JPWO2020036875A5 - - Google Patents
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Description
[0004]種々の適用のために使用され得る自然に対合したTCRのハイスループットクローニングのための組成物および方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される組成物および方法は、シークエンシングおよび合成より優れることができ、宿主細胞における
直接発現のためのTCRの同種対をコードする融合核酸分子を提供することができる。組成物および方法はまた、B細胞受容体(BCR)などの他の二分免疫受容体にも適用され得る。本明細書は以下の発明の開示を包含する。
[1]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを調製するための方法であって、
(a)複数のベッセルを生成するステップであって、各々が、(1)二分免疫受容体の第1のペプチド鎖をコードする第1の核酸および前記二分免疫受容体の第2のペプチド鎖をコードする第2の核酸を含む細胞と、(2)複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーとを含む、ステップと、
(b)前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化して複数の硬化粒子を形成するステップであって、前記複数の硬化粒子のそれぞれが重合またはゲル化した複数のポリマーおよび/またはモノマーからなるマトリクスを有し、前記複数の硬化粒子のそれぞれが前記第1の核酸の第1のプライマー伸長産物および前記第2の核酸の第2のプライマー伸長産物を含み、前記第1のプライマー伸長産物および前記第2のプライマー伸長産物が前記マトリクス内に包埋または封入されており、前記第1のプライマー伸長産物および前記第2のプライマー伸長産物の拡散が抑制される、ステップと
を含む、方法。
[2]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が、逆転写(RT)産物、第2の鎖合成(SSS)産物、または増幅産物である、[1]に記載の方法。
[3]前記第1および/または前記第2のプライマー伸長産物がアダプター配列を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記アダプター配列が、前記第1または前記第2の核酸分子とハイブリダイズできないか、または相補的ではない、[3]に記載の方法。
[5]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が可変ドメインをコードする、[1]または[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記可変ドメインが、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、[1]に記載の方法。
[7]前記第1および/または前記第2のプライマー伸長産物が、定常ドメインをさらにコードする、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記細胞を溶解して前記第1の核酸および前記第2の核酸を放出させるステップをさらに含む、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記第1の核酸および前記第2の核酸を逆転写するステップをさらに含む、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記逆転写するステップが、RTプライマーを使用することによって実施される、[9]に記載の方法。
[11]前記RTプライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記RTプライマーの拡散を抑制する、[10]に記載の方法。
[12]鋳型スイッチ反応またはSSS反応を実施するステップをさらに含む、[1]~[11]のいずれかに記載の方法。
[13]前記第1の核酸および前記第2の核酸を増幅させて第1および第2の増幅産物を生成するステップをさらに含む、[1]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14]前記第1または前記第2の核酸の各々について、前記増幅させるステップが、第1の増幅プライマーおよび第2の増幅プライマーを使用することによって実施される、[13]に記載の方法。
[15]前記第1の増幅プライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記第1の増幅プライマーの拡散を抑制する、[14]に記載の方法。
[16]前記複数の硬化粒子を洗浄するステップをさらに含む、[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17]前記複数の硬化粒子を洗浄して、試薬が前記複数の硬化粒子から拡散することを可能にするステップをさらに含む、[16]に記載の方法。
[18]前記試薬が、RTプライマー、増幅プライマー、鋳型スイッチプライマー、SSSプライマー、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[17]に記載の方法。
[19]前記複数の硬化粒子を繰り返し洗浄するステップをさらに含む、[1]~[18]のいずれかに記載の方法。
[20]洗浄するステップの後に油中で前記複数の硬化粒子を乳化し、それによってさらなる複数のベッセルを形成するステップであって、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセルが前記複数の硬化粒子の単一の硬化粒子を含む、ステップをさらに含む、[6]~[19]のいずれかに記載の方法。
[21]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が拡散抑制剤に連結している、[1]~[20]のいずれかに記載の方法。
[22]前記拡散抑制剤がポリマーである、[11]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23]前記ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である、[22]に記載の方法。
[24]前記拡散抑制剤が粒子である、[21]に記載の方法。
[25]前記粒子が、前記マトリクスの孔径より大きい直径を有する、[24]に記載の方法。
[26]前記拡散抑制剤が前記マトリクスである、[21]~[25]のいずれかに記載の方法。
[27]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が、捕捉剤を介して前記拡散抑制剤に連結している、[21]~[26]のいずれかに記載の方法。
[28]前記捕捉剤が固定化部分を含む、[27]に記載の方法。
[29]前記固定化部分が、前記捕捉剤を前記拡散抑制剤に連結する、[28]に記載の方法。
[30]前記固定化部分が反応基を含む、[28]または[29]に記載の方法。
[31]前記捕捉剤がターゲティング部分をさらに含む、[27]~[30]のいずれかに記載の方法。
[32]前記ターゲティング部分が捕捉オリゴヌクレオチドである、[31]に記載の方法。
[33]前記第1の増幅プライマーが、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む、[14]~[32]のいずれかに記載の方法。
[34]前記第1および前記第2の増幅産物が、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含み、それによって前記第1および前記第2の増幅産物を前記捕捉剤に連結し、それによって前記拡散抑制剤に連結する、[14]~[33]のいずれかに記載の方法。
[35]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物を連結して、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセル内に融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それによって複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを有する前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成するステップをさらに含む、[20]~[34]のいずれかに記載の方法。
[36]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がライゲーションまたはPCRによって連結されている、[35]に記載の方法。
[37]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がホスホジエステル結合によって連結して連続ポリヌクレオチドを形成する、[35]または[36]に記載の方法。
[38]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がインフレームで連結している、[35]~[37]のいずれかに記載の方法。
[39]前記さらなる複数のベッセルから前記複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを放出させるステップをさらに含む、[35]~[38]のいずれかに記載の方法。
[40]前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを環状化させるステップをさらに含む、[39]に記載の方法。
[41]前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドをベクターに挿入するステップをさらに含む、[39]に記載の方法。
[42]前記ベクターが、自己増幅RNAレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである、[41]に記載の方法。
[43]前記ベクターがウイルスベクターである、[41]に記載の方法。
[44]前記ベクターが非ウイルスベクターである、[41]に記載の方法。
[45]前記二分免疫受容体が、T細胞受容体(TCR)またはB細胞受容体(BCR)である、[1]~[44]のいずれかに記載の方法。
[46]前記TCRが、TCRアルファペプチド鎖およびTCRベータペプチド鎖、またはTCRガンマペプチド鎖およびTCRデルタペプチド鎖を含み、前記BCRが、重ペプチド鎖および軽ペプチド鎖を含む、[45]に記載の方法。
[47]前記細胞が免疫細胞である、[1]~[46]のいずれかに記載の方法。
[48]前記免疫細胞がリンパ球である、[47]に記載の方法。
[49]前記リンパ球がT細胞またはB細胞である、[48]に記載の方法。
[50]前記T細胞が、炎症性T細胞、細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、ヘルパーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、またはそれらの組合せである、[49]に記載の方法。
[51]前記T細胞が、CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、[49]または[50]に記載の方法。
[52]前記B細胞が、形質芽球細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーB細胞、濾胞性B細胞、辺縁帯B細胞、B-1細胞、B-2細胞、または調節性B細胞である、[49]~[51]のいずれかに記載の方法。
[53]前記免疫細胞が、腫瘍組織または血液試料から単離される、[47]~[52]のいずれかに記載の方法。
[54]前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するステップをさらに含む、[35]~[53]のいずれかに記載の方法。
[55]前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーが、少なくとも50個の異なる融合二分免疫受容体配列を含む、[35]~[54]のいずれかに記載の方法。
[56]前記第1のペプチド鎖および前記第2のペプチド鎖が前記二分免疫受容体の同種対である、[1]~[55]のいずれかに記載の方法。
[57]前記ベッセルが液滴である、[1]~[56]のいずれかに記載の方法。
[58]前記液滴が油中水液滴である、[57]に記載の方法。
[59]前記硬化粒子がヒドロゲル粒子である、[1]~[58]のいずれかに記載の方法。
[60]前記ポリマーが、多糖、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せである、[1]~[59]のいずれかに記載の方法。
[61]前記多糖が、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、またはアルギネートである、[60]に記載の方法。
[62]前記モノマーが、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである、[1]~[61]のいずれかに記載の方法。
