KR100264623B1 - 인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및 이의 제조방법 - Google Patents

인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트-결합 단백질을 분해함으로써 수득할 수 있는, 글루코오스아민, 갈락토오스, 만노오스, 이노시톨, 인산, 에탄올아민 및 Asn-Cys-Tyr의 서열을 지닌 펩티드를 함유하는, 포스포이노시톨-글리칸-펩티드, 이의 제법 및 당뇨병 및 비-인슐린-의존형 당뇨병을 치료하기 위한 이의 용도에 대해 기술하였다.

Description

인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및 이의 제조방법
본 발명은 인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인슐린은 인슐린-감응성 조직상에서 다양하게 작용한다. 한가지 중요한 효과는 포유동물에 투여되는 경우 글루코오스량을 신속하게 감소시키는 것이다. 이는 글루코오스가 혈액으로부터 근세포와 지방세포에 의해 신속하게 흡수되기 때문이다. 더우기, 인슐린은 글리코겐 신테타제(synthetase)를 활성화시키고 지방분해를 억제한다. 인슐린은 아미노산으로부터 단백질 합성을 촉진시키고, 피루베이트 데하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase) 및 포스포프럭토키나제(phosphofructokinase)의 분비를 증가시키며, 피루베이트 카복실라제 및 프럭토오즈-1,6-비스포스파타제와 같은, 포도당 신생 작용을 하는 특정 효소의 형성을 억제한다.
비-인슐린-의존성 당뇨병인, 제II형 당뇨병은 근육 조직 또는 지방 조직과 같은 말초 조직이 인슐린 내성을 갖고 있는 것과 관련이 있다. 이러한 조직에서의 글루코오스 이용성의 감소는 글루코오스 수송 및 연속적인 대사과정(당원형성, 지방형성)에 대한 인슐린 자극의 부재에 의해 유발된다. 이러한 다양한 내성은 수용체 또는 후-수용체 단계에, 즉 제2메신저(messenger)가 생성되기 전의 단계에 결함이 발생했음을 의미한다[참조:Garvey, Diabetes/Metabolism Reviews, 5, (1989), 727-742].
현재까지 인슐린 수용체를 경유하지 않으면서도 인슐린-유사 작용을 하는 활성물질에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명에 이르러, 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트(cAMP)-결합 단백질로부터 수득가능한 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드가 실험관내에서 인슐린-유사 작용을 하며 또한 인슐린-내성 조직상에서 인슐린-유사 작용을 나타냄이 밝혀졌다.
이와 같이, 본 발명은 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트-결합 단백질 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 분해함으로써 수득할 수 있는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드에 관한 것이다.
용어, 인슐린-내성 조직은 예를 들면, 더 이상 활성 인슐린 수용체를 갖지 않는 랫트의 지방세포를 의미한다. cAMP-결합 단백질은 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트아 결합하는 특성이 있는 단백질이다.
현재, 본 발명에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드에 대한 구조적 자료에 따르면, 이는 갈락토오즈, 글루코오스아민 및 만노오스를 함유하는 글리칸 부위를 가지며, 포스포릴에탄올아민 잔기를 통해 펩타이드의 카복실 말단에 아미드 결합에 의해 결합된 포스포이노시톨을 나타낸다. 펩타이드는 고등 진핵 세포의 원형질막 단백질과 유사한 구조를 가지며, 막 앵커(membrane anchor)로서 작용하는 공유 결합된 당지질 내에서 재현된다[참조:Roberts et al., J. Biol. Chem., 263, (1983), 18776-18784]. 글리칸 잔기는 글루코오스아민, 갈록토오즈, 만노오스 및 1몰당 2개 이상의 인산염 잔기를 함유한다. 펩타이드의 서열은 -Asn-Cys-Try-이며, 포스포이노시톨 글리칸의 아미노 그룹으로 아미드 결합을 통해 아스파라긴산의 카복실 말단에 결합된다. 포스포이노시톨 글리칸 부위가 활성에 필요하다. 펩타이드는 인슐린-유사 작용을 증진시킨다. 또한, 완전한 구조의 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드에 의해서 뿐만 아니라 부분적 구조물에 의해서도 인슐린-유사 작용이 나타남이 밝혀졌는데, 예를 들면 포스포이노시톨 글리칸에 결합되어 있는 절단된 펩타이드 서열 또는 펩타이드가 없는 포스포이노시톨 글리칸으로도 역시 인슐린-유사 작용이 나타난다.
본 발명에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드의 생리학적으로 허용되는 염의 적합한 예는 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄염 뿐만 아니라, 생리학적으로 허용되는 유기 암모늄 또는 트리에틸아민 염기들이다.
