FI102842B - Menetelmä fosfoinositoliglykaanipeptidin valmistamiseksi, jolla on ins uliinin kaltainen vaikutus - Google Patents

Description

102842

Menetelmä fosfoinositollglykaanlpeptidin valmistamiseksi, jolla on insuliinin kaltainen vaikutus

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisen fosfoinositoliglykaanipeptidin valmistamiseksi, joka sisältää fosfoinositoliglykaania, johon on kytketty aminohappo tai tripeptidi ja jolla on insuliinin kaltainen vaikutus, ja/tai fosfoinositoliglykaanipeptidin fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi. Fos-10 foinositoliglykaanipeptidejä voidaan käyttää lääkkeenä diabetes mellituksen tai insuliinista riippumattoman diabeteksen hoitoon.

Insuliinilla on joukko vaikutuksia insuliinille herkkiin kudoksiin. Yksi silmiinpistävä vaikutus on nopea 15 glukoositason lasku nisäkkäillä käytettäessä insuliinia.

Tämä tapahtuu sitä kautta, että lihas- ja rasvasolut ottavat nopeasti glukoosia verestä. Insuliini aktivoi lisäksi glykogeenisyntetaasia ja inhiboi lipolyysiä. Insuliini ohjaa proteiinisynteesiä aminohapoista, voimistaa pyru-20 vaattidehydrogenaasin ja fosfofruktokinaasin induktiota ja estää tiettyjen glukoneogeneesiin liittyvien entsyymien, kuten pyruvaattikarboksylaasin ja fruktoosi-1,6-difosfa-taasin, muodostumista.

Tyyppiä II oleva diabetes, insuliinista riippumaton 25 diabetes, liittyy ääreiskudosten, kuten lihas- ja rasvaku dosten insuliiniresistenssiin. Sitä kautta heikentyneen glukoosin hyväksikäytön aiheuttaa glukoosin kuljetuksen insuliinistimulaation puuttuminen ja sitä seuraavat meta-boliset prosessit (glukogeneesi, lipogeneesi). Tämä monin-30 kertainen resistenssi voidaan selittää reseptoritasolla f - tai sitä myöhemmällä tasolla, ts. ennen "toisen lähetin" ("second messenger") muodostusta, esiintyvällä vialla [Garvey, Diabetes/Metabolism Reviews 5 (1989) 727 - 742].

Tätä ennen ei ole tunnettu vaikuttavia aineita, 35 jotka kiertävät insuliinireseptorit ja joilla on siitä huolimatta insuliinin kaltainen vaikutus.

· 2 102842

Nyt on havaittu, että fosfoinositoliglykaanipepti-deillä, joita voidaan valmistaa 3',5'-syklisestä adenosii-nimonofosfaattia (cAMPttä) sitovasta proteiinista, on in vitro ja myös insuliiniresistensseihin kudoksiin insulii-5 nin kaltainen vaikutus.

Biochem. Biophys. Res. Comm. 164 (2) (1989) (Lisan-ti et ai.) kuvaa GPI-proteiineja, jotka saadaan lohkaisemalla fosfolipaasi C:llä. Tässä ei suoriteta prote-aasikäsittelyä. Proteaasikäsittelyn johdosta esillä olevan 10 keksinnön mukaisesti valmistettavat yhdisteet ovat uusia verrattuna mainittuun julkaisuun. Edelleen julkaisussa ei ole minkäänlaista mainintaa tai viittausta siihen, että esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä olisi insuliinin kaltainen vaikutus.

15 166 (2) (1990) 765-771 (Bruni et ai.), NATO ASI

Series H 44 (1990) 167-179 (Varela et ai.) kuvaa fosfo- oligosakkarideja. Nämä yhdisteet eroavat esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavista yhdisteistä siinä, että niistä puuttuu aminohappo- tai tripeptidiryhmä. Esil-20 lä olevan hakemuksen esimerkeissä on osoitettu, että va paalla fosfoinositoliglykaanipeptidillä (PIG), jossa ei ole aminohapporyhmää, ei ole mitään insuliinin kaltaista vaikutusta.

EP 245 965 kuvaa yhdisteitä, joissa ei ole mitään • 25 proteiiniosaa. Näin ollen ne eroavat oleellisesti esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavista yhdisteistä.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä fos-foinositoliglykaanipeptidien valmistamiseksi pilkkomalla 31,5'-syklistä adenosiinimonofosfaattia sitovaa proteii-.30 nia. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Insuliiniresistentillä kudoksella tarkoitetaan esimerkiksi rotan rasvasoluja, joissa ei enää ole insuliini-reseptoreja. cAMP-sitojaproteiinit ovat proteiineja, jotka 35 sitovat 3',5'-syklistä adenosiinimonofosfaattia.

• « 3 102842 Tässä kuvattua fosfoinositoliglykaanipeptidiä koskevat tähänastiset rakennetiedot viittavat fosfoinosito-liin, jossa on galaktoosia, glukosamiinia ja mannoosia sisältävä glykaaniosa, joka on kytkeytynyt peptidin kar-5 boksyylipäähän amidi sidoksella fosforyylietanoliamiiniryh- män kautta. Sitä esiintyy samanlaisena rakenteena "kalvo-ankkureina" toimivien kovalenttisesti sitoutuneiden glyko-lipidien sisäpuolella ylempien eukaryoottien glypoituneis- sa plasmakalvoproteiineissa [Roberts et ai., J. Biol. 10 Chem. 263 (1983) 18 776 - 18 784]. Glykaaniryhmä sisältää glukosamiinia, galaktoosia, mannoosia ja vähintään kaksi fosfaattiryhmää molekyyliä kohden. Peptidissä on sekvenssi Asn-Cys-Tyr-, ja se sitoutuu asparagiinihapon karboksyyli-päästä amidisidoksella fosfoinositoliglykaanin aminoryh-15 mään. Fosfoinositoliglykaaniosa on välttämätön aktiivisuu delle. Peptidi voimistaa insuliinin kaltaista vaikutusta. Lisäksi on osoittautunut, että insuliinin kaltaista vaikutusta ei ole pelkästään täydellisellä fosfoinositoligly-kaanipeptidillä vaan myös osarakenteilla, esimerkiksi fos-20 foinositoliglykaaniin sitoutuneilla lyhentyneillä peptidi- sekvensseillä tai pelkällä fosfoinositoliglykaanilla ilman peptidiä.

Keksinnön mukaisen fosfoinositoliglykaanipeptidin soveltuvia fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja ovat esi-25 merkiksi alkali-, maa-alkali- tai ammoniumsuolat samoin kuin fysiologisesti hyväksyttävien orgaanisten ammonium- - tai trietyyliamiiniemästen suolat.

