JPH05301891A - インスリン様作用を有するホスホイノシトール−グリカン−ペプチド - Google Patents
インスリン様作用を有するホスホイノシトール−グリカン−ペプチドInfo
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- JPH05301891A JPH05301891A JP4219946A JP21994692A JPH05301891A JP H05301891 A JPH05301891 A JP H05301891A JP 4219946 A JP4219946 A JP 4219946A JP 21994692 A JP21994692 A JP 21994692A JP H05301891 A JPH05301891 A JP H05301891A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アデノシン３′,５′−サイクリックモノホ
スフェート結合性タンパク質の分解により取得できるホ
スホイノシトール−グリカン−ペプチド、その製造およ
びその真性糖尿病および非インスリン依存性糖尿病の治
療のための使用方法に関する。 【構成】 このホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドは、グルコサミン、ガラクトース、マンノース、イノ
シトール、燐酸、エタノールアミンおよびＡｓｎ−Ｃｙ
ｓ−Ｔｙｒという配列を有するペプチドを含み、アデノ
シン３′,５′−サイクリックモノホスフェート結合性
タンパク質の酵素的分解と引き続く精製によって得られ
る。
スフェート結合性タンパク質の分解により取得できるホ
スホイノシトール−グリカン−ペプチド、その製造およ
びその真性糖尿病および非インスリン依存性糖尿病の治
療のための使用方法に関する。 【構成】 このホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドは、グルコサミン、ガラクトース、マンノース、イノ
シトール、燐酸、エタノールアミンおよびＡｓｎ−Ｃｙ
ｓ−Ｔｙｒという配列を有するペプチドを含み、アデノ
シン３′,５′−サイクリックモノホスフェート結合性
タンパク質の酵素的分解と引き続く精製によって得られ
る。
Description
【０００１】本発明はインスリン様作用を有するホスホ
イノシトール−グリカン−ペプチド、その製造方法、そ
の特に真性糖尿病または非インスリン依存性糖尿病治療
薬としての使用方法に関する。
イノシトール−グリカン−ペプチド、その製造方法、そ
の特に真性糖尿病または非インスリン依存性糖尿病治療
薬としての使用方法に関する。
【０００２】インスリンはインスリン感受性組織に対し
て多くの作用を及ぼす。注目すべき一つの作用はインス
リン投与時の哺乳動物におけるグルコースレベルの速か
な低下である。これはグルコースが筋細胞および脂肪細
胞により血液から速やかに取り込まれることによって生
じる。さらにインスリンはグリコーゲンシンセターゼを
活性化しそして脂肪分解を阻害する。インスリンはアミ
ノ酸からのタンパク質合成を促進し、ピルベートデヒド
ロゲナーゼの誘導を促進しそしてある種のグルコース新
生酵素例えばピルベートカルボキシラーゼおよびフラク
トース−１,６−ビスホスホターゼなどの形成を阻害す
る。
て多くの作用を及ぼす。注目すべき一つの作用はインス
リン投与時の哺乳動物におけるグルコースレベルの速か
な低下である。これはグルコースが筋細胞および脂肪細
胞により血液から速やかに取り込まれることによって生
じる。さらにインスリンはグリコーゲンシンセターゼを
活性化しそして脂肪分解を阻害する。インスリンはアミ
ノ酸からのタンパク質合成を促進し、ピルベートデヒド
ロゲナーゼの誘導を促進しそしてある種のグルコース新
生酵素例えばピルベートカルボキシラーゼおよびフラク
トース−１,６−ビスホスホターゼなどの形成を阻害す
る。
【０００３】非インスリン依存性糖尿病であるII型糖尿
病は筋組織または脂肪組織などの末梢組織によるインス
リン抵抗性を伴う。その際低下するグルコース利用は、
グルコース輸送または引き続いての代謝道程（糖原形
成、脂肪生成）に対するインスリン刺激が存在しないこ
とによるものである。この多重的な抵抗性はレセプター
またはポスト−レセプターレベルに、すなわち第二メッ
センジャー産生前に欠陥のあることを示唆している（Ga
rvey, Diabetes／−Metabolism Reviews, 5, (1989), 7
27〜742）。
病は筋組織または脂肪組織などの末梢組織によるインス
リン抵抗性を伴う。その際低下するグルコース利用は、
グルコース輸送または引き続いての代謝道程（糖原形
成、脂肪生成）に対するインスリン刺激が存在しないこ
とによるものである。この多重的な抵抗性はレセプター
またはポスト−レセプターレベルに、すなわち第二メッ
センジャー産生前に欠陥のあることを示唆している（Ga
rvey, Diabetes／−Metabolism Reviews, 5, (1989), 7
27〜742）。
【０００４】今日に到るも、インスリンレセプターをバ
イパスするが、なおインスリン様作用を示す活性物質は
開示されていない。
イパスするが、なおインスリン様作用を示す活性物質は
開示されていない。
【０００５】アデノシン３′,５′−サイクリックモノ
ホスフェート（ｃＡＭＰ）−結合性タンパク質から得る
ことのできるホスホイノシトール−グリカン−ペプチド
がイン・ビトロ（試験内）でインスリン様作用を示すほ
かインスリン抵抗性組織に対してもインスリン様作用を
示すことを今般見出した。
ホスフェート（ｃＡＭＰ）−結合性タンパク質から得る
ことのできるホスホイノシトール−グリカン−ペプチド
がイン・ビトロ（試験内）でインスリン様作用を示すほ
かインスリン抵抗性組織に対してもインスリン様作用を
示すことを今般見出した。
【０００６】従って本発明は、アデノシン３′,５′−
サイクリックモノホスフェート結合性タンパク質の分解
によって得られるホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チドおよび／またはその生理学的に許容される塩に関す
る。
サイクリックモノホスフェート結合性タンパク質の分解
によって得られるホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チドおよび／またはその生理学的に許容される塩に関す
る。
【０００７】インスリン抵抗性組織という用語は、例え
ば活性なインスリンレセプターをもはや有しないラット
脂肪細胞を意味する。ｃＡＭＰ結合性タンパク質はアデ
ノシン３′,５′−サイクリックモノホスフェートを結
合する性質を有するタンパク質である。
ば活性なインスリンレセプターをもはや有しないラット
脂肪細胞を意味する。ｃＡＭＰ結合性タンパク質はアデ
ノシン３′,５′−サイクリックモノホスフェートを結
合する性質を有するタンパク質である。
【０００８】本発明のホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドに関する今日までの構造データは、ガラクトー
ス、グルコサミンおよびマンノースを含みホスホリルエ
タノールアミン残基を介してアミド連結をもってペプチ
ドのカルボキシル末端に結合したグリカン部を有するホ
スホイノシトールを示している。それはメンブラン・ア
ンカーとして働く共有結合的に結合した糖脂質の中に、
高等真核生物の原形質膜タンパク質における類似の構造
で再出現する（Roberts et al., J. Biol. Chem., 263,
(1983), 18776〜18784)。そのグリカン残基はグルコサ
ミン、ガラクトース、マンノースおよび１モルあたり少
なくとも二つのホスフェート残基を含む。そのペプチド
は−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−配列を有しそしてアスパ
ラギン酸のカルボキシル末端にそしてアミド連結を介し
てホスホイノシトールグリカンのアミノ基に結合され
る。その活性にはホスホイノシトールグリカン部が必要
である。そのペプチドはインスリン様作用を高める。さ
らに、インスリン様作用は完全なホスホイノシトール−
グリカン−ペプチドによってのみならず部分構造によっ
ても示されることも分かっており、例えばホスホイノシ
トールグリカンに結合された、切断短縮（truncated）
ペプチド配列も、あるいはペプチドのないホスホイノシ
トールグリカンもインスリン作用を示す。
ペプチドに関する今日までの構造データは、ガラクトー
ス、グルコサミンおよびマンノースを含みホスホリルエ
タノールアミン残基を介してアミド連結をもってペプチ
ドのカルボキシル末端に結合したグリカン部を有するホ
スホイノシトールを示している。それはメンブラン・ア
ンカーとして働く共有結合的に結合した糖脂質の中に、
高等真核生物の原形質膜タンパク質における類似の構造
で再出現する（Roberts et al., J. Biol. Chem., 263,
(1983), 18776〜18784)。そのグリカン残基はグルコサ
ミン、ガラクトース、マンノースおよび１モルあたり少
なくとも二つのホスフェート残基を含む。そのペプチド
は−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−配列を有しそしてアスパ
ラギン酸のカルボキシル末端にそしてアミド連結を介し
てホスホイノシトールグリカンのアミノ基に結合され
る。その活性にはホスホイノシトールグリカン部が必要
である。そのペプチドはインスリン様作用を高める。さ
らに、インスリン様作用は完全なホスホイノシトール−
グリカン−ペプチドによってのみならず部分構造によっ
ても示されることも分かっており、例えばホスホイノシ
トールグリカンに結合された、切断短縮（truncated）
ペプチド配列も、あるいはペプチドのないホスホイノシ
トールグリカンもインスリン作用を示す。
【０００９】本発明のホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドの適当な生理学的に許容される塩としては例え
ばアリカリ金属、アリカリ土類金属またはアンモニウム
塩のほか生理学的に許容される有機アンモニウムまたは
トリエチルアミン塩基の塩などが挙げられる。
ペプチドの適当な生理学的に許容される塩としては例え
ばアリカリ金属、アリカリ土類金属またはアンモニウム
塩のほか生理学的に許容される有機アンモニウムまたは
トリエチルアミン塩基の塩などが挙げられる。