본 발명에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드는 예를 들면,
a) cAMP-결합 단백질을 함유하는 유기체를 사용하는 단계,
b) cAMP-결합 단백질을 분리하는 단계,
c) cAMP-결합 단백질로부터 단백질 부위를 제거하고, 경우에 따라, 생성된 글리코실포스파티딜이노시톨-펩타이드를 정제하는 단계,
d) 공정 단계 c)에서 수득한 생성물로부터 모노- 또는 디아실글리세롤을 제거하는 단계 및
e) 공정 단계 d)에서 수득한 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 분리하는 단계에 의해 제조한다.
cAMP-결합 단백질은 다양한 유기체, 예를 들면 미생물, 식물, 진균 또는 동물의 기관으로부터 수득할 수 있다. 또한, 예를 들면, 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 특히 DSM 6649가 적합하다.
사카로마이에스 세레비지아에에 의한 cAMP-결합 단백질의 제조는 탄소원 및 질소원 뿐만 아니라 통상적인 무기염을 함유하는 영양액내에서 발효시킴으로써 수행한다. 이 cAMP-결합 단백질은 효모의 원형질 막내에 주로 축적된다.
공정 단계 a)의 가장 우수한 방법은 하기와 같다. 사카로마이세스 세레비지아에내의 cAMP-결합 단백질은 사카로마이세스 세레비지아에용으로 통상적인 영양액내에서 잘 형성된다. 배양은 호기적으로 즉, 예를들면, 진탕 플라스크 또는 발효기내에서 진탕 또는 교반하고, 경우에 따라 공기 또는 산소를 공급하면서, 심부배양한다. 이는 약 18 내지 35℃, 바람직하게는 약 25 내지 30℃, 특히 28 내지 30℃의 온도에서 수행할 수 있다. pH 범위는 2 내지 8, 유리하게는 3 내지 7이다. 일반적으로 효모를 이 조건하에서 약 107개 세포/영양액 ml가 될 때까지 배양한다.
공정 단계 b)의 가장 우수한 방법은 cAMP-결합 단백질을 분리하기 위해 영양 배지로부터 효모 세포를 분리하여 완충액으로 세척하는 것이다. 이는 예를 들면 뮐러 및 반들로브(Muler 및 Bandlow)가 기술한 바와 같이 분리한다[참조:Biochemistry, 28, (1989), 9957-9967]. 이를 위해, 효모 세포를 효소(자이몰라제)처리하여 원형질체(spheroplast)로 전환시키고 냉각(0 내지 4℃)하 프로테아제 억제제의 존재하에서 균질화기를 사용하여 분쇄한다. 효모 용해질(lysate)을 원심 분리하고, 세포 침전물을 완충액으로 세척하여 다시 원심분리한다. 상층액을 합하고 퍼콜 구배(Percoll gradient, 28% Percoll) 및 슈크로오스 구배(15 내지 28%의 슈크로오스)로 정제한다. 이러한 원심분리 단계에서 세포질, 원형질막, 마이크로솜 및 미토콘드리아가 서로 분리된다.
cAMP-결합 단백질을 원형질 막 분획으로부터, 예를 들면 N6-(2-아미노에틸)-cAMP-세파로오스 컬럼에 의해 결합시킨후, cAMP가 있는 컬럼으로부터 용출시켜 탈염한다.
공정 단계 c)에서 가장 우수한 방법은 cAMP-결합 단백질의 단백질 부위를 효소적으로 제거하는 것이다. 효소적으로 분해하기 위해, 예를 들면 프로나제(Pronase), 엔도프로테아자 Lys-C[라이소박터 엔지모게네스(Lysobacter enzymogense)] 또는 V8 프로테아제[스타필로코커스 아우레아수(Staphylococcus aureus)]와 같은 프로테아제를 사용한다. 이에 의해 단백질 부위가 분해된다. 프로테아제 V8의 사용에 의해 글리코실-포스파티딜이노시톨과 펩타이드 서열 Asn-Cys-Tyr이 수득되며, 프로테아제 프로나제와 함께 항온처리하면 펩타이드 부위가 아미노산 Asn 만으로 구성된 글리코실-포스파티딜이노시톨-펩타이드가 수득된다.
이 프로테아제는 예를들면, 트리클로로아세트산과 같은 산으로 침전시킨다. 이 글리코실-포스파티딜이노시톨-펩타이드는 원심분리시켜 프로테아제로부터 분리하며, 페닐-세파로오즈 컬럼으로 농축시키고 박층 크로마토그래피로 정제한다.
공정 단계 d)를 수행하기 위한 가장 우수한 방법은 글리코실-포스파티딜이노시톨-펩타이드에 결합된 모노- 또는 디아실글리세롤 잔기를 효소적으로 제거하고, 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 이러한 방식으로 유출시키는 것이다. 효소적 분해를 위해, 예를 들면, 포스파티딜이노시톨 특이적인 포스포리파제 C[바실러스 세레우스(Bacillus cereus])와 같은 포스포리파제를 사용한다. 이에 의해, 인산염 그룹을 통해 마이오-이노시톨에 결합된 모노- 또는 디아실글리세롤 잔기가 제거된다. 이 글리세롤-함유 잔기는 공정 단계 c)에서 프로테아제 처리에 의해 제거되지는 않는다. 공정 단계 c) 및 d)는 또한 역순으로 수행할 수 있다.
