CZ290341B6 - Fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulinu, způsob její výroby, léčivo tuto látku obsahující a její pouľití - Google Patents
Fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulinu, způsob její výroby, léčivo tuto látku obsahující a její pouľití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290341B6 CZ290341B6 CS19922553A CS255392A CZ290341B6 CZ 290341 B6 CZ290341 B6 CZ 290341B6 CS 19922553 A CS19922553 A CS 19922553A CS 255392 A CS255392 A CS 255392A CZ 290341 B6 CZ290341 B6 CZ 290341B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insulin
- phosphoinositol glycan
- phosphoinositol
- compound
- binding protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0827—Tripeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1027—Tetrapeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
e en se t²k fosfoinositolglykanov²ch slou enin s · inkem podobn²m inzulinu, z skateln²ch t pen m adenosin-3',5'-cyklick² monofosf t-vazebn ho proteinu a/nebo jeho fyziologicky p°ijateln²ch sol , obsahuj c ch fosfoinositolglykan a ethanolamin a jejich fyziologicky p°ijateln²ch sol , zp sobu jejich v²roby a jejich pou it , obzvl t jako l iv, obzvl t pro o et°en diabetes mellitus nebo diabetes nez visl m na inzulinu.\
Description
Oblast techniky
Vynález se týká fosfoinositolglykanových sloučenin s účinkem podobným inzulínu, způsobu jejich výroby a jejich použití, obzvláště jako léčiv pro ošetření diabetes mellitus nebo diabetes, která není závislá na inzulínu.
Dosavadní stav techniky
Inzulín má větší počet účinků na tkáně, citlivé na inzulín. Nápadným efektem je rychlá redukce hladiny glukózy u savců v případě použití inzulínu, což je způsobeno iychlým přijímáním glukózy z krve svalovými a tukovými buňkami. Inzulín aktivuje dále glykogen-syntetázu a inhibuje lipolýzu. Inzulín podporuje syntézu proteinů z aminokyselin a zesiluje indukci pyruvátdehydrogenázy a fosfofruktokinázy a inhibuje tvorbu určitých enzymů glukoneogeneze, jako je pyruvátkarboxyláza a fruktózo-l,6-bifosfatáza.
Diabetes typu Π, neinzulinová diabetes, působí s inzulínovou resistencí periferních tkání, jako jsou svalové tkáně a tukové tkáně. Tím redukované zužitkování glukózy je způsobeno chybějící inzulínovou stimulací transportu glukózy a následujícím metabolickým procesem (glukogeneze, lipogeneze). Z této dvojité resistence se dá usuzovat na defekt na úrovni receptorů nebo postreceptorů, to znamená před výrobou „second messenger“ (Garvey, Diabetes/Metabolism Reviews, 5, (1989), 727-742).
Dosud nejsou známé žádné účinné látky, které obcházejí inzulínový receptor a přesto vykazují účinek podobný inzulínu.
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že fosfoinositolglykanové sloučeniny, které se mohou získat z vazebného proteinu adenosin-3',5'-cyklického monofosfátu (cAMP), vykazují in vitro účinek podobný inzulínu a také na inzulin-resistentních tkáních vykazují účinek podobný inzulínu.
Vynález se tedy týká fosfoinositolglykanových sloučenin, získatelných štěpením adenosin-3',5'cyklický monofosfát-vazebného proteinu a/nebo jeho fyziologicky přijatelných solí.
Předmětem předloženého vynálezu tedy je fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulínu, obsahující fosfoinositolglykan a ethanolamin a její fyziologicky přijatelné soli.
Pod pojmem inzulin-resistentní tkáň se rozumí například krysí tukové buňky, které nemají žádný inzulínový receptor. cAMP-vazebné proteiny jsou proteiny, které mají vlastnost vázat adenosin3',5'-cyklický monofosfát.
Dosavadní strukturní data fosfoinositolglykanové sloučeniny podle předloženého vynálezu předpokládají fosfoinositol s glykanovým podílem, obsahujícím galaktózu, glukózamin a manózu, který je přes fosforylethanolaminový zbytek vázán amidovou vazbou na karboxylovém konci peptidu. Tento se opět nachází uvnitř kovalentně vázaného glykolipidu, sloužícího jako výměnná skupina membrány, o podobné struktuře jako u plazmových membránových proteinů vyšších eukaryontů (Roberts a kol., J. Biol. Chem., 263, (1983), 18776-18784). Glykanový zbytek obsahuje glukózamin, galaktózu, manózu a alespoň dva fosfátové zbytky na mol. Peptid
-1CZ 290341 B6 obsahuje sekvenci -Aan-Cys-Tyr- a je spojen s karboxylovým koncem kyseliny asparagové přes amidovou vazbu na aminoskupině fosfoinositolového glykanu. Fosfoinositolglykanový podíl je potřebný pro aktivitu. Peptid zesiluje účinek podobný inzulínu. Dále se ukázalo, že účinek podobný inzulínu nevykazuje pouze úplný fosfoinositolglykanový peptid, ale také dílčí struktury. Účinek podobný inzulínu vykazují například také zkrácené peptidové sekvence, které jsou vázané na fosfoinositolglykan, nebo pouze fosfoinositolglykan bez peptidu.
Vhodné fyziologicky přijatelné soli fosfoinositolglykanového peptidu podle předloženého vynálezu jsou například soli s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin nebo amonné, jakož i soli s fyziologicky přijatelnými organickými amonnými nebo trimethylaminovými bázemi.
Výroba fosfoinositolglykanových sloučenin podle předloženého vynálezu probíhá například tak, že se
a) použijí organismy, obsahující adenosin-3 ',5 '-cyklický monofosfát-vazebný protein,
b) izoluje se adenosin-3 ',5 '-cyklický monofosfát-vazebný protein,
c) proteinový podíl adenosin-3 '-,5 '-cyklický monofosfát-vazebného proteinu se odštěpí úplně nebo s výjimkou terminálního asparaginu nebo s výjimkou terminálního tripeptidu AsnCys-Tyr a vzniklá glykosylfosfatidyl-inositolová sloučenina se popřípadě čistí,
d) z produktu, získaného ve stupni c) se odštěpí monoacylglycerol nebo diacylglycerol a
e) fosfoinositolglykanová sloučenina, získaná ve stupni d), se izoluje a popřípadě se převede na odpovídající fyziologicky přijatelné soli.
Adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebný protein se může získat z různých organismů, například z mikroorganismů, rostlin, hub nebo zvířecích orgánů. Vhodné jsou například také kvasinky Saccharomyces cerevisiae, obzvláště DSM 6649.
