KR0180689B1 - 흑화 성분을 제거하여 개선된 미백효과를 갖는 반하 비극성 지질 분획 추출물 및 이를 함유하는 기미, 주근깨 개선 및 피부미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반하로부터 흑화성분을 제거하여 미백효과가 개선된 반하의 비극성 지질분획 추출물 및 이를 함유한 기미, 주근깨 개선 및 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 반하 비극성 지질 분획 추출물은 반하를 물, 함수 또는 무수의 탄소수 1~4의 저급알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤으로 1회이상 추출하고, 추출액을 감압 농축한 후 비극성 용매를 이용하여 비극성 지질 분획을 얻는 방법으로 제조된다.

본 발명에 따른 조성물은 반하의 비극성 지질 분획 추출물을 건조중량으로 0.00005~0.5중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.

Description

흑화 성분을 제거하여 개선된 미백효과를 갖는 반하 비극성 지질 분획 추출물 및 이를 함유하는 기미, 주근깨 개선 및 피부미백용 조성물

본 발명은 반하추출물에서 흑화성분을 제거함으로써 미백효과를 개선시킨 것을 특징으로 하는 반하의 비극성 지질 분획 추출물과 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라닌 생성 억제효과와 미백효과가 우수한 개선된 반하의 비극성 지질 분획 추출물과 이를 함유하는 기미, 주근깨 개선 및 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결같은 소망이다. 사람의 피부색은 피부내 멜라닌(melanin)의 농도와 분포에 따라 유전적으로 결정되나, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 같은 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 그러나 멜라닌이 만들어지는 경로는 알려져 있으나, 티로시나제가 작용하는 이전단계인 멜라닌합성을 유도하는 메카니즘(mechanism)이 무엇인지에 대하여는 아직도 자세히 밝혀지지 않고 있다.

이에 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acide), 고지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)같은 티로시나제에 저해활성을 갖는 물질을 연고나 화장료에 배합하여, 피부미백이나 기미, 주근깨 개선의 목적에 사용하여 왔으나, 피부에 자극성을 유발하거나 제품안정성이 좋지 못하여 사용이 제한되고 또 그 효과도 미약한 단점이 있었다.

따라서 본 발명자들은 멜라닌 합성유도 자체를 억제하는 물질까지 스크리닝할 수 있는 쥐의 멜라노마 세포(BI6 melanoma cell)를 이용하여 천연에서 자생하는 동식물들을 대상으로 새로운 미백제를 개발하여 왔다.

일본공개특허 평6-219934호에는 반하, 산약등의 약재추출물이 취의 멜라노마세포(BI6 melanoma cell)의 색소생합성을 억제한다고 보고한 바 있다.

그러나 평 6-219934호에서 인용된 반하추출물을 그대로 사용할 경우 효과가 미약하고 고농도로 사용할 경우 짙은 흑갈색을 띠어 실제 제품에 적용하기에는 매우 곤란하다. 이에 본 발명자들은 연구에 정진하여 반하추출물에는 미백효과를 갖는 성분 뿐 아니라 오히려 쥐의 멜라노마세포(BI6 melanoma cell)를 강력하게 흑화시키는 성분이 다량 혼재되어 있어 전체추출물의 미백효과가 미약하다는 것을 발견하고, 반하 추출물로부터 분리된 흑화성분을 피부흑색제로 특허출원한 바있다. (대한민국 특허출원번호 : 제95-34976호).

이어 반하의 추출물에 다량 혼재되어 있는 흑화성분을 제거하면 반하의 비극성 지질 분획 추출물은 미백효과가 획기적으로 개선되며, 또한 비극성 지질 분획을 실리카 젤컬럼을 통과시켜 얻어진 클로로포름 용출액이 미백효과를 나타내는 주성분임을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

생약재로 시판되는 반하를 구입하여 잘게 분쇄하고 분쇄물 건조중량에 대하여 5~20부피의 물이나 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤으로 환류냉각기가 달린 추출기에서 50~100℃로 1~5시간 가열하여 추출한다. 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출한다. 추출액을 합하여 감압 농축한 후 다시 침전을 걸러 내고 농축한다. 이어 농축된 1차 추출물에 정제수를 가하고 노말헥산과 같이 물에 불용성이고 극성도가 1.0이하인 비극성 유기용매를 첨가하여 잘 섞은 후 비극성 유기용매에 녹는 분획을 얻어 반하의 비극성 지질분획 추출물을 얻는다.

