JPWO2020153364A1 - 細胞付着用シート - Google Patents

Abstract

本発明は、血小板の付着が抑制され、細胞の付着に優れる細胞付着用シートを提供する。本発明の細胞付着用シートは、式（１）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される。

Description

本発明は細胞付着用シートに関する。

血液、組織液、および、リンパ液などの体液から、細胞、生理活性物質およびタンパク質などの標的物質を選択的に分離・回収する方法、または生体組織液から細菌またはウイルスなどを分離または除去する方法などの分離・回収技術は、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群；ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および移植後の急性拒絶反応防止などに利用されている。
さらに、血液のがんである白血病を始め、がん化した生体組織由来のがん細胞を検出し、治療を行う細胞医療にとって、がん化した細胞を高感度で効率的に分離、回収する技術は重要である。近年、がん化した組織からがん細胞を直接採取する生検（バイオプシー）に代えて、血液に代表される生体組織液から腫瘍マーカーやがん化した細胞そのものを検出する血液生検（リキッドバイオプシー）が注目を集めている。従来から行われてきた組織採取による検査は被検者に対して高侵襲な手法であるのに対し、血液生検においては血液採取という低侵襲な手法を用いるため、被検者の体への負担が極めて軽いことが特徴である。その一方で、血液生検による腫瘍マーカーを用いた検査では、がん化した組織に部位特異的な腫瘍マーカーが確立されている場合が少ない。このため、がん化した組織からわずかに血液中に漏れ出して体内を循環しているがん細胞（血中循環がん細胞）を高感度、高効率、かつ特異的に捕捉し、検出する技術の開発が望まれていた。

例えば、特許文献１には、生体内に存在する所定の細胞を選択的に吸着して分離させるための細胞分離方法に用いられる水和性組成物として、「中間水の量が３０ｗｔ％以下であることを特徴とするがん細胞分取用水和性組成物。」（請求項４）が記載されている。

特開２０１２−１０５５７９号公報

しかし、特許文献１に記載されたがん細胞分取用水和性組成物を用いて形成した細胞付着用シートでは、血小板の付着が抑制されるものの、細胞の付着に改善の余地が認められた。

そこで、本発明は、血小板の付着が抑制され、細胞の付着に優れる細胞付着用シートを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、後述する式（１）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される細胞付着用シートが、血小板の付着が抑制され、細胞の付着に優れることを知得し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］である。
［１］ 後述する式（１）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される細胞付着用シート。
［２］ Ｘが、窒素原子である、［１］に記載の細胞付着用シート。
［３］ Ｘが、＞ＣＲ^１０２−である、［１］に記載の細胞付着用シート。
［４］ Ｒ^３がアルキル基である、上記［１］〜［３］に記載の細胞付着用シート。
［５］ Ｒ^３が炭素数４以下のアルキル基である、上記［１］〜［４］に記載の細胞付着用シート。
［６］ Ｒ^１ＡおよびＲ^１Ｂが、酸素原子である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の細胞付着用シート。
［７］ 式（１）で表される化合物が、後述する式（１−１）で表される化合物、および、後述する式（１−２）で表される化合物からなる群から選択される、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞付着用シート。
［８］ がん細胞付着用である、上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載の細胞付着用シート。

本発明によれば、血小板の付着が抑制され、細胞の付着に優れる細胞付着用シートを提供できる。

本明細書において、「〜」を用いて表される範囲には、「〜」の両端を含むものとする。例えば、「Ａ〜Ｂ」と表される範囲には、ＡおよびＢを含む。

本明細書において、固形分とは、溶媒成分を除いた組成物に含まれる成分を意図し、その性状が液状であっても固形分として計算する。

以下では、本発明の細胞付着用シートについて詳細に説明する。

［細胞付着用シート］
本発明の細胞付着用シートは、後述する式（１）で表される化合物（以下「化合物（１）」という場合がある。）を含む組成物（以下「本発明の硬化性組成物」という場合がある。）を用いて形成される細胞付着用シートである。