Výroba adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebného proteinu ze Saccharomyces cerevisiae se provádí fermentací v živném roztoku, který obsahuje zdroj uhlíku a dusíku, jakož i běžné anorganické soli. Vazebný protein se výhodně hromadí v plazmových membránách kvasinek.
Při pracovním stupni a) se nejlépe postupuje následujícím způsobem. Tvorba adenosin-3',5'cyklický monofosfát-vazebného proteinu v Saccharomyces cerevisiae pobíhá dobře za běžných kultivačních podmínek pro Saccharomyces cerevisiae. Kultivace probíhá aerobně, tedy například submersně za třepání nebo míchání, v třepacích baňkách nebo ve fermentorech, popřípadě za přívodu vzduchu nebo kyslíku. Může se pracovat při teplotě v rozmezí 18 až 35 °C, výhodně při 25 až 30 °C, obzvláště při 28 až 30 °C. Rozmezí hodnoty pH by mělo být mezi 2 a 8, výhodně mezi 3 a 7. Kultivace kvasinek za těchto podmínek probíhá všeobecně až do koncentrace asi 107 buněk/ml živného roztoku.
Při pracovním stupni b) se postupuje nejlépe tak, že se buňky kvasinek pro izolaci cAMPvazebného proteinu oddělí od živného média a promyjí se pufrem. Izolace se provádí například postupem, popsaným Můllerem a Bandlowem (Biochemistiy, 28, (1989), 9957-9967). K tomu se buňky kvasinek enzymaticky (zymolyasa) přemění na spheroplasty a v homogenizátoru se za přítomnosti inhibitorů proteáz za chladu (při teplotě v rozmezí 0 až 4 °C) rozmělní. Lyzát kvasinek se centrifuguje a buněčná sraženina se promyje pufrem a znovu centrifuguje. Kapaliny nad sedlinou se spojí a čistí se v gradientu RPercollu (28 % Percollu) a sacharózy (15 až 18 % sacharózy). Pomocí těchto centrifugačních kroků se od sebe oddělí cytoplazma, plazmové membrány, mikrozomy a mitochondrie.
Z frakce plazmových membrán se adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebný protein váže například na sloupci N6-(2-aminoethyl)-cAMP-sepharosy a vazebný protein se ze sloupce eluuje a odsolí.
Při pracovním stupni c) se nejlépe postupuje tak, že se proteinový podíl adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebného proteinu enzymaticky odštěpí. Pro enzymatické štěpení se používají například proteázy, jako je pronasa, endoproteáza Lys-C (Lysobacter enzymogenez) nebo V8 proteáza (Staphylococcus aureus). Tím se dosáhne odbourání proteinového podílu. Pomocí proteázy V8 se získá glykosyl-fosfatidylinositol s peptidovou sekvencí Asn-Cys-Tyr; inkubace s proteázou pronasou poskytuje glykosyl-fosfatidylinositolovou sloučeninu, u které peptidový podíl sestává pouze z aminokyseliny Asn.
Proteáza se vysráží například kyselinami, jako je kyselina trichloroctová. Glykosyl-fosfatidylinositolové peptidy se od proteáz oddělí centrifugací, koncentrují se na sloupci fenylsepharosy a čistí se pomocí chromatografie na tenké vrstvě.
Při pracovním stupni d) se postupuje nejlépe tak, že se monoacylglycerinový nebo diacylglycerinový zbytek, vázaný na glykosyl-fosfatidylinositolové sloučenině, enzymaticky odštěpí a tím se uvolní fosfoinositolglykanová sloučenina. Pro enzymatické štěpení se použijí například fosfolipázy, jako je fosfatidylinositol specifická fosfolipáza C (Bacillus cereus). Tím se dosáhne odštěpení monoacylglycerinového nebo diacylglycerinového esteru, který je vázán na Myo-inositol přes fosfátovou skupinu. Zbytek obsahující glycerol, se zpracováním proteázami v pracovním stupni c) neodštěpí. Pracovní stupně c) a d) se mohou provádět také v obráceném pořadí.
Enzymatické reakce v pracovních stupních c) a d) se provádějí za podmínek, které jsou pro enzymatické reakce vhodné. Na základě známých reakčních podmínek pro uvedené enzymy není pro odborníky těžké zjistit optimální reakční podmínky.
Při pracovním stupni e) se postupuje nejlépe tak, že se fosfolipázy vysrážejí pomocí kyselin, jako je například kyselina trichloroctová. Posfoinositolglykanová sloučenina se od fosfolipázy oddělí centrifugací, čistí se na sloupci Biogelu P—4 a koncentruje se pomocí elektroforézy na tenké vrstvě.
Fosfoinositolglykanové sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich fyziologicky přijatelné soli slouží v první řadě jako účinné látky pro farmaceutické přípravky pro aplikaci při diabetes melitus nebo při diabetes nezávislé na inzulínu.
Předmětem předloženého vynálezu jsou tedy také léčiva, obsahující účinné množství fosfoinositolglykanové sloučeniny a/nebo alespoň jednu z jejich fyziologicky přijatelných solí v rozpuštěné, amorfní a/nebo krystalické formě.
Léčiva jsou výhodně roztoky nebo suspenze pro injekční účely s hodnotou pH 3,0 až 9,0, výhodně 5,0 až 8,5, které obsahují vhodné izotonické činidlo, vhodný konservační prostředek a popřípadě vhodný pufr, jakož i popřípadě také depotprincip, vše přírodní ve sterilním vodném roztoku nebo suspensi. Zbytek součástí přípravku kromě účinné látky tvoří nosič.
Vhodná izotonická činidla jsou například glycerol, glukóza, manit chlorid sodný a sloučeniny vápníku nebo hořčíku, jako je například chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý.
Jako vhodné konservační prostředky je možno uvést například fenol, m-kresol, benzylalkohol a/nebo estery kyseliny p-hydroxybenzoové.
Jako pufrovací substance, obzvláště pro nastavení hodnoty pH na rozmezí asi 5,0 až 8,5 se mohou použít například octan sodný, citrát sodný nebo fosforečnan sodný. Jinak jsou pro
-3CZ 290341 B6 nastavení hodnoty pH také vhodné fyziologicky neškodné zředěné kyseliny (typickým příkladem je kyselina chlorovodíková), popřípadě louhy (typickým příkladem je hydroxid sodný).
Za účelem variace profilu účinku léčiv podle předloženého vynálezu je možno přimísit také modifikované (viz EP-B 132 769 a EP-B 132 770) a/nebo nemodifikované inzulíny, například hovězí, vepřový nebo lidský inzulín, obzvláště lidský inzulín.