Keksinnön mukaisesti fosfoinositoliglykaanipeptide-jä valmistetaan esimerkiksi 30 a) käyttämällä organismeja, jotka sisältävät cAMP- . sitojaproteiinia, b) eristämällä cAMP-sitojaproteiini, c) lohkaisemalla irti cAMP-sitojaproteiinin prote-iiniosa ja puhdistamalla muodostunut glykosyylifosfatidyy- 35 li-inositolipeptidi, • · 4 102842 d) lohkaisemalla menettelyvaiheessa c) saadusta tuotteesta mono- tai diasyyliglyseriini ja e) eristämällä menettelyvaiheessa d) saatu fosfo-inositoliglykaanipeptidi.

5 cAMP-sitojaproteiinia voidaan saada lukuisista or- '

ganismeista, esimerkiksi mikro-organismeista, kasveista, sienistä tai eläinten elimistä. Soveltuva lähde on esimerkiksi hiiva Saccharomyces cerevisiae, erityisesti DSM

6649.

10 cAMP-sitojaproteiinin valmistus käyttämällä Saccha romyces cerevisiaeta tapahtuu fermentoimalla ravintoliuoksessa, joka sisältää hiili- ja typpilähdettä samoin kuin tavanomaisia epäorgaanisia suoloja. cAMP-proteiini rikastetaan edullisesti hiivan plasmakalvoon.

15 Menettelyvaiheessa a) on paras menettelytapa seu- raava: cAMP-proteiinin muodostuminen Saccharomyces cerevi- siaessa etenee hyvin Saccharomyces cerevisiaelle tavanomaisesti käytettävissä ravintoliuoksissa. Kasvatus tapahtuu aerobisesti, siis esimerkiksi pinnanalaisesti ravis-20 telien tai sekoittaen ravistuspulloissa tai fermentoreis- sa, mahdollisesti syöttäen ilmaa tai happea. Se voidaan tehdä suunnilleen lämpötila-alueella 18 - 35 °C, edullisesti noin 25 - 30 °C, erityisesti 20 - 30 °C. pH:n tulisi olla alueella 2-8, edullisesti 3-7. Hiivaa viljellään 25 näissä olosuhteissa yleensä suunnilleen pitoisuuteen 107 solua/ml ravintoliuosta.

Menettelyvaiheessa b) on parasta menetellä sillä tavalla, että cAMP-sitojaproteiinin eristämiseksi hiivasolut erotetaan ravintoalustasta ja pestään puskurilla.

30 Eristys tehdään esimerkiksi Mullerin ja Bandlowin kuvaa- maila tavalla [Biochemistry 28 (1989) 9 957 - 9 967] . Sen tekemiseksi hiivasolut muutetaan ensymaattisesti (tsymoly-aasilla) sferoplasteiksi ja hienonnetaan homogenaattorilla proteaasi-inhibiittoreiden läsnä ollessa kylmässä (0 -35 4 °C). Hiivalysaatit sentrifugoidaan ja solusakka pestään s 102842 puskurilla ja sentrifugoidaan uudelleen. Supernatantit yhdistetään ja puhdistetaan PercollR-gradientissa (25 % Percollia) ja sakkaroosigradientissa (15 - 28 % sakkaroosia) . Näillä sentrifugointivaiheilla erotetaan sytoplasma, 5 plasmakalvo, mikrosomit ja mitokondriot toisistaan.

Plasmakalvof raktiosta sidotaan cAMP-sitojaproteiini esimerkiksi N6-(aminoetyyli)-cAMP-sefaroosipylväällä ja cAMP-sitojaproteiini eluoidaan pylväästä cAMP:llä ja poistetaan siitä suolat.

10 Menettelyvaiheessa c) on paras menetellä sillä ta valla, että lohkaistaan irti cAMP-sitojaproteiinin prote-iiniosa. Entsymaattiseen lohkaisuun käytetään esimerkiksi proteaaseja, kuten pronaasia, endoproteaasi Lys-C:tä (Ly-sobacter enzymogenes) tai proteaasia V8 (Staphylococcus 15 aureus). Sillä tavalla saadaa aikaan proteiiniosan hajo aminen. Proteaasilla V8 saadaan glykosyylifosfatidyyli-inositolia, jossa on peptidisekvenssi Asn-Cys-Tyr; inku-bointi pronaasiproteaasin kanssa antaa tulokseksi glyko-syylifosfatidyyli-inositolipeptidiä, jonka peptidiosa 20 koostuu ainoastaan Asn-aminohaposta.

Proteaasi saostetaan esimerkiksi hapoilla, kuten trikloorietikkahapolla. Glykosyylifosfatidyyli-inositoli-peptidit erotetaan proteaaseista sentrifugoimalla, konsentroidaan fenyylisefaroosipylväällä ja puhdistetaan ohut-25 kerroskromatografiällä.

Vaiheessa d) paras menettelytapa on lohkaista entsymaattisesti glykosyylifosfatidyyli-inositolipeptidiin sitoutunut mono- tai diasyyliglyseriiniryhmä ja vapattaa siten fosfoinositoliglykaanipeptidi. Entsymaattiseen loh-30 kaisuun käytetään esimerkiksi fosfolipaaseja, kuten fosfa- - tidyyli-inositolille spesifistä fosfolipaasi C:tä (Bacil lus cereus). Sillä tavalla saadaan irrotetuksi mono- tai diasyyliglyseriiniryhmä, joka on sitoutunut myoinositolin fosfaattiryhmän kautta. Glyseriinipitoinen ryhmä ei lohkea 35 proteaasikäsittelyllä menettelyvaiheessa c) . Menettelyvai- • t 102842 6 heet c) ja d) voidaan toteuttaa myös päinvastaisessa järjestyksessä.

Entsymaattiset reaktiot toteutetaan menettelyvai-heissa c) ja d) entsymaattiselle reaktiolle suotuisissa 5 olosuhteissa. Ammattimiehen on helppo määrätä optimaaliset reaktio-olosuhteet mainituille entsyymeille sopiviksi tiedettyjen reaktio-olosuhteiden perusteella.

Menettelyvaiheessa e) on paras menettelytapa saos-taa fosfolipaasit hapoilla, kuten trikloorietikkahapolla. 10 Fosfoinisotoliglykaanipeptidi erotetaan fosfolipaasista sentrifugoimalla, puhdistetaan Biogel P-4-pylväällä ja konsentroidaan ohutkerroselektroforeesilla.