[63]前記重合またはゲル化した複数のポリマーおよび/またはモノマーが、アガロースおよびポリアクリルアミドの混合物を含む、[1]~[62]のいずれかに記載の方法。
[64]前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、開始剤を使用するステップを含む、[1]~[63]のいずれかに記載の方法。
[65]前記開始剤がUV光または化学物質である、[64]に記載の方法。
[66]前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、前記ベッセルの温度を低下させるステップを含む、[1]~[65]のいずれかに記載の方法。
[67]標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数のT細胞を準備するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が、前記複数のTCRのTCRの同種対を発現する、ステップと、
(b)前記複数のT細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞の個々のT細胞を含む、ステップと、
(c)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞の前記TCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、(i)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
(e)前記複数の細胞において複数のベクターから前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性TCRを発現する、ステップと、
(f)前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
(g)前記複数の細胞のサブセットの前記複数の標的反応性TCRの標的反応性TCRを同定するステップと
を含む、方法。
[68]送達するステップの前に、前記複数の融合ポリヌクレオチドを含む複数のベクターを生成するステップであって、前記複数のベクターの各ベクターが前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、[67]に記載の方法。
[69]前記複数の細胞が複数のレシピエント細胞である、[67]または[68]に記載の方法。
[70]前記内因性核酸が、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)である、[67]~[69]のいずれかに記載の方法。
[71]前記DNAがゲノムDNAである、[70]に記載の方法。
[72]前記RNAがメッセンジャーRNAである、[70]または[71]に記載の方法。
[73]接触させるステップが、細胞の集団を、前記1つまたは複数の標的抗原を提示する1つまたは複数の細胞と接触させるステップをさらに含む、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[74]前記1つまたは複数の細胞が、1つもしくは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞(APC)または前記1つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたAPCである、[73]に記載の方法。
[75]前記1つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAと共に送達される、[74]に記載の方法。
[76]接触させるステップが、前記細胞の集団を腫瘍組織と接触させるステップをさらに含む、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[77]前記1つまたは複数の標的抗原が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[78]前記MHCがMHC四量体である、[77]に記載の方法。
[79]前記第1のTCR鎖がTCRアルファ鎖であり、前記第2のTCR鎖がTCRベータ鎖である、[67]~[78]のいずれかに記載の方法。
[80]前記第1のTCR鎖がTCRガンマ鎖であり、前記第2のTCR鎖がTCRデルタ鎖である、[67]~[78]のいずれかに記載の方法。
[81]前記複数の細胞が細胞系細胞である、[67]~[80]のいずれかに記載の方法。
[82]前記細胞系細胞が、CHO-K1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2-OS細胞;NIH 3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHO-S細胞;DG44細胞;K-562細胞、U-937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;Jurkat細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT-1080細胞;HCT-116細胞;Hu-h7細胞;Huvec細胞;またはMolt4細胞である、[81]に記載の方法。
[83]前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、[67]~[80]のいずれかに記載の方法。
[84]前記複数のT細胞が、対象由来の試料から単離される、[67]~[82]のいずれかに記載の方法。
[85]前記試料が、腫瘍組織、血液試料、末梢血単核細胞(PBMC)試料、またはそれらの組合せである、[84]に記載の方法。
[86]前記腫瘍組織が多くても約2000mm3である、[85]に記載の方法。
[87]前記血液試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、[85]に記載の方法。
[88]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[67]~[87]のいずれか一項に記載の方法。
[89]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[67]~[88]のいずれかに記載の方法。
[90]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞を単離するステップをさらに含む、[67]~[89]のいずれかに記載の方法。
[91]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞がFACSによって単離される、[90]に記載の方法。
[92]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞がマーカーに基づいて単離される、[90]または[91]に記載の方法。
[93]前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、[92]に記載の方法。
[94]前記細胞表面マーカーが、CD39、CD69、CD103、CD25、PD-1、TIM-3、OX-40、4-1BB、CD137、CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、GITR、FoxP3、またはそれらの組合せである、[93]に記載の方法。
[95]前記サイトカインが、IFN-γ、TNF-アルファ、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムB、パーフォリン、またはそれらの組合せである、[93]または[94]に記載の方法。
[96](i)前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞を前記対象に投与するステップまたは(ii)同定された標的反応性TCRを含む自家もしくは同種異系間細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、[67]~[95]のいずれかに記載の方法。
[97]前記自家または前記同種異系間細胞が、前記同定された標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドを含む、[96]に記載の方法。
[98]前記同定された標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドが、前記融合ポリヌクレオチドもしくはその増幅産物であるか、または前記融合ポリヌクレオチドの前記第1のTCR鎖および前記第2のTCR鎖をコードする配列を含む、[97]に記載の方法。
[99]複数の標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数の細胞を準備するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数のTCRのTCRを発現し、前記複数のTCRが少なくとも50個の異なる同種対を含み、複数のV遺伝子由来のV領域を含み、前記複数のTCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと、
(b)前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
(c)前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも2つの細胞を同定するステップであって、少なくとも2つの細胞が前記複数の標的反応性TCRのうちの少なくとも2つの標的反応性TCRを発現し、それによって前記複数の標的反応性TCRのうちの前記少な
くとも2つの標的反応性TCRを同定する、ステップと
を含む、方法。
[100]前記複数のV遺伝子が、少なくとも10個の異なるV遺伝子を含む、[99]に記載の方法。
[101]前記複数の細胞が、複数の遺伝子操作された細胞である、[99]または[100]に記載の方法。
[102]前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、[99]~[101]のいずれかに記載の方法。
[103]前記試料が、組織試料、血液試料、PBMC試料、またはそれらの組合せである、[102]に記載の方法。
[104]前記複数のTCRが、少なくとも100個の異なる同種対を含む、[99]~[103]のいずれかに記載の方法。
[105]前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞を単離するステップをさらに含む、[99]~[104]のいずれかに記載の方法。
[106](b)が、前記複数の細胞を、前記1つまたは複数の標的抗原を提示する1つまたは複数の細胞と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[107]前記1つまたは複数の細胞が、1つまたは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞(APC)または前記1つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたAPCである、[106]に記載の方法。
[108]前記1つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAを含む、[107]に記載の方法。
[109](b)が、前記複数の細胞を腫瘍組織と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[110](b)が、前記複数の細胞を、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している前記1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[111]前記MHCがMHC四量体である、[110]に記載の方法。
[112]前記1つまたは複数の標的抗原の配列または同一性が知られていない、[99]~[111]のいずれかに記載の方法。
[113]前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞のうちの少なくとも1つを対象に投与するステップをさらに含む、[99]~[112]のいずれかに記載の方法。
[114]前記複数の細胞の各細胞がレポーター遺伝子を含み、前記細胞のTCRが前記1つまたは複数の標的抗原の標的抗原に結合すると、前記レポーター遺伝子がシグナルを送るように調節される、[99]~[113]のいずれかに記載の方法。
[115]前記複数の細胞が細胞系細胞である、[99]~[114]のいずれかに記載の方法。
[116]前記複数のTCRが、少なくとも100の異なるVJの組合せを含む、[99]~[115]のいずれかに記載の方法。
[117]前記複数のTCRが対象由来の試料からのTCRを含む、[99]~[116]のいずれかに記載の方法。
[118]前記対象が疾患または状態を有する、[117]に記載の方法。
[119]前記複数のTCRが、対象由来の腫瘍浸潤リンパ球を含む試料からのTCRを含む、[99]~[116]のいずれかに記載の方法。
