HU210431B - Process for producing phosphoinositol glykan and it`s peptide derivatives containing 1-4 amino acids with insulin-like activity and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents
Process for producing phosphoinositol glykan and it`s peptide derivatives containing 1-4 amino acids with insulin-like activity and pharmaceutical compositions containing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU210431B HU210431B HU9202701A HU9202701A HU210431B HU 210431 B HU210431 B HU 210431B HU 9202701 A HU9202701 A HU 9202701A HU 9202701 A HU9202701 A HU 9202701A HU 210431 B HU210431 B HU 210431B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- peptide
- phosphoinositol
- phosphoinositol glycan
- binding protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0827—Tripeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1027—Tetrapeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány új, inzulinszerű hatással rendelkező foszfoinozitol-glikán és 1—4 aminosavat tartalmazó peptidszármazékai előállítására, valamitn ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozik. A fenti vegyületek Diabetes mellitus vagy inzulintól független Diabetes kezelésére alkalmazhatók.
Az inzulin a rá érzékeny szövetekben különféle hatásokat vált ki. Az egyik jelentős hatása, hogy emlősöknél gyorsan lecsökkenti a glükóz szintet. Ez úgy történik, hogy hatására az izom- és zsírsejtek gyorsan felveszik a glükózt a vérből. Az inzulin aktivizálja továbbá a glikogén szintetáz enzimet, és gátolja a lipolízist. Az inzulin gyorsítja az aminosavakból kiinduló fehéqeszintézist, és erősíti a piruvát-dehidrogenáz, és a foszfo-fruktókináz indukcióját, továbbá gátolja a cukorszintézisben résztvevő egyes enzimek, így a piruvát-karboxiláz, és a fruktóz1,6-biszfoszfatáz képződését.
AII típusú Diabetes az inzulintól független cukorbetegség, ami a perifériás szövetek, így izom- és zsírszövetek inzulin rezisztenciájából ered. Az ebből következő csökkent glükóz értékesítést a glükóz transzport hiányzó inzulinstimulációja és az ezt követő metabolikus folyamatok (glükogenézis és lipogenézis) okozzák. Ez a sokrétű rezisztencia a receptorok és poszt-receptorok, vagyis az úgynevezett „second messenger” képzés zavaraira utal [Garvey: Diabetes/Metabolism Reviews, 5, 727-742 (1989)].
Eddig nem ismert olyan hatóanyag, ami megkerüli az inzulin receptorokat, és ennek ellenére inzulinszerű hatással rendelkezik.
Azt találtuk, hogy az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát (cAMP) kötőfehérjéjéből (továbbiakban cAMP-kötőfehérje) nyerhető foszfoinozitol-glikán és peptidszármazékai in vitro inzulinszerű hatással rendelkeznek, és inzulin rezisztens szövetekben is inzulinszerű hatást váltanak ki.
A találmány ezért cAMP-kötőfehéqe hasításával nyerhető foszfoinozitol-glikán és peptidszármazékai előállítására vonatkozik.
Az inzulinrezisztens szövet kifejezés alatt például olyan patkány zsírsejteket értünk, amelyek nem tartalmaznak inzulin receptorokat. A cAMP-kötőfehérje olyan fehérje, amely képes az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát megkötésére.
Az eddig megismert szerkezeti adatok szerint a találmány szerinti foszfoinozitol-glikán peptid egy galaktózt, glükózamint és mannózt tartalmazó glikánrésszel rendelkező foszfoinozitolból áll, amely egy foszforil-etanol-amin maradékon keresztül amidkötéssel egy peptid karboxil végéhez csatlakozik. Ez a membránhoz történő kötődést biztosító kovalens kötésű glikopeptiden belül található, amely magasabbrendű eukariótákban található plazmamembrán fehérjékkel hasonló szerkezetet mutat [Roberts és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 18776-18784 (1983)]. A glikánrész glükózamint, galaktózt és mannózt, valamint mólonként legalább két foszfátmaradékot tartalmaz. A peptid az Asn-Cys-Tyr szekvenciával rendelkezik, és az aszparaginsav karboxil végével amidkötéser. keresztül a foszfoinozitol-glikán aminocsoportjához kapcsolódik.
Az aktivitást a foszfoinozitol-glikán rész határozza meg. A peptid erősíti az inzulinszerű hatást. Emellett azt találtuk, hogy nemcsak a teljes foszfoinozitol-glikán peptid rendelkezik inzulinszerű hatással, hanem ennek részei is, például a rövidített peptid szekvencia, amely a foszfoinozitol-glikánhoz kapcsolódik, vagy önmagában a peptid nélküli foszfoinozitol-glikán.
A találmány értelmében a foszfoinozitol-glikán és 1-4 aminosavat tartalmazó peptidszármazékai előállítása során úgy járunk el, hogy
1) adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéjét tartalmazó Saccharomyces cerevisiae DSM 6649 sejtet ismert módon, előnyösen aerob körülmények között 18-35 °C hőmérsékleten és pH = 2-8 tartományban 107/ml sejtsűrűségig fermentálunk,
2) az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéjét ismert módon izoláljuk,
3) az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéje fehérjerészét és kívánt esetben a kapott glikozil-foszfatidil-inozitol-peptid peptid részét enzimatikusan, előnyösen V8 proteáz vagy pronáz segítségével, és/vagy kémiailag, előnyösen Edmann-lebontással hasítjuk, és a kapott terméket izoláljuk és kívánt esetben tisztítjuk,
4) majd a kapott termékből enzimatikusan, előnyösen foszfolipáz segítségével egy mono- vagy diacil-glicerint lehasítunk, és
5) a kapott terméket izoláljuk.
A cAMP-kötőfehéqe különböző szervezetekből, így mikroorganizmusokból, növényekből, gombákból, valamint állati szervekből kinyerhető [Müller és Bandlow: Biochemistry, 28, 9957-9967, 9968-9973 és 9974-9981 (1989)]. A találmány szerinti eljárás során élesztősejtet, így Saccharomyces cerevisiae, elsősorban a DSM 6649 törzshöz tartozó sejtet alkalmazunk.
A cAMP-kötőfehérje Saccharomyces cerevisiae törzs által történő előállítását szén- és nitrogénforrást, valamint a szokásos szervetlen sókat tartalmazó tápoldatban történő fermentálással végezzük. A cAMP-kötőfehérje előnyösen az élesztősejt plazmamembránjában dúsul fel.
Az 1) eljáráslépésben előnyösen az alábbiak szerint járunk el. A cAMP-kötőfehérje képződése a Saccharomyces cerevisiae törzsben az adott mikroorganizmus esetében szokásos tápoldatokban könnyen lejátszódik. A tenyésztést aerob körülmények között, például submers kultúrában, valamely rázólombikban vagy fermentorban rázás vagy keverés közben végezzük, adott esetben levegő vagy oxigén bevezetése mellett. A hőmérséklet általában 18-35 °C, előnyösen 25-30 °C, elsősorban 28-30 °C. A pH tartomány 2-8, előnyösen 3-7. Az élesztőt a fenti körülmények között általában 107 sejt/ml tápoldat koncentrációig tenyésztjük.