Keksinnön mukaiset fosfoinositoliglykaanipeptidit ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat toimivat 15 ennen kaikkea vaikuttavina aineina farmseuttisissa valmis teissa diabetes mellituksen tai insuliinista riippumattoman sokeritaudin hoitamiseksi.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja fosfoinositoli-glykaanipeptidejä voidaan käyttää lääkkeissä, jotka sisäl-20 tävät vaikuttavan määrän fosfoinositoliglykaanipeptidiä ja/tai vähintään yhtä sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa liuotetussa, amorfisessa ja/tai kiteisessä muodossa .

Lääke on edullisesti injektioihin tarkoitettu liuos 25 tai suspensio, jonka pH on noin 3,0 - 9,0, edullisesti 5,0 - 8,5 ja joka sisältää sopivaa isotonisuuden aikaansaavaa ainetta, sopivaa säilytettä ja mahdollisesti soveltuvaa puskuria samoin kuin mahdollisesti hidastetun vapautumisen aikaansaavaan aineosaa (depot-aineosaa), kaikki 30 luonnollisesti steriilissä vesiliuoksessa tai suspensios- f .! sa. Valmisteen muut aineosat kuin vaikuttava aineosa muo- dostavat yhdessä valmisteen kantajan.

Soveltuvia isotonisuuden aikaansaavia aineita ovat esimerkiksi glyseriini, glukoosi, mannitoli, NaCl ja kal-35 sium- tai magnesiumyhdisteet, kuten esimerkiksi CaCl2 tai

MgCl2.

'1 · 7 102842

Soveltuvia säilytteitä ovat esimerkiksi fenoli, m-kresoli, bentsyylialkoholi ja/tai p-hydroksibentsoehappo-esterit.

Puskuriaineina, erityisesti pH-arvon säätämiseksi 5 suunnilleen alueelle 5,0 - 8,5, voidaan käyttää esimerkik si natriumasetaattia, natriumsitraattia tai natriumfos-faattia. pH-arvon säätämiseen soveltuvat kuitenkin myös fysiologisesti haitattomat laimennetut hapot (tyypillisesti HC1) ja emäkset (tyypillisesti NaOH).

10 Lääkkeen vaikutusprofiilin vaihtelemiseksi voidaan joukkoon sekoittaa myös muunnettuja (EP-julkaisut 132 769 ja 132 770) ja/tai muuntamattornia insuliineja, edullisesti naudan, sian tai ihmisen insuliinia, erityisesti ihmisen insuliinia.

15 Lääke valmistetaan saattamalla fosfoinositoligly- kaanipeptidi ja/tai vähintään yksi sen fysiologisesti hyväksyttävä suola, mahdollisesti yhdessä muunnettujen ja/ tai muuntamattomien insuliinien (tai johdannaisten) kanssa, fysiologisesti haitattoman kantajan samoin kuin mah-20 dollisesti soveltuvien lisä- ja apuaineiden kanssa sopi vaan antomuotoon.

Keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1

Saccharomyces cerevisiae DSM 6649:n fermentointi 25 Saccharomyces cerevisiae DSM:ää viljellään aerobi sesti fermentorissa. Alusta sisältää seuraavat aineosat litrassa vettä:

Hiivauutetta 3 g 30 Glukoosia 1 g ; KH2P04: a 1 g NH4C1: a 1 g

CaCl2-2H20:a 0,5 g

NaCl:a 0,5 g 3 5 MgS04 -H20: a 0,6 g • · 102842 8

FeCl3:a 0,3 ml l-%:ista vesi- liuos ta

Maitohappoa 22 ml 90-%:ista liuos- 5 ta pH säädetään arvoon 5,5 KOH:lla. Ilmastus tehdää ilmalla, jota käytetään 1 1/1 fermentorin tilavuutta. Soluja kasvatetaan ravintoliuoksessa solutiheyteen 1 * 107 10 solua/ml; saanto on noin 3 g (märkäpaino)/1 ravintoliuos ta. Solut otetaan talteen sentrifugoimalla (5 min, 3000 - g) ja pestään fosfaattipuskurilla (pH 6).

Esimerkki 2 cAMP-sitojaproteiinin eristys 15 Esimerkin 1 mukaisesti saadut solut muutetaan ent symaattisesti (tsymolyaasi, 2 000, Seikagaku Kogyolo, Tokio) sferoplasteiksi ja hienonnetaan lasihomogenaattorilla (Arthur H. Thomas and Co.) lämpötilassa 0 °C. Seuraavat eristysvaiheet tehdään proteaasi-inhibiittoreiden [fenyy-20 limetaanisulfonyylifluoridi (PMSF), leupeptiini, aproti- niini, a2-makroglobuliini, trypsiini-inhibiitori; Boehrin-ger Mannheim) läsnä ollessa. Solulysaatti sentrifugoidaan (1 000 * g, 3 min, 4 °C), solusedimentti pestään SEM-pus- kurilla [0,25 mol/1 sakkaroosia, 0,5 mmol/1 etylee-25 nidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 20 mmol/1 3-(N-morfo- liini)-propaanisulfonihappo(MOPS) * KOH:a, pH 7,4) ja sentrifugoidaan uudelleen. Supernatantit yhdistetään ja sentrifugoidaan (18 000 * g, 15 min, 4 °C) PercollR-gradi- entissa (Pharmacia, Freiburg; 28 % Percollia, SEM-pusku-30 ria, 0,5 mg proteiinia/ml). Tässä gradietissa sytoplasma, plasmakalvo, mikrosomit ja mitokondriot erottuvat toisis-taan. Plasmakalvot jäävät gradientin ylimpään kolmannekseen. Ne poistetaan ruiskun avulla gradientista, laimennetaan viisinkertaisella tilavuudella SEM-puskuria ja 35 sentrifugoidaan (48 000 - g, 30 min, 4 °C) . Sedimentti suspendoidaan MOPS-puskuriin (5 mg proteiinia/ml) ja inku- 9 102842 boidaan n- [3H]-asetyylikonkanavaliini A:n kanssa [Amersham Buchler, Braunschweig; 1 mg proteiinia (55 μΟϊ) 500 μΐ-.ssa. MOPS-puskuria (Boehringer Mannheim; 20 mmol/1, pH 7,4), joka sisältää 0,5 mmol/1 EDTAa, 50 mmol/1 KCl:a, 5 mmol/1 5 CaCl2:a ja 200 μg naudan seerumialbumiinia (Behring Werke,

Marburg)] yliäänihauteessa lämpötilassa 4 °C 60 min. Kon-kanavaliini A -yhdiste toimii merkkiaineena. Suspensiot pipetoidaan sakkaroosigradientille (15 - 28 % sakkaroosia MOPS-puskurissa) ja sentrifugoidaan (kierrostaajus 10 25 000 min'1, 90 min, 4 °C, Beckmann SW 27 -roottori) . Sak- karoosigradientit fraktioidaan ja radioaktiiviset fraktiot (noin 23 % sakkaroosia) yhdistetään laimennetaan kolminkertaiseen tilavuuteen MOPS-puskurilla (50 mmol/1 konkana-valiini A:ta, Sigma Deisenhofen, 250 mmol/1 KCl:a) ja sen-15 trifugoidaan (200 000 * g, 60 min, 4 °C, Beckmann TL100 -roottori). Sedimentti pestään SEM-puskurilla (250 mmol/1 KCl:a), sentrifugoidaan ja suspendoidaan uudelleen KCl:a sisältämättömään SEM-puskuriin (2,5 mg proteiinia/ml).