〈式（１）で表される化合物〉
式（１）で表される化合物〔化合物（１）〕について説明する。

上記式（１）中、各記号の意味は以下のとおりである。
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に、水素原子またはアルキル基を表し、水素原子または炭素数４以下のアルキル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基またはプロパン−２−イル基であることがより好ましく、水素原子またはメチル基であることがさらに好ましく、メチル基であることがいっそう好ましい。

Ｒ^３は、水素原子または１価の置換基を表し、水素原子、アルキル基、アリール基、または下記式（２）で表される基であることが好ましく、水素原子、アルキル基、フェニル基、または下記式（２）で表される基であることがより好ましく、アルキル基であることがさらに好ましく、炭素数４以下のアルキル基であることがいっそう好ましい。炭素数４以下のアルキル基の例は、メチル基、エチル基、プロピル基、およびプロパン−２−イル基であるが、これらに限定されるものではなく、炭素数４以下のアルキル基としては、エチル基またはメチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。

式（２）中の各記号の意味は以下のとおりである。
式（２）中、Ｒ^５は、水素原子またはアルキル基を表し、水素原子または炭素数４以下のアルキル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、またはプロパン−２−イル基であることがより好ましく、水素原子またはメチル基であることがさらに好ましい。

式（２）中、Ｒ^１Ｃは、酸素原子または−ＮＲ^１０２−を表す。Ｒ^１０２は、水素原子またはアルキル基を表し、水素原子または炭素数４以下のアルキル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、またはプロパン−２−イル基であることがより好ましく、水素原子またはメチル基であることがさらに好ましく、水素原子であることがいっそう好ましい。Ｒ^１Ｃは、酸素原子（−Ｏ−）または−ＮＨ−であることが好ましく、酸素原子（−Ｏ−）であることがより好ましい。

式（２）中、Ｌ^５は、−ＮＨ−ＣＯＯ−＊２で表されるウレタン結合を含み、エーテル結合を含んでいてもよい脂肪族炭化水素基を表し、−（ＣＨ_２）_ｍ−ＮＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−であることが好ましく、ここで、ｍおよびｎは、それぞれ独立に、１〜１０の整数であり、２または３であることが好ましく、２であることがより好ましい。
なお、上記Ｌ^５で表される上記脂肪族炭化水素基中の上記ウレタン結合は、＊２がＸ側となるように配置されている。

式（１）中の各記号の意味は以下のとおりである。
Ｒ^１ＡおよびＲ^１Ｂは、それぞれ独立に、酸素原子または−ＮＲ^１０１−を表す。
Ｒ^１０１は、水素原子またはアルキル基を表し、水素原子または炭素数４以下のアルキル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、またはプロパン−２−イル基であることがより好ましく、水素原子またはメチル基であることがさらに好ましく、水素原子であることがいっそう好ましい。
Ｒ^１ＡおよびＲ^１Ｂは、それぞれ独立に、酸素原子（−Ｏ−）または−ＮＨ−であることが好ましく、酸素原子（−Ｏ−）であることがより好ましい。

Ｌ^１およびＬ^３は、それぞれ独立に、−ＮＨ−ＣＯＯ−＊１で表されるウレタン結合を含み、エーテル結合を含んでいてもよい脂肪族炭化水素基を表す。
Ｌ^１は−（ＣＨ_２）_ｐ−〔Ｏ−（ＣＨ_２）_ｒ〕_ｔ−ＮＨ−ＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｖ−＊２であることが好ましい。＊２側が、Ｘと結合する。ここで、ｐ、ｒおよびｖは、それぞれ独立に、１以上の整数であり、１〜３の整数であることが好ましく、２または３であることがより好ましい。ｔは０以上の整数であり、０〜３の整数であることが好ましく、０または１であることがより好ましい。
Ｌ^２は＊３−（ＣＨ_２）_ｗ−ＯＣＯ−ＮＨ−〔（ＣＨ_２）_ｓ−Ｏ〕_ｕ−（ＣＨ_２）_ｑ−であることが好ましい。＊３側がＸと結合する。ここで、ｑ、ｓおよびｗは、それぞれ独立に、１以上の整数であり、１〜３の整数であることが好ましく、２または３であることがより好ましい。ｕは０以上の整数であり、０〜３の整数であることが好ましく、０または１であることがより好ましい。
なお、Ｌ^１で表される脂肪族炭化水素基中のウレタン結合は、＊２がＸ側となるように配置されている。また、Ｌ^３で表される脂肪族炭化水素基中のウレタン結合は、＊１がＸ側となるように配置されている。