A 2) eljáráslépés során előnyösen úgy járunk el, hogy az élesztősejteket a cAMP-kötőfehérje izolálása érdekében elválasztjuk a tápközegtől, és pufferrel mossuk. Az izolálást például Müller és Bandlow módszerével [Biochemistry, 28, 9957-9967 (1989)] végezzük. Ehhez az élesztősejteket enzimatikusan (például zimoliáz segítségével) szferoplasztokká alakítjuk, és egy
HU 210 431 Β homogenizátorban proteáz inhibitor jelenlétében hidegen (0-4 °C) aprítjuk. Az élesztő lizátumot centrifugáljuk, és a sejtcsapadékot pufferral mossuk, és ismét centrifugálják. A feliilúszókat egyesítjük, és Percoll gradiensben (28% Percoll) és szaccharóz gradiensben (15-28% szaccharóz) tisztítjuk. Ezekkel a centrifugálási lépésekkel elválasztjuk egymástól a citoplazmát, a plazmamembránt, a mikroszómát és a mitokondriumot.
A plazmamembrán frakcióból a cAMP-kötőfehéijét például N6-(2-amino-etil)-cAMP-szefaróz-oszlopon megkötjük, és a cAMP-kötőfehérjét cAMP segítségével eluáljuk, és sómentesítjük.
A 3) eljáráslépés során előnyösen úgy járunk el, hogy a cAMP-kötőfehérje fehérjerészét enzimatikusan lehasítjuk. Az enzimatikus hasításhoz alkalmazható például proteáz, így pronáz, endoproteáz Lys-C (Lysobacter enzimogenézis) vagy V8 proteáz (Staphylococcus aureus). így elérjük a fehérjerész lebontását. A V8 proteázzal glikozil-foszfatidil-inozitolt kapunk, amelynek peptid-szekvenciája Asn-Cys-Tyr; a proteáz pronázzal végzett inkubálás során glikozil-foszfatidil-inozitol-peptidet kapunk, ahol a peptidrész csak Asn aminosavból áll. A peptidrész hossza, vagyis az aminosavak száma tehát az alkalmazott enzimtől függ.
A hasítás megvalósítható kémiai eljárással is, például Edmann-lebontással, melynek során az összes aminosavat eltávolítva glikozil-foszfatidil-inozitolt kapunk.
A proteázt például savakkal, így triklór-ecetsavval kicsapjuk. A glikozil-foszfatidil-inozitolt vagy peptidszármazékát centrifugálásással elválasztjuk a proteáztól, fenilszefaróz oszlopon koncentráljuk, és vékonyrétegkromatográfiásan tisztítjuk.
A cAMP-kötőfehérje mono- vagy diacil-glicerin részt tartalmaz. A fehérjének ez a része közelebbről nem ismert, így nem tudjuk, hogy mikor van monoacilglicerin jelen, és mikor diacil-glicerin. Az inzulinszerű hatás szempontjából ez a rész felesleges, ezért a 4) eljáráslépésben enzimatikusan eltávolítjuk.
A 4) eljáráslépés során előnyösen úgy járunk el, hogy a glikozil-foszfatidil-inozitolon vagy peptidszármazékán lógó mono-vagy diacil-glicerin részt enzimatikusan lehasítjuk, és ezáltal felszabadítjuk a foszfoinozitol-glikánt, illetve peptidszármazékát. Az enzimatikus hasításhoz alkalmazható például foszfolipáz, így foszfatidil-inozitolspecifikus C foszfolipáz (Bacillus cereus). Ezáltal eléqük a mono- vagy diacil-glicerin rész lehasítását, amely a foszfátcsoporton keresztül a mio-inozitolhoz kötődik. A glicerin tartalmú maradékot a 3) lépés szerinti proteáz kezeléssel nem hasítjuk le. A 3) és 4) eljárási lépések fordított sorrendben is megvalósíthatók.
A 3) és 4) lépések szerinti enzimatikus reakciót az ilyen reakciókhoz előnyös körülmények között végezzük. Az említett enzimek ismert reakciókörülményei alapján szakember könnyen meghatározhatja az optimális paramétereket.
Az 5) eljáráslépés során előnyösen úgy járunk el, hogy a foszfolipázt savval, így triklór-evetsavval kicsapjuk. A foszfoinozitol-glikán peptid centrifugálással elválasztható a foszfolipáztól, majd Biogel P-4 oszlopon tisztítjuk, és vékonyréteg elektroforézissel koncentráljuk.
A találmány szerint előállított foszfoinozitol-glikán és peptidszármazéka előnyösen alkalmazható a Diabetes mellitus és az inzulintól független Diabetes kezelésére.
A találmány kiterjed ezért olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely hatékony mennyiségben foszfoinozitol-glikánt vagy 1-4 aminosavat tartalmazó peptidszármazékát tartalmazza oldott, amorf és/vagy kristályos formában.
A gyógyszerkészítmény előnyösen alkalmazható injekciós célra szokásos oldat vagy szuszpenzió formájában, amelynek pH értéke általában 3,0-9,0, előnyösen 5,0-8,5, amely megfelelő izotonizálószert, konzerválószert és adott esetben puffért, valamint adott esetben nyújtott hatást biztosító adalékanyagot tartalmaz természetesen steril, vizes oldat vagy szuszpenzió formában.
Izotonizálószerként alkalmazható például glicerin, glükóz, mannit, nátrium-klorid, kalcium- vagy magnézium-vegyületek, így kalcium-klorid vagy magnézium-klorid.
Konzerválószerként alkalmazható például fenol, m-krezol, benzilalkohol, és/vagy p-hidroxi-benzoesav-észter.
Pufferanyagként előnyösen alkalmazhatók a pH = 5,0-8,5 tartomány beállítására szolgáló pufferek, példaként említhető a nátrium-acetát, nátrium-citrát és nátrium-foszfát. A pH beállítására alkalmazhatók továbbá fiziológiailag felhasználható hígított savak, például sósav, valamint lúgok, például nátrium-hidroxid.
A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmény hatásprofiljának megváltoztatására a foszfoinozitol-glikánt vagy peptidszármazékát egyéb hatóanyaggal kombináljuk. Az ilyen kombinációknál nincs szinergista hatás. Egyéb hatóanyagként alkalmazható például módosított inzulin (például EP 132 769 és EP 132 770 számú irat), és/vagy nem módosított inzulin, előnyösen szarvasmarha, disznó vagy humán inzulin, elsősorban humán inzulin.