Noin 500 μg plasmakalvoproteiineja liuotetaan pus-20 kuriin {25 mmol/1 MOPS*KOH:a, pH 7,0, 150 mmol/1 NaCl:a, 4 mmol/1 MgCl2:a, 0,4 mmol/1 EGTAa [etyleeniglykolibis(β-aminoetyylieetteri)tetraetikkahappoa], 0,5 mmol/1 DTT:tä (ditiotreitolia), 0,5 % deoksikolaattia, 0,1 mmol/1 MBX:ää (isobutyylimetyyliksantiinia) , 0,1 mmol/1 PMSFrää, 25 50 μπιοΐ/ΐ leupeptiiniä, 0,1 mmol/1 aprotiniinia (2 mg/ml)}. Liuos laitetaan 2 ml:n N6-(2-aminoetyyli)-cAMP-sefaroosipylväälle (Pharmacia, Freiburg), joka on tasapainotettu samalla puskurilla, lämpötilassa 4 °C. Pylväs pestään viidesti käyttämällä kullakin kerralla 2 ml puskuria 30 [25 mmol/1 MPOPS-KOH:a, pH 7,2, 100 mmol/1 Na-sitraattia, * 5 mmol/1 DTT:tä, 5 mmol/1 MgCl2:a, 150 mmol/1 NaClra, 250 mmol/1 sakkaroosia, 7,5 % etyleeniglykollia (Merck, Darmstadt), 10 % glyseriiniä, 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 1 mmol/1 IBMXrää). Eluointi tehdään lämpötilassa 35 4 °C käyttämällä 2 ml samaa puskuria, joka sisältää lisäk- • · 10 102842 si 100 μτηοΐ/ΐ cAMP:tä. Ensimmäisistä 250 ^l:sta eluaattia poistetaan suolat 1 ml:n Sephadex G-25-pylväällä, joka on tasapainotettu puskurilla (25 mmol/1 MOPS - K0H:a, pH 7,0, 50 mmol/1 KCl:a, 5 mmol/1 MgCl2:a, 10 mmol/1 DTT:tä, 5 50 μιηοΐ/ΐ EDTA, 50 μπιοΐ/ΐ PMSF:ää, 0,1 % deoksikolaattia, 5 % glyseriiniä). Materiaalia, josta poistettu suolat, inkuboidaan 30 min lämpötilassa 4 °C yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, joka sisältää 8 % polyetyleeniglykoli 4 000:a (Pharmacia, Freiburg) puskurissa (10 mmol/1 MOPS -10 K0H:a, pH 7,2, 1 mmol/1 EDTA). Kun on sentrifugoitu 15 min, sedimentti liuotetaan puskuriin (20 mmol/1 MOPS -KOH:a, pH 7,2, 1 mmol/1 EDTA, 100 μτηοΐ/ΐ PMSF:ää, 0,5 % deoksikolaattia; 2 mg proteiinia/ml).

Esimerkki 3 15 Fosfoglykaanipeptidien valmistus a) Hajotus pronaasilla (Streptomyces griseus; Boeh-ringer Mannheim): 100 μg:aa cAMP-sitojaproteiinia inkuboidaan 10 tuntia lämpötilassa 50 °C 1 ml:ssa liuosta, joka sisältää 0,1 mol/1 N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-2-20 etaanisulfonihappo(HEPES) - KOH:a (pH 8,0), 15 mmol/1

CaCl2:a, 1 % Triton X-100:a (Boehringer Mannheim) ja 450 μg/ml pronaasia. Kun on lisätty 1 % SDS:ää (natriumdo-dekyylisulfaattia), jatketaan inkubointia 7 tuntia lämpötilassa 50 °C toisen annoksen kanssa pronaasia. Automaat-25 tinen Edmann-hajotus osoittaa, että pronaasihajotus johtaa fosfoinositoliglykaaniin, jossa on etanoliamiinin amino-päähän amidisidoksella liittynyt asparagiini. Tästä fosfo-inositoliglykaanipeptidistä käytetään jatkossa merkintää PIG-N.

30 b) Hajotus endoproteinaasi Glu-C:llä, EC 3.4.21.19 ; (proteaasi V8; Staphylococcus aureus; Boehringer Mann heim) : Inkuboidaan 100 μg:aa cAMP-sitojaproteiinia 18 tuntia lämpötilassa 37 °C 1 ml:ssa seosta, joka sisältää 20 mmol/1 (NH4)2C03:a (pH 7,8), 0,5 % oktyyliglukosidia 35 (Boehringer Mannheim) ja 300 μg proteaasia V8.

11 102842

Automaattinen Edmann-hajotus osoittaa, että hajotus proteaasilla V8 johtaa fosfoinositoliglykaaniin, jossa on peptidi Asn-Cys-Tyr. Asparaginihapporyhmä liittyy karbok-sipäästään fosfoinositoliglykaaniin. Tripeptidin Asn-Cys-5 Tyr sisältävästä fosfoinositoliglykaaniyhdisteestä käyte tään jatkossa merkintää PIG-NCY.

c) Hajotus endoproteaasilla Lys-C (Lysobacter enzy-mogenes; Boehringer Mannheim) : Inkuboidaan 100 μgzaa cAMP-sitojaproteiinia 18 tuntia lämpötilassa 37 °C 0,5 ml:ssa 10 seosta, joka sisältää 50 mmol/1 (NH4)2C03:a (pH 8,2), 0,5 % oktyyliglukosidia (Boehringer Mannheim) ja 55 μg endopro-teaasia Lys-C.