공정 단계 c) 및 d)에서의 효소 반응은 효소 반응이 잘 이루어지는 조건하에 세정제의 존재하에서 수행한다. 상기 효소에 대해 공지된 반응 조건을 기준으로 하여 최적 반응 조건을 설정하는 것은 당해 분야의 숙련가에게 용이하다.
공정 단계 e)의 가장 우수한 방법은 포스포리파제를 트리클로로아세트산과 같은 산으로 침전시키는 것이다. 이 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드는 포스포리파제로부터 원심분리에 의해 분리하고, 바이오겔 P-4 컬럼으로 정제하여 박층 전기영동에 의해 농축시킨다.
본 발명에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 이의 염은 당뇨병 또는 비-인슐린-의존성 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 조성물용 활성 물질로서 주로 사용된다.
따라서, 본 발명은 용해된 무정형 및/또는 결정 형태의 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및/또는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 이의 염을 유효량 포함하는 약제에 관한 것이다.
이 약제는 pH가 약 3.0 내지 9.0, 바람직하게는 5.0 내지 8.5인 주사용 액제 또는 현탁제가 바람직하며, 적합한 등장화제, 적합한 보조제, 경우에 따라, 적합한 완충액 뿐만 아니라, 경우에 따라 축적질 성분을 함유하며, 모든 경우에 멸균 수성액 또는 현탁액의 형태이다. 활성물질을 제외한 조성물 성분의 총 함량은 조성물 비히클로 이루어져 있다.
적합한 등장화제의 예에는 글리세롤, 글루코오스, 만니톨, NaCl, 칼슘 또는 마그네슘 화합물(예; CaCl2또는 MgCl2)이 있다.
적합한 방부제의 예에는 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올 및/또는 P-하이드록시 벤조산 에스테르가 있다.
특히 pH를 약 5.0 내지 8.5로 조정하는데 사용할 수 있는 완충 물질의 예에는 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 및 인산나트륨이 있다. 한편, 생리학적으로 허용되는 희석산(통상적으로 HCl) 또는 알칼리(통상적으로 NaOH)가 또한 pH 조정에 적합하다.
본 발명에 따른 약제의 작용 특성을 변화시킬 목적으로, 개질된 인슐린(예:유럽 특허 WPB-132 769호 및 유럽 특허 WPB 132 770호) 및/또는 비개질된 인슐린, 바람직하게는 소, 돼지 또는 사람 인슐린, 특히 사람 인슐린을 혼합하는 것이 또한 가능하다.
약제는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 및/또는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 이의 염을, 경우에 따라 개질된 인슐린 및/또는 비개질된 인슐린 또는 이의 유도체와, 생리학적으로 허용되는 비히클 및 경우에 따라, 적합한 부가제 및 보조 물질과 함께 적합한 투여형으로 전환시켜 제조한다.
이제, 본 발명을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
[사카로마이세스 세레비지아에 DSM 6649의 발효]
사카로마이세스 세레비지아에 DSM 6649[이 미생물은 1991년 8월 5일에 기탁기관(DSM)에 기탁번호 제DSM 6649호로 기탁되었다]를 발효기내에서 호기적으로 배양한다. 이 배지는 물 1ℓ당 하기 성분을 함유한다:
KOH를 사용하여 pH를 5.5로 조정한다. 통기는 발효기 용적 1ℓ당 공기 1ℓ를 사용하여 수행한다. 세포 밀도가 1×107개 세포/배양액 ml가 될 때까지 세포를 배양하여 배양액 1ℓ당 약 3g의 습식 중량을 수득한다. 이 세포를 원심분리(3,000×g, 5분)하여 수거하고 pH 6인 인산염 완충액으로 세척한다.
[실시예 2]
[cAMP-결합 단백질의 분리]
실시예 2로부터 세포를 효소[자이몰라제(zymolase), 2,000, 도쿄 소재의 Seikagaku Kogyolo 제조원] 처리하여 원형질체로 전환시키고, 0℃에서 유리 균질화기(Arthur H. thomas and Co. 제조원)로 분쇄한다. 하기의 분리 단계는 프로테아제 억제제[페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF), 류펩틴, 아프로티닌, α2-마크로글로불린, 트립신 억제제; Boehringer Mannheim 제조원]의 존재하에 수행한다. 이 세포 용해질을 원심분리(1,000×g, 3분, 4℃)하고, 세포 침전물을 SEM 완충액[0.25M 슈크로오스, 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 20mM 3-[N-모르폴리노]프로판설폰산(MOPS)/KOH, pH 7.4]으로 세척하여 다시 원심분리한다. 상층액을 합하여 퍼콜 구배물(Pharmacia, Freiburg; 28% Percoll, SEM 완충액, 단백질 0.5mg/ml)내에서 원심분리(18,000×g, 15분, 4℃)한다. 세포질, 원형질막, 마이크로솜 및 미토콘드리아가 이 구배물에서 서로 분리된다. 원형질 막은 구배물중 제3층에 부유한다. 이를 주사기를 사용하여 구배물로부터 분리하고, 5배 용량의 SEM 완충액으로 희석하여 원심분리한다(48,000×g, 30분, 4℃). 침전물을 MOPS 완충액(단백질 5mg/ml)에 현탁시켜 N-[3H]아세틸-콘카나발린 A[Amersham Buchler, Brunswick 제조원; MOPS 완충액(Boehringer mannheim 제조원) 500μl중 55μCi의 단백질 1mg, 20mM, pH7.4; 0.5mM EDTA, 50mM KCl, 5mM CaCl2, 소 혈청 알부민 200μg(Behringwerke, Marburg 제조원)]과 함께 4℃의 초음파 욕조내에서 60분 동안 항온처리한다. 콘카나발린 A의 결합은 마커로서 제공된다. 이 현탁액을 슈크로오스 구배물(MOPS 완충액 15 내지 28% 슈크로오스)상에 피펫팅하고 원심분리(25,000회전/분, 90분, 4℃, 벡크만 SW 27로터)한다. 이 슈크로오스 구배물을 분획화하고, 방사성 분획물(약 23% 슈크로오스)를 합하여 MOPS 완충액(50mM 콘카나발린 A; Sigma Deisenhofen 제조원, 250mM KCl)으로 3배 희석한 다음 원심분리(200,000×g, 60분, 4℃, 베크만 TL-100로터)한다. 침전물을 SEM 완충액(250mM KCl)으로 세척하여 원심분리하고 KCl을 함유하지 않은 MOPS 완충액(단백질 2.5mg/ml)에 재현탁시킨다.