Léčiva se vyrobí tak, že se fosfoinositolglykanový peptid a/nebo alespoň jedna z jeho fyziologicky přijatelných solí, popřípadě společně s modifikovanými a/nebo nemodifikovanými inzulíny nebo deriváty inzulínu, s fyziologicky neškodnými nosiči a popřípadě s vhodnými přídavnými a pomocnými látkami, převede na vhodnou aplikační formu.
Příklady provedení vynálezu
Předložený vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení.
Příklad 1
Fermentace Saccharomyces cerevisiae DSM 6649
Saccharomyces cerevisiae DSM 6649 se kultivuje aerobně ve fermentoru. V jednom litru vody jsou obsaženy následující součásti:
kvasničný extrakt glukóza dihydrogenfosforečnan draselný chlorid amonný chlorid vápenatý dihydrát chlorid sodný síran hořečnatý hydrát chlorid železitý kyselina mléčná g
g g
lg
0,5 g
0,5 g
0,6 g
0,3 ml 1% vodného roztoku ml 90% roztoku.
Hodnota pH roztoku se nastaví na 5,5. Aerace se provádí vzduchem v množství 1 1/1 objemu fermentoru. Buňky se pěstují až do dosažení koncentrace lxlO7 buněk/ml kultivačního média; výtěžek činí asi 3 g vlhké hmoty najeden litr kultivačního roztoku. Buňky se oddělí centrifúgací (5 minut 3000 x g) a promyjí se fosfátovým pufrem pH 6.
Příklad 2
Izolace cAMP-vazného proteinu
Buňky z příkladu 2 se přemění enzymaticky (Zymolase, 2000, Seikagaku Kogyolo, Tokio) na sféroplasty a při teplotě 0 °C se rozmělní ve skleněném homogenizátoru (Arthur H. Thomas and Co.). Následující izolační kroky probíhají za přítomnosti inhibitorů proteáz (fenylmethansulfonylfluorid /PMSF/, leupeptin, aprotinin, alfa2-makroglobulin, trypsin-inhibitor; Boehringer Mannheim). Buněčný lyzát se centrifúguje (1000 x g, 3 minuty, 4 °C), buněčný sediment se promyje SEM-pufrem (0,25 M sacharóza, 0,5 mM kyselina ethylendiamintetraoctová /EDTA/, 20 mM kyselina 3-/N-morfolino/-propansulfonová (MOPS)/KOH, pH 7,4) a znovu se centrifúguje. Kapaliny nad sedlinami se spojí a centrifugují se v RPercoll-gradientu (Pharmacia, Freiburg; 28 % Percoll, SEM-pufr, 0,5 mg proteinu/ml) (18 000 x g, 15 minut, 4 °C). V tomto gradientu se od sebe oddělí cytoplazma, plazmové membrány, mikrozomy a mitochondrie.
-4CZ 290341 B6
Plazmové membrány flotují v horní třetině gradientu. Vyjmou se z gradientu pomocí střičky, zředí se pětinásobným objemem SEM-pufru a centrifugují se (48 000 x g, 30 minut, 4 °C).
Sediment se suspenduje v MOPS-pufru (5 mg proteinu/ml) a v ultrazvukové lázni se při teplotě 4 °C inkubuje po dobu 60 minut s N-/3H/acetyl-concanvalinem A (Amersham Buchler, Braunschweig; 1 mg proteinu s 55 pCi, v 500 μΐ MOPS-pufru /Boehringer Mannheim), 20 mM, pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 50 mM KC1, 5 mM CaCl2, 200 pg hovězího sérového albuminu; Behring Werke, Marburg). Vazba Concavalinu A slouží jako markér. Suspense se pipetují na gradienty sacharózy (15 až 28 % sacharózy v MOPS-pufru) a centrifugují se (25 000 otáček za minutu, 90 minut, 4 °C, Beckmann SW 27 Rotor). Sacharózové gradienty se frakcionují a radioaktivní frakce (asi 23 % sacharózy) se spojí, třikrát se zředí MOPS-pufrem (50 mM Concavalinu A; Sigma Deinsenhofen, 250 mM KC1) a centrifugují se (200 000 x g, 60 minut, 4 °C, Beckman TL-100-Rotor). Sediment se promyje SEM-pufrem (250 mM KC1), centrifuguje se a v SEMpufru bez KC1 se resuspenduje (2,5 mg proteinu/ml).
Asi 500 pg plazmového membránového proteinu se solubilizuje v pufru (25 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 150 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0,4 mM EGTA /kyseliny ethylenglykol-bis(betaaminoethylether)tetraoctová/, 0,5 mM DTT (dithiothreitol), 0,5 % desoxycholátu, 0,1 mM IBMX /izobutylmethylxanthin/, 0,1 mM PMSF, 50 pM leupeptinu, 0,1 mM aprotininu (2 mg/ml/). Roztok se nanese na sloupec 2 ml N6-(2-aminoethyl)-cAMP-sepharosy (Pharmacia Freiburg) při teplotě 4 °C, který byl eqilibován stejným pufrem. Sloupec se pětkrát promyje vždy 2 ml pufru (25 mM MOPS/KOH, pH 7,2, 100 mM Na-citrátu, 5 mM DTT, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 250 mM sacharózy, 7,5 % ethylenglykolu /Měrek, Darmstadt/, 10 % glycerinu, 1 mg/ml hovězího sérového albuminu, 1 mM IBMX).
Eluuje se při teplotě 4 °C 2 ml stejného pufru, který obsahuje ještě 100 pm cAMP. Prvních 250 pl eluátu se po centrifugaci odsolí na sloupci 1 ml sephadexu G-25, který byl equlibrován pufrem (25 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 50 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50 pM EDTA, 50 pm PMSF, 0,1 % desoxycholátu, 5 % glycerinu. Odsolený materiál se inkubuje se stejným objemem 8% polyethylenglykolu 4000 (Pharmacia, Freiburg) v pufru (10 mM MOPS/KOH, pH 7,2, 1 mM EDTA) po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Po patnáctiminutové centrifugaci. se sediment rozpustí v pufru (20 mM MOPS/KOH, pH 7,2, 1 mM EDTA, 100 pM PMSF, 0,5 % desoxycholátu) (2 mg proteinu/ml).