Ｘは、窒素原子または＞ＣＲ^１０２−を表す。なかでも、細胞付着用シートのＥｐＣＡＭ陰性癌細胞とＥｐＣＡＭ陽性癌細胞との付着性に差が生じやすい点で、＞ＣＲ^１０２−が好ましい。
なお、＞ＣＲ^１０２−とは、以下の式（Ｙ）で表される基である。式（Ｙ）中、＊は結合位置を表す。

なお、Ｘが窒素原子である場合は、式（１）で表される化合物は、式（１−１）で表される化合物に該当し、Ｘが＞ＣＲ^１０２−である場合、式（１）で表される化合物は、式（１−２）で表される化合物に該当する。

Ｒ^１０２は、水素原子または１価の置換基を表し、水素原子、アルキル基、アリール基、または上記式（２）で表される基であることが好ましく、水素原子、アルキル基、フェニル基、または上記式（２）で表される基であることがより好ましく、アルキル基であることがさらに好ましく、炭素数４以下のアルキル基であることがいっそう好ましい。炭素数４以下のアルキル基の例は、メチル基、エチル基、プロピル基、およびプロパン−２−イル基であるが、これらに限定されるものではなく、炭素数４以下のアルキル基としては、エチル基またはメチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。

式（１）で表される化合物の分子量は、細胞付着用シートの弾性率および可とう性のバランスを適切に保つ点から、２００〜１０００であることが好ましく、300〜800であることがより好ましく、３５０〜５５０であることがさらに好ましい。

《式（１）で表される化合物の具体例》
上記式（１）で表される化合物の好ましい例は、下記式（Ａ）、（Ｇ）、（Ｈ）または（Ｉ）で表される化合物であり、なかでも、下記式（Ａ）で表される化合物が特に好ましい。

上記式（１）で表される化合物の好ましい例は、式（Ｊ）で表される化合物および式（Ｋ）で表される化合物も挙げられる。

《式（１）で表される化合物の含有量》
硬化性組成物中の式（１）で表される化合物の含有量は、特に限定されないが、本発明の硬化性組成物の固形分の合計質量に対して、５０質量％以上であることが好ましく、７５質量％以上であることがより好ましく、８５質量％以上であることがさらに好ましく、９５質量％以上であることがいっそう好ましい。
本発明の硬化性組成物中の式（１）で表される化合物の含有量の上限は、特に限定されないが、通常、１００質量％未満であり、９９．９質量％以下であることが好ましい。

《式（１）で表される化合物の合成方法》
式（１）で表される化合物は、従来公知の方法によって、容易に合成することができる。

〈化合物（１）以外の成分〉
本発明の硬化性組成物は、本発明の作用効果を妨げない限り、上述した化合物（１）以外に、化合物（１）以外の他のモノマー、界面活性剤、重合開始剤、重合禁止剤および溶媒など、化合物（１）以外の成分をさらに含んでもよい。

《化合物（１）以外の他のモノマー》
本発明の硬化性組成物では、硬化膜の力学物性（引張強度や耐摩耗性など）を調整する目的で、市販の単官能モノマーおよび／または多官能モノマーを、式（１）で表される化合物と併用してもよい。
本発明の硬化性組成物が化合物（１）以外の他のモノマーを含む場合の、本発明の硬化性組成物中の化合物（１）以外の他のモノマーの含有量は、特に限定されないが、本発明の硬化性組成物の固形分の合計質量に対して、０質量％超４０質量％以下であることが好ましい。なお、化合物（１）以外の他のモノマーの含有量が０質量％であるとは、本発明の硬化性組成物が化合物（１）以外の他のモノマーを含まないことを意味する。