【００１０】本発明のホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドは、例えば、 a) ｃＡＭＰ結合性タンパク質を含有する生物を用い、 b) そのｃＡＭＰ結合性タンパク質を単離し、 c) そのｃＡＭＰ結合性タンパク質からタンパク質部分
を除去しまた得られるグリコシル−ホスファチジルイノ
シトール−ペプチドを適切な場合には精製し、 d) c)工程で得られた生成物からモノ−またはジアシル
グリセロールを除去し、そして e) 工程d)で生成したホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドを単離することによって製造される。
ペプチドは、例えば、 a) ｃＡＭＰ結合性タンパク質を含有する生物を用い、 b) そのｃＡＭＰ結合性タンパク質を単離し、 c) そのｃＡＭＰ結合性タンパク質からタンパク質部分
を除去しまた得られるグリコシル−ホスファチジルイノ
シトール−ペプチドを適切な場合には精製し、 d) c)工程で得られた生成物からモノ−またはジアシル
グリセロールを除去し、そして e) 工程d)で生成したホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドを単離することによって製造される。
【００１１】ｃＡＭＰ結合性タンパク質は多くの生物、
例えば微生物、植物、真菌、または動物臓器などから得
ることができる。例えば、酵母サッカロマイセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）特にＤＳＭ ６６
４９も適当である。
例えば微生物、植物、真菌、または動物臓器などから得
ることができる。例えば、酵母サッカロマイセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）特にＤＳＭ ６６
４９も適当である。
【００１２】サッカロマイセス・セレビシエによるｃＡ
ＭＰ結合性タンパク質の製造は炭素源および窒素源のほ
か慣用の無機塩を含む栄養溶液中での発酵により行われ
る。ｃＡＭＰ結合性タンパク質は酵母の原形質膜中に優
先的に蓄積される。
ＭＰ結合性タンパク質の製造は炭素源および窒素源のほ
か慣用の無機塩を含む栄養溶液中での発酵により行われ
る。ｃＡＭＰ結合性タンパク質は酵母の原形質膜中に優
先的に蓄積される。
【００１３】工程a)の最良の手順は次のとおりである。
サッカロマイセス・セレビシエにおけるｃＡＭＰ結合性
タンパク質の形成はサッカロマイセス・セレビシエのた
めの慣用の栄養液で良好に行われる。培養は好気的に行
われ、例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で振盪または
撹拌しながら適切な場合には空気または酸素を導入して
液内培養される。それは約１８〜３５℃、好ましくは約
２５〜３０℃、特に２８〜３０℃の温度範囲で行うこと
ができる。pH域は２〜８、有利には３〜７、とするのが
よい。酵母はこれらの条件下に一般に栄養液１mlあたり
約１０7個細胞が存在するようになるまで培養される。
サッカロマイセス・セレビシエにおけるｃＡＭＰ結合性
タンパク質の形成はサッカロマイセス・セレビシエのた
めの慣用の栄養液で良好に行われる。培養は好気的に行
われ、例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で振盪または
撹拌しながら適切な場合には空気または酸素を導入して
液内培養される。それは約１８〜３５℃、好ましくは約
２５〜３０℃、特に２８〜３０℃の温度範囲で行うこと
ができる。pH域は２〜８、有利には３〜７、とするのが
よい。酵母はこれらの条件下に一般に栄養液１mlあたり
約１０7個細胞が存在するようになるまで培養される。
【００１４】工程b)の最良の手順は、ｃＡＭＰ結合性タ
ンパク質を単離するために酵母細胞を栄養培地から分離
しそして緩衝液で洗浄するというものである。単離は例
えばMuellerおよびBandlow（Biochemistry, 28, (198
9), 9957〜9967）に記載の如くに行われる。そのため
に、酵母細胞は酵素的に（ザイモリアーゼ（zymolyas
e））スフェロプラストに変えられ、そして冷所（０〜
４℃）でプロテアーゼ阻害剤の存在下にホモジナイザー
を用いて粉砕される。酵母の分解液を遠心分離し、そし
て細胞沈降物を緩衝液で洗浄し、再び遠心分離する。上
清を合一し、そして RPercoll勾配（２８％ Percoll）
およびスクロース勾配（１５〜２８％スクロース）で精
製する。これらの遠心分離段階により細胞質、原形質
膜、ミクロソームおよびミトコンドリアが相互に分離さ
れる。
ンパク質を単離するために酵母細胞を栄養培地から分離
しそして緩衝液で洗浄するというものである。単離は例
えばMuellerおよびBandlow（Biochemistry, 28, (198
9), 9957〜9967）に記載の如くに行われる。そのため
に、酵母細胞は酵素的に（ザイモリアーゼ（zymolyas
e））スフェロプラストに変えられ、そして冷所（０〜
４℃）でプロテアーゼ阻害剤の存在下にホモジナイザー
を用いて粉砕される。酵母の分解液を遠心分離し、そし
て細胞沈降物を緩衝液で洗浄し、再び遠心分離する。上
清を合一し、そして RPercoll勾配（２８％ Percoll）
およびスクロース勾配（１５〜２８％スクロース）で精
製する。これらの遠心分離段階により細胞質、原形質
膜、ミクロソームおよびミトコンドリアが相互に分離さ
れる。
【００１５】ｃＡＭＰ結合性タンパク質は原形質膜画分
から、例えばＮ6−(２−アミノエチル)−ｃＡＭＰ−Sep
haroseカラムにより結合され、そしてそのｃＡＭＰ結合
性タンパク質をカラムからｃＡＭＰで溶出しそして脱塩
する。
から、例えばＮ6−(２−アミノエチル)−ｃＡＭＰ−Sep
haroseカラムにより結合され、そしてそのｃＡＭＰ結合
性タンパク質をカラムからｃＡＭＰで溶出しそして脱塩
する。
【００１６】工程c)の最良の手順は、ｃＡＭＰ結合性タ
ンパク質のタンパク質部分を酵素的に除去するというも
のである。その酵素的分解に用いられるのは、例えばプ
ロテアーゼ、例えばプロナーゼ（Pronase）、エンドプ
ロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ライソバクター・エンザイモゲ
ネス(Lysobacter enzymogenes)）またはＶ８プロテアー
ゼ（スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus
aureus)）などである。これによってそのタンパク質部
分が分解される。プロテアーゼＶ８を用いた場合にはペ
プチド配列Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するグリコシル
−ホスファチジルイノシトールが得られ；プロテアーゼ
のプロナーゼと共にインキュベーションすると、そのペ
プチド部分がアミノ酸Ａｓｎのみより成るグリコシル−
ホスファチジルイノシトール−ペプチドが生成する。
ンパク質のタンパク質部分を酵素的に除去するというも
のである。その酵素的分解に用いられるのは、例えばプ
ロテアーゼ、例えばプロナーゼ（Pronase）、エンドプ
ロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ライソバクター・エンザイモゲ
ネス(Lysobacter enzymogenes)）またはＶ８プロテアー
ゼ（スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus
aureus)）などである。これによってそのタンパク質部
分が分解される。プロテアーゼＶ８を用いた場合にはペ
プチド配列Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するグリコシル
−ホスファチジルイノシトールが得られ；プロテアーゼ
のプロナーゼと共にインキュベーションすると、そのペ
プチド部分がアミノ酸Ａｓｎのみより成るグリコシル−
ホスファチジルイノシトール−ペプチドが生成する。
【００１７】前記プロテアーゼは例えばトリクロロ酢酸
などの酸により沈殿させる。グリコシル−ホスファチジ
ルイノシトール−ペプチドは遠心分離によりプロテアー
ゼから分離し、フェニル−Sepharoseカラムで濃縮しそ
して薄層クロマトグラフィーにより精製する。
などの酸により沈殿させる。グリコシル−ホスファチジ
ルイノシトール−ペプチドは遠心分離によりプロテアー
ゼから分離し、フェニル−Sepharoseカラムで濃縮しそ
して薄層クロマトグラフィーにより精製する。
【００１８】工程d)の最良の手順は、グリコシル−ホス
ファチジルイノシトール−ペプチドに結合したモノ−ま
たはジアシルグリセロール残基を酵素的に除去するとい
うものであり、このようにしてホスホイノシトール−グ
リカン−ペプチドが遊離される。この酵素的分解に用い
られるのは例えばホスホリパーゼ例えばホスファチジル
イノシトール−特異的−ホスホリパーゼＣ（バチルス・
セレウス(Bacillus cereus)）である。これにより、ホ
スフェート基を介してミオ−イノシトールに結合したモ
ノ−またはジアシルグリセロールが除去される。そのグ
リセロール含有残基は工程c)のプロテアーゼ処理によっ
ては除去されない。工程c)およびd)は逆の順序で行うこ
ともできる。
ファチジルイノシトール−ペプチドに結合したモノ−ま
たはジアシルグリセロール残基を酵素的に除去するとい
うものであり、このようにしてホスホイノシトール−グ
リカン−ペプチドが遊離される。この酵素的分解に用い
られるのは例えばホスホリパーゼ例えばホスファチジル
イノシトール−特異的−ホスホリパーゼＣ（バチルス・
セレウス(Bacillus cereus)）である。これにより、ホ
スフェート基を介してミオ−イノシトールに結合したモ
ノ−またはジアシルグリセロールが除去される。そのグ
リセロール含有残基は工程c)のプロテアーゼ処理によっ
ては除去されない。工程c)およびd)は逆の順序で行うこ
ともできる。
【００１９】工程c)およびd)における酵素反応は、その
酵素反応に好ましい条件下に洗剤（デタージェント）の
存在下に行われる。前記酵素についての既知の反応条件
に基づいて至適反応条件を確立することは当業者にとり
困難なことではない。
酵素反応に好ましい条件下に洗剤（デタージェント）の
存在下に行われる。前記酵素についての既知の反応条件
に基づいて至適反応条件を確立することは当業者にとり
困難なことではない。
【００２０】工程e)の最良の手順は、ホスホリパーゼを