또한 노말 헥산 분획을 실리카젤 컬럼을 통과시켜 얻어진 클로로포름 용출액의 미백효과가 월등함을 알았다.

이와 같이 얻어진 정제물을 일본 공개특허 평 6-219934호와 비교하여 쥐의 멜라노마세포(BI6 melanoma cell)에 적용해 본 결과, 반하의 총추출물에는 강력한 멜라닌 합성 촉진효과를 나타내는 흑화성분이 다량 존재하여 총추출물에서는 미백효과가 없거나 매우 미약한 반면, 본 발명에서와 같이 멜라닌 합성을 촉진하는 흑화성분을 제거하면 반하의 비극성 지질 분획 추출물은 미백효과가 340배 이상 획기적으로 증대되어 저농도 사용이 가능하여 연고나 로션 등의 피부미백제를 제조하여도 제품의 색상이나 제형에 전혀 문제가 없으며 사람의 피부에 도포하였을 때도 안전하고 뛰어난 미백효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 흑화성분이 제거되지 않은 반하 총추출물은 미백효과를 기대하기 어려웠으며 오히려 자극성이 있으며 제품에서도 흑갈색이 나타나는 등 제형에도 문제가 있었다.

피부외용연고나 화장료제조시에 함유되는 본 발명의 반하 비극성 지질 분획 추출물의 함량은 건조중량으로 0.00005~0.5중량%가 적당하다. 0.00005중량%이하의 농도에서는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었고, 0.5중량% 이상의 농도에서는 함유량의 증가에 따라 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않았다.

다음에 실시예, 비교예 및 실험예에 의거하여 본 발명을 자세히 설명하고자 하며, 본 발명이 실시예에만 한정되는 것이 아님을 밝혀둔다.

[비교예 1]

반하의 괴경 분쇄물 300g을 80% 메탄올 용액 1.5L에 넣고 냉각콘덴서가 달린 환류 추출기에서 3시간 끓여 추출한 다음, 300메쉬 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 추출액을 상온에서 화트만(Whatman)2번 여과지로 침전을 걸러내어 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 분무건조하여 건조중량12.1g을 얻었다.

[실시예 1]

비교예 1에서 얻어진 반하의 1차 추출물에 정제수 120ml를 첨가하고 동량의 노말 헥산을 가하여 잘 섞은 후 노말 헥산 분획을 얻는 과정을 3회 반복하여 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 35℃에서 감압농축하여 건조중량 1.0g을 얻었다.

[비교예 2]

실시예 1에서 얻은 여액에 동량의 메칠렌클로라이드를 첨가하여 잘 섞은 후 메칠렌 클로라이드의 분획을 얻는 과정을 3회 반복하여 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압농축하여 건조중량 1.2g을 얻었다.

[비교예 3]

비교예 2에서 얻은 여액에 동량의 노말부탄올을 첨가하여 잘 섞은 후 노말부탄올의 분획을 얻는 과정을 3회 반복하여 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 50℃로 감압농축하여 건조중량 2.5g을 얻었다.

[비교예 4]

반하의 과정 분쇄물 300g을 50℃에서 일본 공개특허 평6-219934호에 따른 방법으로 실시하여 건조중량 10.5g을 얻었다.

[실시예 2]

비교예 4에서 얻은 반하 추출물 10.5g 에 정제수 100ml를 첨가하고 실시예 1과 같은 방법으로 건조중량 0.7g을 얻었다.

[비교예 5]

실시예 2에서의 여액을 비교예 2와 같은 방법으로 실시하여 건조중량 0.9g을 얻었다.

