상기 IL-10은 단핵구 및 단핵세포의 억제효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 IL-10이 대량으로 발현한다 (도 3e 참조)는 것은 콜키친 및 클로로카인의 투여에 의해 단핵구나 대식세포의 활성화가 억제된다는 것을 알 수 있다.

또한, 주목할 것은 IL-2의 발현이다 (도 3f의 B 참조). 대조군에서 IL-2가 거의 발현되지 않았으나, 콜키친 및 클로로카인을 투여한 제 1군에서는 어느 정도의 IL-2가 발현되고 있다. 또한 IFNγ의 발현과 관련하여, 도 3g에 나타낸 바와 같이 3일째와 5일째에 IFNγ가 가장 많이 발현되고 있는데, 이는 IL-2와 마찬가지로 상당히 의외의 결과였다. IL-2나 IFNγ 모두 T 세포에 의해 만들어지며 T 세포의 증식이나 면역세포들의 활성화, 또 MHC 종 I, II 분자의 발현양을 증가시키는 사이토카인임에도 불구하고 생체 내에서 면역억제 효과가 있는 것으로 나타난 콜키친 및 클로로카인 처리한 1군에서 발현된다는 것은 매우 흥미로운 일이 아닐 수 없다. 특히, IFNγ는 3, 5일째 최고치를 나타낸 후 7일째에 갑자기 감소하였다가, 서서히 다시 증가하는 양상을 보였다.

이러한 양상은 하기의 실시예들에서 확인할 수 있듯이, T 임파구의 과도한 활성화로 인하여 세포자멸사를 일으켜 많은 종류의 사이토카인들이 줄어들며, 이로 인해 면역억제효과가 나타나는 것으로 보인다.

실시예 4

분자생물학적 방법에 의한 분석

(IL-2 발현 분석)

콜키친의 면역억제 효과에 대해 더욱 정확한 기작을 규명하고자 분자생물학적 방법에 의하여 분석해 보았다. 먼저 RPA 실험에서 콜키친 및 콜키친과 클로로카인 처리군에서 특이하게 발현하였던 IL-2에 대하여 실험을 진행하였다.

분석은 하기와 같이 축조된 Jurkat Tag 세포주로 수행되었다: Jurkat 세포주를 SV40 기원을 함유하는 외래 유전자로 순간 트랜스펙션할 수 있도록 SV40 Large T 항원을 코딩하는 DNA 서열로 트랜스펙션하고, T 세포 활성화에 따른 IL-2의 발현을 쉽게 알아볼수 있도록, 다중 NFAT(Nuclear Factor for Activated T cell) 결합부위와 IL-2 최소 프로모터에 링크된 β-갈락토시다제 유전자로 또한 트랜스펙션시켰다.

이 세포주는 T 세포 활성화 시스널에 의해 발현되는 IL-2 대신, 발현량을 쉽게 정량할 수 있는 β-갈락토시다제를 발현한다. 즉, 이 세포주에 활성화 자극을 줄 경우, IL-2 대신 β-갈락토시다제가 발현되어, 그 활성화 정도를 정량적으로 분석할 수 있다. 이러한 세포주를 이용하여 콜키친이 IL-2 생성에 미치는 영향을 조사하였다.

β-갈락토시다제 분석을 위하여 비처리 대조군, 콜키친을 처리군의 샘플들을 PBS (phosphate buffered saline)로 3회 세척한 후, Triton 용해 용액 (100mM 인산칼륨 pH7.8, 0.2%(v/v) Triton X-100, 1 mM DTT)에 재현탁후, 14000rpm에서 15분간 원심분리후 상징액을 취했다. 이 상징액을 1xONPG (0.1M 인산나트륨 pH7.5중의 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 4mg/ml), 100xMg 용액 (0.1M, MgCl₂), 0.1M 인산나트륨 pH 7.5와 혼합하여 37℃에서 연한 노란색이 발색될때까지 배양한다. ONPG는 β-갈락토시다제의 기질 중의 하나로 β-갈락토시다제와 반응하면 연한 노란색을 발색하게 되며, 분광광도계를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정한다.

8시간 후에 세포를 수확하였다. 수확전 세포의 형태를 도립(inverted) 현미경하에서 관찰한 결과, 콜키친을 처리한 군에서 심한 세포자멸사의 양상을 관찰할 수 있었으며, 세포수가 상당히 줄어있음을 알 수 있었다. 세포수가 많이 변화하였기 때문에 (비처리군은 1000000에서 1900000으로, 처리군은 1000000에서 480000으로) 각 군 끼리의 O.D 값을 직접 비교할 수 없어서 β-갈락토시다제 유니트를 세포수로 나누어, β-갈락토시다제 유니트/세포로 각 β-갈락토시다제 발현을 비교하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

비처리 대조군과 콜키친을 처리한 군을 비교하였을 때, 콜키친 처리군이 비처리 대조군에 비하여 2배 정도의 β-갈락토시다제 발현량을 보였다. 이 결과를 살펴 볼때, 콜키친은 T 세포에서 2배 가량의 IL-2 발현하여, 이로 인해 AICD 가 유도되어 세포자멸사를 일어나는 것으로 생각된다.

(DNA fragmentation Assay)

Jurkat Tag 세포주에 대해 다양한 농도의 콜키친 처리에 의한 세포자멸사를 DNA 단편화로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 의하면, 매우 낮은 콜키친 농도에서도 T 세포의 DNA 단편화가 일어나고 있음을 확인할 수 있다.