Automaattinen Edmann-hajotus osoittaa, että endo-proteaasi Lys-C johtaa fosfoinositoliglykaaniin, jossa on 15 peptidi Asn-Cys-Tyr-Glu. Peptidin sitoutuminen fosfoinosi toliglykaaniin tapahtuu asparagiinin karboksyylipään kautta. Yhdisteestä käytetään jatkossa merkintää PIG-NCYE.

d) Karboksiterminaalisen aminohapon poistaminen: Pronaasilla hajotetulle cAMP-sitojaproteiinille (katso 20 kohta a) tehdään manuaalinen Edmann-hajotus. Syntyneestä aminohapottomasta fosfoinositoliglykaanista käytetään jatkossa merkintää PIG.

Proteolyyttisten hajotusten jälkeen proteaasit poistetaan saostamalla 5-%:isella trikloorietikkahapolla 25 (TCA). Kun on sentrifugoitu (15 min, 10 000 - g) konsent roidaan ja puhdistetaan supernatantissa olevat fosfoino-sitoliglykaanipeptidijohdannaiset samoin kuin Edmann-ha-jotuksella saatu fosfoinositoliglykaani sitomalla fenyyli-sefaroosipylvääseen. Kun pylväs on eluoitu 2-%:isella ok-30 tyylifenoli(etyleeniglykolieetterillä) (TX-100), puhdiste- - j taan fosfoinositoliglykaanipeptidijohdannaiset ohutkerros- kromatografisesti kahdella erilaisella liuotinjärjestel-mällä. Kun on tehty ensimmäinen ajo happamalla järjestelmällä (kloroformi, asetoni, metanoli, jääetikka, vesi 35 10:4:2:2:1), eluoidaan silikageelilevyllä (tyyppi 60) le- • · 102842 12 vityskohdan lähellä olevat fosfoinositoliglykaanipeptidit metanolilla ja tehdään sitten toinen kromatografia-ajo emäksisellä järjestelmällä (kloroformi, metanoli, ammoniakki, vesi 45:45:3,5:10). Fosfoinositoliglykaanipeptidi-5 johdannaiset eluoidaan uudelleen levyltä (Rf = 0,45) ja uu tetaan kloroformin ja metanolin seoksella (2:1). Orgaaninen faasi pestään ja haihdutetaan ja materiaali suspendoi-daan fosfaattipuskuriin, joka sisältää 0,5 % TX-100:a.

e) Kohdissa a) - d) saatuja fosfoinositoliglykaane- 10 ja tai fosfoinositoliglykaanipeptidejä inkuboidaan 10 yk sikön kanssa fosfatidyyli-inositolille spesifistä fosfoli-paasia C, EC 3.1.1.5, (Bacillus cereus; Sigma, Deisenho-fen) 0,2 ml:ssa seosta, joka sisältää 0,2 mol/1 kaliumfosfaattia (pH 7,2), 2 mmol/1 DTT:tä, 10 mmol/1 MgCl2:a, 15 50 mmol/1 NaCl:a ja 0,05 % TX-100:aa, 2 tuntia lämpötilas sa 37 °C. Kun on lisätty 10 mmol/1 EDTA, erotetaan hajoamistuotteet toisistaan ohutkerroskromatografisesti emäksisellä ajoliuosjärjestelmällä (katso kohta d). Levityskoh-dan välittömässä läheisyydessä oleva materiaali eluoidaan 20 levyltä ja siihen lisätään 2 % poly (etyleeniglykoli) 8-mono- (oktyylifenyylieetteriä) (TX-114). Faasien erottuminen saadaan aikaan lämmittämällä ja sentrifugoimalla. Vesifaasi konsentroidaan Speedvac-väkevöintilaitteessa.

f) Fosfoglykaanipeptidien standardoimiseksi muute- 25 taan menettelyvaiheissa a) - d) valmistetun materiaalin vapaan glukosamiinin typpi permetyloinnilla radioaktiivi-sesti leimatuksi trimetyyliammoniumkationiksi. Sen tekemiseksi näyte kuivataan alipaineessa ja siihen lisätään 100 μΐ dimetyylisulfoksidia. Ultraäänikäsittelyn (1 min) 30 jälkeen lisätään 10 mg NaOH:a ja 40 μΐ [12SI] metyylijodidia : (0,2 μΟϊ; NEN-Dupont, Dreieich) . Kun on sekoitettu 45 min lämpötilassa 25 °C, liuotin poistetaan Speedvac-laitteessa ja lisätään 40 μΐ H20:ä. Näyte pestään kolmesti kloroformilla ja kloroformiuuteliuos kolmesti H20:llä. Kloroformi 35 haihdutetaan typen alla. Permetylointi tapahtuu laajalla • · „ 102842 pitoisuusalueella lineaarisesti ja kvantitatiivisesti. Testattaessa insuliinin kaltaista vaikutusta käytetään ekvivalenttisia tilavuuksia (samat pulssimäärät minuutissa) fosfoinositoliglykaanipeptidejä (1 - 100 "mielival-5 täistä yksikköä").

g) Kohdissa a) - d) valmistetun materiaalin inku-bointi typpihapokkeen kanssa johtaa fosfoinositoliglykaa-nin lohkeamiseen.

Esimerkki 4 10 Fosfoinositoliglykaanipeptidien tunnusmerkilliset rakenteelliset piirteet a) Hiivasoluja viljellään esimerkissä 1 kuvatulla tavalla seuraavien radioaktiivisesti leimattujen substraattien (NEN-Dupont, Dreieich) läsnä ollessa: steariini- 15 happo, myoinositoli, etanoliamiini, glukosamiini tai man- noosi. Koko plasmakalvofraktiolle tai affiniteettikromato-grafisesti puhdistetlle cAMP-sitojaproteiinille (katso esimerkki 2) tehdään SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo-reesi. Värjäys Coomassie-sinisellä tai komponenttien auto-20 radiografia osoittaa, että kaikki mainitut radioaktiiviset komponentit tulevat sisällytetyiksi fosfoinositoliglykaa-nipeptidiin.

b) Esmerkin 3a) mukaisella tavalla valmistettavissa oleva fosfoinositoliglykaanipeptidi hajotetaan edelleen 25 kemiallisesti ja entsymaattisesti. Pilkkoutumistuotteet analysoidaan ohutkerroskromatografiällä ja mittaamalla radioaktiivisuuden jakautuminen ( [3H] steariinihappo ja [l4C] myoinositoli) . Jäljelle jäävä radioaktiiivisesti leimautunut rakenne eluoidaan levyltä ja käsitellään seuraa-30 vassa pilkkomisreaktiossa. Pronaasihajotuksessa muodostu- - :* neesta rakenteesta vapautetaan fosfatidyyli-inositoli (Pl) deaminoimalla typpihapokkeella. Se muutetaan fosfolipaasi D:llä fosfatidyylihapoksi tai fosfolipaasi C:llä diasyyli-glyseroliksi. Tällöin myosinositolileimaus katoaa, mutta 35 steariinihappoleimaus jää jäljelle. Fosfatidyylihappo muu- 102842 14 tetaan sitten asetolyysillä diglyseridiasetaatiksi. Tästä rakenteesta samoin kuin diasyyliglyserolista vapautetaan lopuksi alkalisella hydrolyysillä steariinihappo.