[비교예 6]

비교예 5에서의 여액을 비교예 3과 같은 방법으로 실시하여 건조중량 2.1g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 1에서의 건조물을 노말헥산에 녹여 실리카젤 60(70-230 mesh) 80g 으로 층진된 직경 3.5센티미터의 컬럼으로 옮기고 클로로포름, 아세톤, 메탄올을 순차적으로 사용하여 클로로포름에 용출되는 분획을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 35℃로 감압농축하여 건조중량 0.3g을 얻었다.

[실시예 4]

반하의 괴경 분쇄물 300g을 노말헥산 1.5L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 환류추출기에서 3시간 끓여 추출한 다음 300 매쉬 여과포로 여과한 후 잔사는 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 추출액을 합하여 건조시킨 후 물 100ml에 현탁시키고 다시 클로로포름으로 극성지질을 제거하고 여액을 건조시켜 건조중량 1.1g을 얻었다.

[실험예 1]

상기 실시예 1~4와 비교예 1~6에서 얻어진 각 추출물들을 쥐 멜라노마 세포(BI6 mouse melanoma cell)의 배양액에 첨가하여 세포수준에서의 미백효과를 실험하였다(Lotan R., Lotan D. Cancer Res. 40: 3345-3350, 1980). 실시예 1~4와 비교예 1~6에서 얻어진 각 추출물들과 하이드로퀴논을 각각 쥐 멜라노마(BI6 melanoma cell)세포의 배양 배지에 첨가하여 3일간 배양한 후 세포들을 트립신(trypsin)처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후 멜라닌을 추출하였다. 이것에 수산화나트륨 용액(IN 농도) 1ml를 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고 분광 광도계를 이용, 400 나노미터(nm)에서 흡광도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 단위 세포수단(10⁶cell)의 흡광도로 나타내는 방법으로 수행하였으며, 대조군에 대한 상대적인 멜라닌 생성량을 저해율(%)로 계산하고 결과를 표 1에 정리하였다.

상기 결과에서 알 수 있듯이, 비교예 2와 3을 대조군과 비교하면 극미량의 적용 농도(최종농도 0.01%)임에도 불구하고 멜라닌 생성을 강력하게 촉진하는 흑화성분이 존재함을 알 수 있다. 그러나 실시예 1과 같이 흑화성분을 제거하면 비교예 1의 2 X 10 배 농도에서도 미백효과가 10배 이상 획기적으로 증대함을 알 수 있다. 따라서 반하 총추출물의 미약한 미백효과는 멜라닌 생성을 촉진하는 흑화성분이 멜라닌 생성 억제효과를 상쇄시켜 나타나는 현상임을 알 수 있다. 또 일본공개특허 평6-219934호에 따른 비교예 4도 비교예 5와 6의 흑화성분이 존재하며, 이 흑화성분을 제거하면 실시예 2와 같이 미백효과가 마찬가지로 개선되어진다.

또한 반하의 노말핵산 분획을 더욱 정제한 실시예 3의 미백효과는 실시예 1에 비해 10배 이상 향상되어 소량 적용할 수 있으며 제품 적용시 전혀 제품의 색상에 문제가 없음을 알수 있다.

[실험예 2]

실험예 1과 같은 방법으로 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 실시예 3의 추출물에 대하여 농도에 따른 멜라닌 생성 억제능을 조사하였으며 결과는 표2와 같다.

위의 결과에서 볼 수 있듯이 실시예 3의 추출물은 배양된 쥐 멜라노마 세포에 대하여 매우 강력한 멜라닌 생성 억제능을 가지고 있으며, 실시예 3의 추출물의 농도에 따라 0.00005%에서 0.005%이상까지 멜라닌 생성 억제능이 증가한다. 또한 하이드로퀴논이 미백효과는 우수하나, 세포의 성장을 억제하고 세포형태를 변화시키는 등의 세포독성으로 0.0001%이상에서는 실험을 할 수 있는 것에 반하여 실시예 3의 추출물은 0.005% 농도에서도 세포독성을 나타내지 않으면서 하이드로퀴논보다 높은 멜라닌생성 억제능을 갖는다.

이하에 실시예의 추출물을 함유하는 피부미백용 조성물의 처방예를 제조예에 의해 나타내었다.