A gyógyszerkészítmény előállításához előnyösen úgy járunk el, hogy a foszfoinozitol-glikánt vagy peptidszármazékát adott esetben módosított és/vagy nem módosított inzulinnal vagy inzulin-származékokkal együtt gyógyszerészeti hordozóanyaggal, valamint adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
Saccharomyces cerevisiae DSM 6649fermentálása
Saccharomyces cerevisiae DSM törzset aerob körülmények között fermentorban tenyésztjük. Egy liter vízben a következő tápanyagokat vesszük fel:
| 3g | élesztő extraktum |
| lg | glükóz |
| 1 g | KH2PO4 |
| lg | nh4ci |
| 0,5 g | CaCl2 x 2H2O |
| 0,5 g | NaCl |
| 0,6 g | MgSO4xH2O |
| 0,3 ml | 1 tömeg%-os vizes FeCl3 oldat |
| 22 lm | 90 tömeg%-os tejsav oldat. |
HU 210 431 Β
A tápközeget kálium-hidroxiddal pH = 5,5 értékre állítjuk. A levegőztetést 1 liter/liter fermentor térfogat mennyiségű levegő befúvatásával végezzük. A sejteket egyszer 107 sejt/ml tenyészoldat sejtsűrűségig tenyésztjük.
Kitermelés: mintegy 3 g/1 tenyészoldat a nedves tömegre számolva.
A sejteket centrifugálással (5 perc, 3000 g) összegyűjtjük, és pH = 6 értékű foszfát pufferrel mossuk.
2. példa cAMP-kötőfehérje izolálása
A 1. példában nyert sejteket enzimatikusan (zymoliáz, 2000, Seikagaku Kogyolo, Tokió, Japán) szferoplasztokká alakítjuk, és egy üveghomogenizátorral (Arthur H. Thomas és társai) 0 °C hőmérsékleten aprítjuk. Az ezt követő izolációs lépéseket proteáz inhibitorok (fenil-metán-szulfonil-fluorid (PMSF), leupeptin, aprotinin, a2-makroglobulin, tripszin-inhibitor; Boehringer Mannheim) jelenlétében végezzük. A sejtlizátumot centrifugáljuk (1000 g, 3 perc, 4 °C), a sejtüledéket SEM-pufferrel (0,25 mól/1 szaccharóz, 0,5 mól/1 etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), 20 mmól/1 3-[Nmorfolinoj-propán-szulfonsav (MOPS)/KOH, pH = 7,4) mossuk, és ismét centrifugáljuk. A felülúszókat egyesítjük, és Percoll gradiensben (Pharmacia, Freiburg; 28% Percoll, SEM-puffer, 0,5 mg fehérje/ml) centrifugáljuk (18 000 g, 15 perc, 4 °C). Ebben a gradiensben elválasztjuk egymástól a citoplazmát, a plazmamembránt, a mikroszómákat és a mitokondriumot. A plazmamembrán a gradiens felső harmadában található. Ezt gradiens befecskendezésével eltávolítjuk, ötszörös térfogatú SEM-pufferrel hígítjuk, és centrifugáljuk (48 000 g, 30 perc, 4 °C). Az üledéket MOPS pufferben (5 mg fehéije/ml) szuszpendáljuk, és N-3H-acetilkonkanavalin A-val (Amersham Buchler, Braunschweig; 1 mg fehérje 55 gCi értékkel, 500 μΐ MOPS pufferben (Boehringer, Mannheim), 20 mmól/1, pH = 7,4, 0,5 mmól/1 EDTA; 50 mmól/1 KC1, 5 mmól/1 CaCl2, 200 gg boqúszérum albumin, Behring Werke, Marburg) ultrahangos fürdőben 60 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Akonkanavalin A-val kialakított kötés markerként szolgál. A szuszpenziót szaccharóz gradiensre (15-28% szaccharóz MOPS pufferben) pipettázzuk, és centrifugáljuk (25 000 fordulat/perc, 90 perc, 4 °C, Beckmann SW 27 rotor). A szaccharóz gradienst frakcionáljuk, és a radioaktív frakciókat (mintegy 23% szaccharóz) egyesítjük, MOPS pufferrel (50 mmól konkanavalin A, Sigma Deisenhofen, 250 mmól/1 KC1) háromszorosára hígítjuk, és centrifugáljuk (200 000 g, 60 perc, 4 °C, Beckmann TL-100 rotor). Az üledéket SEM pufferrel (250 mmól/1 KC1) mossuk, centrifugáljuk, és KC1 mentes SEM pufferben ismét szuszpendáljuk (2,5 mg fehérje/ml).
Mintegy 500 gg plazmamembrán fehérjét pufferben oldunk (25 mmól/1 MOPS/KOH, pH = 7,40, 105 mmól/1 NaCl, 4 mmól/1 MgCl2, 0,4 mmól/1 EGTA (etilén-glikol-bisz(P-amino-etil-éter)-tetraecetsav), 0,5 mmól/1 DTT (ditiotreit), 0,5% dezoxi-kolát,
0,1 mmól/1 IBMX (izobutil-metil-xantin), 0,1 mmól/1 PMSF, 50 gmól/l Leupeptin, 0,1 mmól/1 aprotinin; 2 mg/ml). Az oldatot 2 ml N6-(2-amino-etil)-cAMPszefaróz-oszlopra (Pharmacia, Freiburg) visszük 4 °C hőmérsékleten, amit előzetesen ugyanezzel a pufferrel egyensúlyozunk ki. Az oszlopot ötször 2 ml pufferrel (25 mmól/1 MOPS/KOH, pH = 7,2,100 mmól/1 Na-citrát, 5 mmól/1 DTT, 5 mmól/1 MgCl2, 150 mmól/1 NaCl, 250 mmól/1 szaccharóz, 7,5% etilén-glikol (Merck, Darmstadt), 10% glicerin, 1 mg/ml borjúszérum albumin, 1 mmól/1 IMBX) mossuk. Ezután 4 °C hőmérsékleten 2 ml azonos pufferrel eluáljuk, amely további komponensként 100 gmól/l cAMP-t tartalmaz. Az első 250 μΐ eluátumot 1 ml Sephadex G25 oszlop centrifugálásával sómentesítjük, amit előzetesen pufferrel (25 mmól/1 MOPS/KOH, pH = 7,0, 50 mmól/1 KC1, 5 mmól/1 MgCl2, 10 mmól/1 DTT, 50 gmól/l EDTA, 50 gmól/l PMSF, 0,1% dezoxi-kolát, 5% glicerin) egyensúlyozunk ki. Az sómentesített anyagot azonos térfogatú 8% polietilén-glikol 4000-rel (Pharmacia, Freiburg) pufferben (10 mmól/1 MOPS/KOH, pH = 7,2, 1 mmól/1 EDTA) 30 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 15 percen keresztül centrifugáljuk, majd az üledéket pufferben (20 mmól/1 MOPS/KOH, pH = 7,2, 1 mmól/1 EDTA, 10 gmól/l PMSF, 0,5% dezoxi-kolát) oldjuk (2 mg fehérje/ml).