c) Esimerkkien 3a) ja 3e) mukaisesti valmistettu 5 rakenne kuivataan ja käsitellään HF:lla (60 % vedessä, 16 tuntia, 0 °C) ja saadut oligosakkaridit hydrolysoidaan trifluorietikkahapolla (2 mol/1, 4 tuntia, 100 °C) . Sitten reaktioliuos kuivataan ja läsnä olevat sokerit pelkistetään [1 % NaBH4: ä ammoniumhydroksidiliuoksessa (0,1 mol/1), 10 1 tunti, 37 °C] ja sen jälkeen asetyloidaan (pyridiinin ja etikkahappoanhydridin seos suhteessa 1:1, 1 tunti, 60 °C) . Kaasukromatografia tehtiin Packardin valmistamalla kaasu-kromatografilla, malli 428; kolonni 100/120 Supelcoport (Supelco, Bellefonte, USA) lämpötilassa 60 °C. Tulokseksi 15 saatiin seuraava kvalitatiivinen koostumus: mannoosi, ga- laktoosi, myoinositoli ja glukosamiini.

d) Esimerkkien 3a) ja 3e) mukaisesti valmistettu rakenne hydrolysoidaan kohdassa c) kuvatulla tavalla HF:11a (60 °C, vedessä) ja HCl:lla (4 mol/1, 16 tuntia 20 lämpötilassa 100 °C). Aminohappoanalysaattorilla (Bio- tronic, LC 6001) tehty erotus antoi tulokseksi seuraavat rakenneosat: asparagiinihappo, NH3, etanoliamiini ja glukosamiini.

Kun otetaan huomioon hydrolysointiolosuhteet, aspa-25 ragiinihapon ja NH3:n suhde samoin kuin esimerkissä 3a) saadut tulokset, on luonnon fosfoinositoliglykaanipepti-dissä esiintyvä aminohappo asparagiini.

Esimerkki 5

Keksinnön mukaisesti valmistettavien fosfoinosito-30 liglykaanipeptidien (PGP) biologinen aktiivisuus määrite- : tään rotasta peräisin olevilla preparatiivisesti eriste tyillä rasvasoluilla ja palleapaloilla.

Merkintä "PIG" tarkoittaa peptiditöntä fosfoinosi-toliglykaania, joka on saatu esimerkkien 3d) ja 3e) mukai-35 sesti; "PIG-N" tarkoittaa asparagiinia sisältävää fosfo- i 102842 15 inositoliglykaania, joka on saatu esimerkkien 3a) ja 3e) mukaisesti; "PIG-NCY" tarkoittaa peptidin Asn-Cys-Tyr sisältävää fosfoinositoliglykaania, joka on saatu esimerkkien 3b) ja 3e) mukaisesti; "PIG-NCYE" tarkoittaa peptidin 5 Asn-Cys-Tyr-Glu sisältävää fosfoinositoliglykaania, joka on saatu esimerkkien 3c) ja 3e) mukaisesti; "PIG-NCY (na) " tarkoittaa esimerkkien 3b) ja 3e) mukaisesti saatua materiaalia, joka on hajotettu typpihapokkeella (katso esimerkki 3g). Merkintä "perustaso" tarkoittaa aktiivisuutta 10 ilman stimulaatiota, insuliini on ihmisen insuliini ja min'1 radioaktiivisten hajoamisten määrää minuutissa.

Rotasta peräisin olevat rasvasolut preparoitiin seuraavasti: Lisäkivesten rasvakudos (Wistar-rotta, 160 - 180 g, ei rajoituksia ravinnon suhteen) hajotetaan 15 kollagenaasilla ja muodostuneet yksittäiset rasvasolut pestään useaan kertaan vaahdottamalla.

Rotasta peräisin olevien palleapalojen preparointi: useaan kertaan pestyistä toispuoleisista palleoista (Wistar-rotta, 60 - 70 g, ravinnon suhteen ei rajoituksia) 20 leikattiin pieniä kudospaloja (läpimitta 5 mm).

Rotan rasvasolujen insuliinireseptorien inaktivoi-miseksi solut käsitellään trypsiinillä (10 - 40 μg/ml). Kun on lisätty proteaasi-inhibiittoreita, solut pestään kahdesti vaahdottamalla ja jatketaan inkubointia 15 min 25 lämpötilassa 37 °C. Näitä soluja käytetään sitten testiin, jossa tutkitaan lipogeneesin stimuloitumsta fosfoinosito-liglykaanipeptidien vaikutuksesta. Vertailuinkubointi insuliinin kanssa osoittaa, että trypsiinikäsitellyissä soluissa esiintyy vain hyvin vähäistä insuliinilla stimuloi-30 tavissa olevaa lipogeneesiä, joten niissä on vain sangen - : rajoitettu määrä toimivia insuliinireseptoreja.

Rotan pallean insuliinireseptoreiden inaktivoimi-seksi kudospaloja inkuboidaan syöttäen jatkuvasti 02:a KRH-puskurissa [0,1 mmol/1 glukoosia forboliesteri tetradeka-35 noyylifosboliasetaatin (50 ^g/ml) läsnä ollessa] 90 min 102842 16 lämpötilassa 25 °C. Sen jälkeen kudospalat pestään kahdesti KRH-puskurilla ja käytetään kyseisiin kokeisiin.

Seuraavien kokeiden yhteydessä koetulokset, jotka on saatu kudoksilla tai soluilla, joiden insuliiniresepto-5 rit on inaktivoitu, ilmoitetaan kulloinkin suluissa. PIG- NCYE:llä ei ole vaikutusta yhdessäkään seuraavista kokeista .

a) Glykogeneesi Tällä testillä määritetään insuliinilla stimuloita-10 vissa oleva lihassoluissa tapahtuva glykogeenisynteesi, joka käsittää glukoosin kuljetuksen plasmakalvon läpi ja glukoosin muuttamisen glykogeeniksi mukaan luettuna toimiva insuliinisignaalin siirtokaskadi.