Příklad 3
Výroba fosfoglykanových peptidů
a) Trávení s pronasou (Streptomyces griseus; Boehringer Mannheim):
100 pg cAMP-vazebného proteinu se inkubuje po dobu 10 hodin při teplotě 50 °C v 1 ml 0,lM kyseliny N-2-hydroxyethylpiprazin-N-2-ethansulfonové (HEPES)/KOH (pH 8,0), 15mM CaCl2, 1% tritin X-1000 (Boehringer Mannheim) se 450 pg/ml pronasy. Po přídavku 1 % SDS (natriumdodecylsulfát) inkubace pokračuje s druhým alikvotním podílem pronasy po dobu 7 hodin při teplotě 50 °C. Automatizované Edmannovo odbourávání ukazuje, že odbourávání pomocí pronasy vede k fosfoinositolglykanu samidicky vázaným asparaginem na aminovém konci ethanolaminu.
Takto získaný fosfoinositolglykanový peptid je v následujícím označován jako PIG-N.
b) Trávení s endoprotenázou Glu-C, EC 3.4.21.19, (V8 Proteáza) (Staphylococcus aureus; Boehringer Mannheim):
-5CZ 290341 B6
100 pg cAMP-vazebného proteinu se inkubuje po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v 1 ml 20 mM uhličitanu amonného (pH 7,8), 0,5 % oktylglukózidu (Boehringer Mannheim) se 300 pg
V8 proteázy. Automatické Edmannovo odbourávání ukazuje, že trávení V8 proteázou vede k fosfoinositolglykanu s peptidem Asn-Cys-Tyr. Aminokyselina kyselina asparagová je vázána na fosfoinositolglykan karboxylovým koncem.
Získaný fosfoinositolglykan stripeptidem Asn-Cys-Tyr je v následujícím označován jako PIG-NCY.
c) Trávení endoproteázou lys-C (Lysobacter enzymogenez; Boehringer Mannheim):
100 pg cAMP-vazebného proteinu se inkubuje po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v 0,5 ml 50 mM (NH4)2CO3 (pH 8,2), 0,5 % oktylglukózidu s 55 pg endoproteázy Lys-C.
Automatické Edmannovo odbourávání ukazuje, že endoproteáza Lys-C vede k fosfoinositolglykanu s peptidem Asn-Cys-Tyr-Glu. Vazba peptidů na fosfoinositolglykan probíhá přes karboxylový konec asparaginu.
Získaná sloučenina je v následujícím označována jako PIG-NCYE.
d) Odstranění karboxy-koncové aminokyseliny:
Pronasou natrávený cAMP-vazebný protein (viz a)) se podrobí manuelnímu Emannovu odbourávání. Vzniklý fosfoinositolglykan bez aminokyseliny se v následujícím označuje jako PIG.
Po proteolytickém štěpení se proteázy odstraní precipitací s 5% kyselinou trichloroctovou (TCA). Po centrifugaci (15 minut, 10 000 x g) se fosfoinositolglykan-peptidové deriváty, obsažené v kapalině nad sedlinou, jakož i fosfoinositolglykany zEdmannova odbourávání koncentrují vazbou na sloupci fenylsepharosy a čistí se. Po elucí 2% oktylfenol(ethylenglykoletherem) (TX-1000) se posfoinositolglykan-peptidové deriváty čistí pomocí chromatografie na tenké vrstvě za pomoci dvou různých rozpouštědlových systémů. Po prvním průběhu v kyselém systému (chloroform/aceton/methylalkohol/ledová kyselina octová/voda 10 :4:2:2:1) se fosfoinositolglykanové peptidy eluují v blízkosti nanášecího místa na silikagelové destičce (typ 60) methylalkoholem a potom se rechromatografuje ve druhém stupni v bazickém systému (chloroform/methylalkohol/amoniak/voda45 : 45 : 3,5 : 10). Fosfoinositolglykan-peptidové deriváty se znovu z destičky eluují (Rf = 0,45) a extrahují se směsí chloroformu a methylalkoholu (2: 1). Organická fáze se promyje a evaporuje a materiál se suspenduje ve fosfátovém pufru s 0,5 % TX-100.
e) Fosfoinositolglykany nebo fosfoinositolglykanové peptidy, získané podle postupu a) až d), se inkubují s 10 jednotkami fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C, EC 3.1.1.5, (Bacillus cereus; Sigma, Deisenhofen) v 0,2 ml 0,2 M fosforečnanu draselného (pH 7,2), 2 mM DTT, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0,05 % TX-100 po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Po přídavku 10 mM EDTA se štěpné produkty navzájem oddělí pomocí chromatografie na tenké vrstvě v bazickém rozpouštědlovém systému (viz d)). Materiál se v bezprostřední blízkosti nanášecího místa z destičky eluuje a smísí se s 2% poly(ethylenglykol)8-mono-(oktylfenyletherem (TX-114). Zahřátím a centrifugaci se zahájí dělení fází. Vodná fáze se koncentruje v koncentrátoru Speedvac.
f) Pro standardizování fosfoglykanových peptidů se dusík volného glukózaminu materiálu získaného ve stupních a) až d) převede permethylací na radioaktivně značený trimethylamoniový kation. K tomu se vzorek ve vakuu vysuší a smísí se se 100 μΐ dimethylsufoxidu. Po zpracování ultrazvukem (1 minuta) se přidá 10 mg hydroxidu sodného a 40 μΐ (125J/methyljodidu (0,2 pCi; NEN-Dupont, Dreieich). Po míchání po dobu 45 minut při teplotě 25 °C se rozpouštědlo ve
-6CZ 290341 B6
Speedvacu odstraní a přidá se 400 μΐ vody. Vzorek se třikrát promyje chloroformem a chloroformové extrakty se třikrát promyjí vodou Chloroform se pod dusíkem odstraní.
Permethylace probíhá v širokém koncentračním rozmezí lineárně a kvantitativně. V testech na účinek podobný inzulínu se používají ekvivalentní objemy (stejné hodnoty dpm) fosfoinositolglykanových peptidů (1-100 „arbitary units“).
g) Inkubace materiálu, získaného ve stupních a) až d) s kyselinou dusitou vede ke štěpení fosfonositolglykanu.
Příklad 4
Strukturní znaky fosfoinositolglykanových peptidů
a) Buňky kvasinek se nechaly nasáknout, jak je uvedeno v příkladě 1, za přítomnosti radioaktivně značených substancí (firma NEN-Dupont, Dreieich):
kyselina stearová myo-inositol ethanolamin glukózamin nebo manóza.
Celková plazmová membránová frakce nebo cAMP-protein, vyčištěný pomocí afinitní chromatografie (viz příklad 2) se podrobí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Zbarvení komponent pomocí Coomassie blue nebo autoradiografií ukazuje, že všechny výše uvedené komponenty (radioaktivní) se do fosfoinositolglykanového peptidů zabudovávají.
b) Fosfoinositolglykanový peptid, získaný podle příkladu 3a), se chemicky a enzymaticky dále štěpí. Štěpné produkty se analyzují pomocí chromatografie na tenké vrstvě a měřením rozdělení radioaktivity (/3H/kyselina stearová a /14C/myo-inositol).