《界面活性剤》
本発明の硬化性組成物には、硬化性組成物の基材への濡れ性やレベリング性を調整するために、市販の界面活性剤を添加してもよい。
本発明の硬化性組成物が界面活性剤を含む場合の、本発明の硬化性組成物中の界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、本発明の硬化性組成物の固形分の合計質量に対して、０質量％超３質量％以下であることが好ましい。なお、界面活性剤の含有量が０質量％であるとは、本発明の硬化性組成物が界面活性剤を含まないことを意味する。

《重合開始剤》
重合開始剤は、特に限定されないが、例えば、光ラジカル重合開始剤、光カチオン重合開始剤および光アニオン重合開始剤などの光重合開始剤、ならびに熱ラジカル重合開始剤および熱カチオン重合開始剤などの熱重合開始剤が挙げられる。
本発明の硬化性組成物が重合開始剤を含む場合の、本発明の硬化性組成物中の重合開始剤の含有量は、特に限定されないが、本発明の硬化性組成物の固形分の合計質量に対して、０．１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．５質量％〜８質量％であることがより好ましく、１質量％〜５質量％であることがさらに好ましい。

《重合禁止剤》
本発明の硬化性組成物には、化合物（１）および硬化性組成物の保存安定性を持たせるために、市販の重合禁止剤を添加してもよい。
本発明の硬化性組成物が重合禁止剤を含む場合の、本発明の硬化性組成物中の重合禁止剤の含有量は、特に限定されないが、本発明の硬化性組成物の固形分の合計質量に対して、０．０００５質量％〜１質量％であることが好ましい。

《溶媒》
溶媒は、特に限定されないが、アルコール、ケトンまたはこれらの混合溶媒が好ましく、炭素数３以下のアルコール、炭素数４以下のケトンまたはこれらの混合溶媒がより好ましく、メタノール、アセトンがさらに好ましい。

硬化性組成物が溶媒を含む場合の硬化性組成物中の溶媒の含有量は、特に限定されないが、硬化性組成物の１０質量％〜９５質量％であることが好ましく、３０質量％〜９０質量％であることがより好ましく、５０質量％〜８０質量％であることがさらに好ましい。

［細胞付着用シートの製造方法］
本発明の細胞付着用シートの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば以下に説明する方法が挙げられる。

〈硬化性組成物の調製〉
式（１）で表される化合物を含む組成物（以下「硬化性組成物」という。）を調製する。
硬化性組成物には、式（１）で表される化合物に加えて、重合開始剤および溶媒などを含んでもよい。

〈硬化性組成物膜の形成〉
硬化性組成物を基材に塗布し、硬化性組成物膜を形成する。
基材は特に限定されないが、例えば、ガラス基材、樹脂基材および金属基板が挙げられる。
ガラス基材の例は、ソーダ石灰ガラス製基材、ホウケイ酸ガラス製基材、および石英ガラス製基材が挙げられる。ガラス基材の形状は、特に限定されないが、板状であることが好ましい。ガラス基材の表面はコーティングされていてもよいし、プラズマ処理などにより改質されていてもよい。
樹脂基材の例は、ポリエステル系樹脂基材、ポリイミド系樹脂基材、エポキシ系樹脂基材、ポリエーテル系樹脂基材、ポリスルフォン系樹脂基板、およびポリスチレン系樹脂基材が挙げられる。樹脂基材の形状は、特に限定されないが、板状またはフィルム状であることが好ましい。樹脂基材の表面はコーティングされていてもよいし、プラズマ処理などにより改質されていてもよい。
金属基板の例は、金、白金、パラジウム、銅、マンガン、ケイ素、モリブデン、亜鉛、スズ、イリジウム、コバルト、クロム、チタン、および、これらの合金、並びに、アルミナ、ジルコニア、ヒドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸八カルシウム、および、リン酸四カルシウムなどが挙げられる。金属基材の形状は、特に限定されないが、板状であることが好ましい。金属基材の表面はコーティングされていてもよいし、プラズマ処理などにより改質されていてもよい。