원형질막 단백질 약 500μg을 완충액[25mM MOPS/KOH, pH 7.0, 150mM NaCl, 4mM MgCl2, 0.4mM EGTA(에틸렌 글리콜 비스(β-아미노에틸 에테르)테트라아세트산), 0.5mM DTT(디티오트레이톨), 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1mM IBMX(이소부틸메틸크산틴), 0.1V PMSF, 50μM 류펩틴, 0.1mM 아프로티닌(2mg/ml)]중에 용해시킨다. 이 용액을 동일한 완충액으로 평형화시킨, N6-(2-아미노에틸)-cAMP-세파로오스 컬럼(Pharmacia, Freibrg 제조원) 2ml상에 4℃에서 로딩(loading)한다. 이 컬럼을 매회 완충액[25mM MOPS/KOH, pH 7.2, 100mM 시트르산나트륨, 5mM DTT, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 250mM 슈크로오스, 7.5% 에틸렌 글리콜(Merck, Darmstadt 제조원), 10% 글리세롤, 1mg/ml 소 혈청 알부민, 1mM IBMX] 2ml로 5회 세척한다. 추가로 100μM cAMP를 함유하는 동일한 완충액 2ml로 4℃에서 용출시킨다. 완충액(25mM MOPS/KOH, pH 7.0, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 10mM DTT, 50μM EDTA, 50μM PMSF, 0.1% 데옥시콜레이트, 5% 글리세롤)으로 평형화시킨 세파덱스 G-25 컬럼 1ml를 원심분리하여 제1용출액 250μl를 탈염시킨다. 탈염된 물질을 완충액(10mM MOPS/KOH, pH 7.2M, 1mM EDTA)중 동일한 용량의 8% 폴리에틸렌 글리콜 4,000(Pharmacia, Freiburg 제조원)과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. 15분 동안 원심분리한 후, 침전물을 완충액[20mM MOPS/KOH, pH 7.2, 1mM EDTA, 100μM PMSF, 0.5% 데옥시콜레이트](단백질 2mg/ml)중에 용해한다.
[실시예 3]
[포스포글리칸-펩타이드의 제조]
a) 프로나제[스트렙토마이에스 그리세우스(Streptomyces griseus); Boehringer Mannheim 제조원]을 사용한 분해:cAMP-결합 단백질 100μg을 0.1M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)/KOH(pH 8.0), 15mM CaCl2, 1% 트리톤 X-100(Boehrnger mannheim 제조원) 1ml중 프로나제 450μg/ml와 함께 50℃에서 10시간 동안 항온처리한다. 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)를 첨가한 후, 제2분취량의 프로나제와 함께 50℃에서 7시간 동안 계속 항온처리한다. 자동화된 에드만 분해(Automated Edmann degradation)는 에탄올아민의 아미노 말단에 대해 아스파라긴의 아미드-형 결합을 갖는 포스포이노시톨 글리칸이 수득됨을 나타낸다. 이 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 이하, PIG-N이라 칭한다.
b) 엔도프로테이나제 Glu-C[EC 3.4.21.19, (V8 프로테아제), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus); Boehringer Mannheimn 제조원]를 사용한 분해:cAMP-결합 단백질 100μg을 20mM(NH4)2CO3(pH 7.8), 0.5% 옥틸 글루코시드(Boehringer mannheim 제조원) 1ml중 V8 프로테아제 300μg과 함께 37℃에서 18시간 동안 항온처리한다.