Palleapaloja inkuboidaan KRH-puskurissa, joka si-15 sältää 50 μπιοΐ/ΐ D-[U-14C] glukoosia, insuliinin ja PGP:n läsnä ja poissa ollessa 15 min lämpötilassa 37 °C. Kun alusta on imetty pois, kudospalat pestään perusteellisesi, pakastetaan lämpötilassa -70 °C ja homogenoidaan sitten lämpötilassa 2 °C Polytron-hajottimella. Homogenaatti 20 sentrifugoidaan (2 000 g) ja supernatantti pipetoidaan suodatinpaperille. Muodostuneen glykogeenin määrittämiseksi suodatin siirretään TCA-liuokseen (5 %) , pestään etanolilla ja asetonilla, kuivataan ja määritetään radioaktiivisuus tuikelaskennalla { [14C] glykogeeni (cpm · 10'3) }.

25 Fosfoinositoliglykaanipeptideille käytetyt yksiköt ovat mielivaltaisia yksiköitä, jotka määriteltiin esimerkissä 3f) .

Tulokset esitetään taulukossa 1.

«· ^ • · 102842 17

Taulukko 1

Glykogeneesi (cpm · 10'3)

Perustaso Insuliini p|Q PIG-N PIG-NCY PIG-NCY | 5 (na) 10 nmol/I 3,3(3,4) 8.4(4.1) 10 1 3.2(3.1) 5 3.6(3,5) 25 4,4(3,9) 100 15 1 3.0(2,5) 10 4,2(3,8) 100 6,7(6,2) 2 0 1 3.2(2·7) 5 4,8(4,3) I 25 6,5(5,8) 100 8,0(7,1) 2 5 1 3.0(2,5) ί10 3,2(2,9) 100 3,6(3,4) b) Glykogeenisynteesi 30 Tällä testillä määritetään aktivoidun glukoosin - ; (UDP-glukoosi) insuliinilla stimuloitavissa oleva muuttu minen glykogeeniksi (glykogeenisyntaasiaktiivisuus) mukaan luettuna toimiva insuliinisignaalin siirtokaskadi. Glukoosin kuljetus ja aktivointi kierretään (lukuun ottamatta 35 glykogeenisynteesimittausta, katso kohta a).

• * 102842 18

Palleapaloja inkuboidaan D-glukoosin kanssa (0,1 mmol/1) insuliinin ja PGP:n läsnä ja poissa ollessa 30 min lämpötilassa 37 °C. Valmistetaan homogenaatti ja sentrifugoidaan se (20 000 * g) . Suerpnatanttia inkuboi-5 daan U- [14C]UDP-glukoosin (0,3 mmol/1) kanssa glukoosi-6- fosfaatin läsnä ollessa (0,1 mmol/1 tai 10 mmol/1) 60 min lämpötilassa 37 °C. Seokset siirretään suodatinpaperille ja suodatin käsitellään edellä kuvatulla tavalla. Glyko-geenisyntaasiaktiivisuus lasketaan entsyymin I-muodon 10 (riippumaton glukoosi-6-fosfaatista, defosforyloitu, vas taa aktiivisen entsyymin määrää homogenaatissa) ja entsyymin D-muodon (glukoosi-6-fosfaatista riippuva, fosforyloi-tu, vastaa aktivoitavissa olevan entsyymin kokonaismäärää homogenaatissa) osanopeuksina { [14C] glykogeeni (cpm 15 10'3)}.

Tulokset esitetän taulukossa 2.

.1 < • « I " • · 102842 19

Taulukko 2

Glykogeenisyntaasi (cpm · 10‘3)

Perustaso Insuliini PIG PIG-N PIG-NCY PIG-NCY

5 (na) 4,4(3,5) 10 nnol/1 10,1(6,0) 1Q 1 3,9(3,5) 5 4,8(3,8) 25 5,7(4,5) 100 6,7(6,0) 15 1 3,9(3.5) 10 5,7(5,0) 100 7,2(6,2) 1 3,8(3.4) 2 0 5 5,7(5,1) 25 7,2(6,4) 100 6,8(8,1) 1 3,2(3.0) ' 25 10 4,0(3,5) 100 4,5(4.0) c) Llpogeneesi Tällä testillä määritetään glukoosin insuliinilla 30 stimuloitavissa oleva muuttuminen tolueeniin liukeneviksi * ~ tuotteiksi (triglyserideiksi, fosfolipideiksi, rasvaha poiksi) , joka vaatii glukoosin kuljetusta ja triglyseridin (glyseriini-3-P-synteesi, esteröinti), fosfolipidin ja rasvahapon synteesiä mukaan luettuna toimiva insuliinisig-35 naalin siirtokaskadi.

102842 20 *

Rotan rasvasoluja inkuboidaan D- [3-3H]glukoosin (loppupitoisuus 0,2 tai 1 mmol/1) kanssa insuliinin ja PGP:n läsnä tai poissa ollessa 90 min lämpötilassa 37 °C. Solut saatetaan liukenevaan muotoon lisäämällä tolueeniin 5 liukenevaa tuikelaskentaseosta ja erotetaan lipidit vesi liukoisista tuotteista ja inkubointiväliaineesta. Kun faasit ovat erottuneet, lipideihin sisällytetyksi tullut radioaktiivisuus määritetään suoraan tuikelaskennalla poistamatta vesifaasia { [3H] lipidi (cpm · 10'3) } .

10 Tulokset esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3

Lipogeneesi (cpm - 10‘3)

Perustaso Insuliini PIQ PIG-N PIG-NCY PIG-NCY

is________i!L

1.0(1,0) 10 nmol/1 11,2(1,9) 1 1.0(0.9) 20 5 2.1(1.5) 25 3.1(3.0) 100 4.2(3.5) 11 1.0(1.2) 10 3.5(3.3) 100 5.4(4.8) 1 1.0(0,9) 30 5 3.5(3.0) T 25 5.5(5,2) 100 6,8(5,9) 1 1.0(0,9) 35 10 1.0(1,5) 100 2,1(2,5) l__L_L--L-J— 1 —— 102842 21 d) Glukoosinkuljetusominaisaktiivi suus

Rotan rasvasoluista (katso esimerkki 5) otetaan - talteen eristetyt plasmakalvorakkulat pesemällä rasvasolut kahdesti homogenointipuskurissa [20 mmol/1 trihydoksiami-5 nometaani(Tris) *HCl:a, pH 7,4, 1 mmol/1 EDTAa, 0,25 mol/1 sakkaroosia) ja homogenoidaan sitten lämpötilassa 4 °C samassa puskurissa (20 ml) (teflonsurvimella varustettu lasihomogenaattori).