トリクロロ酢酸などの酸で沈殿させるというものであ
る。ホスホイノシトール−グリカン−ペプチドは遠心分
離によりホスホリパーゼから分離し、Biogel Ｐ−４カ
ラムで精製し、そして薄層電気泳動により濃縮する。
トリクロロ酢酸などの酸で沈殿させるというものであ
る。ホスホイノシトール−グリカン−ペプチドは遠心分
離によりホスホリパーゼから分離し、Biogel Ｐ−４カ
ラムで精製し、そして薄層電気泳動により濃縮する。
【００２１】本発明のホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドおよびそれらの生理学的に許容される塩は主と
して真性糖尿病または非インスリン依存性糖尿病治療用
薬学的組成物の活性物質として用いられる。
ペプチドおよびそれらの生理学的に許容される塩は主と
して真性糖尿病または非インスリン依存性糖尿病治療用
薬学的組成物の活性物質として用いられる。
【００２２】従って本発明は、有効量のホスホイノシト
ール−グリカン−ペプチドおよび／または少なくとも一
つのその生理学的に許容される塩を溶解、無定形および
／または結晶状態で含有する医薬にも関する。
ール−グリカン−ペプチドおよび／または少なくとも一
つのその生理学的に許容される塩を溶解、無定形および
／または結晶状態で含有する医薬にも関する。
【００２３】前記医薬は、好ましくは、適当な等張化
剤、適当な保存剤および場合によっては適切な緩衝剤、
および場合によってはさらにデポー主剤（depot princi
ple）を（もちろんすべて滅菌水性溶液または懸濁液中
に）含む約３.０〜９.０、好ましくは５.０〜８.５のpH
を有する注射用の溶液または懸濁液である。活性物質は
別として組成物成分全体が組成物ビヒクルを形成する。
剤、適当な保存剤および場合によっては適切な緩衝剤、
および場合によってはさらにデポー主剤（depot princi
ple）を（もちろんすべて滅菌水性溶液または懸濁液中
に）含む約３.０〜９.０、好ましくは５.０〜８.５のpH
を有する注射用の溶液または懸濁液である。活性物質は
別として組成物成分全体が組成物ビヒクルを形成する。
【００２４】適当な等張化剤の例はグリセロール、グル
コース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウムまたはマ
グネシウム化合物例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2であ
る。
コース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウムまたはマ
グネシウム化合物例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2であ
る。
【００２５】適当な保存剤の例はフェノール、ｍ−クレ
ゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロ
キシ安息香酸エステルである。
ゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロ
キシ安息香酸エステルである。
【００２６】特にpHを約５.０〜８.５に調節するために
使用できる緩衝物質の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムおよび燐酸ナトリウムである。そのほか、生
理学的に許容し得る希酸（典型的にはＨＣｌ）またはア
ルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もpH調節に適している。
使用できる緩衝物質の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムおよび燐酸ナトリウムである。そのほか、生
理学的に許容し得る希酸（典型的にはＨＣｌ）またはア
ルカリ（典型的にはＮａＯＨ）もpH調節に適している。
【００２７】さらに、本発明の医薬の作用プロフィール
を変える目的で、修飾（ＥＰ−Ｂ−１３２ ７６９およ
びＥＰ−Ｂ １３２ ７７０参照）および／または非修飾
インスリン、好ましくはウシ、ブタまたはヒトインスリ
ン、特にヒトインスリンを混合することもできる。
を変える目的で、修飾（ＥＰ−Ｂ−１３２ ７６９およ
びＥＰ−Ｂ １３２ ７７０参照）および／または非修飾
インスリン、好ましくはウシ、ブタまたはヒトインスリ
ン、特にヒトインスリンを混合することもできる。
【００２８】前記医薬はホスホイノシトール−グリカン
−ペプチドおよび／または少なくとも一つのその生理学
的に許容される塩を、場合により修飾および／または非
修飾インスリンまたはそれらの誘導体と共に、生理学的
に許容し得るビヒクルと共に、そして場合により適当な
添加剤および補助物質と共に適当な投与剤形に変えるこ
とにより調製される。
−ペプチドおよび／または少なくとも一つのその生理学
的に許容される塩を、場合により修飾および／または非
修飾インスリンまたはそれらの誘導体と共に、生理学的
に許容し得るビヒクルと共に、そして場合により適当な
添加剤および補助物質と共に適当な投与剤形に変えるこ
とにより調製される。
【００２９】本発明を以下の実施例により詳述する。
【００３０】実施例１ サッカロマイセス・セレビシエＤＳＭ ６６４９の発酵 サッカロマイセス・セレビシエＤＳＭを発酵槽中で好気
的に培養する。培地は水１リットル中に以下の成分を含
有する： 酵母エキス ３ｇ グルコース １ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ ＮＨ4Ｃｌ １ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.５ｇ ＮａＣｌ ０.５ｇ ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ ０.６ｇ ＦｅＣｌ3 ０.３mlの１％ 水性溶液 乳酸 ２２mlの９０％ 溶液。
的に培養する。培地は水１リットル中に以下の成分を含
有する： 酵母エキス ３ｇ グルコース １ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ ＮＨ4Ｃｌ １ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.５ｇ ＮａＣｌ ０.５ｇ ＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ ０.６ｇ ＦｅＣｌ3 ０.３mlの１％ 水性溶液 乳酸 ２２mlの９０％ 溶液。
【００３１】pHをＫＯＨを用いて５.５に調節する。発
酵槽容量１リットルあたり空気１リットルを用いて通気
を行う。培養液１mlあたり１×１０7個細胞の細胞密度
となるまで細胞を培養する；収量は培養液１リットルあ
たり約３ｇの湿重量。細胞は遠心分離（３,０００×
ｇ、５分）により集め、そしてホスフェート緩衝液、pH
６で洗浄する。
酵槽容量１リットルあたり空気１リットルを用いて通気
を行う。培養液１mlあたり１×１０7個細胞の細胞密度
となるまで細胞を培養する；収量は培養液１リットルあ
たり約３ｇの湿重量。細胞は遠心分離（３,０００×
ｇ、５分）により集め、そしてホスフェート緩衝液、pH
６で洗浄する。
【００３２】実施例２ ｃＡＭＰ結合性タンパク質の単離 実施例２よりの細胞を酵素的に（ザイモラーゼ、２,０
００、Seikagaku Kogyolo、Tokyo）スフェロプラストに
転化し、ガラスホモジナイザー（Arthur H. Thomas and
Co.）を用いて０℃で粉砕する。以下の単離段階はプロ
テアーゼ阻害剤（フェニルメタンスルホニルフルオライ
ド(ＰＭＳＦ)、ロイペプチン(leupeptin)、アプロチニ
ン(aprotinin)、α2−マクログロブリン、トリプシン阻
害剤；Boehringer Mannheim）の存在下に行われる。細
胞分解液を遠心分離し（１,０００×ｇ、３分、４℃)、
細胞沈降物をＳＥＭ緩衝液（０.２５Ｍ スクロース、
０.５mM エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、２０mM
３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)
／ＫＯＨ、pH７.４）で洗浄しそして再び遠心分離す
る。上清を合一しそして RPercoll勾配（Pharmacia, Fr
eiburg; ２８％ Percoll,ＳＥＭ緩衝液、０.５mgタンパ
ク質／ml）を用いて遠心分離する（１８,０００×ｇ、
１５分、４℃)。この勾配で細胞質、原形質膜、ミクロ
ソームおよびミトコンドリアが相互に分離される。原形
質膜はこの勾配の上三分の一に浮遊する。それらをシリ
ンジで勾配から取り出し、５倍容のＳＥＭ緩衝液で希釈
し、そして遠心分離する（４８,０００×ｇ、３０分、
４℃)。沈降物をＭＯＰＳ緩衝液に懸濁し（５mgタンパ
ク質／ml)、そしてＮ−〔3Ｈ〕アセチル−コンカナバリ
ンＡ（Amersham Buchler、Brunswick; ５００μlのＭＯ
ＰＳ緩衝液(Boehringer Mannheim)、２０mM、pH７.４、
０.５mM ＥＤＴＡ、５０mM ＫＣｌ、５mM ＣａＣｌ2、
２００μgの牛血清アルブミン中に５５μCiを有するタ
ンパク質１mg；Behring werke, Marburg）と共に４℃で
超音波浴中で６０分間インキュベートする。コンカナバ
リンＡの結合はマーカーとして役立つ。それら懸濁液を
スクロース勾配（ＭＯＰＳ緩衝液中１５〜２８％スクロ
ース）にピペットで移しそして遠心分離する（２５,０
００回転／分、９０分、４℃、Beckmann ＳＷ ２７ロー
ター）。スクロース勾配を分画し、そして放射性画分
（約２３％スクロース）を合一し、ＭＯＰＳ緩衝液（５
０mM コンカナバリンＡ；Sigma Deisenhofen, ２５０mM
ＫＣｌ）で３倍に希釈し、そして遠心分離する（２０
０,０００×ｇ、６０分、４℃、Beckmann ＴＬ−１００
ローター）。沈降物をＳＥＭ緩衝液（２５０mM ＫＣ
ｌ）で洗浄し、遠心分離しそしてＫＣｌを含まないＳＥ
Ｍ緩衝液に再懸濁する（２.５mg タンパク質／ml)。
００、Seikagaku Kogyolo、Tokyo）スフェロプラストに
転化し、ガラスホモジナイザー（Arthur H. Thomas and
Co.）を用いて０℃で粉砕する。以下の単離段階はプロ
テアーゼ阻害剤（フェニルメタンスルホニルフルオライ
ド(ＰＭＳＦ)、ロイペプチン(leupeptin)、アプロチニ
ン(aprotinin)、α2−マクログロブリン、トリプシン阻