자동화된 에드만 분해는 V8 프로테아제를 사용한 분해로 펩타이드 Asn-Cys-Tyr를 갖는 포스포이노시톨 글리칸이 생성됨을 나타낸다. 아미노산 아스파르트산은 카복실 말단에 의해 포스포이노시톨 글리칸에 결합된다. 트리펩타이드 Asn-Cys-Tyr을 갖는 포스포이노시톨 글리칸의 화합물을 이하, PIG-NCY라 칭한다.
c) 엔도프로테아제 Lys-C[라이소박터 엔지모게네스(Lysobacter enzymogenes); Boehringer Mannheim 제조원]를 사용한 분해:cAMP-결합 단백질 100μg을 50mM (NH4)2CO3(pH 8,2), 0.5% 옥틸 글루코시드 0.5ml중 엔도프로테아제 Lys-C 55μg가 함께 37℃에서 18시간동안 항온처리한다.
자동화된 에드만 분해는 엔도프로테아제 Lys-C가 펩타이드 Asn-Cs-Try-Glu를 가진 포스포이노시톨 글리칸을 생성함을 나타낸다. 이 펩타이드는 아스파라긴의 카복실 말단을 통해 포스포이노시톨 글리칸에 결합된다. 이하, 이것을 PIG-NCYE라 칭한다.
d) 카복시-말단 아미노산의 분리:프로나제 분해된 cAMP-결합 단백질(a 참조)을 에드만 분해 안내서에 따라 적용시킨다. 생성되는 아미노산 비함유 포스포이노시톨 글리칸을 이하, PIG라고 칭한다.
단백질 분해적으로 분해한 후, 프로테아제를 5% 트리클로로아세트산(TCA)으로 침전시켜 제거한다. 원심분리(10,000×g, 15분) 후, 상층액내에 함유된 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 유도체 뿐만 아니라, 에드만 분해로부터 생성된 포스포이노시톨 글리칸을 농축시키고 페닐-세파로오스 컬럼에 결합시켜 정제한다. 2% 옥틸페놀 에틸렌 글리콜 에테르(TX-100)을 사용하여 용출시킨 후, 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 유도체를 2개의 상이한 용매 시스템을 사용하는 박층 크로마토그패리로 정제한다. 산성 시스템(클로로포름/아세톤/메탄올/빙초산/물 10:4:2:2:1)에서 1차 크로마토그래피를 수행한 후, 실리카겔 플레이트(타입 60)상의 적용점 근처의 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 메탄올로 용출한 다음 계속해서 염기성 시스템(클로로포름/메탄올/암모니아/물 45:45:3.5:10)에서 2차크로마토그래피를 수행한다. 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 유도체를 플레이트로부터 다시 용출(Rf=0.45)시키고 클로로포름/메탄올(2:1)로 추출한다. 이 유기상을 세척 및 증발시키고, 당해 물질을 0.5% TX-100을 함유하는 인산염 완충액중에 현탁시킨다.
e) 공정 단계 a) 내지 d)에서 수득한 포스포이노시톨 글리칸 또는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 0.2M 인산칼륨(pH 7.2), 2mM DTT, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 0.05% TX-100 0.2ml중에서 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C[EC 3.1.1.5, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); Sigma, Deisenhofen 제조원] 10단위와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 10mM EDTA를 첨가한 후, 분해 산물을 염기 용매 시스템(단계 d 참조)내에서 박층 크로마토그래피에 의해 서로 분리한다. 적용점의 직접적인 근접부내의 물질을 플레이트로부터 용출시켜 2% 폴리(에틸렌 글리콜)8모노(옥틸페닐 에테르)(TX-114)와 함께 혼합한다. 가열 및 원심분리에 의해 상 분리를 개시한다. 수성 상을 스피드백(Speedvac) 농축기내에서 농축시킨다.
f) 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 표준화하기 위해, 공정 단계 a) 내지 d)의 물질중 유리 글루코오스아민의 질소 원자를 과메틸화하여 방사선 표지된 트리메틸암모늄 양이온으로 전환시킨다. 이 과정을 위해, 샘플을 진공중에서 건조시키고, 디메틸 설폭사이드 100μl를 가한다. 초음파 처리(1분)후, NaOH 10mg 및 [125I]요오드화메틸(0.2μ Ci; NEN-Dupont, Dreieich 제조원) 40μl를 가한다. 25℃에서 45분간 교반하고, 이어서 스피드백내의 용매를 제거한 다음 H2O 400μl를 가한다. 이 샘플을 클로로포름으로 3회 세척하고 클로로포름 추출물을 H2O로 3회 세척한다. 이 클로로포름을 N2하에 증발시킨다. 과메틸화는 광범위한 농도 범위에 걸쳐 선형이며 정량적이다. 인슐린-유사 작용을 시험하기 위해, 동일한 용량(동일한 dmp값)의 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 사용한다(1 내지 100의 임의의 단위).
g) 공정 단계 a) 내지 d)에서 수득한 물질을 아질산과 함께 항온처리하여 포스포이노시톨 글리칸을 분해시킨다.