(Mixed Lymphocyte Reaction)

상기 결과들을 생체내 실험으로 더 상세히 알아보기 위하여 MLR (Mixed Lymphocyte Reaction)을 병행하였다. 상기 결과로 예측해 볼때, 콜키친에 의하여 IL-2의 생산이 증가되기 때문에 MLR의 결과는 임파구의 일시적인 증식이 예상된다.

MLR은 비처리대조군, 콜키친 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001㎍/ml 처리군으로 나누어 진행하였으며, Balb/c 마우스를 활성자로 C57B/6 마우스를 응답자로 사용하여 각각의 비장을 적출한 후, 비장내에 있는 림프구를 분리하여 활성자:응답자=4:1의비율로 섞어준 뒤, 3일후 메틸-¹⁴C-티미딘을 첨가한 다음 16 시간후에 수확하여 β-카운터로 세포내로의 티미딘 혼입을 측정하였다. 그 결과, 각 농도별의 콜키친 처리군에서 비처리 대조군에 비하여 임파구의 2-3배 가량 많은 증식을 보였다 (도 6 참조). 또한, 0.001㎍/ml의 낮은 농도의 콜키친에서도 다른 높은 농도의 처리군과 비슷한 효과를 보였다.

(Anti-Cpp-32 westernblot)

상기 결과를 세포자멸사 신호전달경로 상에서 확인해 보기 위하여, caspase-32 (Cpp-32)에 대한 웨스턴블롯을 시행하였다.

Cpp-32의 경우 세포자멸사 시그널이 전달될 경우 원래의 32kDa의 비활성 형태에서, 17kDa의 활성 형태로 절단이 일어난다. 콜키친 처리후 6-8시간 후 세포자멸사가 진행되므로 Jurkat Tag 세포주를 콜키친으로 처리후 항-Cpp-32 단일클론 항체로 웨스턴블롯 하였다. 그 결과 콜키친 처리군에서만 17kDa의 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다 (도 7a 참조).

또한, 콜키친 처리하의 T 세포가 활성화 시그널에 의해 어떻게 반응하는 지 알아보기 위해, 항-Cpp-32 웨스턴블롯을 하였다. 즉, T 세포의 활성화를 위하여 T 세포 수용체 복합체의 CD3-ε사슬에 대한 단일클론 항체인 OKT3를 이용하여 T 세포 활성화를 가한 후, 용해하여, 전기영동한 후 웨스턴블롯을 시행하였다. 그 결과 활성화 3분, 5분 후에 각기 17kDa의 밴드가 나타났는데, 3분에 비해 5분 활성화를 가했을때 더 진한 17kDa의 밴드를 관찰할 수 있었다 (도 7b 참조).

실시예 5

동맥벽 절편 이식 모델에서 만성 면역반응의 억제

동맥벽 절편 이식 모델을 이용한 만성 이식모델로 이용하여, 만성이식 거부반응에서 콜키친의 효과를 시험하였다.

8 주령의 수컷 루이스 랫 3 마리로부터의 동맥벽 절편을 8 주령의 수컷 위스터 랫 3 마리에 이식하였다. 대조군의 위스터 랫(K군)에는 아무 약품도 처리하지 않았다. 이식후 10일 동안 L군의 랫에는 콜키친(10㎎/㎏)을 투여하고, M군의 랫에는 CsA(5㎎/㎏) 및 콜키친(10㎎/㎏)을 투여하였다.

2개월후에, 각 군의 이식된 동맥벽을 조직학적으로 관찰하였다. 관찰 결과를 +++ (심하다), ++(보통), +(가벼움) 및 -(없음)으로 분류하였다 (표 2 참조).

이식된 동맥벽의 조직학적 관찰

	처리	내벽	중벽	외벽	기타
	처리	스핀들 세포의 증식	염증세포의 침윤	괴사	기타	스핀들 세포의 증식	염증세포의 침윤
K군 (#1)	비처리	++	++	+++	++	++	*.석회화
K군 (#2)	비처리	+++	+	+	+++	+++
L군 (#1)	콜키친	++	+	-	+	++
L군 (#2)	콜키친	++	+	-	+	++
L군 (#3)	콜키친	+	+	-	++	++
M군 (#1)	CsA/콜키친	++	+	+	+	++
M군 (#2)	CsA/콜키친	+	+	-	+	++
M군 (#3)	CsA/콜키친	+	+	-	+++	+++

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 면역억제제를 사용하지 않는 대조군(K군)에 비하여, 콜키친이 처리된 L군에서 혈관내벽 및 중벽, 외벽의 염증 세포 침윤과 괴사, 스핀들 세포증식이 감소하였다. 게다가, CsA와 콜키친을 함께 사용한 M군에서콜키친 단독 처리군에 보다 더 우수한 면역억제 효과를 보였다.

본 발명의 면역억제제는 임상적으로 이미 안정성이 인정된 상태인 콜키친, 또는 콜키친 및 클로로카인을 유효성분으로서 사용하여, 종래의 면역억제제와 비교하여 다양한 투여 경로를 통해 적은 양을 사용하여 단기간 동안 투여해도 보다 좋은 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 장기이식 후의 생존율도 종래의 면역억제제를 사용한 경우보다 매우 높다.

Claims

콜키친을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제.
제 1항에 있어서, 추가로 클로로카인을 유효성분으로서 함유하는 것인 면역억제제.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역억제제는 급성 이식면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역억제제.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역억제제는 만성 이식면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역억제제.