3. példa
Foszfoinozitol-glikán peptidek előállítása
a) A pronázzal (Streptomyces griseus, Boehringer Mannheim) végzett emésztéshez 100 gg cAMP-kötőfehéijét 10 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten 1 ml 0,1 mól/1 N-2-hidroxi-etil-piperazin-N-2-etén-szulfonsav (HEPES)/KOH (pH = 8,0), 10 mmól/1 CaCl2 és 1% Triton X-100 (Boehringer, Mannheim) jelenlétében 450gg/ml pronázzal inkubálunk. 1% SDS (nátriumdodecil-szulfát) hozzáadása után az inkubálást egy második adag pronázzal 7 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten folytatjuk. Az automatizált Edmann-lebontás szerint a pronáz emésztés során olyan foszfoinozitol-glikán keletkezik, amelynél az etanol-amin amino végéhez amidszerűen egy aszparagin kapcsolódik. Ezt a foszfoinozitol-glikán peptidet a továbbiakban PIG-N rövidítéssel jelöljük.
b) Az endoproteináz Glu-C, EC 3.4.21.19 (V8 proteáz) (Staphylococcus aureus, Boehringer, Mannheim) enzimmel végzett emésztéshez 100 gg cAMP-kötőfehérjét 18 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 1 ml 20 mmól/1 (NH4)2CO3 (pH = 7,8) és 0,5% oktil-glükozid (Boehringer Mannheim) jelenlétében 300 gg V8 proteázzal inkubálunk. Az automatizált Edmann-lebontás szerint a V8 proteázzal végzett emésztés peptidként Asn-CysTyr szakaszt tartalmazó foszfoinozitol-glikánhoz vezet. Az aszparaginsav karboxiterminális részével a foszfoinozitol-glikánhoz kapcsolódik. A foszfoinozitol-glikán és az Asn-Cys-Tyr tripeptid vegyületet a továbbiakban PIG-NCY rövidítéssel jelöljük.
c) Az endoproteáz Lys-C enzimmel (Lysobacter enzymogenes, Boehringer Mannheim) végzett emésztéshez 100 gg cAMP-kötőfehérjét 18 órán keresztül 37 °C
HU 210 431 Β hőmérsékleten 0,5 ml 50 mmól/l (NH4)2CO3 (pH = 8,2) és 0,5% oktil-glükozid jelenlétében 55 gg endoproteáz Lys-C enzimmel inkubálunk. Az automatizált Edmannlebontás szerint az endoproteáz Lys C Asn-Cys-Tyr-Glu pepiidet tartalmazó foszfoinozitol-glikánt eredményez. A peptid a foszfoinozitol-glikánhoz az aszparagin karboxi végével kapcsolódik. Ezt a vegyületet a továbbiakban PIG-NCYE rövidítéssel jelöljük.
d) A karboxi-terminális aminosav eltávolításához a pronázzal emésztett cAMP-kötőfehérjét (lásd az a) pontot) manuális Edmann-lebontásnak vetjük alá. A keletkező aminosavmentes foszfoinozitol-glikánt a továbbiakban PIG rövidítéssel jelöljük.
A proteolitikus lehasítás után a proteázokat 5 tömeg% triklór-ecetsavval (TCA) végzett kicsapással eltávolítjuk. Centrifugálás (15 perc, 10 000 g) után a felülúszóban található foszfoinozitol-glikán peptid származékot az Edmann-lebontásból származó foszfoinozitolglikánhoz hasonlóan fenil-szefaróz oszlophoz kötve koncentráljuk és tisztítjuk. Az eluálást 2% oktil-fenol-(etilénglikol-éter)-rel (TX-100) végezzük. A foszfoinozitol-glikán peptid származékot vékonyrétegkromatográfiásan két különböző oldószer rendszerben tisztítjuk. A savas rendszemel (kloroform/aceton/metanol/jégecet/víz 10:4:2:2:1) végzett első futtatás után a foszfoinozitol-glikán pepiidet a felviteli helyhez közel szilikagél lemezen (Typ 60) metanollal eluáljuk, és ezután egy második menetben bázikus rendszerrel (kloroform/metanol/ammónia/víz 45:45:3,5:10) ismét kromatografáljuk. A foszfoinozitol-glikán peptid származékot a lemezről újból eluáljuk (Rf = 0,45) és kloroform/metanol 2:1 eleggyel extraháljuk. A szerves fázist mossuk, és bepároljuk, a maradékot foszfát pufferben 0,5% T-100 jelenlétében szuszpendáljuk.
e) Az a)-d) pontokban kapott foszfoinozitol-glikánt vagy foszfoinozitol-glikán pepiidet 10 egység foszfatidil-inozitol-specifikus foszfolipáz C, EC 3. 1. 1. 5 enzimmel (Bacillus cereus, Sigma, Diesenhofen) 0,2 ml 0,2 mmól/l kálium-foszfát (pH = 7,2), 2 mmól/l DDT, 10 mmól/l MgCl2, 50 mól/1 NaCl és 0,05% TX100 jelenlétében 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 10 mmól/l EDTA hozzáadása után a hasítási terméket vékonyrétegkromatográfiásan lúgos futtatószerben (lásd a d) pontot) elválasztjuk. A felviteli hely közvetlen közelében található anyagot a lemezről eluáljuk, és 2% poli(etilén-glikol)8-mono(oktil-feniléter)-rel (TX-114) elegyítjük. A fázisokat melegítéssel és centrifugálással szétválasztjuk, és a vizes fázist Speedvac koncentrátorban koncentráljuk.
f) A foszfoinozitol-glikán vagy peptidszármazéka standardizálásához az a)-d) pontokban kapott anyagról a szabad glükózamin nitrogénjét permetilezéssel radioaktív jelölésű trimetil-ammónium-kationná alakítjuk. Ehhez a mintát vákuumban szárítjuk, és 100 μΐ dimetilszulfoxiddal elegyítjük. Ultrahangos besugárzás (1 perc) után 10 mg nátrium-hidroxidot és 40 μΐ 125J metil-jodidot (0,2 μθ, NEN-Dupont, Dreieich) adunk hozzá. 45 percen keresztül 25 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert Speedvac-ban eltávolítjuk, és a maradékot 400 μΐ vízzel elegyítjük. A mintát háromszor kloroformmal, majd a kloroformos extraktumot háromszor vízzel mossuk. A kloroformot nitrogén atmoszférában eltávolítjuk. A permetilezés széles koncentrációtartományon belül lineáris és kvantitatív. Az inzulinszerű hatás vizsgálatához ekvivalens térfogatú (azonos dpm érték) foszfoinozitol-glikán pepiidet (1100 önkényes egység) alkalmazunk.
g) Az a)—d) pontokban kapott anyag salétromsav jelenlétében végzett inkubálásával hasítjuk a foszfoinozitol-glikánt.