[실시예 4]
[포스포이노시톨-글리칸-펩타이드의 구조적 특징]
a) 효모 세포를 방사성 표지된 기질(NEN-Dupont, Dreieich에서 공급)인 스테아르산, 마이오-이노시톨, 에탄올아민, 글루코오스아민 또는 만노오스의 존재하에 실시예 1에 나타낸 바와 같이 항온처리한다. 친화성 크로마토그래피(실시예 2참조)에 의해 정제한 완전한 원형질막 분획물 또는 cAMP-결합 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨다. 코마지에 블루(Coomassie blue)를 사용한 염색 또는 이 성분들의 자동방사선 사진은 상술한 방사성 성분 모두가 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 내로 혼입되었음을 나타낸다.
b) 실시예 3의 공정 단계 a)에서와 같이 수득할 수 있는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 화학적 및 효소적으로 추가로 분해한다. 분해 산물을 박층 크로마토그래피로 분석하여 방사성 분포([3H] 스테아르산 및 [14C]마이오-이노시톨)을 측정한다. 잔류하는 방사성 표지된 구조물을 플레이트로부터 용출하여 후속 분해반응을 수행한다. 프로나제 분해후 생성된 구조물을 아질산으로 탈아민화하여 포스파티딜이노시톨(PI)을 유리시킨다. PI를 포스포리파제 D에 의해 포스파티드산으로 전환시키거나 포스포리파제 C에 의해 디아실글리세롤로 전환시킨다. 이로써 마이오-이노시톨 수준이 감소되나, 스테아르산에 의한 방사성 표지는 유지된다. 계속해서 포스파티드산을 초해(acetolysis)시켜 디글리세라이드 아세테이트로 전환시킨다. 최종적으로, 스테아르산을 디아실글리세롤로부터 뿐만 아니라 디글리세라이드 아세테이트로부터 알카리성 가수분해에 의해 유리시킨다.
c) 실시예 3a) 및 3e)에서 수득한 구조물을 건조시키고 HF(수중 60%, 0℃, 16시간)로 처리하면, 생성되는 올리고사카라이드를 2M 트리플루오로아세트산으로 가수분해(100℃, 4시간)한다. 이 반응 용액을 계속해서 건조시키고, 존재하는 당을 환원(0.1M 수산화암모늄중 1% NaBH4, 37℃, 1시간)시키며 최종적으로 아세틸화한다(피리딘 및 아세트산 무수물의 1:1 혼합물, 60℃, 1시간). 가스 크로마토그래피를 팩카드 가스 크로마토그래프[Packard gas chromatograph, 모델 428; 컬럼 100/120 Supelcoport(Supelco, Bellefonte, USA 제조원)]로 60℃에서 수행한다. 하기의 정량적인 조성물이 생성된다:만노오스, 갈락토오스, 마이오-이노시톨 및 글루코오스아민.
d) 실시예 3a) 및 3e)에서와 같이 수득한 구조물을 c)에서와 같이 HF(수중 60%) 및 4M HCl을 사용하여 100℃에서 16시간 동안 가수분해한다. 아미노산 분석기(Biotronic, LC 6001)내에서 하기 성분으로 분리된다:아스파르트산, NH3, 에탄올 아민 및 글루코오스아민.
가수분해 조건, 아스파르트산 및 NH3의 비, 및 실시예 3a)에서의 결과에 있어서, 천연의 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드내에 존재하는 아미노산은 아스파라긴이다.
[실시예 5]
본 발명에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드(PGP)의 생물학적 활성을 랫트로부터 해부하여 분리한 지방세포 및 횡격막 단편을 사용하여 측정한다.
용어 “PIG”는 실시예 3d) 및 3e)에서와 같이 수득한, 펩타이드를 함유하지 않는 포스포이노시톨 글리칸을 의미하며; “PIG-N”은 실시예 3a) 및 3e)에서와 같이 수득한, 아스파라긴을 함유하는 포스포이노시톨 글리칸을 의미하고; “PIG-NCY”는 실시예 3b) 및 3e)에서와 같이 수득한, 펩타이드 Asn-Cys-Tyr을 함유하는 포스포이노시톨 글리칸을 의미하며; “PIG-NCYE”는 실시예 3c) 및 3e)에서와 같이 수득한, 펩타이드 Asn-Cys-Tyr-Glu를 함유하는 포스포인시톨 글리칸을 의미하고; “PIG-NCY(na)”는 아질산으로 분해(실시에 3g 참조)시킨 실시예 3b) 및 3e)에서와 같이 수득한 물질을 의미한다. 용어 “기저치”는 자극이 없는 상태에서의 활성을 나타내며, 인슐린은 사람 인슐린이고, dpm은 분당 방사성 붕괴량을 의미한다.
랫트로부터의 지방세포는 하기와 같이 제조한다:
부고환(위스타 랫트, 160 내지 180g, 먹이 제한 없음)의 지방 조직을 콜라게나제로 분해하고, 수득되는 분리된 지방세포를 부유에 의해 수회 세척한다.
[랫트로부터 횡격막 단편의 제조]
헤미횡격막(위스타 랫트, 60 내지 70g, 먹이 제한 없음)으로부터 소형 조직 단편(50mm 직경)을 펀치하고 수회 세척한다.