害剤；Boehringer Mannheim）の存在下に行われる。細
胞分解液を遠心分離し（１,０００×ｇ、３分、４℃)、
細胞沈降物をＳＥＭ緩衝液（０.２５Ｍ スクロース、
０.５mM エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、２０mM
３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)
／ＫＯＨ、pH７.４）で洗浄しそして再び遠心分離す
る。上清を合一しそして RPercoll勾配（Pharmacia, Fr
eiburg; ２８％ Percoll,ＳＥＭ緩衝液、０.５mgタンパ
ク質／ml）を用いて遠心分離する（１８,０００×ｇ、
１５分、４℃)。この勾配で細胞質、原形質膜、ミクロ
ソームおよびミトコンドリアが相互に分離される。原形
質膜はこの勾配の上三分の一に浮遊する。それらをシリ
ンジで勾配から取り出し、５倍容のＳＥＭ緩衝液で希釈
し、そして遠心分離する（４８,０００×ｇ、３０分、
４℃)。沈降物をＭＯＰＳ緩衝液に懸濁し（５mgタンパ
ク質／ml)、そしてＮ−〔3Ｈ〕アセチル−コンカナバリ
ンＡ（Amersham Buchler、Brunswick; ５００μlのＭＯ
ＰＳ緩衝液(Boehringer Mannheim)、２０mM、pH７.４、
０.５mM ＥＤＴＡ、５０mM ＫＣｌ、５mM ＣａＣｌ2、
２００μgの牛血清アルブミン中に５５μCiを有するタ
ンパク質１mg；Behring werke, Marburg）と共に４℃で
超音波浴中で６０分間インキュベートする。コンカナバ
リンＡの結合はマーカーとして役立つ。それら懸濁液を
スクロース勾配（ＭＯＰＳ緩衝液中１５〜２８％スクロ
ース）にピペットで移しそして遠心分離する（２５,０
００回転／分、９０分、４℃、Beckmann ＳＷ ２７ロー
ター）。スクロース勾配を分画し、そして放射性画分
（約２３％スクロース）を合一し、ＭＯＰＳ緩衝液（５
０mM コンカナバリンＡ；Sigma Deisenhofen, ２５０mM
ＫＣｌ）で３倍に希釈し、そして遠心分離する（２０
０,０００×ｇ、６０分、４℃、Beckmann ＴＬ−１００
ローター）。沈降物をＳＥＭ緩衝液（２５０mM ＫＣ
ｌ）で洗浄し、遠心分離しそしてＫＣｌを含まないＳＥ
Ｍ緩衝液に再懸濁する（２.５mg タンパク質／ml)。
【００３３】約５００μgの原形質膜タンパク質を緩衝
液（２５mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.０、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、４mM ＭｇＣｌ2、０.４mM ＥＧＴＡ（エチレン
グリコールビス（β−アミノエチルエーテル）四酢
酸)、０.５mM ＤＴＴ（ジチオトレイトール)、０.５％
デオキシコレート、０.１mM ＩＢＭＸ（イソブチルメチ
ルキサンチン)、０.１mM ＰＭＳＦ、５０μM ロイペプ
チン、０.１mM アプロチニン（２mg／ml）に可溶化す
る。その溶液を同じ緩衝液で平衡させた２ml Ｎ6−(２
−アミノエチル)−ｃＡＭＰ−Sepharoseカラム（Pharma
cia, Freiburg）に４℃でかける。そのカラムを各２ml
の緩衝液（２５mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.２、１００
mM クエン酸ナトリウム、５mM ＤＴＴ、５mM ＭｇＣ
ｌ2、１５０mM ＮａＣｌ、２５０mM スクロース、７.５
％エチレングリコール（Merck、Darmstadt）、１０％グ
リセロール、１mg／ml 牛血清アルブミン、１mM ＩＢＭ
Ｘ）で５回洗浄する。付加的に１００μM ｃＡＭＰを含
有する同じ緩衝液２mlを用いて４℃で溶出を行う。最初
の２５０μlの溶出液を、緩衝液（２５mM ＭＯＰＳ／Ｋ
ＯＨ、pH７.０、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2、１０
mM ＤＴＴ、５０μM ＥＤＴＡ、５０μM ＰＭＳＦ、０.
１％デオキシコレート、５％グリセロール）で平衡させ
た１ml Sephadex Ｇ−２５カラムの遠心分離により脱塩
する。その脱塩物を等容の緩衝液（１０mM ＭＯＰＳ／
ＫＯＨ、pH７.２、１mM ＥＤＴＡ）中８％ポリエチレン
グリコール４０００（Pharmacia, Freiburg）と共に４
℃で３０分インキュベートする。１５分間遠心分離後、
沈降物を緩衝液（２０mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.２、
１mM ＥＤＴＡ、１００μM ＰＭＳＦ、０.５％デオキシ
コレート）に溶解する（２mgタンパク質／ml)。
液（２５mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.０、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、４mM ＭｇＣｌ2、０.４mM ＥＧＴＡ（エチレン
グリコールビス（β−アミノエチルエーテル）四酢
酸)、０.５mM ＤＴＴ（ジチオトレイトール)、０.５％
デオキシコレート、０.１mM ＩＢＭＸ（イソブチルメチ
ルキサンチン)、０.１mM ＰＭＳＦ、５０μM ロイペプ
チン、０.１mM アプロチニン（２mg／ml）に可溶化す
る。その溶液を同じ緩衝液で平衡させた２ml Ｎ6−(２
−アミノエチル)−ｃＡＭＰ−Sepharoseカラム（Pharma
cia, Freiburg）に４℃でかける。そのカラムを各２ml
の緩衝液（２５mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.２、１００
mM クエン酸ナトリウム、５mM ＤＴＴ、５mM ＭｇＣ
ｌ2、１５０mM ＮａＣｌ、２５０mM スクロース、７.５
％エチレングリコール（Merck、Darmstadt）、１０％グ
リセロール、１mg／ml 牛血清アルブミン、１mM ＩＢＭ
Ｘ）で５回洗浄する。付加的に１００μM ｃＡＭＰを含
有する同じ緩衝液２mlを用いて４℃で溶出を行う。最初
の２５０μlの溶出液を、緩衝液（２５mM ＭＯＰＳ／Ｋ
ＯＨ、pH７.０、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2、１０
mM ＤＴＴ、５０μM ＥＤＴＡ、５０μM ＰＭＳＦ、０.
１％デオキシコレート、５％グリセロール）で平衡させ
た１ml Sephadex Ｇ−２５カラムの遠心分離により脱塩
する。その脱塩物を等容の緩衝液（１０mM ＭＯＰＳ／
ＫＯＨ、pH７.２、１mM ＥＤＴＡ）中８％ポリエチレン
グリコール４０００（Pharmacia, Freiburg）と共に４
℃で３０分インキュベートする。１５分間遠心分離後、
沈降物を緩衝液（２０mM ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、pH７.２、
１mM ＥＤＴＡ、１００μM ＰＭＳＦ、０.５％デオキシ
コレート）に溶解する（２mgタンパク質／ml)。
【００３４】実施例３ ホスホグリカン−ペプチドの製造 a) プロナーゼ（ストレプトマイセス・グリゼウス(Str
eptomyces griseus)；Boehringer Mannheim）による消
化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質を、１mlの
０.１Ｍ ４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジン
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）／ＫＯＨ（pH８.０)、
１５mM ＣａＣｌ2、１％ Triton Ｘ−１００（Boehring
er Mannheim）中の４５０μg／ml プロナーゼと共に５
０℃で１０時間インキュベートする。１％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）の添加後、第二アリコートのプロ
ナーゼを用いて５０℃で７時間インキュベーションを続
ける。自動化エドマン分解は、プロナーゼ分解によりア
スバラギンがエタノールアミンのアミノ末端にアミド様
に結合したホスホイノシトールグリカンが得られること
を示している。このホスホイノシトール−グリカン−ペ
プチドを以下ＰＩＧ−Ｎと呼ぶ。
eptomyces griseus)；Boehringer Mannheim）による消
化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質を、１mlの
０.１Ｍ ４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジン
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）／ＫＯＨ（pH８.０)、
１５mM ＣａＣｌ2、１％ Triton Ｘ−１００（Boehring
er Mannheim）中の４５０μg／ml プロナーゼと共に５
０℃で１０時間インキュベートする。１％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）の添加後、第二アリコートのプロ
ナーゼを用いて５０℃で７時間インキュベーションを続
ける。自動化エドマン分解は、プロナーゼ分解によりア
スバラギンがエタノールアミンのアミノ末端にアミド様
に結合したホスホイノシトールグリカンが得られること
を示している。このホスホイノシトール−グリカン−ペ
プチドを以下ＰＩＧ−Ｎと呼ぶ。
【００３５】b) エンドプロティナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｅ
Ｃ ３.４.２１.１９（Ｖ８プロテアーゼ）（スタフィロ
コッカス・オーレウス；Boehringer Mannheim）による
消化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質を１mlの
２０mM（ＮＨ4)2ＣＯ3（pH７.８)、０.５％オクチルグ
ルコシド（Boehringer Mannheim）中３００μgのＶ８プ
ロテアーゼと共に３７℃で１８時間インキュベートす
る。
Ｃ ３.４.２１.１９（Ｖ８プロテアーゼ）（スタフィロ
コッカス・オーレウス；Boehringer Mannheim）による
消化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質を１mlの