[120]対象におけるがんを治療する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数のT細胞を準備するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が前記複数のTCRのTCRの同種対を発現する、ステップと、
(b)前記複数のT細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞の個々のT細胞を含む、ステップと、
(c)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞の前記TCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、(i)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
(e)前記複数の細胞において前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから複数の標的反応性TCRを発現する、ステップと、
(f)前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから前記複数の標的反応性TCRを同定するステップと、
(g)前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体を複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各細胞が、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体のうちの少なくとも1つを含む、ステップと、
(h)(i)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも1つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または(ii)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも2つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも2つのレシピエント細胞が異なるTCRを発現する、ステップと
を含む、方法。
[121]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[120]に記載の方法。
[122]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[120]または[121]に記載の方法。
[123]前記複数のT細胞が、in vitroで活性化され、および/または増殖する、[120]~[122]のいずれかに記載の方法。
[124]前記複数の融合ポリヌクレオチドが複数のベクターにおいて送達され、前記複数のベクターの各ベクターが、前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、[120]~[123]のいずれかに記載の方法。
[125](d)における送達するステップの前に、前記複数のベクターを生成するステップをさらに含む、[124]に記載の方法。
[126](f)における同定するステップが、前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが、前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップを含む、[120]~[125]のいずれかに記載の方法。
[127]前記1つまたは複数の標的抗原が、1つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、または人工APC(aAPC)によって提示される、[126]に記載の方法。
[128]前記1つまたは複数のAPCまたはaAPCが、(i)前記1つもしくは複数の標的抗原によってパルスされるか、または(ii)標的抗原をコードするDNAもしくはRNAを含む、[127]に記載の方法。
[129]前記1つまたは複数の抗原の各抗原が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している、[126]に記載の方法。
[130]前記MHCがMHC四量体である、[129]に記載の方法。
[131](g)における送達するステップの前に、前記複数の細胞のサブセットの1つまたは複数の細胞を単離するステップをさらに含む、[120]~[130]のいずれかに記載の方法。
[132]前記対象から前記複数のTCRを発現する前記複数のT細胞を単離するステップをさらに含む、[120]~[131]のいずれかに記載の方法。
[133]投与するステップが、前記複数のT細胞を単離してから多くても約60日後に実施される、[132]に記載の方法。
[134]前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間細胞、自家細胞、または細胞系細胞である、[120]~[133]のいずれかに記載の方法。
[135]前記複数の細胞が、遺伝子操作された細胞または細胞系細胞である、[120]~[134]のいずれかに記載の方法。
[136](h)の前に、前記複数のレシピエント細胞を増殖させるステップをさらに含む、[120]~[135]のいずれかに記載の方法。
[137]前記誘導体が、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの配列を含む、[120]~[136]のいずれかに記載の方法。
[138]前記誘導体が、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの増幅産物または合成産物である、[120]~[137]のいずれかに記載の方法。
[139]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)複数のT細胞受容体(TCR)を発現する前記対象から複数のT細胞を単離するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が、内因性核酸から前記複数のTCRのTCRの同種対を発現し、前記複数のTCRが複数の腫瘍反応性TCRを含む、ステップと、
(b)前記複数のTCRから前記複数の腫瘍反応性TCRを同定するステップと、
(c)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、(i)前記ポリヌクレオチドが前記内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記ポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数のレシピエント細胞において前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現させるステップと、
(e)(i)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも1つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または(ii)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも2つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも2つのレシピエント細胞が異なるTCRを発現する、ステップと
を含む、方法。
[140]ホスホロアミダイトを使用した前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドの化学合成を含まない、[139]に記載の方法。
[141]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[139または140]に記載の方法。
[142]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[139]~[141]のいずれかに記載の方法。
[143]前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間T細胞、自家T細胞、または細胞系細胞である、[139]~[142]のいずれかに記載の方法。
[144](b)の前に、複数のレポーター細胞において前記複数のTCRを発現させるステップをさらに含む、[139]~[143]のいずれかに記載の方法。
[145]発現させるステップが、ウイルスベクターによって前記複数のTCRをコードする核酸配列を送達するステップを含む、[144]に記載の方法。
[146]前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[145]に記載の方法。
[147]前記複数のレポーター細胞の各レポーター細胞がレポーター遺伝子を含む、[144]~[146]のいずれかに記載の方法。
[148](b)において、同定するステップが、前記複数のTCRを、1つもしくは複数の標的抗原、または1つもしくは複数の標的抗原を提示する細胞もしくは組織と接触させるステップを含む、[144]~[147]のいずれかに記載の方法。
[149]前記1つまたは複数の標的抗原が、1つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、人工APC(aAPC)によって提示される、[148]に記載の方法。
[150]前記1つまたは複数のAPCまたはaAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAを含む、[149]に記載の方法。
[151]前記1つまたは複数の標的抗原がMHCと複合体を形成している、[148]に記載の方法。
[152]前記MHCがMHC四量体である、[151]に記載の方法。
[153]前記複数のTCRの前記複数の腫瘍反応性TCRが、TCRの少なくとも2つの異なる同種対を含む、[144]~[152]のいずれかに記載の方法。
[154]前記複数の腫瘍反応性TCRの各TCRが、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的である、[144]~[153]のいずれかに記載の方法。
[155]前記複数の腫瘍反応性TCRの各TCRが、異なる(i)TCRアルファCDR3配列、(ii)TCRベータCDR3可変ドメイン配列、(iii)TCRアルファ可変ドメイン配列、(iv)TCRベータ可変ドメイン配列、または(v)TCRアルファおよびTCRベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、[144]~[154]のいずれかに記載の方法。
[156]前記複数の腫瘍反応性TCRが、前記対象由来の腫瘍細胞に結合するが、前記対象由来の健康な細胞に結合しないか、または前記腫瘍細胞に対してより少なくとも10倍低い親和性で前記対象由来の健康な細胞に結合する、[144]~[155]のいずれかに記載の方法。
[157](e)において投与される前記複数のレシピエント細胞が、(a)において単離される前記複数のT細胞より少なくとも10倍多い細胞を含む、[144]~[156]のいずれかに記載の方法。
[158]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)T細胞受容体(TCR)の集団を発現する前記対象からT細胞の集団を単離するステップであって、前記T細胞の集団が多くても約10,000個の細胞を含む、ステップと、
(b)前記TCRの集団から複数の腫瘍反応性TCRを同定するステップと、
(c)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが少なくとも2個の異なる同種対を含む、ステップと
を含む、方法。
[159]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)TCRの集団から複数の腫瘍反応性T細胞受容体(TCR)を同定するステップであって、前記TCRの集団がTCRの少なくとも50個の異なる同種対を含む、ステップと、
(b)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが、少なくとも50個の異なる同種対のうちの少なくとも5個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと
を含む、方法。
[160]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)TCRの集団から同定された複数の腫瘍反応性TCRを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記TCRの集団がTCRの少なくとも50個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが、前記少なくとも50個の異なる同種対のうちの少なくとも5個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップ
を含む、方法。