래트 지방세포내의 인슐린 수용체를 불활성화시키기 위해, 세포를 트립신 10 내지 40μg/ml로 처리한다. 프로테아제 억제제를 첨가한 후, 이 세포를 부유시켜 2회 세척하고, 37℃에서 15분 동안 계속 항온처리한다. 이어서, 이 세포를 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드에 의한 지방형성의 자극 시험에 사용한다. 인슐린과의 대조 항온처리시, 트립신-처리된 세포는 인슐린에 의해 자극될 수 있는 매우 적은 지방형성을 보여 매우 제한된 수의 작용성 인슐린 수용체를 지닌다는 것을 보여준다.
랫트 횡격막내의 인슐린 수용체를 불활성화하기 위해, 조직의 단편을 25℃에서 KRH 완충액(테트라데카노일포르볼 아세테이트 50μg/ml의 존재하에 0.1mM 글루코오스)중에서, O2를 계속 통과시키면서, 90분 동안 항온처리한다. 이어서, 이 조직의 단편을 KRH 완충액으로 2회 세척하여 관련 시험에 사용한다.
인슐린 수용체가 불활성화된 조직 또는 세포를 사용하는 하기 실험에서 수득한 실험 결과를 각 경우 괄호안에 나타낸다. 하기 실시예의 어느것에서도 PIG-NCYE는 효과를 나타내지 않는다.
a) 당원 형성
이 시험은, 근세포내에서 인슐린에 의해 자극받을 수 있고, 원형질막을 통한 글루코오스의 수송 및 작용성 인슐린 신호 전달 캐스캐이드(cascade)를 포함하는 글루코오스의 글리코겐으로의 전환을 포함하는, 글리코겐 합성을 측정한다.
횡격막 단편을 인슐린 및 PGP의 존재 또는 부재하에 KRH 완충액중에서 50μM D-[U-14C]글루코오스와 함께 37℃에서 15분 동안 항온처리한다. 배지를 흡입제거한 다음 조직의 단편을 완전히 세척하여 -70℃에서 동결시킨 다음 계속해서 폴리트론 균질화기(Polytron homogenizer)로 2℃에서 균질화시킨다. 이 균질물을 원심분리(2,000g)하고 상층액을 필터 페이퍼 상에 피펫팅한다. 형성된 글리코겐을 측정하기 위해, 필터를 TCA(5%)로 이동시키고, 에탄올 및 아세톤으로 세척하여 건조하고, 신틸레이션 측정([14C]글리코겐[dpm*10-3])에 의해 이들의 방사성을 측정한다. 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드의 단위는 실시예 3f)에서 정의한 임의의 단위이다.
이 결과를 표 1에 나타낸다:
[표 1]
b) 글리코겐 합성
이 시험은, 인슐린에 의해 자극될 수 있는, 작용성 인슐린 신호 전달 캐스캐이드를 포함하는 활성화된 글루코오스(UDP-글루코오스)의 글리코겐으로의 전환(글리코겐 신테타제 활성)을 측정한다. 글루코오스 수송 및 글루코오스의 활성화는 우회된다[이는 글리코겐 합성 측정과 상이하다; a) 참조
횡격막 단편을 D-글루코오스(0.1mM)와 함께 인슐린 및 PGP의 존재 또는 부재하에 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 균질물을 제조하여 원심분리(20,000×g)한다. 이 상층액을 0.1mM 또는 10mM의 글루코오스 6-포스페이트의 존재하에 37℃에서 60분 동안 U-[14C]UDP-글루코오스(0.3mM)과 함께 항온처리한다. 이 혼합물을 필터 페이퍼로 이동시키고, 필터를 상기와 같이 처리한다. 글리코겐 신테타제 활성은 I형의 효소(균질물중 활성 효소의 양에 상응하는, 글루코오스 6-포스페이트와는 독립적인 탈포스포릴화된 효소) 및 D형의 효소(균질물중 활성화가능한 효소의 총 양에 상응하는, 글루코오스 6-포스페이트에 대해 의존적인 포스포릴화된 효소) 사이의 분획비로써 계산한다([14C]글리코겐[dpm*10-3]).
표 2에 이 결과를 나타낸다:
[표 2]
c) 지방형성
이 시험은, 인슐린 신호 전달 캐스캐이드를 포함하는 글루코오스 수송 및 트리글리세라이드(글리세롤 3-P 합성, 에스테르화)/인지질/지방산 합성에 필요한, 인슐린에 의해 자극될 수 있는, 글루코오스의 톨루엔-가용성 산물(트리글리세라이드, 인지질, 지방산)로의 전환을 측정한다.
랫트 지방세포를 KRH 완충액중에서 인슐린 및 PGP의 존재 또는 부재하에 37℃에서 90분 동안 D-[3-3H]글루코오스(최종 농도 0.2mM 또는 1mM)와 함께 항온처리한다. 톨루엔-가용성 신틸레이션 칵테일을 첨가하여 이 세포를 파괴하고, 지질을 수용성 산물 및 항온처리 배지로부터 분리한다. 상 분리후, 지질내에 혼입된 방사성을, 수성상을 제거하지 않고 직접 신틸레이션 측정에 의해 측정한다([3H]지질[dpm*10-3]).