２０mM（ＮＨ4)2ＣＯ3（pH７.８)、０.５％オクチルグ
ルコシド（Boehringer Mannheim）中３００μgのＶ８プ
ロテアーゼと共に３７℃で１８時間インキュベートす
る。
【００３６】自動化エドマン分解は、Ｖ８プロテアーゼ
消化によりペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するホ
スホイノシトールグリカンが得られることを示してい
る。そのアミノ酸アスバラギン酸は、カルボキシル末端
によりホスホイノシトールグリカンに結合している。ト
リペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するホスホイノ
シトールグリカンの化合物は、以下トリペプチドＡｓｎ
−Ｃｙｓ−ＴｙｒはＰＩＧ−ＮＣＹと称する。
消化によりペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するホ
スホイノシトールグリカンが得られることを示してい
る。そのアミノ酸アスバラギン酸は、カルボキシル末端
によりホスホイノシトールグリカンに結合している。ト
リペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒを有するホスホイノ
シトールグリカンの化合物は、以下トリペプチドＡｓｎ
−Ｃｙｓ−ＴｙｒはＰＩＧ−ＮＣＹと称する。
【００３７】c) エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ライ
ソバクター・エンザイモゲネス；Boehringer Mannhei
m）による消化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質
を、０.５mlの５０mM（ＮＨ4)2ＣＯ3（pH８.２)、０.５
％オクチルグルコシド中の５５μgのエンドプロテアー
ゼＬｙｓ−Ｃと共に３７℃で１８時間インキュベートす
る。
ソバクター・エンザイモゲネス；Boehringer Mannhei
m）による消化：１００μgのｃＡＭＰ結合性タンパク質
を、０.５mlの５０mM（ＮＨ4)2ＣＯ3（pH８.２)、０.５
％オクチルグルコシド中の５５μgのエンドプロテアー
ゼＬｙｓ−Ｃと共に３７℃で１８時間インキュベートす
る。
【００３８】自動化エドマン分解はエンドプロテアーゼ
Ｌｙｓ−ＣによりペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｕを有するホスホイノシトールグリカンが生じること
を示している。そのペプチドはアスバラギンのカルボキ
シル末端を介してホスホイノシトールグリカンに結合し
ている。それを以下ＰＩＧ−ＮＣＹＥと呼ぶ。
Ｌｙｓ−ＣによりペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｕを有するホスホイノシトールグリカンが生じること
を示している。そのペプチドはアスバラギンのカルボキ
シル末端を介してホスホイノシトールグリカンに結合し
ている。それを以下ＰＩＧ−ＮＣＹＥと呼ぶ。
【００３９】d) カルボキシル末端アミノ酸の除去：プ
ロナーゼ消化されたｃＡＭＰ結合性タンパク質（ａ参
照）をマニュアル方式のエドマン分解にかける。アミノ
酸を含まない生成ホスホイノシトールグリカンを以下Ｐ
ＩＧと呼ぶ。
ロナーゼ消化されたｃＡＭＰ結合性タンパク質（ａ参
照）をマニュアル方式のエドマン分解にかける。アミノ
酸を含まない生成ホスホイノシトールグリカンを以下Ｐ
ＩＧと呼ぶ。
【００４０】タンパク質分解の後、プロテアーゼを５％
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて沈殿させることによ
り除去する。遠心分離（１０,０００×g、１５分）後、
上清中に含まれるホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チド誘導体およびエドマン分解から得られるホスホイノ
シトール−グリカンを濃縮し、そしてフェニル−Sephar
oseカラムに結合させることにより精製する。２％オク
チルフェノールエチレングリコールエーテル（ＴＸ−１
００）で溶出後、ホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チド誘導体を二つの異なる溶媒系を用いた薄層クロマト
グラフィーにより精製する。酸系（クロロホルム／アセ
トン／メタノール／氷酢酸／水 １０：４：２：２：
１）中での第一ラン（ｒｕｎ）の後、シリカゲルプレー
ト（タイプ６０）上の適用点近傍のホスホイノシトール
−グリカン−ペプチドをメタノールで溶出し、次いで塩
素系（クロロホルム／メタノール／アンモニア／水 ４
５：４５：３.５：１０）の中の第二ランで再クロマト
グラフィーにかける。ホスホイノシトール−グリカン−
ペプチド誘導体を再びプレート（Ｒf＝０.４５）から溶
出しそしてクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出
する。有機相を洗浄し蒸発させ、そしてその物質を０.
５％ ＴＸ−１００含有ホスフェート緩衝液に懸濁す
る。
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて沈殿させることによ
り除去する。遠心分離（１０,０００×g、１５分）後、
上清中に含まれるホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チド誘導体およびエドマン分解から得られるホスホイノ
シトール−グリカンを濃縮し、そしてフェニル−Sephar
oseカラムに結合させることにより精製する。２％オク
チルフェノールエチレングリコールエーテル（ＴＸ−１
００）で溶出後、ホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チド誘導体を二つの異なる溶媒系を用いた薄層クロマト
グラフィーにより精製する。酸系（クロロホルム／アセ
トン／メタノール／氷酢酸／水 １０：４：２：２：
１）中での第一ラン（ｒｕｎ）の後、シリカゲルプレー
ト（タイプ６０）上の適用点近傍のホスホイノシトール
−グリカン−ペプチドをメタノールで溶出し、次いで塩
素系（クロロホルム／メタノール／アンモニア／水 ４
５：４５：３.５：１０）の中の第二ランで再クロマト
グラフィーにかける。ホスホイノシトール−グリカン−
ペプチド誘導体を再びプレート（Ｒf＝０.４５）から溶
出しそしてクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出
する。有機相を洗浄し蒸発させ、そしてその物質を０.
５％ ＴＸ−１００含有ホスフェート緩衝液に懸濁す
る。
【００４１】e) a)〜d)で得られたホスホイノシトール
グリカンまたはホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドを０.２mlの０.２Ｍ 燐酸カリウム（pH７.２)、２mM
ＤＴＴ、１０mM ＭｇＣｌ2、５０mM ＮａＣｌ、０.０５
％ ＴＸ−１００中、１０単位のホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＣ、ＥＣ ３.１.１.５（バ
チルス・セレウス；Sigma, Deisenhofen）と共に３７℃
で２時間インキュベートする。１０mM ＥＤＴＡ添加
後、分解生成物を塩素性溶媒系（ｄ参照）での薄層クロ
マトグラフィーにより相互に分離する。適用点にすぐ近
くの物質をプレートから溶出し、そして２％ポリ（エチ
レングリコール)８モノ(オクチルフェニルエーテル）
（ＴＸ−１１４）と混合する。加熱および遠心分離によ
り相分離を開始させる。水性相をSpeedvac濃縮装置で濃
縮する。
グリカンまたはホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドを０.２mlの０.２Ｍ 燐酸カリウム（pH７.２)、２mM
ＤＴＴ、１０mM ＭｇＣｌ2、５０mM ＮａＣｌ、０.０５
％ ＴＸ−１００中、１０単位のホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＣ、ＥＣ ３.１.１.５（バ
チルス・セレウス；Sigma, Deisenhofen）と共に３７℃
で２時間インキュベートする。１０mM ＥＤＴＡ添加
後、分解生成物を塩素性溶媒系（ｄ参照）での薄層クロ
マトグラフィーにより相互に分離する。適用点にすぐ近
くの物質をプレートから溶出し、そして２％ポリ（エチ
レングリコール)８モノ(オクチルフェニルエーテル）
（ＴＸ−１１４）と混合する。加熱および遠心分離によ
り相分離を開始させる。水性相をSpeedvac濃縮装置で濃
縮する。
【００４２】f) ホスホイノシトール−グリカン−ペプ
チドを標準化するために、工程a)〜d)よりの物質中の遊
離グルコサミンの窒素は、過メチル化により放射性標識
トリメチルアンモニウム陽イオンに転化される。これを
行うために、サンプルを真空乾燥し、そして１００μl
のジメチルスルホキシドを添加する。超音波処理（１分
間）の後、１０mgのＮａＯＨおよび４０μlのメチル〔
125Ｉ〕アイオダイド（０.２μCi；ＮＥＮ−Dupont Dre
ieich）を添加する。２５℃で４５分間撹拌後、Speedva
cで溶媒を除去しそして４００μlのＨ2Ｏを添加する。
サンプルをクロロホルムで３回洗浄し、そしてクロロホ
ルム抽出液をＨ2Ｏで３回洗浄する。クロロホルムをＮ2
下に蒸発させる。過メチル化は広い濃度範囲にわたって
直線的であり定量的である。インスリン様作用のテスト
では等価容量（dpm値の等しい）ホスホイノシトール−
グリカン−ペプチドを用いる（１〜１００任意単位)。
チドを標準化するために、工程a)〜d)よりの物質中の遊
離グルコサミンの窒素は、過メチル化により放射性標識
トリメチルアンモニウム陽イオンに転化される。これを
行うために、サンプルを真空乾燥し、そして１００μl
のジメチルスルホキシドを添加する。超音波処理（１分
間）の後、１０mgのＮａＯＨおよび４０μlのメチル〔
125Ｉ〕アイオダイド（０.２μCi；ＮＥＮ−Dupont Dre
ieich）を添加する。２５℃で４５分間撹拌後、Speedva
cで溶媒を除去しそして４００μlのＨ2Ｏを添加する。
サンプルをクロロホルムで３回洗浄し、そしてクロロホ
ルム抽出液をＨ2Ｏで３回洗浄する。クロロホルムをＮ2
下に蒸発させる。過メチル化は広い濃度範囲にわたって
直線的であり定量的である。インスリン様作用のテスト
では等価容量（dpm値の等しい）ホスホイノシトール−