[161]前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが少なくとも5個のTCRを含み、前記少なくとも5個のTCRの各TCRが、(1)異なるエピトープもしくは異なるタンパク質に特異的であるか、または(2)異なる(i)TCRアルファCDR3配列、(ii)TCRベータCDR3可変ドメイン配列、(iii)TCRアルファ可変ドメイン配列、(iv)TCRベータ可変ドメイン配列、もしくは(v)TCRアルファおよびTCRベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、[159]または[160]に記載の方法。
[162](a)の前に、前記対象から前記TCRの集団を発現するT細胞の集団を単離するステップをさらに含む、[159]~[161]のいずれかに記載の方法。
[163]前記少なくとも50個の異なる同種対が、少なくとも5個の異なるV遺伝子由来のV領域を含む、[159]~[162]のいずれかに記載の方法。
[164]同定するステップが、マーカーによって前記複数の腫瘍反応性TCRを単離するステップを含む、[159]~[163]のいずれかに記載の方法。
[165]前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する前記複数の細胞が、複数の同種異系間細胞、自家細胞または細胞系細胞である、[159]~[164]のいずれかに記載の方法。
[166]前記複数の同種異系間細胞が、抑制性ナチュラルキラー(NK)細胞受容体に結合するタンパク質を発現する、[165]に記載の方法。
[167]前記タンパク質が、B2M-HLA-EまたはB2M-HLA-G融合タンパク質である、[166]に記載の方法。
[168]標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定するための方法であって、
(a)第1の試料由来の複数のT細胞を、対象由来の腫瘍細胞を含む第2の試料または第3の試料と接触させるステップであって、前記第3の試料が前記第2の試料に由来し、前記第3の試料が、
(i)前記第2の試料の前記腫瘍細胞由来の標的抗原または前記標的抗原をコードする核酸、およびMHC、
(ii)MHCにおける前記標的抗原を提示する細胞、または
(iii)MHCを含む細胞および前記核酸によってコードされるタンパク質産物
を含み、
前記複数のT細胞のサブセットが、前記MHCと複合体を形成している前記標的抗原に
結合する、ステップと、
(b)前記第1の試料の前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップと、
(c)前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部の個々のT細胞を含む、ステップと、
(d)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを同定し、それによって1つまたは複数の対合ポリヌクレオチドを生成するステップと
を含む、方法。
[169]同定するステップが、前記第1のTCR鎖をコードする前記第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の前記第2のTCR鎖をコードする前記第2のポリヌクレオチドを物理的に連結させるステップを含む、[168]に記載の方法。
[170]前記1つまたは複数の対合ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドである、[168]または[169]に記載の方法。
[171]同定するステップが、シークエンシングによって前記第1のTCR鎖をコードする前記第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の前記第2のTCR鎖をコードする前記第2のポリヌクレオチドを連結させるステップを含む、[168]に記載の方法。
[172]前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが、ホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、[168]~[170]のいずれかに記載の方法。
[173]前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが、前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物または増幅産物である、[168]~[170]のいずれかに記載の方法。
[174]前記第1の試料または前記第2の試料が対象から単離される、[168]~[173]のいずれかに記載の方法。
[175]前記第1の試料および前記第2の試料が同じ対象から単離される、[168]~[174]のいずれかに記載の方法。
[176]前記第1の試料および前記第2の試料が異なる対象から単離される、[168]~[174]のいずれかに記載の方法。
[177]前記第1の試料または前記第2の試料が、組織試料、血液試料、PBMC試料、またはそれらの組合せである、[168]~[176]のいずれかに記載の方法。
[178]前記組織試料が、腫瘍組織または健康な組織である、[177]に記載の方法。
[179]前記第1の試料または前記第2の試料が、コア生検、細針生検、またはアフェレーシスによって対象から単離される、[168]~[178]のいずれかに記載の方法。
[180]単離するステップが、マーカーによって前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップを含む、[168]~[179]のいずれかに記載の方法。
[181]前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、[180]に記載の方法。
[182]前記細胞表面マーカーが、CD39、CD69、CD103、CD25、PD-1、TIM-3、OX-40、4-1BB、CD137、CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、GITR、FoxP3、またはそれらの組合せである、[181]に記載の方法。
[183]前記標的抗原を提示する細胞が、腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、または人工APC(aAPC)である、[168]~[181]のいずれかに記載の方法。
[184]前記APCまたは前記aAPCが、前記標的抗原によりパルスされる、[183]に記載の方法。
[185]前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記核酸またはその誘導体と共に送達されるAPCまたはaAPCである、[168]~[184]のいずれかに記載の方法。
[186]前記APCまたは前記aAPCが、前記MHCをコードするさらなる核酸と共にさらに送達される、[185]に記載の方法。
[187]前記核酸またはその誘導体がDNAまたはRNAである、[185または186]に記載の方法。
[188]前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、対象から単離されるか、または細胞系細胞である、[168]~[187]のいずれかに記載の方法。
[189]前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記第1の試料および前記第2の試料が単離される同じ対象から単離される、[188]に記載の方法。
[190]前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを含む1つまたは複数のベクターを生成するステップであって、前記1つまたは複数のベクターの各ベクターが、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、[168]~[189]のいずれかに記載の方法。
[191]前記1つまたは複数のベクターを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記1つまたは複数のベクターのうちの少なくとも1つのベクターを含む、ステップをさらに含む、[190]に記載の方法。
[192]前記複数の細胞において前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性TCRを発現する、ステップをさらに含む、[191]に記載の方法。
[193]前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップをさらに含む、[192]に記載の方法。
[194]前記複数の標的反応性TCRの1つまたは複数の標的反応性TCRを同定するステップをさらに含む、[193]に記載の方法。
[195]前記1つまたは複数の標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップをさらに含む、[194]に記載の方法。
[196]前記複数のレシピエント細胞の1つまたは複数の細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、[195]に記載の方法。
[197][67]~[116および168]~[196]のいずれかに記載の方法によって同定される標的反応性または腫瘍反応性TCRをコードする配列を含むレシピエント細胞を含む医薬組成物。
[198][197]に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、レシピエント細胞を投与する方法。
直接発現のためのTCRの同種対をコードする融合核酸分子を提供することができる。組成物および方法はまた、B細胞受容体(BCR)などの他の二分免疫受容体にも適用され得る。本明細書は以下の発明の開示を包含する。
[1]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを調製するための方法であって、
(a)複数のベッセルを生成するステップであって、各々が、(1)二分免疫受容体の第1のペプチド鎖をコードする第1の核酸および前記二分免疫受容体の第2のペプチド鎖をコードする第2の核酸を含む細胞と、(2)複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーとを含む、ステップと、
(b)前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化して複数の硬化粒子を形成するステップであって、前記複数の硬化粒子のそれぞれが重合またはゲル化した複数のポリマーおよび/またはモノマーからなるマトリクスを有し、前記複数の硬化粒子のそれぞれが前記第1の核酸の第1のプライマー伸長産物および前記第2の核酸の第2のプライマー伸長産物を含み、前記第1のプライマー伸長産物および前記第2のプライマー伸長産物が前記マトリクス内に包埋または封入されており、前記第1のプライマー伸長産物および前記第2のプライマー伸長産物の拡散が抑制される、ステップと
を含む、方法。
[2]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が、逆転写(RT)産物、第2の鎖合成(SSS)産物、または増幅産物である、[1]に記載の方法。
[3]前記第1および/または前記第2のプライマー伸長産物がアダプター配列を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記アダプター配列が、前記第1または前記第2の核酸分子とハイブリダイズできないか、または相補的ではない、[3]に記載の方法。
[5]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が可変ドメインをコードする、[1]または[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記可変ドメインが、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、[1]に記載の方法。
[7]前記第1および/または前記第2のプライマー伸長産物が、定常ドメインをさらにコードする、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記細胞を溶解して前記第1の核酸および前記第2の核酸を放出させるステップをさらに含む、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記第1の核酸および前記第2の核酸を逆転写するステップをさらに含む、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記逆転写するステップが、RTプライマーを使用することによって実施される、[9]に記載の方法。
[11]前記RTプライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記RTプライマーの拡散を抑制する、[10]に記載の方法。
[12]鋳型スイッチ反応またはSSS反応を実施するステップをさらに含む、[1]~[11]のいずれかに記載の方法。
[13]前記第1の核酸および前記第2の核酸を増幅させて第1および第2の増幅産物を生成するステップをさらに含む、[1]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14]前記第1または前記第2の核酸の各々について、前記増幅させるステップが、第1の増幅プライマーおよび第2の増幅プライマーを使用することによって実施される、[13]に記載の方法。