4. példa
A foszfoinozitol-glikán peptidek szerkezeti jellemzése
a) Élesztősejteket az 1. példában megadott módon radioaktív jelölésű szubsztrátum (NEN-Dupont, Dreieich): sztearinsav, mio-inozitol, etanolamin, glükozamin vagy mannóz jelenlétében tenyésztünk. A teljes plazmamembrán frakciót vagy az affinitás kromatográfiásan tisztított cAMP-kötőfehérjét (lásd a 2. példát) SDS poliakrilamid gélelektroforézisnek vetjük alá. A Coommassie blue festékkel végzett színezés vagy a komponensek autoradiográfiás vizsgálata szerint a fent említett radioaktív komponensek beépülnek a foszfoinozitol-glikán peptidbe.
b) A 3 a) példa szerint előállított foszfoinozitol-glikán pepiidet kémiailag és enzimatikusan tovább hasítjuk. A hasítási termékeket vékonyrétegkromatográfiásan és a radioaktivitás eloszlás mérésével ([3H]-sztearinsav és [I4C]-mio-inozitol) analizáljuk. A visszamaradó radioaktívjelölésű szerkezetet a lemezről eluáljuk, és a következő hasítási reakcióba visszük. A pronáz emésztéssel keletkező szerkezetből salétromsavval végzett dezaminálással felszabadítjuk a foszfatidil-inozitolt (Pl). Ezt foszfolipáz D segítségével foszfatidilsavvá vagy foszfolipáz C segítségével diacil-glicerollá alakítjuk. Ennek során elveszik a mio-inozitol jelölés, megmarad azonban a sztearinsav radioaktív jelölése. A foszfatidilsavat ezután acetilezéssel diglicerid-acetáttá alakítjuk. Ebből a szerkezetből, a diacil-glicerolhoz hasonlóan lúgos hidrolízissel felszabadítjuk a sztearinsavat.
c) A 3 a) és 3 e) példák szerint előállított szerkezetet szárítjuk, és 60%-os, vizes hidrogén-fluoriddal 16 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. A kapott oligoszaccharidot 2 mól/1 trifluor-ecetsavval 4 órán keresztül 100 °C hőmérsékleten hidrolizáljuk. A reakciőoldatot ezután szárítjuk, és a kapott cukrot 1% NaBH4 segítségével 0,1 mól/1 ammónium-hidroxidban 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten redukáljuk, majd piridin/ecetsavanhidrid 1:1 eleggyel 1 órán keresztül 60 °C hőmérsékleten acetilezzük. A terméket Packard Modell 428 gázkromatográfon 100/120 Supelcoport oszlopon (Supelco, Bellefonte, USA) 60 °C hőmérsékleten gázkromatografálva az alábbi kvalitatív összetételű terméket kapjuk: mannóz, galaktóz, mio-inozitol-glükózamin.
d) A 3 a) és 3 e) példák szerint előállított szerkezetet a
c) szerinti hidrogén-fluoriddal (60 °C, víz) és 4 mól/1 sósavval 16 órán keresztül 100 °C hőmérsékleten hidrolizáljuk. Aminosav analizátoron (Biotronic, LC 6001) végzett elválasztás szerint a következő összetételt kapjuk: aszparaginsav, NH3, etanolamin és glükózamin.
HU 210 431 Β
A hidrolízis körülményeinek, az aszparaginsav és az NH3 arányának, valamint a 3 a) példa szerinti eredmények figyelembevételével a natív foszfoinozitol-glikán pepiidben aminosavként az aszparagin fordul elő.
5. példa
A találmány szerint előállított foszfoinozitol-glikán peptid (PGP) biológiai aktivitását patkányokból izolált zsírsejteken és diafragma darabokon határozzuk meg.
A PIG rövidítés peptid nélküli foszfoinozitol-glikánt jelent, amely előállítható a 3 d) és 3 e) példa szerint; a PIG N rövidítés aszparaginsavat tartalmazó foszfoinozitol-glikánt jelent, amely előállítható a 3 a) és 3 e) példa szerint; a PIG-NCY rövidítés Asn-CysTyr pepiidet tartalmazó foszfoinozitol-glikánt jelent, amely előállítható a 3 b) és 3 e) példa szerint; a PIGNCYE rövidítés Asn-Cys-Tyr-Glu pepiidet tartalmazó foszfoinozitol-glikánt jelent, amely előállítható a 3 c) és 3 e) példa szerint; a PIG-NCY(na) rövidítés a 3 b) és 3 e) példa szerint előállított anyagot jelenti, amit salétromsavval hasítunk (lásd a 3 g) példát). Az alap aktivitás stimuláció nélküli aktivitást jelent, az inzulin humán inzulin, és a dpm rövidítés a percenként bekövetkező radioaktív bomlást jelöli.
A táplálékfelvételben nem korlátozott 160-180 g tetsttömegű Wistar patkányok mellékheréjének zsírszövetét kollagenázzal emésztjük, és a keletkezett egyedi zsírsejteket flotációval többször mossuk.
A táplálékfelvételben nem korlátozott 60-70 g testtömegű Wistar patkányok többször átmosott Hemi-diafragmáját 5 mm átmérőjű szövetdarabkákra aprítjuk.
A patkány zsírsejtek inzulin receptorainak inaktiválásához a sejteket 10-40 gg/ml tripszinnel kezeljük. Proteáz inhibitor hozzáadása után a sejteket flotációval kétszer mossuk, és az inkubálást 15 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten folytatjuk. Ezeket a sejteket alkalmazzuk a lipogenézis foszfoinozitol-glikán pepiiddel végzett stimulálásának vizsgálatához. Az inzulinnal végzett kontroll inkubálás szerint a tripszinnel kezelt sejtek csak nagyon csekély inzulinnal stimulálható lipogenézt, és ezáltal csak igen korlátozott mennyiségű funkcióképes inzulin receptort tartalmaznak.
A patkány diafragma inzulin receptorainak inaktiválásához a szövetdarabkákat oxigénnel végzett állandó gázosítás mellett KRH-pufferben (0,1 mmól/1 glükóz, 50 gg/ml forbolészter tetradekanoil-forbolacetát jelenlétében) 90 percen keresztül 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A szövetdarabkákat ezután KRH-pufferrel kétszer mossuk, és a vizsgálathoz felhasználjuk.
A következő kísérletekben a szövettel vagy sejttel megcélzott vizsgálati eredményeket, amelyekben az inzulin receptorokat inaktiváltuk, zárójelben adjuk meg. A következő vizsgálatokban a PIG-NCYE egyetlen esetben sem mutatott aktivitást.
a) Glikogenézis
Ebben a vizsgálatban az izomsejtek inzulinnal stimulálható glikogén szintézisét határozzuk meg, amely felöleli a glükóz transzportot a plazmamembránon keresztül, és a glükóz glikogénné történő átalakítását, valamint a funkcióképes inzulinszignál átviteli kaszkádot.