Homogenaatti sentrifugoidaan (16 000 * g, 15 min), 10 sedimentti suspendoidaan samaan puskuriin ja sentrifugoi daan uudelleen. Sedmentti suspendoidaan homogenointipusku-riin (5 ml) , levitetään sakkaroosikerroksen pinnalle (1,12 mol/1 sakkaroosia, 20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,4, 1 mmol/1 EDTAa), poistetaan sentrifugoinnin (100 000 - g, 15 70 min) jälkeen plasmakalvorakkuloita sisältävä välifaasi ruiskun avulla, laimennetaan puskurilla (45 ml) ja sentrifugoidaan uudelleen (48 000 - g, 45 min). Sedimentti suspendoidaan puskuriin (10 ml) , sentrifugoidaan uudelleen ja suspendoidaan uudelleen puskuriin (3 ml).

20 Eristettyjä plasmakalvorakkuloita inkuboidaan insu liinin ja PGP:n läsnä tai poissa ollessa 30 min lämpötilassa 25 °C. Sen jälkeen rakkuloita inkuboidaan ominaisak-tiivisuudeltaan samanlaisten D- [3-3H] glukoosin ja L[1-14C] glukoosin (50 mmol/1) kanssa 90 s lämpötilassa 25 °C. Se-25 okset imetään nopeasti nitroselluloosasuodattimien läpi.

Suoattimet pestään perusteellisesti ja kuivataan. Niiden radioaktiivisuus määritetään nestetuikelaskennalla. Omi-naiskuljetus [ (D- [3H] glukoosi/L- [14C] glukoosi) (cpm 10‘3) ] lasketaan [3H] - ja [14C]-radioaktiivisuuksien erona.

30 Tulokset esitetään taulukossa 4.

i 22 1 0 2 8 4 2

Taulukko 4

Glukoosin ominaiskuljetus

Perustaso Insuliini PIG PIG-N PIG-NCY PIG-NCY

5 (na) 2,4(2,6) I 10 nnol/l 2.5(2,3) 10 1 2,3(2,5) 5 2,9(2,7) 25 2.7(2.7) 100 2,9(3,3) -------- 15 1 2,7(2,6) 10 3.5(3.7) 100 4,0(3,8) 1 2,3(2,7) 20 5 3.5(3.7) I 25 4,7(4,6) 100 6.9(5,8) 1 2.5(2.3) 10 2.6(2.7) 100 2,7(3.0) e) Proteiinisynteesi

Toisin kuin edellä esitetyillä määrityksillä mita-30 tut insuliinin metaboliset vaikutukset proteiinisynteesin | stimulaatio kuuluu insuliinin pitkäaikaisvaikutuksiin (kasvuhormonina) . Määritykseen sisältyy insuliinisignaali-kaskadi.

Rotan rasvasoluja inkuboidaan leusiinittomassa 35 "Dulbecco's modified essential medium" -alustassa j i 23 102842 (DMEM: ssä) primaarivil jelmänä L- [3H] leusiinin (50 μιηοΐ/ΐ) , insuliinin ja PGP:n läsnä ollessa 4 tuntia lämpötilassa 37 °C. Solut erotetaan niitä ympäröivästä alustasta öljy-sentrifugointimenetelmällä ja niihin lisätään veden kanssa 5 yhteensopivaa tuikelaskentaseosta. Sentrifugoinnin jälkeen pestään prteiinisakka asetonilla, suspendoidaan se l-%:iseen SDS-liuokseen ja lisätään tuikelaskentaseosta. Soluihin liittyvä radioaktiivisuus, joka määritetään tui-kelaskennalla, toimii mittana proteinisynteesille ja ami-10 nohappokuljetukselle plasmakalvon läpi { [3H[leusiini (cpm io-4)}.

Tulokset esitetään taulukossa 5.

Taulukko 5 Proteiinisynteesi

15 Perustaso Insuliini P|Q P|G-N PIG-NCY PIG-NCY

(na) 3.5(3,4) 10 nmol/l 10,1(4.0) 20 1 3.5(3,3) 5 3,55(3,5) 25 4,0(3,5) 100 3,8(3,3) ·. 25 ~' 1 3,4(3.3) 10 4.1(3,2) 100 5,3(4.2) : 30 1 3.8(3.7) 5 4.4(4,2) 25 5.1(5.0) 100 6.9(5,8) 1 3.7(3.5) 10 3,8(3,7) 100 4.1(3,8) 35

Claims (6)

102842

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen fos- ψ foinositoliglykaanipeptidin valmistamiseksi, joka sisäl-5 tää fosfoinositoliglykaania, johon on kytketty aminohappo tai tripeptidi ja jolla on insuliinin kaltainen vaikutus, ja/tai fosfoinositoliglykaanipeptidin fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 10 a) käytetään organismeja, jotka sisältävät 3',5'- syklistä adenosiinimonofosfaattia sitovaa proteiinia, b) eristetään 3',5'-syklistä adenosiinimonofosfaattia sitova proteiini, c) lohkaistaan irti 3',5'-syklistä adenosiinimo- 15 nofosfaattia sitovan proteiinin proteiiniosa ja syntynyt glykosyylifosfatidyyli-inositolipeptidi puhdistetaan mahdollisesti, d) lohkaistaan menettelyvaiheessa c) saadusta tuotteesta mono- tai diasyyliglyseriini ja 20 e) eristetään fosfoinositoliglykaanipeptidi ja muutetaan se mahdollisesti vastaaviksi fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloiksi, jonka menetelmän menettelyvaiheet c) ja d) voi-daan toteuttaa myös päinvastaisessa järjestyksessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fosfoinositoliglykaanipeptidi, joka sisältää vähintään yhden glukosa-miini-, galaktoosi-, mannoosi-, myoinositoli-, fosfori- . happo- ja etanoliamiiniryhmän ja peptidiryhmän, jonka « . 30 sekvenssi on Asn-Cys-Tyr, ja jolla on insuliinin kaltai nen vaikutus.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fosfoinositoliglykaanipeptidi, joka sisältää vähintään fosfoinositoli- 35 glykaania ja asparagiinia ja jolla on insuliinin kaltainen vaikutus. 102842

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään hii vasoluja ja proteiiniosa lohkaistaan entsymaattisesti.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen 5 menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Sac- charomyces cerevisiae DSM 6649:ää, endoproteinaasia Glu-C, EC 3.4.21.19 ja/tai fosfolipaasia C, EC 3.1.1.5.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menettelyvaihei- 10 den c) ja d) järjestys vaihdetaan päinvastaiseksi. « « e 26 102842