グリカン−ペプチドを用いる（１〜１００任意単位)。
【００４３】g) a)〜d)で得られた物質を亜硝酸と共に
インキュベートするとホスホイノシトールグリカンが分
解する。
インキュベートするとホスホイノシトールグリカンが分
解する。
【００４４】実施例４ ホスホイノシトール−グリカン−ペプチドの構造的特徴 a) 酵母細胞を実施例１に示す如く放射性標識基質（Ｎ
ＥＮ−Dupont, Dreieich、により供給されたもの）の存
在下に培養する： ステアリン酸 ミオ−イノシトール エタノールアミン グルコサミンまたは マンノース。
ＥＮ−Dupont, Dreieich、により供給されたもの）の存
在下に培養する： ステアリン酸 ミオ−イノシトール エタノールアミン グルコサミンまたは マンノース。
【００４５】完全な原形質膜画分またはアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製されたｃＡＭＰ結合性タ
ンパク質（実施例２参照）をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかける。クーマシーブルー染色または成
分のオートラジオグラフィーは前述のすべての放射性成
分がホスホイノシトール−グリカン−ペプチドに取り込
まれることを示している。
クロマトグラフィーにより精製されたｃＡＭＰ結合性タ
ンパク質（実施例２参照）をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかける。クーマシーブルー染色または成
分のオートラジオグラフィーは前述のすべての放射性成
分がホスホイノシトール−グリカン−ペプチドに取り込
まれることを示している。
【００４６】b) 実施例３a)において得られるホスホイ
ノシトール−グリカン−ペプチドを化学的および酵素的
にさらに分解する。分解生成物を薄層クロマトグラフィ
ーおよび放射性分布測定（〔3Ｈ〕ステアリン酸および
〔14Ｃ〕ミオ−イノシトール）により分析する。残る放
射性標識構造物をプレートから溶出しそして次の分解反
応にかける。プロナーゼ消化後に生成する構造物を亜硝
酸で脱アミノ化するとホスファチジルイノシトール（Ｐ
Ｉ）が遊離する。後者は、ホスホリパーゼＤによりホス
ファチジン酸に、またはホスホリパーゼＣによりジアシ
ルグリセロールに転化される。これはミオ−イノシトー
ル標識の損失を伴うがステアリン酸による放射性標識は
保持される。そのホスファチジン酸は次にアセトリシス
によりジグリセライドアセテートに転化される。最後
に、後者の構造物から、およびジアシルグリセロールか
ら、アルカリ性加水分解によりステアリン酸が遊離す
る。
ノシトール−グリカン−ペプチドを化学的および酵素的
にさらに分解する。分解生成物を薄層クロマトグラフィ
ーおよび放射性分布測定（〔3Ｈ〕ステアリン酸および
〔14Ｃ〕ミオ−イノシトール）により分析する。残る放
射性標識構造物をプレートから溶出しそして次の分解反
応にかける。プロナーゼ消化後に生成する構造物を亜硝
酸で脱アミノ化するとホスファチジルイノシトール（Ｐ
Ｉ）が遊離する。後者は、ホスホリパーゼＤによりホス
ファチジン酸に、またはホスホリパーゼＣによりジアシ
ルグリセロールに転化される。これはミオ−イノシトー
ル標識の損失を伴うがステアリン酸による放射性標識は
保持される。そのホスファチジン酸は次にアセトリシス
によりジグリセライドアセテートに転化される。最後
に、後者の構造物から、およびジアシルグリセロールか
ら、アルカリ性加水分解によりステアリン酸が遊離す
る。
【００４７】c) 実施例３a)および３e)で得られた構造
物を乾燥しそしてＨＦ（水中６０％、０℃、１６時間）
で処理し、そして生成オリゴサッカライドを２Ｍ トリ
フルオロ酢酸で加水分解する（１００℃、４時間)。次
に反応溶液を乾燥し、そして存在する糖を還元し（０.
１Ｍ 水酸化アンモニウム中１％ＮａＢＨ4、３７℃、１
時間)、そして最後にアセチル化する（ピリジンと酢酸
無水物の１：１混合物、６０℃、１時間)。Packardガス
クロマトグラフ、モデル４２８、カラム１００／１２０
Supelcoport（Supelco, Bellefonte, USA）を用いて６
０℃でガスクロマトグラフィーを行う。以下の定性的組
成が明らかとなった：マンノース、ガラクトース、ミオ
−イノシトールおよびグルコサミン。
物を乾燥しそしてＨＦ（水中６０％、０℃、１６時間）
で処理し、そして生成オリゴサッカライドを２Ｍ トリ
フルオロ酢酸で加水分解する（１００℃、４時間)。次
に反応溶液を乾燥し、そして存在する糖を還元し（０.
１Ｍ 水酸化アンモニウム中１％ＮａＢＨ4、３７℃、１
時間)、そして最後にアセチル化する（ピリジンと酢酸
無水物の１：１混合物、６０℃、１時間)。Packardガス
クロマトグラフ、モデル４２８、カラム１００／１２０
Supelcoport（Supelco, Bellefonte, USA）を用いて６
０℃でガスクロマトグラフィーを行う。以下の定性的組
成が明らかとなった：マンノース、ガラクトース、ミオ
−イノシトールおよびグルコサミン。
【００４８】d) 実施例３a)および３e)で得られた構造
物をc)にと同様、ＨＦ（水中６０％）および４Ｍ ＨＣ
ｌを用いて１００℃で１６時間加水分解した。アミノ酸
分析機（Biotronic, ＬＣ ６００１）で分離したところ
以下の成分が明らかとなった：アスパラギン酸、Ｎ
Ｈ3、エタノールアミンおよびグルコサミン。
物をc)にと同様、ＨＦ（水中６０％）および４Ｍ ＨＣ
ｌを用いて１００℃で１６時間加水分解した。アミノ酸
分析機（Biotronic, ＬＣ ６００１）で分離したところ
以下の成分が明らかとなった：アスパラギン酸、Ｎ
Ｈ3、エタノールアミンおよびグルコサミン。
【００４９】加水分解条件、アスパラギン酸とＮＨ3の
割合および実施例３a)の結果からして、自然ホスホイノ
シトール−グリカン−ペプチドに存在するアミノ酸はア
スパラギンである。
割合および実施例３a)の結果からして、自然ホスホイノ
シトール−グリカン−ペプチドに存在するアミノ酸はア
スパラギンである。
【００５０】実施例５ 本発明によるホスホイノシトール−グリカン−ペプチド
（ＰＧＰ）の生物学的活性をラットから解剖により取り
出した横隔膜片および脂肪細胞を用いて測定する。
（ＰＧＰ）の生物学的活性をラットから解剖により取り
出した横隔膜片および脂肪細胞を用いて測定する。
【００５１】“ＰＩＧ”という用語は実施例３d)および
３e)で得られるペプチドを含まないホスホイノシトール
グリカンを意味し；“ＰＩＧ−Ｎ”は実施例３a)および
３e)で得られるアスパラギンを有するホスホイノシトー
ルグリカンを意味し；“ＰＩＧ−ＮＣＹ”は実施例３b)
および３e)で得られるペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
を有するホスホイノシトールグリカンを意味し；“ＰＩ
Ｇ−ＮＣＹＥ”は実施例３c)および３e)で得られるペプ
チドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを有するホスホイ
ノシトールグリカンを意味し；“ＰＩＧ−ＮＣＹ（ｎ
ａ）”は、亜硝酸で分解された実施例３b)および３e)で
得られる物質を意味する（実施例３ｇ参照)。“基礎”
という用語は無刺激時の活性を表わし、インスリンはヒ
トインスリンを表わし、そしてdmpは1分間あたりの放射
崩壊（radioactive disintegration）を表わす。
３e)で得られるペプチドを含まないホスホイノシトール
グリカンを意味し；“ＰＩＧ−Ｎ”は実施例３a)および
３e)で得られるアスパラギンを有するホスホイノシトー
ルグリカンを意味し；“ＰＩＧ−ＮＣＹ”は実施例３b)
および３e)で得られるペプチドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
を有するホスホイノシトールグリカンを意味し；“ＰＩ
Ｇ−ＮＣＹＥ”は実施例３c)および３e)で得られるペプ
チドＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを有するホスホイ
ノシトールグリカンを意味し；“ＰＩＧ−ＮＣＹ（ｎ
ａ）”は、亜硝酸で分解された実施例３b)および３e)で
得られる物質を意味する（実施例３ｇ参照)。“基礎”
という用語は無刺激時の活性を表わし、インスリンはヒ
トインスリンを表わし、そしてdmpは1分間あたりの放射
崩壊（radioactive disintegration）を表わす。
【００５２】ラットからの脂肪細胞の調製は次のように
して行った：副睾丸（ウイスターラット、１６０〜１８
０ｇ、食餌制限なし）からの脂肪組織をコラゲナーゼで
消化し、そして得られる単離脂肪細胞を浮遊により数回
洗浄する。
して行った：副睾丸（ウイスターラット、１６０〜１８
０ｇ、食餌制限なし）からの脂肪組織をコラゲナーゼで
消化し、そして得られる単離脂肪細胞を浮遊により数回
洗浄する。
【００５３】ラットからの横隔膜片の調製：半横隔膜
（ウイスターラット、６０〜７０ｇ、食餌制限なし）か
ら組織小片（直径５mm）を抜き取りそして数回洗浄し
た。
（ウイスターラット、６０〜７０ｇ、食餌制限なし）か
ら組織小片（直径５mm）を抜き取りそして数回洗浄し
た。
【００５４】ラット脂肪細胞におけるインスリンレセプ
ターを失活させるために、細胞を１０〜４０μg／mlの
トリプシンで処理する。プロテアーゼ阻害剤を添加後、
細胞を浮遊により２回洗浄し、そしてインキュベーショ
ンを３７℃で１５分間続ける。次にこれらの細胞をホス
ホイノシトール−グリカン−ペプチドによる脂肪生成刺
激テストに用いる。インスリンを用いた対照インキュベ
ーションは、トリプシン処理細胞がインスリンにより刺
激できる脂肪生成を極くわずかしか示さない、従って極
めて限られた数の機能性インスリンレセプターしか示さ
ないことを示す。
ターを失活させるために、細胞を１０〜４０μg／mlの
トリプシンで処理する。プロテアーゼ阻害剤を添加後、
細胞を浮遊により２回洗浄し、そしてインキュベーショ
ンを３７℃で１５分間続ける。次にこれらの細胞をホス
ホイノシトール−グリカン−ペプチドによる脂肪生成刺
激テストに用いる。インスリンを用いた対照インキュベ
ーションは、トリプシン処理細胞がインスリンにより刺
激できる脂肪生成を極くわずかしか示さない、従って極
めて限られた数の機能性インスリンレセプターしか示さ
ないことを示す。
【００５５】ラット横隔膜のインスリンレセプターを失
活させるために、組織片をＫＲＨ緩衝液（５０μg／ml
テトラデカノイルホルボールアセテートが共存する０.