A diafragma darabkákat KRH-pufferben 50 μιηόΐ/ΐ D-[U-14C]-glükózzal inzulin és PGP jelenlétében vagy távollétében 15 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A közeg leszűrése után a szövetdarabkákat intenzíven mossuk, -70 °C hőmérsékleten fagyasztjuk, és 2 °C hőmérsékleten politron aprítóban homogenizáljuk. A homogenizátumot centrifugáljuk (2000 g), és a felülúszót szűrőpapírra pipettázzuk. A képződött glikogén meghatározásához a szűrőt 5% TCA-ba visszük, etanollal és acetonnal mossuk, szárítjuk, és radioaktivitását szcintillációs számlálóval ([14C]-glikogén, dpm 10r3) meghatározzuk. A foszfoinozitol-glikán-peptid mérésére a 3 f) példában definiált önkényes egységeket alkalmazzuk.
A mérési eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
7. táblázat
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 3,3 (3,4) | ||||||
| 10 nmól/1 | 8,4(4,1) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,2(3,1) 3,6 (3,5) 4,4(3,9) | |||||
| 1 10 100 | 3,0 (2,5) 4,2(3,8) 6,7(6,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,2(2,7) 4,8 (4,3) 6,5 (5,8) 8,0(7,1) | |||||
| 1 10 100 | 3,0(2,5) 3,2 (2,9) 3,6(3,4) |
HU 210 431 Β
b) Glikogén szintézis
A vizsgálatban az aktivált glükóz (UPD-glükóz) inzulinnal stimulálható átalakulását határozzuk meg, amelynek során glikogén keletkezik (glikogén-szintáz aktivitás), és amelyhez egy funkciós inzulin szignálátviteli kaszkád csatlakozik. A glükóz transzportot és a glükóz aktiválását megkerüljük (a glikogén szintézis mérésétől eltérően, lásd a) pont).
A diafragma darabokat 0,1 mmól/1 D-glükózzal inkubáljuk inzulin és PGP jelenlétében vagy távollétében 10 30 percen keresztül és 37 °C hőmérsékleten. Ezután homogenizáljuk, és centrifugáljuk (20 000 g). A felülúszót
0,3 mmól/1 U-[14C]UDP-glükózzal 0,1 mmól/1 vagy 10 mmól/1 glükóz-6-foszfát jelenlétében 60 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten ínkubáljuk. Az elegyet szűrőpapírra visszük, és a szűrletet a fent leírt módon kezel5 jük. A glikogén-szintáz aktivitást az enzim I-formája (a glükóz-6-foszfáttól független, de foszforilezett, a homogenizátumban található aktív enzim mennyiségének felel meg), és az enzim D-formája (a glükóz-6-foszfáttól függ, foszforilezett, a homogenizátumban lévő aktiválható enzim összmennyiségének felel meg) közötti ffakcionális sebességként számláljuk ([l4C]glikogén, dpm 1 θ'3).
A mérési eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 4,4 (3,5) | ||||||
| 10 nmól/1 | 10,1 (6,0) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,9 (3,5) 4,8 (3,8) 5,7 (4,5) 6,7(6,0) | |||||
| 1 10 100 | 3,9(3,5) 5,7 (5,0) 7,2 (6,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,8 (3,4) 5.7 (5,1) 7,2(6,4) 8.8 (8,1) | |||||
| 1 10 100 | 3,2(3,0) 4,0(3,5) 4,5 (4,0) |
c) Lipogenézis
Ebben a vizsgálatán a glükóz inzulin által stimulálható átalakulását vizsgáljuk, amelynek során toluolban oldható termékek (trigliceridek, foszfolipidek és zsírsavak) keletkeznek, ami magába foglalja a glükóz transzportot, és a triglicerid (glicerin-3-P-szintézis, észterezés)-/foszfolipid/-zsírsav-szintézist, valamint az inzulin szignálátvivő kaszkádot.
A patkány zsírsejteket KRH-pufferben 0,2 mmól/1 vagy 1 mmól/1 végkoncentrációban D-[3-3H]gIükóz35 zal ínkubáljuk inzulin és PGP jelenlétében vagy távollétében 90 percen keresztül és 37 ’C hőmérsékleten. Toluolban oldható szcintillációs koktél hozzáadásával a sejteket feltárjuk, és a lipideket elválasztjuk a vízben oldódó termékektől és az inkubációs közegtől.
A fázisok szétválasztása után a lipid által hordozott radioaktivitást szcintillációs méréssel közvetlenül, a vizes fázis eltávolítása nélkül határozzuk meg ([3H]lipid, dpm 10'3).
A mérési eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 1,0(1,0) | ||||||
| 10 nmól/1 | 11,2(1,9) | |||||
| 1 5 25 100 | 1,0(0,9) 2.1 (1,5) 3.1 (3,0) 4,2(3,5) | |||||
| 1 10 100 | 1,0(1,2) 3,5 (3,3) 5,4(4,8) |
HU 210 431 Β
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 1 5 25 100 | 1,0(0,9) 3.5 (3,0) 5.5 (5,2) 6,8 (5,9) | |||||
| 1 10 100 | 1,0(0,9) 1,0(1,5) 2,1 (2,5) |
d) Valóságos glükóz transzport aktivitás
Patkány zsírsejtekből (5. példa) izoláljuk a plazmamembrán vezikulumot, amelyhez a zsírsejteket kétszer homogenizáló pufferben (20 mmól/1 trihidroxi-aminometán (Trisz)/HCl, pH = 7,4, 1 mmól/1 EDTA és 0,25 mól/1 szaccharóz) mossuk, majd 4 °C hőmérsékleten 20 ml fenti pufferben homogenizáljuk (üveg homogenizátor, teflon pisztillusz).
A homogenizátumot centrifugáljuk (16 000 g, 15 perc), az üledéket a fenti pufferben szuszpendáljuk, és ismét centrifugáljuk. Az üledéket 5 ml homogenizáló pufferben szuszpenáljuk, és szaccharóz rétegre (1,12 mól/1 szaccharóz, 20 mml/1 Trisz/HCl, pH = 7,4, és 1 mmól/1 EDTA) visszük, és centrifugálás (100 000 g, 70 perc) után a plazmamembrán vezikilumot tartalmazó belső fázist fecskendővel eltávolítjuk. 45 ml pufferrel hígítjuk, és ismét centrifugáljuk (48 000 g, 45 perc). Az üledéket 10 ml pufferben szuszpendáljuk, ismét centrifugáljuk, és 3 ml pufferben szuszpendáljuk.
Az izolált plazmamembrán vezikulumot inzulin és
PGP jelenlétében vagy távollétében 30 percen keresztül 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a vezikulumot azonos specifikus radioaktivitású 50 pmól/l D-[33H]-glükóz és L-[l-14C]-glükóz jelenlétében 90 másodpercen keresztül 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
Az elegyet gyorsan nitrocellulóz szűrőn szűrjük, a szűrletet alaposan mossuk, és szárítjuk. A radioaktivitást folyadék szcintillációs méréssel határozzuk meg. A specifikus transzportot (D-[3H]-glükóz/L-[14C]-glükóz, dpm 10'3) a [3H] és a [14C] radioaktivitás különbségé25 bői számoljuk.