Zbylá radioaktivně značená struktura se z destičky eluuje a podrobí se příští štěpné reakci. Ze struktury, vzniklé pronasovým trávením, se deaminací pomocí kyseliny dusité uvolní fosfatidylinositol (Pl). Tento se přemění pomocí fosfolipásy D na kyselinu fosfatidylovou nebo pomocí fosfolipásy C na diacylglycerol. Při tom se značení myo-inositolem ztratí, radioaktivní značení kyselinou stearovou však zůstane zachováno. Fosfatidylová kyselina se potom převede acetolysou na diglyceridacetát. Z této struktury se stejně jako z diacylglycerolu konečně uvolní alkalickou hydrolysou kyselina stearová.
c) Struktura, získaná podle příkladu 3a) až 3e), se usuší, zpracuje se fluorovodíkem (60% ve vodě, 16 hodin, 0 °C) a získané oligosacharidy se hydrolysují pomocí 2M kyseliny trifluoroctové (4 hodiny, 100 °C). Potom se reakční roztok vysuší a přítomný cukr se redukuje (1% NaBH4, v 0,1 M hydroxidu amonném, 1 hodina, 37 °C) a nakonec se acetyluje (směs pyridinu aanhydridu kyseliny octové 1 :1, 1 hodina, 60 °C). Chromatografie se provádí na plynovém chromatografii firmy Packard, model 428; sloupec 100/120 Supelcoport (Supleco, Bellefonte, USA) při teplotě 60 °C. Získá se následující kvalitativní složení:
manóza galaktóza myo-inositol glukózamin.
d) Struktura, získaná podle příkladu 3a) až 3e) se stejně, jako je popsáno v odstavci c), hydrolysuje fluorovodíkem (60 °C ve vodě) a 4M kyselinou chlorovodíkovou po dobu 16 hodin
-7CZ 290341 B6 při teplotě 100 °C. Po rozdělení na analyzátoru aminokyselin (Biotronic, LC 6001) se získají následující součásti:
kyselina asparagová
NH, ethanolamin glukózamin
S ohledem na podmínky hydrolysy, poměr kyseliny asparagové, jakož i na výsledky podle příkladu 3a), je v nativním fosfonositolgkylanovém peptidu danou aminokyselinou asparagin.
Příklad 5
Biologická aktivita fosfoinositolgkylanových peptidů podle předloženého vynálezu (PGP) byla zjišťována za použití preparativně izolovaných tukových buněk a kousků diafragmy z krys.
Výraz „PIG“ značí fosfoinositolglykan bez peptidu, získaný podle příkladu 3d) a 3e); výraz „PIG-N“ značí fosfoinositolglykan s asparaginem, získaný podle příkladu 3a) a 3e); výraz „PIG-NCY“ značí fosfoinositolglykan s peptidem Asn-Cys-Tyr, získaný podle příkladu 3b) a 3e); výraz „PIG-NCYE“ značí fosfoinositolgkylan s peptidem Asn-Cys-Tyr-Glu, získaný podle příkladu 3c) a 3e); výraz „PIG-NCY (na)“ značí materiál získaný podle příkladu 3b) a 3e), který byl rozštěpen kyselinou dusitou (viz příklad 3g)). Výraz „basální“ značí aktivitu bez stimulace, „inzulín“ značí lidský inzulín a „dpm“ značí radioaktivní rozpady za minutu.
Preparace tukových buněk z krys se provádí následujícím způsobem:
Tuková tkáň z okolí varlat (krysy Wistar, 160-180 g, žádné omezení krmivá) se natráví kollagenásou a vzniklé uvolněné buňky se flotací několikrát promyjí.
Preparace kousků diafragmy se provádí následujícím způsobem:
Z několikrát promyté hemi-diafragmy (krysy Wistar, 60-70 g, žádné omezení krmivá) se nařežou malé kousky tkáně (5 mm průměr).
Pro inaktivaci inzulínového receptoru tukových buněk krys se buňky zpracují 10 až 40 pg/ml trypsinu. Po přídavku inhibitoru proteáz se buňky dvakrát flotací promyjí a inkubace pokračuje 15 minut při teplotě 37 °C. Tyto buňky se potom použijí pro test na stimulaci lipogeneze fosfoinositolglykanovými peptidy. Kontrolní inkubace s inzulínem ukázala, že trypsinem zpracované buňky mají pouze velmi nepatrnou inzulínem stimulovatelnou lipogenezi a tedy pouze správně ohraničený počet funkčních inzulínových receptorů.
Pro inaktivaci inzulínového receptoru v krysí diafřagmě se části tkáně inkubují za stálého zavádění kyslíku vKHR pufru (0,1 mM glukózy v přítomnosti 50pg/ml forbolesteru tetradekanoylforbolacetátu) po dobu 90 minut při teplotě 25 °C. Potom se kousky tkáně dvakrát promyjí KRH pufrem a použijí se pro odpovídající testy.
V následujících pokusech jsou výsledky pokusů, které byly docíleny s buňkami nebo tkáněmi, v nichž byly inzulínové receptory inaktivovány, vždy uvedeny v závorkách. V žádném z následujících testů nevykazoval PIG-NCYE účinek.
-8CZ 290341 B6
a) Glykogeneze
Tento test zjišťuje inzulínem stimulovatelnou syntézu glykogenu ve svalových buňkách, která zahrnuje transport glukózy přes plazmové membrány a přeměnu glukózy na glykogen, jakož i inzulínovou signální přenášecí kaskádu.
Kousky diafragmy se inkubují v KRH-pufru s 50 μΜ D-/U-14C/glukózy v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a PGB po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Po odsátí média se kousky tkáně intensivně promyjí, zmrazí se při teplotě -70 °C a potom se homogenizují při teplotě 2 °C v polytronovém homogenizátoru. Získaný homogenizát se centrifuguje (2000 g) a kapalina se pipetuje na filtrační papír. Pro zjištění vytvořeného glykogenu se filtr převede do TCA (5%), promyje se ethylealkoholem a acetonem, vysuší se a stanovuje se radioaktivita scintilačním měřením (/14C/glykogen/dmp* 10'3/).
Jednotky pro fosfoinositolglykované peptidy jsou „arbitary units“, definované v příkladu 3f).
Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1 Glykogeneze (dpm . 10 3)
| basal | Inzulín | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 10 nM | 3,3(3,4) | 8,4(4,1) | ||||
| 1 5 25 100 | 3,2(3,1) 3,6(3,5) 4,4(3,9) | |||||
| 1 10 100 | 3,0(2,5) 4,2(3,8) 6,7(6,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,2(2,7) 4,8(4,3) 6,5(5,8) 8,0(7,1) | |||||
| 1 10 100 | 3,0(2,5) 3,2(2,9) 3,6(3,4) |
b) Syntéza glykogenu
Tento test stanovuje inzulínem stimulovatelnou přeměnu aktivované glukózy (UDP-glukóza) na glykogen (glykogensyntetázová aktivita), zahrnující funkční inzulínovou signální přenášecí kaskádu. Transport glukózy a aktivace glukózy byly pominuty (na rozdíl od měření syntézy glykogenu podle odst. a)).
Kousky diafragmy se inkubují s D-glukózou (0,1 mM) za přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a PGB po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Připraví se homogenát a tento se centrifuguje (20000 x g). Kapalina se potom inkubuje s U-/14C/UDP-glukózou (0,3 mM) za přítomnosti buď 0,1 mM nebo 10 mM glukózo-6-fosfátu po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. Směsi se transferují na filtrační papír a tento se zpracuje jak je uvedeno výše. Glykogensyntetázová aktivita se počítá jako frakcionální rychlost mezi I-formou enzymu (nezávislý na glukózo-6-fosfátu, defosforylovaný, odpovídá množství aktivního enzymu v homogenátu) a D-formou enzymu
-9CZ 290341 B6 (závislý na glukózo-6-fosforylovaný, odpovídá celkovému množství aktivovatelného enzymu v homogenátu) (/14C/glykogen/dpm*10-3/).
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2
Tabulka 2 Glykogensyntetáza (dpm . 10'3)
| basal | Inzulín | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 10 nM | 4,4(3,5) | 10,1(6,0 | ||||
| 1 5 25 100 | 3,9(3,5) 4,8(3,8) 5,7(4,5) 6,7(6,0) | |||||
| 1 10 100 | 3,9(3,5) 5,7(5,0) 7,2(6,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,8(3,4) 5,7(5,1) 7,2(6,4) 8,8(8,1) | |||||
| 1 10 100 | 3,2(3,0) 4,0(3,5) 4,5(4,0) |
c) Lipogeneze
Pomocí tohoto testu se zjišťuje inzulin-stimulovatelná přeměna glukózy na produkty rozpustné v toluenu (triglyceridy, fosfolipidy, mastné kyseliny), která vyžaduje transport glukózy a syntézu triglyceridů (fosfolipidů) mastných kyselin (glycerin-3-P-syntéza, esterifíkace) za zahrnutí inzulínové signalizační přenášecí kaskády.
Krysí tukové buňky se inkubují v KRH-pufru s D/3-3H/glukózou (o,2 mM nebo 1 mM konečné koncentrace) za přítomnosti nebo za nepřítomnosti inzulínu a PGP po dobu 90 minut při teplotě 37 °C. Přídavkem v toluenu rozpustného scintilačního kokteilu se buňky otevřou a lipidy se oddělí od ve vodě rozpustných produktů a inkubačního média. Po rozdělení fází se radioaktivita, inkorporovaná do lipidů stanovuje přímo scintilačním měřením bez odstraňování vodné fáze (/3H/lipid/dpm*10’3/).
Výsledky testu jsou uvedeny v následující tabulce 3.
-10CZ 290341 B6
Tabulka 3 Lipogeneze (dpm*10 3)
| basal | Inzulín | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 10 nM | 1,0(1,0) | 11,2(1,9) | ||||
| 1 5 25 100 | 1,0(0,9) 2,1(1,5) 3,1(3,0) 4,2(3,5) | |||||
| 1 10 100 | 1,0(1,2) 3,5(3,3) 5,4(4,8) | |||||
| 1 5 25 100 | 1,0(0,9) 3,5(3,0) 5,5(5,2) 6,8(5,9) | |||||
| 1 10 100 | 1,0(0,9) 1,0(1,5) 2,1(2,5) |
d) Vlastní aktivita transportu glukózy.
Izolovaná plazmová membránová vezikula se získají z krysích tukových buněk (viz příklad 5), přičemž se tukové buňky dvakrát promyjí v homogenizačním pufru (20 mM trihydroxyaminomethanu (Tris)(HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,25 m sacharózy) a potom se při teplotě 4 °C homogenizují ve 20 ml stejného pufr (skleněný homogenizátor s teflonovými tlouky).
Homogenizát se centrifuguje (16000 x g, 15 minut), sediment se suspenduje ve stejném pufru a znovu se centrifuguje. Sediment se suspenduje v 5 ml homogenizačního pufru a navrství se na sacharózovou vrstvu (1,12 M sacharózy, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4,1 mM EDTA). Po centrifugaci (100 000 * g, 70 minut) se interní fáze s plazmovými membránovými vezikuly pomocí hrotu odebere, zředí se 45 ml pufru a znovu se centrifuguje (48 000 x g, 45 minut). Sediment se suspenduje v 10 ml pufru, znovu se centrifuguje a nakonec se znovu suspenduje ve 3 ml pufru.
Izolovaná plazmová membránová vezikula se inkubují za přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu nebo PGB po dobu 30 minut při teplotě 25 °C. Potom se vezikula inkubují s 50 μΜ D-(3-3H)-glukózy a L-(l-14C)-glukózy stejné specifické radioaktivity po dobu 90 sekund při teplotě 25 °C. Směsi se potom rychle odsají přes nitrocelulózový filtr. Filtr se dokonale promyje a vysuší. Jeho radioaktivita se zjišťuje pomocí kapalinového scintilačního měření. Specifický transport (D-/3H/glukóza /L-/14C/glukóza /dpm*10-3/) se počítá jako diference mezi /3H/a/14C/-radioaktivitou.
Výsledky testu jsou uvedeny v následující tabulce 4.
-11 CZ 290341 B6
Tabulka 4 Vlastní transport glukózy
| basal | Inzulín | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 10 nM | 2,4(2,6) | 2,5(2,3) | ||||
| 1 5 25 100 | 2,3(2,5) 2,9(2,7) 2,7(2,7) 2,9(3,3) | |||||
| 1 10 100 | 2,7(2,6) 3,5(3,7) 4,0(3,8) | |||||
| 1 5 25 100 | 2,3(2,7) 3,5(3,7) 4,7(4,6) 6,9(5,8) | |||||
| 1 10 100 | 2,5(2,3) 2,6(2,7) 2,7(3,0) |
e) Syntéza proteinů
Na rozdíl od předchozích stanovení, měřených metabolickými účinky inzulínu, patří stimulace syntézy proteinů k dlouhodobým účinkům inzulínu (jako růstový hormon). Zkouška zahrnuje inzulínovou signální kaskádu.