１mMグルコース）中、２５℃でＯ2を連続的に通じなが
ら９０分間インキュベートする。それら組織片を次いで
ＫＲＨ緩衝液で２回洗浄しそして関連のテストに用い
る。
活させるために、組織片をＫＲＨ緩衝液（５０μg／ml
テトラデカノイルホルボールアセテートが共存する０.
１mMグルコース）中、２５℃でＯ2を連続的に通じなが
ら９０分間インキュベートする。それら組織片を次いで
ＫＲＨ緩衝液で２回洗浄しそして関連のテストに用い
る。
【００５６】以下の実験においてインスリンレセプター
を失活させた組織または細胞を用いて得られた実験結果
は各々について括弧に示されている。以下のテストのい
ずれにおいてもＰＩＧ−ＮＣＹＥは作用を示さない。
を失活させた組織または細胞を用いて得られた実験結果
は各々について括弧に示されている。以下のテストのい
ずれにおいてもＰＩＧ−ＮＣＹＥは作用を示さない。
【００５７】a) 糖原形成 このテストは筋細胞においてインスリンにより刺激され
得る、そして原形質膜を通してのグルコース輸送、およ
び機能的インスリンシグナル伝導カスケードを含むグル
コースからグリコゲンへの転化を包含する糖原形成を測
定するものである。
得る、そして原形質膜を通してのグルコース輸送、およ
び機能的インスリンシグナル伝導カスケードを含むグル
コースからグリコゲンへの転化を包含する糖原形成を測
定するものである。
【００５８】横隔膜片をＫＲＨ緩衝液中、インスリンお
よびＰＧＰの存在下または非存在下に３７℃で１５分間
５０μM Ｄ−〔Ｕ−14Ｃ〕グルコースと共にインキュベ
ートする。媒質を吸引により除去し、次いで組織片を十
分洗浄し、−７０℃で凍結し、次いでPolytronホモジナ
イザー中、２℃でホモジナイズする。そのホモジネート
を遠心分離（２,０００ｇ）し、そして上清をビペット
で濾紙に移す。形成されたグリコゲンを測定するため
に、それらフィルターをＴＣＡ（５％）中に移し、エタ
ノールおよびアセトンで洗浄し、乾燥し、そしてそれら
の放射能をシンチレーション測定により測定する（〔14
Ｃ〕グリコゲン〔dmp・１０-3〕)。ホスホイノシトール
−グリカン−ペプチドの単位は実施例３f)において定義
された任意単位である。
よびＰＧＰの存在下または非存在下に３７℃で１５分間
５０μM Ｄ−〔Ｕ−14Ｃ〕グルコースと共にインキュベ
ートする。媒質を吸引により除去し、次いで組織片を十
分洗浄し、−７０℃で凍結し、次いでPolytronホモジナ
イザー中、２℃でホモジナイズする。そのホモジネート
を遠心分離（２,０００ｇ）し、そして上清をビペット
で濾紙に移す。形成されたグリコゲンを測定するため
に、それらフィルターをＴＣＡ（５％）中に移し、エタ
ノールおよびアセトンで洗浄し、乾燥し、そしてそれら
の放射能をシンチレーション測定により測定する（〔14
Ｃ〕グリコゲン〔dmp・１０-3〕)。ホスホイノシトール
−グリカン−ペプチドの単位は実施例３f)において定義
された任意単位である。
【００５９】表１に結果を示す：
【表１】
【００６０】b) グリコゲン合成 このテストは、機能的インスリンシグナル伝導カスケー
ドを含む、インスリンにより刺激され得る、活性化グル
コース（ＵＤＰ−グルコース）のグリコゲンへの転化
（グリコゲンシンターゼ活性）を測定する。グルコース
輸送とグルコース活性化はバイパスされる（ことの点が
a)のグリコゲン合成測定と異なる)。
ドを含む、インスリンにより刺激され得る、活性化グル
コース（ＵＤＰ−グルコース）のグリコゲンへの転化
（グリコゲンシンターゼ活性）を測定する。グルコース
輸送とグルコース活性化はバイパスされる（ことの点が
a)のグリコゲン合成測定と異なる)。
【００６１】横隔膜片をインスリンおよびＰＧＰの存在
下または非存在下に３７℃で３０分間Ｄ−グルコース
（０.１mM）と共にインキュベートする。ホモジネート
を調製しそして遠心分離（２０,０００×ｇ）する。そ
の上清を０.１mMまたは１０mMグルコース６−ホスフェ
ートの存在下に３７℃で６０分間Ｕ−〔14Ｃ〕ＵＤＰ−
グルコース（０.３mM）と共にインキュベートする。そ
れら混合物を濾紙に移し、そしてそれらフィルターを前
述の如く処理する。グリコゲンシンターゼ活性はＩ形の
酵素（グルコース６−ホスフェートから独立、脱ホスホ
リル化、ホモジネート中の活性酵素量に相当）とＤ形の
酵素（グルコース６−ホスフェートに依存、ホスホリル
化、ホモジネート中の活性化可能酵素の総量に相当）の
間の割合として算出される（〔14Ｃ〕グリコゲン 〔dmp
・１０-3〕)。
下または非存在下に３７℃で３０分間Ｄ−グルコース
（０.１mM）と共にインキュベートする。ホモジネート
を調製しそして遠心分離（２０,０００×ｇ）する。そ
の上清を０.１mMまたは１０mMグルコース６−ホスフェ
ートの存在下に３７℃で６０分間Ｕ−〔14Ｃ〕ＵＤＰ−
グルコース（０.３mM）と共にインキュベートする。そ
れら混合物を濾紙に移し、そしてそれらフィルターを前
述の如く処理する。グリコゲンシンターゼ活性はＩ形の
酵素（グルコース６−ホスフェートから独立、脱ホスホ
リル化、ホモジネート中の活性酵素量に相当）とＤ形の
酵素（グルコース６−ホスフェートに依存、ホスホリル
化、ホモジネート中の活性化可能酵素の総量に相当）の
間の割合として算出される（〔14Ｃ〕グリコゲン 〔dmp
・１０-3〕)。
【００６２】表２に結果を示す：
【表２】
【００６３】c) 脂肪生成 このテストは、グルコース輸送および、インスリンシグ
ナル伝導カスケードを含むトリグリセライド（グリセロ
ール３−Ｐ合成、エテスル化）／燐脂質／脂肪酸合成を
必要とする、グルコースのトルエン可溶生成物（トリグ
リセライド、燐脂質、脂肪酸）へのインスリンにより刺
激され得る転化を測定するものである。
ナル伝導カスケードを含むトリグリセライド（グリセロ
ール３−Ｐ合成、エテスル化）／燐脂質／脂肪酸合成を
必要とする、グルコースのトルエン可溶生成物（トリグ
リセライド、燐脂質、脂肪酸）へのインスリンにより刺
激され得る転化を測定するものである。
【００６４】ラット脂肪細胞をＫＲＨ緩衝液中、インス
リンおよびＰＧＰの存在下または非存在下に３７℃で９
０分間Ｄ−〔３−3Ｈ〕グルコース（０.２mMまたは１mM
の最終濃度）と共にインキュベートする。それら細胞を
トルエン可溶性シンチレーションカクテルの添加により
破砕し、そして脂質を水溶性生成物およびインキュベー
ション媒質から分離する。相分離後、脂質に取り込まれ
た放射能を水性相を除かずにそのままシンチレーション
測定により測定する（〔3Ｈ〕脂質〔dmp・１０ -3〕)。
リンおよびＰＧＰの存在下または非存在下に３７℃で９
０分間Ｄ−〔３−3Ｈ〕グルコース（０.２mMまたは１mM
の最終濃度）と共にインキュベートする。それら細胞を
トルエン可溶性シンチレーションカクテルの添加により
破砕し、そして脂質を水溶性生成物およびインキュベー
ション媒質から分離する。相分離後、脂質に取り込まれ
た放射能を水性相を除かずにそのままシンチレーション
測定により測定する（〔3Ｈ〕脂質〔dmp・１０ -3〕)。
【００６５】表３に結果を示す。
【表３】
【００６６】d) 固有グルコース輸送活性 脂肪細胞をホモジネーション緩衝液（２０mM トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）／ＨＣ
ｌ、pH７.４、１mM ＥＤＴＡ、０.２５Ｍ スクロース）
中で２回洗浄し次いで２０mlの同緩衝液中、４℃でホモ
ジナイズする（テフロン乳棒付きガラス製ホモジナイザ
ー）ことにより単離原形質膜ベジクル（vesicles）をラ
ット脂肪細胞から得る（実施例５参照)。
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）／ＨＣ
ｌ、pH７.４、１mM ＥＤＴＡ、０.２５Ｍ スクロース）
中で２回洗浄し次いで２０mlの同緩衝液中、４℃でホモ
ジナイズする（テフロン乳棒付きガラス製ホモジナイザ
ー）ことにより単離原形質膜ベジクル（vesicles）をラ
ット脂肪細胞から得る（実施例５参照)。
【００６７】そのホモジネートを遠心分離（１６,００
０×ｇ、１５分間）し、そして沈降物を同緩衝液に懸濁
しそして再び遠心分離する。沈降物を５mlのホモジナイ
ゼーション緩衝液に懸濁し、そしてスクロースクッショ
ン（１.１２Ｍ スクロース、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、pH７.４、１mM ＥＤＴＡ）に重層し、そして遠心分