基材上に硬化性組成物膜を形成する方法は特に限定されないが、バーコーター、スピンコーティング、ディッピング、またはペインティングなどによる方法が挙げられる。

〈硬化膜の形成〉
基材上に形成した硬化性組成物膜を硬化させて、硬化膜を形成する。
硬化性組成物膜を硬化させる方法は、特に限定されないが、光照射または加熱によることが好ましく、光照射によることがより好ましい。特に、基材の耐熱性が低い場合には、光照射により硬化させることが好ましい。光照射は、可視光線、紫外線、電子線、またはガンマ線など、適宜選択すればよい。
硬化性組成物膜を硬化させて得られる硬化膜が本発明の細胞付着用シートである。
本発明の細胞付着用シートは、基材から剥がしたものであってもよいし、基材が貼りついたものであってもよい。後者を区別する場合は、基材付き細胞付着用シートという場合がある。

［細胞付着］
〈選択性〉
本発明の細胞付着用シートは、血小板が付着しにくく、細胞が付着しやすい。細胞としては、正常細胞およびがん細胞が挙げられ、特に、がん細胞が適している。

正常細胞には例えば上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などにおいて正常な機能を維持している組織に由来する細胞が挙げられ、がん細胞には乳がん、線維肉腫、子宮頸がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、結腸がん、膵臓がん、直腸がん、胆嚢がん、肝臓がん、口腔咽頭がん、肺がん、皮膚がんなどのがん化した組織に由来する細胞が挙げられる。

本発明の細胞付着用シートは、選択的な細胞付着性能を有する。
本発明の細胞付着用シートの選択的な細胞付着性能は、硬化膜中の式（１）で表される化合物に由来する構造と、血清中のタンパク質および細胞表面に存在する構造との間に働く分子間引力（例えば、水素結合力や、配向力、誘起力、分散力などで定義されるファンデルワールス力など）に起因するものではないかと考えられるが、詳細は不明である。

この分子間引力は、細胞付着用シートの表面自由エネルギーを構成する成分、すなわち、細胞付着用シートに対する水およびヨウ化メチレンの接触角からOwens-Wendtの式を用いて算出される表面自由エネルギーのうち、分散力成分と水素結合力成分のバランスから見積もることができる。本発明の化合物の構造に起因するこのバランスが変化することで分子間引力が変化し、細胞の接着選択性が発現していると本発明者らは考えている。
細胞付着用シート表面の自由エネルギーにおいて、分散力成分は２２ｍＮｍ^−１以上であることが好ましく、２５ｍＮｍ^−１超４０ｍＮｍ^−１未満であることがより好ましく、２６ｍＮｍ^−１〜３８ｍＮｍ^−１であることがさらに好ましい。水素結合成分は２ｍＮｍ^−１以上であることが好ましく、５ｍＮｍ^−１超５１ｍＮｍ^−１未満であることがより好ましく、１９ｍＮｍ^−１〜４５ｍＮｍ^−１であることがさらに好ましい。

なお、本発明において、細胞付着用シートの表面自由エネルギーの算出には、協和界面科学製 ＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ ＤＭ−５００を用いて、純水もしくはヨウ化メチレン１μＬの液滴を表面に着滴させ、着滴から１０秒の接触角を測定した結果からOwens-Wendtの式を用いて算出したものである。

［実施例１］
〈細胞付着用シートの製造〉
以下に記載する方法により、細胞付着用シート（以下「シート１」という場合がある。）を製造した。

１．化合物Ａの合成
Ｎ−メチルジエタノールアミン（７ｇ、５８．７ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）、およびメタクリル酸２−イソシアナトエチル（１９．６ｇ、１２６ｍｍｏｌ）を混合した。この混合液に、ネオスタンＵ６００（３７７ｍｇ；日東化成社製）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に希釈した溶液を発熱に注意しながら、滴下し、室温で１２時間撹拌した。この反応の式は以下に示すとおりである。反応溶液を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル〜酢酸エチル：メタノール＝９：１）に供することで精製し、式（Ａ）で表される化合物（本明細書において「化合物Ａ」という）（２４ｇ、収率９５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance）にて、目的物であることを確認した。
¹H NMR (メタノール−ｄ_４, 400MHz) δ: 1.93 (6H, s), 2.35 (3H,s), 2.71 (4H, t), 3.39 (4H, t), 4.10-4.19 (8H, m), 5.62 (2H, s), 6.12 (2H, s).