[15]前記第1の増幅プライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記第1の増幅プライマーの拡散を抑制する、[14]に記載の方法。
[16]前記複数の硬化粒子を洗浄するステップをさらに含む、[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17]前記複数の硬化粒子を洗浄して、試薬が前記複数の硬化粒子から拡散することを可能にするステップをさらに含む、[16]に記載の方法。
[18]前記試薬が、RTプライマー、増幅プライマー、鋳型スイッチプライマー、SSSプライマー、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[17]に記載の方法。
[19]前記複数の硬化粒子を繰り返し洗浄するステップをさらに含む、[1]~[18]のいずれかに記載の方法。
[20]洗浄するステップの後に油中で前記複数の硬化粒子を乳化し、それによってさらなる複数のベッセルを形成するステップであって、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセルが前記複数の硬化粒子の単一の硬化粒子を含む、ステップをさらに含む、[6]~[19]のいずれかに記載の方法。
[21]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が拡散抑制剤に連結している、[1]~[20]のいずれかに記載の方法。
[22]前記拡散抑制剤がポリマーである、[11]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23]前記ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である、[22]に記載の方法。
[24]前記拡散抑制剤が粒子である、[21]に記載の方法。
[25]前記粒子が、前記マトリクスの孔径より大きい直径を有する、[24]に記載の方法。
[26]前記拡散抑制剤が前記マトリクスである、[21]~[25]のいずれかに記載の方法。
[27]前記第1および前記第2のプライマー伸長産物が、捕捉剤を介して前記拡散抑制剤に連結している、[21]~[26]のいずれかに記載の方法。
[28]前記捕捉剤が固定化部分を含む、[27]に記載の方法。
[29]前記固定化部分が、前記捕捉剤を前記拡散抑制剤に連結する、[28]に記載の方法。
[30]前記固定化部分が反応基を含む、[28]または[29]に記載の方法。
[31]前記捕捉剤がターゲティング部分をさらに含む、[27]~[30]のいずれかに記載の方法。
[32]前記ターゲティング部分が捕捉オリゴヌクレオチドである、[31]に記載の方法。
[33]前記第1の増幅プライマーが、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む、[14]~[32]のいずれかに記載の方法。
[34]前記第1および前記第2の増幅産物が、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含み、それによって前記第1および前記第2の増幅産物を前記捕捉剤に連結し、それによって前記拡散抑制剤に連結する、[14]~[33]のいずれかに記載の方法。
[35]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物を連結して、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセル内に融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それによって複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを有する前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成するステップをさらに含む、[20]~[34]のいずれかに記載の方法。
[36]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がライゲーションまたはPCRによって連結されている、[35]に記載の方法。
[37]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がホスホジエステル結合によって連結して連続ポリヌクレオチドを形成する、[35]または[36]に記載の方法。
[38]前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物がインフレームで連結している、[35]~[37]のいずれかに記載の方法。
[39]前記さらなる複数のベッセルから前記複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを放出させるステップをさらに含む、[35]~[38]のいずれかに記載の方法。
[40]前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを環状化させるステップをさらに含む、[39]に記載の方法。
[41]前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドをベクターに挿入するステップをさらに含む、[39]に記載の方法。
[42]前記ベクターが、自己増幅RNAレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである、[41]に記載の方法。
[43]前記ベクターがウイルスベクターである、[41]に記載の方法。
[44]前記ベクターが非ウイルスベクターである、[41]に記載の方法。
[45]前記二分免疫受容体が、T細胞受容体(TCR)またはB細胞受容体(BCR)である、[1]~[44]のいずれかに記載の方法。
[46]前記TCRが、TCRアルファペプチド鎖およびTCRベータペプチド鎖、またはTCRガンマペプチド鎖およびTCRデルタペプチド鎖を含み、前記BCRが、重ペプチド鎖および軽ペプチド鎖を含む、[45]に記載の方法。
[47]前記細胞が免疫細胞である、[1]~[46]のいずれかに記載の方法。
[48]前記免疫細胞がリンパ球である、[47]に記載の方法。
[49]前記リンパ球がT細胞またはB細胞である、[48]に記載の方法。
[50]前記T細胞が、炎症性T細胞、細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、ヘルパーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、またはそれらの組合せである、[49]に記載の方法。
[51]前記T細胞が、CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、[49]または[50]に記載の方法。
[52]前記B細胞が、形質芽球細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーB細胞、濾胞性B細胞、辺縁帯B細胞、B-1細胞、B-2細胞、または調節性B細胞である、[49]~[51]のいずれかに記載の方法。
[53]前記免疫細胞が、腫瘍組織または血液試料から単離される、[47]~[52]のいずれかに記載の方法。
[54]前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するステップをさらに含む、[35]~[53]のいずれかに記載の方法。
[55]前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーが、少なくとも50個の異なる融合二分免疫受容体配列を含む、[35]~[54]のいずれかに記載の方法。
[56]前記第1のペプチド鎖および前記第2のペプチド鎖が前記二分免疫受容体の同種対である、[1]~[55]のいずれかに記載の方法。
[57]前記ベッセルが液滴である、[1]~[56]のいずれかに記載の方法。
[58]前記液滴が油中水液滴である、[57]に記載の方法。
[59]前記硬化粒子がヒドロゲル粒子である、[1]~[58]のいずれかに記載の方法。
[60]前記ポリマーが、多糖、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せである、[1]~[59]のいずれかに記載の方法。
[61]前記多糖が、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、またはアルギネートである、[60]に記載の方法。
[62]前記モノマーが、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである、[1]~[61]のいずれかに記載の方法。
[63]前記重合またはゲル化した複数のポリマーおよび/またはモノマーが、アガロースおよびポリアクリルアミドの混合物を含む、[1]~[62]のいずれかに記載の方法。
[64]前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、開始剤を使用するステップを含む、[1]~[63]のいずれかに記載の方法。
[65]前記開始剤がUV光または化学物質である、[64]に記載の方法。
[66]前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび/またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、前記ベッセルの温度を低下させるステップを含む、[1]~[65]のいずれかに記載の方法。
[67]標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数のT細胞を準備するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が、前記複数のTCRのTCRの同種対を発現する、ステップと、
(b)前記複数のT細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞の個々のT細胞を含む、ステップと、
(c)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞の前記TCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、(i)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
(e)前記複数の細胞において複数のベクターから前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性TCRを発現する、ステップと、
(f)前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
(g)前記複数の細胞のサブセットの前記複数の標的反応性TCRの標的反応性TCRを同定するステップと
を含む、方法。
[68]送達するステップの前に、前記複数の融合ポリヌクレオチドを含む複数のベクターを生成するステップであって、前記複数のベクターの各ベクターが前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、[67]に記載の方法。
[69]前記複数の細胞が複数のレシピエント細胞である、[67]または[68]に記載の方法。
[70]前記内因性核酸が、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)である、[67]~[69]のいずれかに記載の方法。
[71]前記DNAがゲノムDNAである、[70]に記載の方法。
[72]前記RNAがメッセンジャーRNAである、[70]または[71]に記載の方法。
[73]接触させるステップが、細胞の集団を、前記1つまたは複数の標的抗原を提示する1つまたは複数の細胞と接触させるステップをさらに含む、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[74]前記1つまたは複数の細胞が、1つもしくは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞(APC)または前記1つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたAPCである、[73]に記載の方法。
[75]前記1つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAと共に送達される、[74]に記載の方法。
[76]接触させるステップが、前記細胞の集団を腫瘍組織と接触させるステップをさらに含む、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[77]前記1つまたは複数の標的抗原が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している、[67]~[72]のいずれかに記載の方法。
[78]前記MHCがMHC四量体である、[77]に記載の方法。