離（100,000×ｇ、７０分間）後、原形質膜ベジクルを
含む中間相（interphase）をシリングで除去し、４５ml
の緩衝液で希釈しそして再び遠心分離する（４８,００
０×ｇ、４５分間)。沈降物を１０mlの緩衝液に懸濁
し、再び遠心分離し、そして再び３mlの緩衝液に懸濁す
る。
０×ｇ、１５分間）し、そして沈降物を同緩衝液に懸濁
しそして再び遠心分離する。沈降物を５mlのホモジナイ
ゼーション緩衝液に懸濁し、そしてスクロースクッショ
ン（１.１２Ｍ スクロース、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、pH７.４、１mM ＥＤＴＡ）に重層し、そして遠心分
離（100,000×ｇ、７０分間）後、原形質膜ベジクルを
含む中間相（interphase）をシリングで除去し、４５ml
の緩衝液で希釈しそして再び遠心分離する（４８,００
０×ｇ、４５分間)。沈降物を１０mlの緩衝液に懸濁
し、再び遠心分離し、そして再び３mlの緩衝液に懸濁す
る。
【００６８】単離原形質膜ベジクルをインスリン／ＰＧ
Ｐの存在下または非存在下に２５℃で３０分間インキュ
ベートする。それらベジクルを次いで同じ比放射能を有
する５０μM Ｄ−〔３−3Ｈ〕−グルコースおよびＬ−
〔１−14Ｃ〕グルコースと共に２５℃で９０秒間インキ
ュベートする。それら混合物をニトロセルロースフィル
ターを通して速かに吸引濾過する。それらフィルターを
十分洗浄しそして乾燥する。それらの放射能を液体シン
チレーション測定により測定する。特異的輸送（Ｄ−〔
3Ｈ〕グルコース／Ｌ−〔14Ｃ〕グルコース〔dmp・１０
-3〕）を〔3Ｈ〕放射能と〔14Ｃ〕放射能の差として計
算する。
Ｐの存在下または非存在下に２５℃で３０分間インキュ
ベートする。それらベジクルを次いで同じ比放射能を有
する５０μM Ｄ−〔３−3Ｈ〕−グルコースおよびＬ−
〔１−14Ｃ〕グルコースと共に２５℃で９０秒間インキ
ュベートする。それら混合物をニトロセルロースフィル
ターを通して速かに吸引濾過する。それらフィルターを
十分洗浄しそして乾燥する。それらの放射能を液体シン
チレーション測定により測定する。特異的輸送（Ｄ−〔
3Ｈ〕グルコース／Ｌ−〔14Ｃ〕グルコース〔dmp・１０
-3〕）を〔3Ｈ〕放射能と〔14Ｃ〕放射能の差として計
算する。
【００６９】表４に結果を示す：
【表４】
【００７０】e) タンパク質合成 タンパク質合成の刺激は（成長ホルモンとして）インス
リンの長期的作用に属する点で前述の諸測定において測
定されたインスリンの代謝作用と異なる。そのアッセイ
はインスリンシグナルカスケードを含む。
リンの長期的作用に属する点で前述の諸測定において測
定されたインスリンの代謝作用と異なる。そのアッセイ
はインスリンシグナルカスケードを含む。
【００７１】ラット脂肪細胞をロイシンを欠くダルベッ
コ修飾必須培地（Dulbecco's modified essential medi
um; DMEM）中の一次培養においてインスリンおよびＰＧ
Ｐの存在下に３７℃で４時間５０μM Ｌ−〔3Ｈ〕−ロ
イシンと共にインキュベートする。細胞をオイル遠心分
離法により周囲培地から分離し、そして水と相容性のあ
るシンチレーションカクテルと混合する。遠心分離後、
タンパク質沈殿をアセトンで洗浄し、１％ ＳＤＳに懸
濁しそしてシンチレーションカクテルと混合する。シン
チレーション測定による細胞随伴放射能は、タンパク質
合成および原形質膜を通してのアミノ酸輸送の尺度とし
て役立つ（〔3Ｈ〕ロイシン〔dmp・１０ -4〕)。
コ修飾必須培地（Dulbecco's modified essential medi
um; DMEM）中の一次培養においてインスリンおよびＰＧ
Ｐの存在下に３７℃で４時間５０μM Ｌ−〔3Ｈ〕−ロ
イシンと共にインキュベートする。細胞をオイル遠心分
離法により周囲培地から分離し、そして水と相容性のあ
るシンチレーションカクテルと混合する。遠心分離後、
タンパク質沈殿をアセトンで洗浄し、１％ ＳＤＳに懸
濁しそしてシンチレーションカクテルと混合する。シン
チレーション測定による細胞随伴放射能は、タンパク質
合成および原形質膜を通してのアミノ酸輸送の尺度とし
て役立つ（〔3Ｈ〕ロイシン〔dmp・１０ -4〕)。
【００７２】表５に結果を示す。
【表５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:26 99:28 (72)発明者 シユテフアン・ミユルナー ドイツ連邦共和国デー−6203ホーホハイ ム・アム・マイン．フリードリヒ−エーベ ルト−シユトラーセ43
Claims (12)
- 【請求項１】 アデノシン３′,５′−サイクリックモ
ノホスフェート結合性タンパク質の分解により取得し得
るホスホイノシトール−グリカン−ペプチドおよび／ま
たはその生理学的に許容される塩。 - 【請求項２】 ホスホイノシトールグリカン、エタノー
ルアミン、トリペプチドおよび／またはホスホイノシト
ール−グリカン−ペプチドの生理学的に許容される塩を
含みそしてインスリン様作用を有する請求項１記載のホ
スホイノシトール−グリカン−ペプチド。 - 【請求項３】 少なくとも一つのグルコサミン、ガラク
トース、マンノース、ミオ−イノシトール、燐酸、エタ
ノールアミン残基およびＡｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒという
配列を有するペプチド残基を有し、そしてインスリン様
作用を有する請求項１または２記載のホスホイノシトー
ル−グリカン−ペプチド。 - 【請求項４】 少なくともホスホイノシトールグリカン
またはホスホイノシトールグリカンとペプチド残基とし
てのアスパラギンを含み、そしてインスリン様作用を有
する請求項１〜３のいずれかに記載のホスホイノシトー
ル−グリカン−ペプチド。 - 【請求項５】 a) アデノシン３′,５′−サイクリッ
クモノホスフェート結合性タンパク質を含有する生物を
用い、 b) そのアデノシン３′,５′−サイクリックモノホス
フェート結合性タンパク質を単離し、 c) アデノシン３′,５′−サイクリックモノホスフェ
ート結合性タンパク質からタンパク質部分を除去し、そ
して得られるグリコシル−ホスファチジルイノシトール
−ペプチドを場合により精製し、 d) 工程c)で得られた生成物からモノ−またはジアシル
グリセロールを除去し、そして e) 工程d)で生成したホスホイノシトール−グリカン−
ペプチドを単離し、そして場合により相当する生理学的
に許容される塩に変えることより成る請求項１〜４のい
ずれかに記載のホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドの製造方法。 - 【請求項６】 酵母細胞が用いられそしてタンパク質部
分が酵素的に除去される請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 工程c)およびd)の順序が逆である請求項
５または６記載の方法。 - 【請求項８】 サッカロマイセス・セレビシエＤＳＭ
６６４９、エンドプロティナーゼＧｌｕ−Ｃ、ＥＣ ３.
４.２１.１９および／またはホスホリパーゼＣ、ＥＣ
３.１.１.５が用いられる請求項５〜７のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項９】 有効量の請求項１〜４のいずれかに記載
のホスホイノシトール−グリカン−ペプチドを含有する
医薬。 - 【請求項１０】 インスリン、好ましくはウシ、ブタま
たはヒトインスリンを含有する請求項９記載の医薬。 - 【請求項１１】 少なくとも一つの、請求項１〜４のい
ずれかに記載のホスホイノシトール−グリカン−ペプチ
ドを、生理学的に許容し得るビヒクルおよび場合により
適当な添加剤、活性物質および／または補助物質と共に
適当な投与剤形に転化することにより成る請求項９また
は１０に記載の医薬の調製方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれかに記載のホス
ホイノシトール−グリカン−ペプチドの真性糖尿病また
は非インスリン依存性糖尿病治療用医薬の調製のための
使用方法。
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