なお、化合物Ａの合成法としては、下記の条件でも同様に合成できる。
Ｎ−メチルジエタノールアミン（７ｇ、５８．７ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）、およびメタクリル酸２−イソシアナトエチル（１９．６ｇ、１２６ｍｍｏｌ）を混合し、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル〜酢酸エチル：メタノール＝９：１）に供することで精製し、式（Ａ）で表される化合物（本明細書において「化合物Ａ」という）（２１ｇ、収率８５％）を得た。

２．硬化性組成物の調製
合成した化合物Ａ（重合禁止剤として、４ＯＨ−ＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）を３０ｐｐｍ含む）と、重合開始剤と、溶媒とを、表１に示す配合量で混合して、硬化性組成物（以下「硬化性組成物１」という。）を調製した。

３．硬化膜の作製
調製した硬化性組成物１を、バーコーターを用いて、乾燥後に厚さ３μｍとなるようにクリアランスを調整して、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタラート）フィルム（コスモシャインＡ４３００，東洋紡社製；両面易接着処理）上に塗布し、乾燥させた。
その後、紫外線露光機（ＥＣＳ−４０１Ｇ，アイグラフィック社製；光源は高圧水銀ランプ）を用いて、２Ｊ／ｃｍ^２の露光量となるように露光し、ＰＥＴフィルム上に硬化膜を作製した。

〈付着性の評価〉
１．血小板付着性
製造した細胞付着用シート（シート１）と、対照試料としてのＰＥＴフィルム（ＤＩＡＦＯＩＬ Ｔ１００Ｅ１２５、三菱樹脂株式会社製）とを用いて、血小板の粘着実験を行った。クエン酸ナトリウムで抗凝固したヒト全血から多血小板血漿と少血小板血漿を遠心分離によって回収し、多血小板血漿を少血小板血漿で希釈することにより４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの血小板懸濁液を調整した。続いて、試料表面と血小板懸濁液とを３７℃で６０分間接触させた後、リン酸緩衝溶液で２回リンスし、粘着した血小板を１％グルタルアルデヒド溶液で固定化した。固定化した試料はリン酸緩衝溶液にて１０分、リン酸緩衝溶液：水＝１：１にて８分、水にて８分、さらに水でもう一度８分浸漬させて洗浄し、室温で風乾した。その後、試料表面１×１０^４μｍ^２に付着した血小板を電子顕微鏡で観察し、血小板粘着数を計測した。
ＰＥＴフィルム（対照試料）に付着した血小板の総数を１００％とした場合の、シート１における血小板の相対数を算出し、血小板付着性を以下の基準に従って評価した。
Ａ・・・５％以下
Ｂ・・・５％超２０％以下
Ｃ・・・２０％超

２．がん細胞付着性１
製造した細胞付着用シート（シート１）と、対照試料としてのＰＥＴフィルム（ＤＩＡＦＯＩＬ Ｔ１００Ｅ１２５、三菱樹脂株式会社製）とを評価用基板として用いて、がん細胞の接着試験を行った。上記基板の表面をリン酸緩衝生理食塩水により洗浄した後、ウシ胎児血清を１０％添加して調製したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ−１２培地の１：１混合培地）に３７℃で６０分間浸漬させて馴化した。その後、上記の培地に懸濁したヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）を各試料に対して１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の密度となるように播種し、３７℃、６０分間接触させた。続いて、基板をリン酸緩衝溶液で２回リンスし、基板に接着した細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞の核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、アクチン骨格をファロイジン抗体でそれぞれ染色して、蛍光顕微鏡を用いて付着細胞数の計測を行った。
ＰＥＴフィルム（対照試料）に付着したがん細胞の総数を１００％とした場合の、シート１におけるがん細胞の相対数を算出し、がん細胞付着性を以下の基準に従って評価した。
Ａ・・・１５００％超
Ｂ・・・１００％以上１５００％以下
Ｃ・・・１００％未満