[79]前記第1のTCR鎖がTCRアルファ鎖であり、前記第2のTCR鎖がTCRベータ鎖である、[67]~[78]のいずれかに記載の方法。
[80]前記第1のTCR鎖がTCRガンマ鎖であり、前記第2のTCR鎖がTCRデルタ鎖である、[67]~[78]のいずれかに記載の方法。
[81]前記複数の細胞が細胞系細胞である、[67]~[80]のいずれかに記載の方法。
[82]前記細胞系細胞が、CHO-K1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2-OS細胞;NIH 3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHO-S細胞;DG44細胞;K-562細胞、U-937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;Jurkat細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT-1080細胞;HCT-116細胞;Hu-h7細胞;Huvec細胞;またはMolt4細胞である、[81]に記載の方法。
[83]前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、[67]~[80]のいずれかに記載の方法。
[84]前記複数のT細胞が、対象由来の試料から単離される、[67]~[82]のいずれかに記載の方法。
[85]前記試料が、腫瘍組織、血液試料、末梢血単核細胞(PBMC)試料、またはそれらの組合せである、[84]に記載の方法。
[86]前記腫瘍組織が多くても約2000mm3である、[85]に記載の方法。
[87]前記血液試料が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、[85]に記載の方法。
[88]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[67]~[87]のいずれか一項に記載の方法。
[89]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[67]~[88]のいずれかに記載の方法。
[90]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞を単離するステップをさらに含む、[67]~[89]のいずれかに記載の方法。
[91]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞がFACSによって単離される、[90]に記載の方法。
[92]前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞がマーカーに基づいて単離される、[90]または[91]に記載の方法。
[93]前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、[92]に記載の方法。
[94]前記細胞表面マーカーが、CD39、CD69、CD103、CD25、PD-1、TIM-3、OX-40、4-1BB、CD137、CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、GITR、FoxP3、またはそれらの組合せである、[93]に記載の方法。
[95]前記サイトカインが、IFN-γ、TNF-アルファ、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムB、パーフォリン、またはそれらの組合せである、[93]または[94]に記載の方法。
[96](i)前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも1つの細胞を前記対象に投与するステップまたは(ii)同定された標的反応性TCRを含む自家もしくは同種異系間細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、[67]~[95]のいずれかに記載の方法。
[97]前記自家または前記同種異系間細胞が、前記同定された標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドを含む、[96]に記載の方法。
[98]前記同定された標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドが、前記融合ポリヌクレオチドもしくはその増幅産物であるか、または前記融合ポリヌクレオチドの前記第1のTCR鎖および前記第2のTCR鎖をコードする配列を含む、[97]に記載の方法。
[99]複数の標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数の細胞を準備するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数のTCRのTCRを発現し、前記複数のTCRが少なくとも50個の異なる同種対を含み、複数のV遺伝子由来のV領域を含み、前記複数のTCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと、
(b)前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
(c)前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも2つの細胞を同定するステップであって、少なくとも2つの細胞が前記複数の標的反応性TCRのうちの少なくとも2つの標的反応性TCRを発現し、それによって前記複数の標的反応性TCRのうちの前記少な
くとも2つの標的反応性TCRを同定する、ステップと
を含む、方法。
[100]前記複数のV遺伝子が、少なくとも10個の異なるV遺伝子を含む、[99]に記載の方法。
[101]前記複数の細胞が、複数の遺伝子操作された細胞である、[99]または[100]に記載の方法。
[102]前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、[99]~[101]のいずれかに記載の方法。
[103]前記試料が、組織試料、血液試料、PBMC試料、またはそれらの組合せである、[102]に記載の方法。
[104]前記複数のTCRが、少なくとも100個の異なる同種対を含む、[99]~[103]のいずれかに記載の方法。
[105]前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞を単離するステップをさらに含む、[99]~[104]のいずれかに記載の方法。
[106](b)が、前記複数の細胞を、前記1つまたは複数の標的抗原を提示する1つまたは複数の細胞と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[107]前記1つまたは複数の細胞が、1つまたは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞(APC)または前記1つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたAPCである、[106]に記載の方法。
[108]前記1つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAを含む、[107]に記載の方法。
[109](b)が、前記複数の細胞を腫瘍組織と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[110](b)が、前記複数の細胞を、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している前記1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップを含む、[99]~[105]のいずれかに記載の方法。
[111]前記MHCがMHC四量体である、[110]に記載の方法。
[112]前記1つまたは複数の標的抗原の配列または同一性が知られていない、[99]~[111]のいずれかに記載の方法。
[113]前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞のうちの少なくとも1つを対象に投与するステップをさらに含む、[99]~[112]のいずれかに記載の方法。
[114]前記複数の細胞の各細胞がレポーター遺伝子を含み、前記細胞のTCRが前記1つまたは複数の標的抗原の標的抗原に結合すると、前記レポーター遺伝子がシグナルを送るように調節される、[99]~[113]のいずれかに記載の方法。
[115]前記複数の細胞が細胞系細胞である、[99]~[114]のいずれかに記載の方法。
[116]前記複数のTCRが、少なくとも100の異なるVJの組合せを含む、[99]~[115]のいずれかに記載の方法。
[117]前記複数のTCRが対象由来の試料からのTCRを含む、[99]~[116]のいずれかに記載の方法。
[118]前記対象が疾患または状態を有する、[117]に記載の方法。
[119]前記複数のTCRが、対象由来の腫瘍浸潤リンパ球を含む試料からのTCRを含む、[99]~[116]のいずれかに記載の方法。
[120]対象におけるがんを治療する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数のT細胞を準備するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が前記複数のTCRのTCRの同種対を発現する、ステップと、
(b)前記複数のT細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞の個々のT細胞を含む、ステップと、
(c)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞の前記TCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、(i)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
(e)前記複数の細胞において前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから複数の標的反応性TCRを発現する、ステップと、
(f)前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから前記複数の標的反応性TCRを同定するステップと、
(g)前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体を複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各細胞が、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体のうちの少なくとも1つを含む、ステップと、
(h)(i)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも1つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または(ii)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも2つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも2つのレシピエント細胞が異なるTCRを発現する、ステップと
を含む、方法。
[121]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[120]に記載の方法。
[122]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[120]または[121]に記載の方法。
[123]前記複数のT細胞が、in vitroで活性化され、および/または増殖する、[120]~[122]のいずれかに記載の方法。
[124]前記複数の融合ポリヌクレオチドが複数のベクターにおいて送達され、前記複数のベクターの各ベクターが、前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、[120]~[123]のいずれかに記載の方法。
[125](d)における送達するステップの前に、前記複数のベクターを生成するステップをさらに含む、[124]に記載の方法。
[126](f)における同定するステップが、前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが、前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップを含む、[120]~[125]のいずれかに記載の方法。
[127]前記1つまたは複数の標的抗原が、1つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、または人工APC(aAPC)によって提示される、[126]に記載の方法。
[128]前記1つまたは複数のAPCまたはaAPCが、(i)前記1つもしくは複数の標的抗原によってパルスされるか、または(ii)標的抗原をコードするDNAもしくはRNAを含む、[127]に記載の方法。