A mérési eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.
4. táblázat
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 2,4 (2,6) | ||||||
| 10 nmól/1 | 2,5 (2,3) | |||||
| 1 5 25 100 | 2,3 (2,5) 2,9 (2,7) 2,7 (2,7) 2,9 (3,3) | |||||
| 1 10 100 | 2,7(2,6) 3,5 (3,7) 4,0(3,8) | |||||
| 1 5 25 100 | 2,3 (2,7) 3,5 (3,7) 4,7(4,6) 6,9 (5,8) | |||||
| 1 10 100 | 2,5 (2,3) 2,6(2,7) 2,7 (3,0) |
e) Fehérjeszintézis
Az előzetes vizsgálatokban mért metabolikus inzulinhatástól eltérően a proteinszintézis stimulálása az inzulin (mint növekedési hormon) hosszan tartó hatásához tartozik. A vizsgálat magában foglalja az inzulin szignálkaszkádot.
Patkány zsírsejteket „Dulbecco’s modified essential médium” (DMEM) közegben, amely kevés leucint tartalmaz, primer kultúrában 50 pmól/l L-[3H]-leucinnal inzulin és PGP jelenlétében 4 órán keresztül 37 °C hő- 60 mérsékleten inkubáljuk. A sejteket olaj centrifugálási módszerrel elválasztjuk a közegtől, és vízzel kompatíbilis szcintillációs koktéllal keverjük. Centrifugálás után a fehéqe csapadékot acetonnal mossuk, 1% SDS55 ben szuszpendáljuk, és szcintillációs koktéllal elegyítjük. A sejt radioaktivitását szcintillációs méréssel határozzuk meg, és ez alapján számoljuk a fehérjeszintézist és a plazmamembránon keresztül mérhető aminosavtranszportot ([3H]-leucin, dpm 10‘4).
A mérési eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.
HU 210 431 Β
5. táblázat
| ALAP | INZULIN | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 3,5 (3,4) | ||||||
| 10 nmól/1 | 10,1 (4,0) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,5 (3,3) 3,55 (3,5) 4,0(3,5) 3,8(3,3) | |||||
| 1 10 100 | 3,4(3,3) 4,1 (3,2) 5,3 (4,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3.8 (3,7) 4,4(4,2) 5,1 (5,0) 6.9 (5,8) | |||||
| 1 10 100 | 3.7 (3,5) 3.8 (3,7) 4,1 (3,8) |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (6)
1) adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéjét tartalmazó Saccharomyces cerevisiae DSM 6649 sejtet ismert módon, előnyösen aerob körülmények között 18-35 ’C hőmérsékleten és pH = 2-8 tartományban 107/ml sejtsűrűségig fermentálunk,
1. Eljárás foszfoinozitol-glikán és 1-4 aminosavat tartalmazó peptidszármazékai előállításához, azzal jellemezve, hogy
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a foszfoinozitolglikán 3 aminosavat tartalmazó peptidszármazéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3) lépésben a megfelelő enzim(ek)et alkalmazzuk.
2) az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéjét ismert módon izoláljuk,
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foszfoinozitolglikán vagy annak aszparagint tartalmazó származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3) lépésben kémiai lebontást végzünk, vagy a megfelelő enzimet alkalmazzuk.
3) az adenozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát kötőfehérjéje fehérjerészét és kívánt esetben a kapott glikozil-foszfatidil-inozitol-peptid peptid részét enzimatikusan, előnyösen V8 proteáz vagy pronáz segítségével, és/vagy kémiailag, előnyösen Edmann-lebontással hasítjuk, és a kapott terméket izoláljuk és kívánt esetben tisztítjuk,
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy V8 proteázként endroproteáz Glu43, EC 3. 4. 21. 19 enzimet és/vagy foszfolipázként foszfolipáz C, EC 3. 1. 1. 5 enzimet alkalmazunk.
4) majd a kapott termékből enzimatikusan, előnyösen foszfolipáz segítségével egy mono- vagy diacil-glicerint lehasítunk, és
5. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított foszfoinozitol-glikánt vagy annak 1-4 aminosavat tartalmazó peptidszármazékát fiziológiailag alkalmazható hordozóanyaggal, valamint adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal, valamint adott esetben egyéb hatóanyaggal keverünk, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
5) a kapott terméket izoláljuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyéb hatóanyagként inzulint, előnyösen marha-, disznó- vagy humán-inzulint alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4127495 | 1991-08-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT62013A HUT62013A (en) | 1993-03-29 |
| HU210431B true HU210431B (en) | 1995-04-28 |
Family
ID=6438668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202701A HU210431B (en) | 1991-08-20 | 1992-08-19 | Process for producing phosphoinositol glykan and it`s peptide derivatives containing 1-4 amino acids with insulin-like activity and pharmaceutical compositions containing them |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5624903A (hu) |
| EP (1) | EP0532915B1 (hu) |
| JP (1) | JP3361126B2 (hu) |
| KR (2) | KR100264623B1 (hu) |
| AT (1) | ATE147407T1 (hu) |
| AU (1) | AU656396B2 (hu) |
| CA (1) | CA2076424C (hu) |
| CZ (1) | CZ290341B6 (hu) |
| DE (1) | DE59207835D1 (hu) |
| DK (1) | DK0532915T3 (hu) |
| ES (1) | ES2096686T3 (hu) |
| FI (1) | FI102842B (hu) |
| GR (1) | GR3022895T3 (hu) |
| HR (1) | HRP940834B1 (hu) |
| HU (1) | HU210431B (hu) |
| IL (1) | IL102859A (hu) |
| NO (1) | NO303452B1 (hu) |
| SG (1) | SG46639A1 (hu) |
| SK (1) | SK281333B6 (hu) |
| TW (1) | TW224104B (hu) |
| YU (1) | YU66892A (hu) |
| ZA (1) | ZA926232B (hu) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE184611T1 (de) * | 1991-11-29 | 1999-10-15 | Hoechst Ag | Peptide mit insulinartiger wirkung |
| ES2159283T3 (es) * | 1992-02-29 | 2001-10-01 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Complejos que contienen glicosil-fosfatidilinositol-proteinas y derivados de acido colanico, procedimiento para su preparacion y su utilizacion. |
| US5652221A (en) * | 1994-11-07 | 1997-07-29 | The University Of Virginia Patent Foundation | Method of treating defective glucose metabolism using synthetic insulin substances |
| GB9618929D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Metal containing carbohydrates from human tissue which regulate glycogen metabolism |
| GB9618934D0 (en) * | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Inositol phosphoglycans for therapeutic use in the treatment of diabetes and obesity |
| GB9618930D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Metal containing carbohydrates from human tissue which regulate lipogenic activity |
| DE19649350A1 (de) * | 1996-11-28 | 1998-06-04 | Hoechst Ag | Inositolglykane mit insulinartiger Wirkung |
| KR100481746B1 (ko) * | 1996-11-28 | 2005-08-10 | 훽스트 악티엔게젤샤프트 | 인슐린-유사작용을갖는이노시톨글리칸및이를포함하는약제학적제제 |
