JPWO2020096959A5

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Publication number: JPWO2020096959A5
Application number: JP2021523353A
Authority: JP
Publication date: 2022-11-11

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宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、前記ポリペプチドの前記２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、前記ポリペプチドの前記２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、前記２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、
前記宿主細胞が、
（１）前記ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、
（２）前記ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、および
（３）ペプチジル－プロリルイソメラーゼおよびタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼからなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位が前記宿主細胞染色体の一部であり、かつ前記宿主細胞染色体に対して天然であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれかつシャペロンタンパク質の染色体過剰発現をもたらす前記第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記プロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド
を含む、形成すること、ならびに
（ｂ）前記宿主細胞から前記生物学的に活性なポリペプチドを回収すること
を含む、方法。
宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、前記ポリペプチドの前記２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、前記ポリペプチドの前記２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、前記２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、
前記宿主細胞が、
（１）前記ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、
（２）前記ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、
（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、かつ前記宿主細胞染色体に対して天然であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれかつシャペロンタンパク質の染色体過剰発現をもたらす前記第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記第１のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド、および
（４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、前記第４の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、かつ前記宿主細胞染色体に対して天然であり、前記第４の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれかつシャペロンタンパク質の染色体過剰発現をもたらす前記第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第４の翻訳単位と前記第２のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第４のポリヌクレオチドを含む、
形成すること、ならびに
（ｂ）前記宿主細胞から前記生物学的に活性なポリペプチドを回収すること
を含み、
第３の翻訳単位および第４の翻訳単位の一方または両方は、宿主細胞染色体に対して天然である、方法。
前記第１および第２のプロモータが両方とも、誘導性プロモータである、請求項２に記載の方法。
前記第１および第２のプロモータが両方とも、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、それぞれ前記第３および第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項３に記載の方法。
前記第１および第２のプロモータの一方が誘導性プロモータであり、前記第１および第２のプロモータの他方が構成的プロモータであり、特に、前記第１のプロモータが誘導性プロモータであり、前記第２のプロモータが構成的プロモータである、請求項２に記載の方法。
前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記第２のプロモータがＣＰ２５プロモータである、請求項５に記載の方法。
前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、ＣＰ２５プロモータである、請求項２に記載の方法。
前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項２に記載の方法。
前記宿主細胞が、（５）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第５の翻訳単位を含む第５のポリヌクレオチドであって、前記第５の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第５の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第５の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第５の翻訳単位と前記第３のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第５のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡであり、前記第３のプロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第５の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである、請求項９に記載の方法。
前記宿主細胞が、（６）前記ポリペプチドの第３の鎖をコードする第６の翻訳単位を含む第６のポリヌクレオチドチドであって、前記第６のポリヌクレオチドが、前記１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、第６のポリヌクレオチドをさらに含み、それによって、発現すると、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の翻訳単位が、免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第６の翻訳単位が、免疫グロブリンＦｃ断片をコードし、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて生物学的に活性な一価抗体を形成する、請求項１１に記載の方法。
前記ポリペプチドが半抗体であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖が、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
第１の抗原に結合することができる第１の半抗体と、第２の抗原に結合することができる第２の半抗体とを含む、二重特異性抗体の産生方法であって、
前記第１の翻訳単位が、前記第１の半抗体の重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、前記第１の半抗体の軽鎖をコードし、前記第１の半抗体が、少なくとも１つのノブ形成変異を含む、請求項１から１０および１３のいずれか一項に記載の方法に従って前記第１の半抗体を産生することと、
前記第１の翻訳単位が、前記第２の半抗体の重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、前記第２の半抗体の軽鎖をコードし、前記第２の半抗体が、少なくとも１つのホール形成変異を含む、請求項１から１０および１３のいずれか一項に記載の方法に従って前記第２の半抗体を産生することと、
還元条件で、前記第１の半抗体を前記第２の半抗体と組み合わせて、前記二重特異性抗体を産生することとを含む、方法。
前記第１の抗原および前記第２の抗原が、異なる抗原である、請求項１４に記載の方法。
前記還元条件を達成するために還元剤を添加する工程をさらに含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
前記還元剤が、グルタチオンである、請求項１６に記載の方法。
宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞であって、
（１）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第１の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第１の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第１の翻訳単位と前記第１のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第１のポリヌクレオチド、および
（２）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、かつ前記宿主細胞染色体に対して天然であり、前記第２の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれかつタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼの染色体過剰発現をもたらす前記第２の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第２の翻訳単位と前記第２のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第２のポリヌクレオチドを含み、
第１の翻訳単位および第２の翻訳単位の一方または両方は、宿主細胞染色体に対して天然である、原核宿主細胞。
前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項１８に記載の原核宿主細胞。
前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、Ｐｈｏプロモータであり、前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項１８に記載の原核宿主細胞。
請求項１８に記載の原核宿主細胞であって、
（３）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第３の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記第３のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチドをさらに含む、原核宿主細胞。
前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータであり、前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質であり、前記第３のプロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである、請求項２１に記載の原核宿主細胞。
（ｉ）ｌａｃＩ^Ｑ変異を有する株である大腸菌である、又は、
（ｉｉ）ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡｌａｃＩ ^Ｑ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株の大腸菌である、
請求項１８から２２のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
（ａ）２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の染色体外翻訳単位を含む第１の染色体外ポリヌクレオチド、および
（ｂ）前記２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の染色体外翻訳単位を含む第２の染色体外ポリヌクレオチド
を含む染色体外発現ベクターであって、それによって、発現すると、前記２つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞において生物学的に活性な２鎖ポリペプチドを形成する、染色体外発現ベクターをさらに含む、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。