Krysí tukové buňky se inkubují vDulbeccově modifikovaném esenciálním médiu (DMEM), ochuzeném o leucin, v primární kultuře s 50 μΜ L-/3H/-leucinu za přítomnosti inzulínu a PGP po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Buňky se oddělí pomocí techniky olejové centrifugace od okolního média a smísí se se scintilačním médiem kompatibilním s vodou. Po centrifugaci se sraženina proteinů promyje acetonem, suspenduje se v 1% SDS a smísí se se scintilačním konteilem. Radioaktivita asociovaná buňkami, zjištěná scintilačním měřením, slouží jako míra proteosyntézy a transportu aminokyselin přes plazmové membrány (/3H/leucin /dpmMO“4/).
Výsledky testu jsou uvedeny v následující tabulce 5.
-12CZ 290341 B6
Tabulka 5 Syntéza proteinů
| basal | Inzulín | PIG | PIG-N | PIG-NCY | PIG-NCY (na) | |
| 10 nM | 3,5(3,4) | 10,1(4,0) | ||||
| 1 5 25 100 | 3,5(3,3) 3,55(3,5) 4,0(3,5) 3,8(3,3) | |||||
| 1 10 100 | 3,4(3,3) 4,1(3,2) 5,3(4,2) | |||||
| 1 5 25 100 | 3,8(3,7) 4,4(4,2) 5,1(5,0) 6,9(5,8) | |||||
| 1 10 100 | 3,7(3,5) 3,8(3,7) 4,1(3,8) |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (11)
1. Fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulínu, obsahující fosfoinositolglykan a ethanolamin a její fyziologicky přijatelné soli.
2. Fosfoinositolglykanová sloučenina podle nároku 1, obsahující dodatečně asparagin nebo tripeptid Asn-Cys-Tyr.
3. Fosfoinositolglykanová sloučenina podle nároku 1, obsahující alespoň jeden zbytek glukózaminu, galaktózy, manózy, myo-inositolu, kyseliny fosforečné a ethanolaminu a peptidový zbytek se sekvencí Asn-Cys-Tyr.
4. Fosfoinositolglykanová sloučenina podle nároku 2, obsahující asparagin.
5. Způsob výroby fosfoinositolglykanových sloučenin podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se
a) použijí organismy obsahující adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebný protein,
b) izoluje se adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebný protein,
c) proteinový podíl adenosin-3',5'-cyklický monofosfát-vazebného proteinu se odštěpí úplně nebo s výjimkou terminálního asparaginu nebo s výjimkou terminálního tripeptidu Asn-Cys-Tyr a vzniklá glykosylfosfatidyl-inositolová sloučenina se popřípadě čistí,
d) z produktu, získaného ve stupni c) se odštěpí monoacylglycerol nebo diacylglycerol a
e) fosfoinositolglykanová sloučenina, získaná ve stupni d), se izoluje a popřípadě se převede na odpovídající fyziologicky přijatelné soli.
-13CZ 290341 B6
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím,že se použijí buňky kvasinek a proteinový podíl se enzymaticky odštěpí.
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že se pořadí pracovních kroků c) a d) vymění.
8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 5 až 7, vyznačující se tím,že se použije Saccharomyces cerevisiae DSM 6649, endoproteáza Glu-C, EC 3.4.21.19 a/nebo fosfolipáza C, LC 3.1.1.5.
9. Léčivo, vyznačující se tím,že obsahuje účinné množství fosfoinositolglykanové sloučeniny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4.
10. Léčivo podle nároku 9, vyznačující se tím,že dále obsahuje inzulín, výhodně hovězí, vepřový nebo lidský inzulín.
11. Použití fosfoinositolglykanové sloučeniny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 pro výrobu léčiv pro aplikaci při diabetes mellitus nebo při diabetes nezávislém na inzulínu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4127495 | 1991-08-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ255392A3 CZ255392A3 (en) | 1993-03-17 |
| CZ290341B6 true CZ290341B6 (cs) | 2002-07-17 |
Family
ID=6438668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS19922553A CZ290341B6 (cs) | 1991-08-20 | 1992-08-19 | Fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulinu, způsob její výroby, léčivo tuto látku obsahující a její pouľití |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5624903A (cs) |
| EP (1) | EP0532915B1 (cs) |
| JP (1) | JP3361126B2 (cs) |
| KR (2) | KR100264623B1 (cs) |
| AT (1) | ATE147407T1 (cs) |
| AU (1) | AU656396B2 (cs) |
| CA (1) | CA2076424C (cs) |
| CZ (1) | CZ290341B6 (cs) |
| DE (1) | DE59207835D1 (cs) |
| DK (1) | DK0532915T3 (cs) |
| ES (1) | ES2096686T3 (cs) |
| FI (1) | FI102842B (cs) |
| GR (1) | GR3022895T3 (cs) |
| HR (1) | HRP940834B1 (cs) |
| HU (1) | HU210431B (cs) |
| IL (1) | IL102859A (cs) |
| NO (1) | NO303452B1 (cs) |
| SG (1) | SG46639A1 (cs) |
| SK (1) | SK281333B6 (cs) |
| TW (1) | TW224104B (cs) |
| YU (1) | YU66892A (cs) |
| ZA (1) | ZA926232B (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE184611T1 (de) * | 1991-11-29 | 1999-10-15 | Hoechst Ag | Peptide mit insulinartiger wirkung |
| ES2159283T3 (es) * | 1992-02-29 | 2001-10-01 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Complejos que contienen glicosil-fosfatidilinositol-proteinas y derivados de acido colanico, procedimiento para su preparacion y su utilizacion. |
| US5652221A (en) * | 1994-11-07 | 1997-07-29 | The University Of Virginia Patent Foundation | Method of treating defective glucose metabolism using synthetic insulin substances |
| GB9618929D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Metal containing carbohydrates from human tissue which regulate glycogen metabolism |
| GB9618934D0 (en) * | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Inositol phosphoglycans for therapeutic use in the treatment of diabetes and obesity |
| GB9618930D0 (en) | 1996-09-11 | 1996-10-23 | Univ London | Metal containing carbohydrates from human tissue which regulate lipogenic activity |
| DE19649350A1 (de) * | 1996-11-28 | 1998-06-04 | Hoechst Ag | Inositolglykane mit insulinartiger Wirkung |
| KR100481746B1 (ko) * | 1996-11-28 | 2005-08-10 | 훽스트 악티엔게젤샤프트 | 인슐린-유사작용을갖는이노시톨글리칸및이를포함하는약제학적제제 |
| EP2158923B1 (en) | 1998-08-06 | 2013-02-27 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| CH697081A5 (de) * | 2002-01-22 | 2008-04-30 | Andreas F Dr Schaub | Zusammensetzung für die Unterstützung der Geburt eines menschlichen Föten. |
| EP1378517A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-07 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Phosphoinositolglycan (PIG) binding protein from adipocytes |
| CA2491555C (en) * | 2002-07-10 | 2012-09-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid-phase and solution-phase synthesis of glycosylphosphatidylinositol glycans |