[129]前記1つまたは複数の抗原の各抗原が、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している、[126]に記載の方法。
[130]前記MHCがMHC四量体である、[129]に記載の方法。
[131](g)における送達するステップの前に、前記複数の細胞のサブセットの1つまたは複数の細胞を単離するステップをさらに含む、[120]~[130]のいずれかに記載の方法。
[132]前記対象から前記複数のTCRを発現する前記複数のT細胞を単離するステップをさらに含む、[120]~[131]のいずれかに記載の方法。
[133]投与するステップが、前記複数のT細胞を単離してから多くても約60日後に実施される、[132]に記載の方法。
[134]前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間細胞、自家細胞、または細胞系細胞である、[120]~[133]のいずれかに記載の方法。
[135]前記複数の細胞が、遺伝子操作された細胞または細胞系細胞である、[120]~[134]のいずれかに記載の方法。
[136](h)の前に、前記複数のレシピエント細胞を増殖させるステップをさらに含む、[120]~[135]のいずれかに記載の方法。
[137]前記誘導体が、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの配列を含む、[120]~[136]のいずれかに記載の方法。
[138]前記誘導体が、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの増幅産物または合成産物である、[120]~[137]のいずれかに記載の方法。
[139]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)複数のT細胞受容体(TCR)を発現する前記対象から複数のT細胞を単離するステップであって、前記複数のT細胞の各T細胞が、内因性核酸から前記複数のTCRのTCRの同種対を発現し、前記複数のTCRが複数の腫瘍反応性TCRを含む、ステップと、
(b)前記複数のTCRから前記複数の腫瘍反応性TCRを同定するステップと、
(c)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、(i)前記ポリヌクレオチドが前記内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または(ii)前記ポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
(d)前記複数のレシピエント細胞において前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現させるステップと、
(e)(i)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも1つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または(ii)前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも2つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも2つのレシピエント細胞が異なるTCRを発現する、ステップと
を含む、方法。
[140]ホスホロアミダイトを使用した前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドの化学合成を含まない、[139]に記載の方法。
[141]前記複数のT細胞が、腫瘍浸潤T細胞または末梢T細胞である、[139または140]に記載の方法。
[142]前記複数のT細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、疲弊T細胞、調節性T細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、[139]~[141]のいずれかに記載の方法。
[143]前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間T細胞、自家T細胞、または細胞系細胞である、[139]~[142]のいずれかに記載の方法。
[144](b)の前に、複数のレポーター細胞において前記複数のTCRを発現させるステップをさらに含む、[139]~[143]のいずれかに記載の方法。
[145]発現させるステップが、ウイルスベクターによって前記複数のTCRをコードする核酸配列を送達するステップを含む、[144]に記載の方法。
[146]前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[145]に記載の方法。
[147]前記複数のレポーター細胞の各レポーター細胞がレポーター遺伝子を含む、[144]~[146]のいずれかに記載の方法。
[148](b)において、同定するステップが、前記複数のTCRを、1つもしくは複数の標的抗原、または1つもしくは複数の標的抗原を提示する細胞もしくは組織と接触させるステップを含む、[144]~[147]のいずれかに記載の方法。
[149]前記1つまたは複数の標的抗原が、1つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、人工APC(aAPC)によって提示される、[148]に記載の方法。
[150]前記1つまたは複数のAPCまたはaAPCが、標的抗原をコードするDNAまたはRNAを含む、[149]に記載の方法。
[151]前記1つまたは複数の標的抗原がMHCと複合体を形成している、[148]に記載の方法。
[152]前記MHCがMHC四量体である、[151]に記載の方法。
[153]前記複数のTCRの前記複数の腫瘍反応性TCRが、TCRの少なくとも2つの異なる同種対を含む、[144]~[152]のいずれかに記載の方法。
[154]前記複数の腫瘍反応性TCRの各TCRが、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的である、[144]~[153]のいずれかに記載の方法。
[155]前記複数の腫瘍反応性TCRの各TCRが、異なる(i)TCRアルファCDR3配列、(ii)TCRベータCDR3可変ドメイン配列、(iii)TCRアルファ可変ドメイン配列、(iv)TCRベータ可変ドメイン配列、または(v)TCRアルファおよびTCRベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、[144]~[154]のいずれかに記載の方法。
[156]前記複数の腫瘍反応性TCRが、前記対象由来の腫瘍細胞に結合するが、前記対象由来の健康な細胞に結合しないか、または前記腫瘍細胞に対してより少なくとも10倍低い親和性で前記対象由来の健康な細胞に結合する、[144]~[155]のいずれかに記載の方法。
[157](e)において投与される前記複数のレシピエント細胞が、(a)において単離される前記複数のT細胞より少なくとも10倍多い細胞を含む、[144]~[156]のいずれかに記載の方法。
[158]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)T細胞受容体(TCR)の集団を発現する前記対象からT細胞の集団を単離するステップであって、前記T細胞の集団が多くても約10,000個の細胞を含む、ステップと、
(b)前記TCRの集団から複数の腫瘍反応性TCRを同定するステップと、
(c)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが少なくとも2個の異なる同種対を含む、ステップと
を含む、方法。
[159]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)TCRの集団から複数の腫瘍反応性T細胞受容体(TCR)を同定するステップであって、前記TCRの集団がTCRの少なくとも50個の異なる同種対を含む、ステップと、
(b)前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが、少なくとも50個の異なる同種対のうちの少なくとも5個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと
を含む、方法。
[160]対象における腫瘍を治療する方法であって、
(a)TCRの集団から同定された複数の腫瘍反応性TCRを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記TCRの集団がTCRの少なくとも50個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが、前記少なくとも50個の異なる同種対のうちの少なくとも5個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性TCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップ
を含む、方法。
[161]前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットが少なくとも5個のTCRを含み、前記少なくとも5個のTCRの各TCRが、(1)異なるエピトープもしくは異なるタンパク質に特異的であるか、または(2)異なる(i)TCRアルファCDR3配列、(ii)TCRベータCDR3可変ドメイン配列、(iii)TCRアルファ可変ドメイン配列、(iv)TCRベータ可変ドメイン配列、もしくは(v)TCRアルファおよびTCRベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、[159]または[160]に記載の方法。
[162](a)の前に、前記対象から前記TCRの集団を発現するT細胞の集団を単離するステップをさらに含む、[159]~[161]のいずれかに記載の方法。
[163]前記少なくとも50個の異なる同種対が、少なくとも5個の異なるV遺伝子由来のV領域を含む、[159]~[162]のいずれかに記載の方法。
[164]同定するステップが、マーカーによって前記複数の腫瘍反応性TCRを単離するステップを含む、[159]~[163]のいずれかに記載の方法。
[165]前記複数の腫瘍反応性TCRまたはそのサブセットを発現する前記複数の細胞が、複数の同種異系間細胞、自家細胞または細胞系細胞である、[159]~[164]のいずれかに記載の方法。
[166]前記複数の同種異系間細胞が、抑制性ナチュラルキラー(NK)細胞受容体に結合するタンパク質を発現する、[165]に記載の方法。
[167]前記タンパク質が、B2M-HLA-EまたはB2M-HLA-G融合タンパク質である、[166]に記載の方法。
[168]標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定するための方法であって、
(a)第1の試料由来の複数のT細胞を、対象由来の腫瘍細胞を含む第2の試料または第3の試料と接触させるステップであって、前記第3の試料が前記第2の試料に由来し、前記第3の試料が、
(i)前記第2の試料の前記腫瘍細胞由来の標的抗原または前記標的抗原をコードする核酸、およびMHC、
(ii)MHCにおける前記標的抗原を提示する細胞、または
(iii)MHCを含む細胞および前記核酸によってコードされるタンパク質産物
を含み、
前記複数のT細胞のサブセットが、前記MHCと複合体を形成している前記標的抗原に
結合する、ステップと、
(b)前記第1の試料の前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップと、
(c)前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部の個々のT細胞を含む、ステップと、
(d)各区画内で、第1のTCR鎖をコードする第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の第2のTCR鎖をコードする第2のポリヌクレオチドを同定し、それによって1つまたは複数の対合ポリヌクレオチドを生成するステップと
を含む、方法。
[169]同定するステップが、前記第1のTCR鎖をコードする前記第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の前記第2のTCR鎖をコードする前記第2のポリヌクレオチドを物理的に連結させるステップを含む、[168]に記載の方法。
[170]前記1つまたは複数の対合ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドである、[168]または[169]に記載の方法。
[171]同定するステップが、シークエンシングによって前記第1のTCR鎖をコードする前記第1のポリヌクレオチドおよび前記個々のT細胞のTCRの同種対の前記第2のTCR鎖をコードする前記第2のポリヌクレオチドを連結させるステップを含む、[168]に記載の方法。
[172]前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが、ホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、[168]~[170]のいずれかに記載の方法。