이 결과를 표 3에 나타낸다:
[표 3]
d) 고유 글루코오스 수송 활성
랫트 지방세포를 균질화 완충액[20mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)/HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 0.25M 슈크로오스]중에서 2회 세척하고 이어서 동일한 완충액 20ml중에서 4℃하에 균질화시켜[테플론 유봉(Teflon pestle)이 장착된 유리 균질화기] 랫트의 지방세포로부터 분리된 원형질막 소낭을 수득한다(실시예 5 참조).
균질물을 원심분리(16,000×g, 15분)하고, 침전물을 동일한 완충액중에 현탁시키고 다시 원심분리시킨다. 이 침전물을 균질화 완충액 5ml중에 현탁하여 슈크로오스 쿠션(cushion)[0.12M 슈크로오스, 20mM 트리스/HCl, pH 7.4, 1mM EDTA]상에 적층화시키고, 원심분리(100,000×g, 70분)한 후, 원형질막 소낭을 함유하는 중간층을 주사기로 분리하여 완충액 45ml로 희석하고 다시 원심분리(48,000×g, 45분)한다. 이 침전물을 완충액 10ml에 현탁시키고, 다시 원심분리하여 완충액 3ml에 다시 현탁시킨다.
분리한 원형질막 소낭을 인슐린/PGP의 존재 또는 부재하에 25℃에서 30분 동안 배양한다. 이 소낭을 동일한 특이 방사성을 지닌 50μM D-[3-3H]-글루코오스 및 L-[1-14C]글루코오스와 함께 25℃에서 90초 동안 항온처리한다. 이 혼합물을 니트로셀룰로오스 필터를 통해 신속하게 흡입여과한다. 필터를 완전히 세척하여 건조시킨다. 이들의 방사성을 액체 신틸레이션법으로 측정한다. [3H]방사성 및 [14C] 방사성 간의 차이로서 특이적 수송량(D-[3H]글루코오스/L-[14C]글루코오스[dpm*10-3])을 계산한다.
이 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
e) 단백질 합성
단백질 합성의 자극은 인슐린의 장기간 작용(성장 호르몬으로서의 역할)에 속한다는 점에서 선행 측정법으로 측정된 인슐린의 대사 효과와는 상이하다. 이 검정은 인슐린 신호 캐스캐이드를 포함한다.
랫트의 지방세포를 인슐린 및 PGP의 존재하에 로이신 대신 0μM의 L-[3H]-로이신을 함유하는 둘베코(Dulbecco) 변형 필수 배지(DMEM)중에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 이 세포를 오일 원심분리 기술로 주변 배지로부터 분리하여 수-혼화성 신틸레이션 칵테일과 함께 혼합한다. 원심분리 후, 단백질 침전물을 아세톤으로 세척하고, 1% SDS중에 현탁시키고 신틸레이션 칵테일과 혼합한다. 방사성을 나타내는 세포를 신틸레이션 측정기로 측정하여, 단백질 합성량 및 원형질막을 통한 아미노산 수송량을 측정한다([3H]로이신[dpm*10-4]).
이 결과를 표 5에 나타낸다.
[표 5]

Claims (8)

  1. 포스포이노시톨 글리칸 잔기에 공유 결합된 하나의 아미노산 또는 트리펩타이드로 이루어지고, cAMP-결합 단백질의 프로테아제 및 포스포리파제 분해에 의해 수득되며, 인슐린에 의해 나타나는 하나 이상의 생물학적 활성을 나타내는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서, 포스포이노시톨 글리칸, 에탄올아민, 트리펩타이드 또는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드의 생리학적으로 허용되는 염을 함유하며, 인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 글루코오스아민, 갈락토오스, 만노오스, 마이오-이노시톨, 인산, 에탄올아민 잔기 및 Asn-Cys-Tyr 서열을 갖는 펩타이드 잔기를 함유하며, 인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 포스포이노시톨 글리칸 또는 포스포이노시톨 글리칸 및 펩타이드 잔기로서 아스파라긴을 함유하며, 인슐린-유사 작용을 하는 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드.
  5. a) 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트 결합 단백질을 함유하는 유기체를 사용하는 단계, b) 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트-결합 단백질을 분리하는 단계, c) 아데노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트-결합 단백질로부터 단백질 부위를 제거하고, 수득되는 글리코실포스파티딜이노시톨-펩타이드를 정제하는 단계, d) 공정 단계 c)에서 수득된 생성물로부터 모노- 또는 디아실글리세롤을 제거하는 단계 및 e) 공정 단계 d)에서 수득된 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 포스포이노시톨-글리칸-펩타이드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 효모 세포가 사용되고, 단백질 부위가 효소적으로 제거되는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 공정 단계 c) 및 d)가 역순으로 수행되는 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) DSM 6649, 엔도프로테인아제 Glu-C(EC 3.4.21.19) 또는 포스포리파제 C(EC 3.1.1.5)가 사용되는 방법.
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