| ITMI20030237A1 (it) * | 2003-02-11 | 2004-08-12 | Indena Spa | Uso della conglutina di lupino per il trattamento del |
| DE102004054552A1 (de) * | 2004-11-11 | 2006-05-18 | Hcb Happy Child Birth Holding Ag | Neue Zusammensetzung zur Erleichterung der Humangeburt |
| RU2435847C2 (ru) | 2005-04-11 | 2011-12-10 | Савиент Фармасьютикалз, Инк. | Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование |
| PL3321359T3 (pl) | 2005-04-11 | 2021-06-28 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Wariantowe postacie oksydazy moczanowej i ich zastosowanie |
| US8148123B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| KR101861547B1 (ko) | 2009-06-25 | 2018-07-02 | 크레알타 파마슈티칼스 엘엘씨 | 페길화된 유리카아제 치료 중에 혈청 요산을 모니터링하여 주입 반응의 위험성 및 반응의 항체매개 상실을 예측하는 방법 및 키트 |
| CN102270762B (zh) * | 2010-06-03 | 2014-08-20 | 清华大学 | 锂离子电池电极浆料及应用该电极浆料制备的电极片 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3326473A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-01-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Pharmazeutisches mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| US4906468A (en) * | 1986-04-11 | 1990-03-06 | The Rockefeller University | Insulin activity messengers, their antibodies, and thereof |
| US4839466A (en) * | 1986-04-11 | 1989-06-13 | The Rockefeller University | Insulin activity messengers |
-
1992
- 1992-07-02 YU YU66892A patent/YU66892A/sh unknown
- 1992-08-04 TW TW081106143A patent/TW224104B/zh not_active IP Right Cessation
- 1992-08-14 DK DK92113897.0T patent/DK0532915T3/da active
- 1992-08-14 EP EP92113897A patent/EP0532915B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-14 SG SG1996006943A patent/SG46639A1/en unknown
- 1992-08-14 ES ES92113897T patent/ES2096686T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-14 AT AT92113897T patent/ATE147407T1/de active
- 1992-08-14 DE DE59207835T patent/DE59207835D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-18 FI FI923702A patent/FI102842B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-08-18 IL IL10285992A patent/IL102859A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 KR KR1019920014893A patent/KR100264623B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 CZ CS19922553A patent/CZ290341B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 ZA ZA926232A patent/ZA926232B/xx unknown
- 1992-08-19 NO NO923252A patent/NO303452B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 CA CA002076424A patent/CA2076424C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-19 AU AU21109/92A patent/AU656396B2/en not_active Expired
- 1992-08-19 SK SK2553-92A patent/SK281333B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-08-19 HU HU9202701A patent/HU210431B/hu unknown
- 1992-08-19 JP JP21994692A patent/JP3361126B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-10-26 HR HR940834A patent/HRP940834B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-12-23 US US08/364,398 patent/US5624903A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-24 GR GR970400577T patent/GR3022895T3/el unknown
-
2000
- 2000-01-20 KR KR1020000002579A patent/KR100318706B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ290341B6 (cs) | Fosfoinositolglykanová sloučenina s účinkem podobným inzulinu, způsob její výroby, léčivo tuto látku obsahující a její pouľití | |
| Ogata et al. | Chemical characterization of the membrane-anchoring domain of human placental alkaline phosphatase. | |
| Cohen et al. | Isolation and characterization of renin-like enzymes from mouse submaxillary glands | |
| McDonald et al. | Dipeptidyl arylamidase II of the pituitary: properties of lysylalanyl-β-naphthylamide hydrolysis: inhibition by cations, distribution in tissues, and subcellular localization | |
| O'Brien et al. | Saposin proteins: structure, function, and role in human lysosomal storage disorders | |
| Brush | Purification and characterization of a protease with specificity for insulin from rat muscle | |
| US4400465A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| Nicholls et al. | Modification of proteins and other biological molecules by acetaldehyde: adduct structure and functional significance | |
| Wingard et al. | Myxobacter AL-1 protease II: specific peptide bond cleavage on the amino side of lysine | |
| Gould et al. | Participation of Aminoacyl Transfer Ribonucleic Acid in Aminoacyl Phosphatidylglycerol Synthesis: II. Specificity of Alanyl Phosphatidylglycerol Synthetase | |
| EP0017938B1 (en) | Process for preparing a b30-threonine insulin | |
| US4401757A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| Tsuboi et al. | Sugar hydrolases and their arrangement on the rat intestinal microvillus membrane | |
| Robertson et al. | Cartilage collagen: inability to serve as a substrate for collagenases active against skin and bone collagen | |
| Deguchi et al. | Blockade by N-methylhydroxylamine or activation of guanylate cyclase and elevations of guanosine 3′, 5′-monophosphate levels in nervous tissues | |
| YOSHINARI et al. | Lysosomal digestion of thyroglobulin: role of cathepsin D and thiol proteases | |
| Kochman et al. | Purification and properties of fructose diphosphate aldolase from Ascaris suum muscle | |
| Haneda et al. | Chemo-enzymatic synthesis and structure-activity study of artificially N-glycosylated eel calcitonin derivatives with a complex type oligosaccharide | |
| Yamaguchi et al. | Amino acid sequence of the nucleotide-binding site of D-(-)-. beta.-hydroxybutyrate dehydrogenase labeled with arylazido-. beta.-[3-3H] alanylnicotinamide adenine dinucleotide | |
| Niederau et al. | Digestive end products release pancreatic enzymes from particulate cellular pools, particularly zymogen granules | |
| Percheron et al. | Mammalian β-d-mannosidase and β-mannosidosis | |
| Ronin et al. | Enzymatic transfer of oligosaccharide from oligosaccharide-lipids to an Asn-Ala-Thr containing heptapeptide | |
| US5440012A (en) | Calcitonin and method for the preparation and use thereof | |
| Klubes et al. | Synthesis of enantiomers of S-(1, 2-dichlorovinyl)-[3-14C cysteine: Their use with Escherichia coli B | |
| Wielgus | Stimulation of intermoult cuticle deposition by a haemolymph trophic factor in the tobacco hornworm, Manduca sexta |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120819 |