[제조예 1]

반하추출물을 함유하는 피부 외용 연고 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 1의 것을 말한다.

[제조예 2 및 비교제조예 1]

반하추출물을 함유하는 화장료 중 크림의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 3의 것을 말한다.

[제조예 3 및 비교제조예 2]

반하추출물을 함유한 화장료 중 유연화장수의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 3의 것을 말한다.

[제조예 4 및 비교제조예 3]

반하추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 3의 것을 말한다.

[제조예 5 및 비교제조예 4]

반하추출물을 함유한 화장료 중 팩의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 3의 것을 말한다.

[제조예 6 및 비교제조예 5]

반하추출물을 함유한 화장료 중 엣센스의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 실시예 3의 것을 말한다.

[비교제조예 6 및 비교제조예 7]

반하추출물을 함유하는 화장료 중 크림의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 비교예 4의 것을 말한다.

[비교제조예 8 및 비교제조예 9]

반하추출물을 함유하는 화장료 중 크림의 처방예는 다음과 같다.

여기서 반하추출물은 비교예 4의 것을 말한다.

[실험예 3]

건강한 남녀 20명을 선정하여 양팔의 하박부에 직경 7mm 크기의 구멍이 6개씩 2줄로 뚫린 알루미늄 호일을 붙이고, 팔에서 10cm 떨어진 거리에서 ORIEL solar simulator 1000W를 이용하여 60mJ/㎠의 광량을 조사하였다. 조사 전에 70% 에탄올 수용액으로 조사부위를 잘 세척하였다. 조사하기 3일전부터 조사 후 3주째까지 1일 2회씩 제조예 2,3,6 및 비교제조예 1,2,5,6,7,8,9에 따라 제조된 반하추출물을 함유한 시료와 반하추출물이 함유되지 않은 기제를 한쌍으로 같은 줄에 도포하였다. 각각에 대하여 제조예와 비교제조예의 색소침착도를 육안으로 판정하고, 제조예가 비교제조예에 비해 색소침착을 억제한 정도를 뚜렷한 효과, 효과있음, 차이없음의 3단계로 평가하였으며, 그 결과는 표3과 같다.

위의 표3의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 3을 사용하여 제조된 제조예 2,3,6에 따라 제조된 반하의 비극성 지질 분획 추출물 함유 화장료는 피시험자 20명 중에서 최소 10명 이상에 대하여 미백효과를 나타내었으며, 어떤 부작용도 나타나지 않아, 개선된 반하의 비극성 분획 추출물이 안전하고 효과가 매우 뛰어난 기미나 주근깨 개선 또는 피부 미백제임을 알 수 있다. 또한 제품에서도 정제시료를 이용하여 제품의 색상이나 제형에 문제가 없었다. 그러나, 비교예 4를 사용하여 제조된 비교제조예 6에서는 제조예 2와 같은 현저한 미백효과를 나타내지 않으며, 이는 반하에 함유된 흑화성분에 의해 미백효과가 상쇄되기 때문이다.

또 비교제조에 8과 같이 농도를 10배(1% 함량) 높여도 미백효과를 인식할 수 없었으며, 특히 제품이 어두운 갈색을 띠며 제형에도 문제가 있고 일부는 자극성을 호소하였다.

그러나 실시예 3을 이용한 제조예 2,3,6에서는 어떤 부작용도 나타나지 않아 개선된 반하 비극성 지질 분획 추출물이 안전하고 효과가 매우 뛰어난 기미나 주근깨 개선 또는 피부미백제임을 알 수 있다.

Claims (2)

1. 반하를 물 또는 무수의 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤으로 1회이상 추출하고 추출액을 감압 농축하는 단계; 상기 농축액에 정제수를 가하고 물에 불용성이며 극성도가 1.0이하인 비극성 유기용매를 첨가하여 분획을 실시하여 유기용매 분획을 얻는 단계 ; 상기 유기용매 분획을 건조하여 비극성 지질 분획을 얻는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 반하 추출물의 비극성 분획 추출물.
2. 제1항의 추출물을 건조 중량으로 0.00005~0.5중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 기미, 주근깨 개선 및 피부 미백용 조성물.