［比較例１］
〈細胞付着用シートの製造〉
下記式（Ｃ）で表される化合物（「化合物Ｃ」という場合がある）を合成し、表１に示す組成で硬化性組成物（以下「硬化性組成物２」という場合がある。）を調製した。
硬化性組成物２を用いて、実施例１と同様にして、細胞付着用シート（以下「シート２」という場合がある。）を製造した。

［比較例２］
〈細胞付着用シートの製造〉
ポリ（２−メトキシエチルアクリレート）（２０ｍｇ）を溶媒（メタノール；１０ｍＬ）に溶解して、組成物（以下「組成物３」という場合がある。）を調製した。
組成物３を用いて、実施例１と同様にして、細胞付着用シート（以下「シート３」という場合がある。）を製造した。なお、ポリ（２−メトキシエチルアクリレート）の分子量は、ＧＰＣの分子量分析の結果から、数平均分子量（Ｍｎ）が２１，０００であり分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．８であった。

［比較例３］
ＰＥＴフィルム（ＤＩＡＦＯＩＬ Ｔ１００Ｅ１２５、三菱樹脂株式会社製）を細胞付着用シート（以下「シート４」という場合がある。）として用いた。

表１中、重合開始剤の欄のＰＩ−１は光重合開始剤（下記式で表される化合物）を表し、Ｉｒｇ１１７３は光重合開始剤（Ｏｍｎｉｒａｄ １１７３，ＩＧＭ Ｒｅｓｉｎｓ社製）を表す。

ＰＩ−１は、国際公開第２０１７／０１８１４６号の［０１０５］〜［０１１０］に記載の方法を参考にして合成したものを用いた。

比較例１〜３の細胞付着用シートを用いて、実施例１と同様にして血小板の付着性およびがん細胞付着性１を評価した。評価結果を表２に示す。

実施例１の細胞付着用シートは、血小板の付着が少なく、かつ、がん細胞の付着が多かった。

また、実施例１のシート１を用いて、他のがん細胞（ＳＷ４８０、ＨＴ２９、ＭＣＦ−７、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に関する付着性を評価した結果、ＨＴ１０８０と同様に細胞付着性が確認された。一方、正常細胞の上皮組織であるヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に関する付着性を評価した結果、がん細胞に比べ、付着数が少ないことが確認された。

［実施例２］
〈細胞付着用シートの製造〉
上記化合物Ａの合成を参照して、下記式（Ｂ）で表される化合物（「化合物Ｂ」という場合がある）を合成し、表３に示す組成で硬化性組成物（以下「硬化性組成物４」という場合がある。）を調製した。
硬化性組成物４を用いて、実施例１と同様にして、細胞付着用シート（以下「シート５」という場合がある。）を製造した。

製造した細胞付着用シート（シート５）を用いて、実施例１と同様にして血小板の付着性、および、以下の（３．がん細胞付着性２）の評価を実施した。評価結果を表４に示す。

２．がん細胞付着性２
製造した細胞付着用シート（シート５）と、対照試料としてのＰＥＴフィルム（ＤＩＡＦＯＩＬ Ｔ１００Ｅ１２５、三菱樹脂株式会社製）とを評価用基板として用いて、がん細胞の接着試験を行った。上記基板の表面をリン酸緩衝生理食塩水により洗浄した後、ウシ胎児血清を１０％添加して調製したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ−１２培地の１：１混合培地）に３７℃で６０分間浸漬させて馴化した。その後、上記の培地に懸濁したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト由来浸潤性悪性乳がん細胞株）を各試料に対して１ｃｍ^２あたり１×１０^４個の密度となるように播種し、３７℃、６０分間接触させた。続いて、基板をリン酸緩衝溶液で２回リンスし、基板に接着した細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞の核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、アクチン骨格をファロイジン抗体でそれぞれ染色して、蛍光顕微鏡を用いて付着細胞数の計測を行った。
ＰＥＴフィルム（対照試料）に付着したがん細胞の総数を１００％とした場合の、シート１におけるがん細胞の相対数を算出し、がん細胞付着性を以下の基準に従って評価した。
Ａ・・・１５００％超
Ｂ・・・１００％以上１５００％以下
Ｃ・・・１００％未満