[173]前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第2のポリヌクレオチドが、前記個々のT細胞の内因性核酸の転写産物または増幅産物である、[168]~[170]のいずれかに記載の方法。
[174]前記第1の試料または前記第2の試料が対象から単離される、[168]~[173]のいずれかに記載の方法。
[175]前記第1の試料および前記第2の試料が同じ対象から単離される、[168]~[174]のいずれかに記載の方法。
[176]前記第1の試料および前記第2の試料が異なる対象から単離される、[168]~[174]のいずれかに記載の方法。
[177]前記第1の試料または前記第2の試料が、組織試料、血液試料、PBMC試料、またはそれらの組合せである、[168]~[176]のいずれかに記載の方法。
[178]前記組織試料が、腫瘍組織または健康な組織である、[177]に記載の方法。
[179]前記第1の試料または前記第2の試料が、コア生検、細針生検、またはアフェレーシスによって対象から単離される、[168]~[178]のいずれかに記載の方法。
[180]単離するステップが、マーカーによって前記複数のT細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップを含む、[168]~[179]のいずれかに記載の方法。
[181]前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、[180]に記載の方法。
[182]前記細胞表面マーカーが、CD39、CD69、CD103、CD25、PD-1、TIM-3、OX-40、4-1BB、CD137、CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、GITR、FoxP3、またはそれらの組合せである、[181]に記載の方法。
[183]前記標的抗原を提示する細胞が、腫瘍細胞、抗原提示細胞(APC)、または人工APC(aAPC)である、[168]~[181]のいずれかに記載の方法。
[184]前記APCまたは前記aAPCが、前記標的抗原によりパルスされる、[183]に記載の方法。
[185]前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記核酸またはその誘導体と共に送達されるAPCまたはaAPCである、[168]~[184]のいずれかに記載の方法。
[186]前記APCまたは前記aAPCが、前記MHCをコードするさらなる核酸と共にさらに送達される、[185]に記載の方法。
[187]前記核酸またはその誘導体がDNAまたはRNAである、[185または186]に記載の方法。
[188]前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、対象から単離されるか、または細胞系細胞である、[168]~[187]のいずれかに記載の方法。
[189]前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記第1の試料および前記第2の試料が単離される同じ対象から単離される、[188]に記載の方法。
[190]前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを含む1つまたは複数のベクターを生成するステップであって、前記1つまたは複数のベクターの各ベクターが、前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、[168]~[189]のいずれかに記載の方法。
[191]前記1つまたは複数のベクターを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記1つまたは複数のベクターのうちの少なくとも1つのベクターを含む、ステップをさらに含む、[190]に記載の方法。
[192]前記複数の細胞において前記1つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性TCRを発現する、ステップをさらに含む、[191]に記載の方法。
[193]前記複数の細胞を1つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記1つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップをさらに含む、[192]に記載の方法。
[194]前記複数の標的反応性TCRの1つまたは複数の標的反応性TCRを同定するステップをさらに含む、[193]に記載の方法。
[195]前記1つまたは複数の標的反応性TCRをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップをさらに含む、[194]に記載の方法。
[196]前記複数のレシピエント細胞の1つまたは複数の細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、[195]に記載の方法。
[197][67]~[116および168]~[196]のいずれかに記載の方法によって同定される標的反応性または腫瘍反応性TCRをコードする配列を含むレシピエント細胞を含む医薬組成物。
[198][197]に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、レシピエント細胞を投与する方法。
Claims (26)
- 標的反応性T細胞受容体(TCR)を同定する方法であって、
(a)複数のTCRを発現する複数の細胞を含む混合物を準備するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が、前記複数のTCRのTCRを発現し、前記複数のTCRが対象由来の試料由来の少なくとも50個の異なる同種対を含み、複数のV遺伝子由来のV領域を含み、前記少なくとも50個の異なる同種対の各同種対がTCRベータ鎖と対合するTCRアルファ鎖を含み、前記複数のTCRが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと、
(b)(a)由来の前記複数の細胞含む混合物を、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している1つまたは複数の標的ペプチド抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性TCRを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している1つまたは複数の標的ペプチド抗原に結合する、ステップと、
(c)(b)由来の前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも2つの細胞を同定するステップであって、少なくとも2つの細胞が前記複数の標的反応性TCRのうちの少なくとも2つの標的反応性TCRを発現し、それによって前記複数の標的反応性TCRのうちの前記少なくとも2つの標的反応性TCRを同定する、ステップと
を含む、方法。 - 前記複数のV遺伝子が、少なくとも10個の異なるV遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離され、前記試料が、組織試料、血液試料、末梢血単核細胞(PBMC)試料、またはそれらの組合せである、請求項99から101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のTCRが、少なくとも100個の異なる同種対を含み、前記少なくとも100個の異なる同種対の各同種対がTCRベータ鎖と対合するTCRアルファ鎖を含む、請求項1に記載の方法。
- (b)が、前記複数の細胞を、前記主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体を形成している1つまたは複数の標的ペプチド抗原を提示する1つまたは複数の細胞と接触させるステップを含む、請求項99から105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の細胞が、1つまたは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞(APC)または前記1つもしくは複数の標的ペプチド抗原を提示するように操作されたAPCである、請求項5に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的ペプチド抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、標的ペプチド抗原をコードするDNAまたはRNAを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的ペプチド抗原を提示するように操作された前記1つまたは複数のAPCが、対象由来のMHC分子を外部に発現する、請求項6に記載の方法。
- 前記複数のTCRが疲弊T細胞由来のTCRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MHCがMHC四量体である、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の標的ペプチド抗原の配列または同一性が知られていない、請求項1に記載の方法。
- 標的反応性TCRを発現すると同定された(b)由来の前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞のうちの少なくとも1つの対象への投与、または(b)由来の前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも2つの細胞のうちの少なくとも1つ細胞であって標的反応性TCRを発現すると同定された細胞の対象への投与のための組成物を調製するステップをさらに含む、請求項1のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞の各細胞がレポーター遺伝子を含み、前記細胞のTCRが前記1つまたは複数の標的ペプチド抗原の標的ペプチド抗原に結合すると、前記レポーター遺伝子がシグナルを送るように調節される、請求項99から113のいずれか一項に記載の方法。
- (c)における同定が、前記レポーター遺伝子に基づいて前記少なくとも2つの細胞を選択することを含む、請求項13に記載の方法。
- (c)における同定が、細胞表面マーカーの発現に基づいて前記少なくとも2つの細胞を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- (c)における同定が、カルシウムの流入に基づいて前記少なくとも2つの細胞を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の細胞が細胞系細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のTCRが、少なくとも100の異なるVJの組合せを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のTCRが疾患または状態を有する対象由来の試料由来のTCRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のTCRが、対象由来の腫瘍浸潤リンパ球を含む試料由来のTCRを含む、請求項1に記載の方法。
- (a)の前に、および前記複数のTCRの各TCRのTCRベータ鎖をコードする第2のポリヌクレオチドとTCRアルファ鎖をコードする第1のポリヌクレオチドを物理的に連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを発生させるステップ、および前記複数の細胞に前記複数の有合ポリヌクレオチドまたはその誘導体を送達するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (a)の前に、前記複数のTCRの同種対を同定するために、前記複数のTCRをシークエンシングする、請求項1に記載の方法。
- (c)における同定が、前記複数の細胞のサブセットの少なくとも2つの細胞を選択することを含み、前記少なくとも2つの細胞が前記複数の標的反応性TCRの少なくとも2つの標的反応性TCRを発現し、それにより前記複数の標的反応性TCRの少なくとも2つの標的反応性TCRが選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記選択が、標的反応性TCRを発現する細胞に関連するマーカーに基づいて標的反応性TCRを発現する細胞を選択する、請求項23に記載の方法。
- 前記選択が、(b)の前記複数の細胞における標的非反応性TCRを発現する細胞から標的反応性TCRを発現する細胞を分離することを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記選択が、標的反応性TCRを発現する細胞に関連するマーカーに基づいて、(b)の前記複数の細胞における標的非反応性TCRを発現する細胞から標的反応性TCRを発現する細胞を分離することを含む、請求項23に記載の方法。
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