| EP2158923B1 (en) | 1998-08-06 | 2013-02-27 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| CH697081A5 (de) * | 2002-01-22 | 2008-04-30 | Andreas F Dr Schaub | Zusammensetzung für die Unterstützung der Geburt eines menschlichen Föten. |
| EP1378517A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-07 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Phosphoinositolglycan (PIG) binding protein from adipocytes |
| CA2491555C (en) * | 2002-07-10 | 2012-09-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid-phase and solution-phase synthesis of glycosylphosphatidylinositol glycans |
| ITMI20030237A1 (it) * | 2003-02-11 | 2004-08-12 | Indena Spa | Uso della conglutina di lupino per il trattamento del |
| DE102004054552A1 (de) * | 2004-11-11 | 2006-05-18 | Hcb Happy Child Birth Holding Ag | Neue Zusammensetzung zur Erleichterung der Humangeburt |
| RU2435847C2 (ru) | 2005-04-11 | 2011-12-10 | Савиент Фармасьютикалз, Инк. | Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование |
| PL3321359T3 (pl) | 2005-04-11 | 2021-06-28 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie |
| US8148123B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| KR101861547B1 (ko) | 2009-06-25 | 2018-07-02 | 크레알타 파마슈티칼스 엘엘씨 | 페길화된 유리카아제 치료 중에 혈청 요산을 모니터링하여 주입 반응의 위험성 및 반응의 항체매개 상실을 예측하는 방법 및 키트 |
| CN102270762B (zh) * | 2010-06-03 | 2014-08-20 | 清华大学 | 锂离子电池电极浆料及应用该电极浆料制备的电极片 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3326473A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-01-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Pharmazeutisches mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| US4906468A (en) * | 1986-04-11 | 1990-03-06 | The Rockefeller University | Insulin activity messengers, their antibodies, and thereof |
| US4839466A (en) * | 1986-04-11 | 1989-06-13 | The Rockefeller University | Insulin activity messengers |
-
1992
- 1992-07-02 YU YU66892A patent/YU66892A/sh unknown
- 1992-08-04 TW TW081106143A patent/TW224104B/zh not_active IP Right Cessation
- 1992-08-14 DK DK92113897.0T patent/DK0532915T3/da active
- 1992-08-14 EP EP92113897A patent/EP0532915B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-14 SG SG1996006943A patent/SG46639A1/en unknown
- 1992-08-14 ES ES92113897T patent/ES2096686T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-14 AT AT92113897T patent/ATE147407T1/de active
- 1992-08-14 DE DE59207835T patent/DE59207835D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-18 FI FI923702A patent/FI102842B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-08-18 IL IL10285992A patent/IL102859A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 KR KR1019920014893A patent/KR100264623B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 CZ CS19922553A patent/CZ290341B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 ZA ZA926232A patent/ZA926232B/xx unknown
- 1992-08-19 NO NO923252A patent/NO303452B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 CA CA002076424A patent/CA2076424C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-19 AU AU21109/92A patent/AU656396B2/en not_active Expired
- 1992-08-19 SK SK2553-92A patent/SK281333B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 HU HU9202701A patent/HU210431B/hu unknown
- 1992-08-19 JP JP21994692A patent/JP3361126B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-10-26 HR HR940834A patent/HRP940834B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-12-23 US US08/364,398 patent/US5624903A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-24 GR GR970400577T patent/GR3022895T3/el unknown
-
2000
- 2000-01-20 KR KR1020000002579A patent/KR100318706B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU210431B (en) | Process for producing phosphoinositol glykan and it`s peptide derivatives containing 1-4 amino acids with insulin-like activity and pharmaceutical compositions containing them | |
| Matsuyama et al. | A novel extracellular cyclic lipopeptide which promotes flagellum-dependent and-independent spreading growth of Serratia marcescens | |
| Schauer | Chemistry and biology of the acylneuraminic acids | |
| Jackson et al. | The biosynthesis of membrane-derived oligosaccharides. A membrane-bound phosphoglycerol transferase. | |
| JPS60152500A (ja) | α−アミラ−ゼ抑制作用を有する新規ポリペプチドおよびそれらの製法 | |
| EP0177366A2 (en) | Enkephalinase B inhibitors, their preparation, and pharmaceutical compositions containing the same | |
| KR100366258B1 (ko) | 신규 kf-1040 물질 및 그 제조법 | |
| US6703213B2 (en) | Substrate analogs for MurG, methods of making same and assays using same | |
| CH660557A5 (fr) | Composition anti-bacterienne et procede de preparation de ses constituants actifs. | |
| Hodgson et al. | Nutrition and metabolism of methyl donors and related compounds in the blowfly, Phormia regina (Meigen) | |
| Brassart et al. | Catabolism of N‐glycosylprotein glycans: evidence for a degradation pathway of sialyglyco‐asparagines resulting from the combined action of the lysosomal aspartylglucosaminidase and endo‐N‐acetyl‐β‐d‐glucosaminidase: A 400‐MHz 1H‐NMR study | |
| Yamaguchi et al. | Amino acid sequence of the nucleotide-binding site of D-(-)-. beta.-hydroxybutyrate dehydrogenase labeled with arylazido-. beta.-[3-3H] alanylnicotinamide adenine dinucleotide | |
| JP3669595B2 (ja) | スフィンゴ脂質セラミドデアシラーゼ | |
| EP0707063B1 (en) | Glycolipid ceramide deacylase | |
| Jacquemin | Glycosyl phosphatidylinositol in thyroid: cell signalling or protein anchor? | |
| US6544965B2 (en) | Compounds with an antioxidant activity, compositions useful as food integrators containing them and process for their preparation | |
| US6821761B2 (en) | Sphingolipid ceramide N-deacylase, methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives, and sphingolipid ceramide N-deacylase gene | |
| US6740509B2 (en) | Method for the production of mucin-type glycopeptide | |
| JP2842613B2 (ja) | フォスフォリパーゼａ▲下２▼阻害物質 | |
| Prakash et al. | Characterization of lipid-linked octa-through undecasaccharides implicated in the biosynthesis of Saccharomyces cerevisiae mannoproteins | |
| JPH02250890A (ja) | 新規リン脂質 | |
| Utsumi et al. | Myristoylation of protein at a distinct position allows its phosphorylation by protein kinase C | |
| PT736102E (pt) | Processo de obtencao de produtos peptidicos | |
| HANTRE et al. | ing zyxwvutsrqponmlkjih | |
| Udenfriend | BIOGENESIS OF PHOSPHATIDYLINOSITOL GLYCOSYL MEMBRANE PROTEINS AND THEIR SIGNIFICANCE |