実施例２の細胞付着用シート５は、血小板の付着が少なく、かつ、がん細胞の付着が多かった。

〈付着選択性の評価〉
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト由来浸潤性悪性乳がん細胞株）とＭＣＦ−７（ヒト由来良性腫瘍細胞株）とをそれぞれウシ胎児血清を１０％添加して調製したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ−１２培地の１：１混合培地）で培養した後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ、ＭＣＦ−７細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。それぞれの細胞が１ｃｍ^２あたり０．５×１０^４個（合計１ｃｍ^２あたり１×１０^４個）の密度になるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に混合してシート１および５上に播種し、３７℃、６０分間接触させた。
続いて、シート１および５をリン酸緩衝溶液でリンスし、シート１および５に接着した細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞固定後のシート１および５をリン酸緩衝溶液でリンスした後、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを使用してスライドガラス上に封入し、蛍光顕微鏡を用いて、付着細胞数の計測を行った。
シート１および５上に付着したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト由来浸潤性悪性乳がん細胞株）とＭＣＦ−７（ヒト由来良性腫瘍細胞株）との両方の付着細胞数を計測し、以下の基準に従って、細胞付着の選択性を評価した。
Ａ：（ＭＢＡ−ＭＢ−２３１の付着細胞数／ＭＣＦ−７の付着細胞数）の比率が２以上
Ｂ：（ＭＢＡ−ＭＢ−２３１の付着細胞数／ＭＣＦ−７の付着細胞数）の比率が２未満
シート１に関しては評価「Ｂ」で、シート５に関しては評価「Ａ」であった。
上記結果より、式（１−２）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される細胞付着用シート（シート５）のほうが、式（１−１）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される細胞付着用シート（シート１）よりも、細胞付着の選択性があることが確認された。なお、従来の細胞付着用シートでは、ＥｐＣＡＭ陰性癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（ＭＣＦ−７）との間で付着の選択性はなかったが、驚くべきことに、シート５では、両者の細胞の付着の選択性が確認された。

Claims (8)

1. 式（１）で表される化合物を含む組成物を用いて形成される細胞付着用シート。
   

   

   式（１）中、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に、水素原子またはアルキル基を表す。Ｒ^３は、水素原子または１価の置換基を表す。Ｒ^１ＡおよびＲ^１Ｂは、それぞれ独立に、酸素原子または−ＮＲ^１０１−を表す。Ｒ^１０１は、水素原子またはアルキル基を表す。Ｌ^１およびＬ^３は、それぞれ独立に、−ＮＨ−ＣＯＯ−＊１で表されるウレタン結合を含み、エーテル結合を含んでいてもよい脂肪族炭化水素基を表す。Ｘは、窒素原子または＞ＣＲ^１０２−を表す。Ｒ^１０２は、水素原子または１価の置換基を表す。
   なお、前記Ｌ^１で表される脂肪族炭化水素基中のウレタン結合は、＊１がＸ側となるように配置されている。また、前記Ｌ^３で表される脂肪族炭化水素基中のウレタン結合は、＊１がＸ側となるように配置されている。
2. Ｘが、窒素原子である、請求項１に記載の細胞付着用シート。
3. Ｘが、＞ＣＲ^１０２−である、請求項１に記載の細胞付着用シート。
4. Ｒ^３がアルキル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞付着用シート。
5. Ｒ^３が炭素数４以下のアルキル基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞付着用シート。
6. Ｒ^１ＡおよびＲ^１Ｂが、酸素原子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞付着用シート。
7. 式（１）で表される化合物が、式（Ａ）で表される化合物、および、式（Ｊ）で表される化合物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞付着用シート。
   

   
8. がん細胞付着用である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞付着用シート。