TW202117014A - 分離tcr基因的方法 - Google Patents

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卡斯汀 黎奈曼
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裘斯 Ｆ Ｃ 加迪歐
赫斯特 傑羅恩 Ｗ Ｊ 凡
鄂蘭 拉奎爾 戈梅茲
黛博拉 蘇菲 舒利科瑪
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Abstract

本發明提供還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法。在一些實施例中，自無活性樣品中還原TCR組庫。在一些實施例中，創建TCRαβ對之庫。在一些實施例中，所揭示之方法用於癌症免疫療法或診斷目的。

Description

分離TCR基因的方法
本發明技術大體上係關於分離T細胞受體(TCR)基因序列以還原TCR之組庫(repertoire)。亦提供用於治療之組合物及方法。
已採用基於PCR之技術及TCR批量鏈定序來偵測TCRαβ對(Kobayashi等人，Nat Med 2013, Linnemann等人，Nat Med. 2013, Tran等人，Science 2015; Tran等人，N Engl J Med 2016; Tsuji等人，Cancer Immunol Res 2018)。
在一些實施例中，本文描述了用於鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法包含(I)提供包含複數個編碼TCRα鏈及TCRβ鏈之變異核酸的庫，(II)將該庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，(III)基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞；(IV)分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集，(V)確定該等變異核酸之核苷酸序列，及(VI)基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。
其他一些實施例係關於自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法，該等方法包含：I)確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸或胺基酸序列；II)選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集；III)藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及IV)自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。
在一些實施例中，基於以下至少一個準則選擇來自該總組庫之該TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集：a)該T細胞群體內之頻率；b)與第二T細胞群體相比之相對富集；c)給定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異，d)該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、序列模體、(預測的) HLA限制性、親和力、輔受體依賴性或親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)；e)基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之起始區域或其他基因之共表現模式；f)在多個樣品中共同出現或在類似頻率下出現，例如在多個腫瘤病變中出現；g)選擇分成多個組以分別還原該TCR組庫之特定部分；h)如不同實施例所定義之多個準則的組合。在一些實施例中，基於該T細胞群體內之頻率的選擇係基於TCR序列之頻率的資料，該資料用於創建針對TCRα鏈及β鏈之單獨排名次序或針對TCRα鏈與β鏈之組合排名次序。在一些實施例中，該等方法進一步包含確定頻率臨限值，該頻率臨限值係基於針對TCR組庫還原之所需深度定義的且用於基於頻率選擇TCRα鏈及β鏈之集合。在一些實施例中，藉由以下中之至少一者確定TCR-α及β序列：a)多重PCR；b)藉由目標富集之TCR序列還原；c)藉由5'RACE及PCR之TCR序列還原；d)藉由空間定序之TCR序列還原；或e)自RNA-seq資料中還原TCR序列。在一些實施例中，所還原TCR鏈序列經定義為CDR3核苷酸序列連同足夠的5'-及3'-核苷酸序列資訊，以基於核苷酸序列比對選擇至少一個TCR V區段及至少一個TCR J區段家族，從而組裝完整TCR鏈序列。在一些實施例中，核苷酸序列比對係基於65%序列一致性、70%序列一致性、75%序列一致性、80%序列一致性、85%序列一致性、90%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、99%序列一致性、100%序列一致性及其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，最佳序列比對係基於根據熟習此項技術者已知之讀段定位演算法使距離量度最小化。在一些實施例中，尋求最佳比對。
在一些實施例中，步驟III係藉由以下中之至少一者達成：i)使用TCR鏈序列來合成TCRα鏈及β鏈DNA片段之單獨庫，該等片段隨後連接成一個DNA或RNA片段(視情況其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接)，ii)藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合，或iii)藉由用以DNA或RNA載體之形式編碼的TCRα基因及β基因之單獨集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞將表現至少一個TCRα鏈與一個β鏈；(iv)TCRα鏈與β鏈之組合連接於單鏈TCR構築體中，該單鏈TCR構築體含有TCR鏈片段以及單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ε或CD3ζ信號傳導域。在一些實施例中，直接合成DNA或RNA片段(其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接)消除了執行電子雜交隨機配對之需要且將所有所得組合合成為一個DNA片段。在一些實施例中，步驟IV係藉由以下中之至少一者達成：i)經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種活化標記物分離抗原反應性報導細胞或T細胞用於TCR分離；ii)經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池用適合於追蹤細胞增殖之螢光染料標記，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於增殖分離抗原反應性報導細胞或T細胞用於TCR分離；iii)將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池分成至少兩個樣品；藉由表現至少一種所關注抗原或不表現之抗原呈現細胞刺激樣品；在刺激之後，將兩個報導細胞或T細胞群體培育一段時間，且隨後藉由TCR分離分析兩個報導細胞或T細胞群體；比較自兩個樣品得到的TCRαβ對，以鑑別暴露於至少一種抗原之樣品中豐度較高的TCR基因；iv)經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種報導TCR觸發的報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-YFP分離抗原反應性報導細胞或T細胞用於TCR分離；v)經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於在TCR信號傳導時例如藉由使用NFAT嘌呤黴素轉殖基因之獲得性抗生素抗性，分離抗原反應性報導細胞或T細胞(基於選擇抗原特異性報導細胞或T細胞)用於TCR分離；vi)將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池暴露於一或多個攜帶所關注抗原之MHC複合物；分離結合於MHC複合物之報導細胞或T細胞用於TCR分離；vii)經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞或T細胞池藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激；隨後，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體方法以使TCR分離與至少一種活化標記物之轉錄物含量的偵測組合來鑑別所關注TCRαβ對；藉此在該報導細胞或T細胞池內偵測到單報導細胞或T細胞，其中TCRαβ轉錄物與增加含量的活化標記物共表現。在一些實施例中，步驟i)至vi)中之TCR分離可藉由以下達成：(i)自批量抗原反應性報導細胞或T細胞分離DNA或RNA以產生TCRαβ特異性PCR產物，藉由DNA定序分析TCRαβ特異性PCR產物以確定抗原反應性報導細胞或T細胞之TCRαβ基因序列或(ii)藉由基於單細胞之液滴PCR或微流體方法以分析在所分析單T細胞中表現的該等TCRαβ基因序列。在一些實施例中，該等報導細胞為T細胞。在一些實施例中，報導細胞監測TCR接合。在一些實施例中，該報導細胞池可為TCR α/β空。
在一些實施例中，個體之樣品包含無活性起始物質。在一些實施例中，還原經鑑別TCR組庫之經定義部分。在一些實施例中，藉由基於包括(但不限於)以下之準則選擇僅部分或全部所偵測TCR鏈來進行定義或選擇性還原：a)該T細胞群體內之頻率，b)與第二T細胞群體相比之相對富集，c)給定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異，d)該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、親和力、輔受體依賴性、親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)或TCR序列模體，e)基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之起始區域或其他基因之共表現模式，f)在多個樣品中共同出現或在類似頻率下出現，例如在多個腫瘤病變中出現，g)選擇分成多個組以分別還原該TCR組庫之特定部分，如不同實施例所定義之多個準則的組合。在一些實施例中，TCR序列之選擇性還原係指還原含有某些V基因片段之TCR序列。
在一些實施例中，還原抗原特異性TCR序列。在一些實施例中，還原治療性TCR序列。在一些實施例中，還原腫瘤反應性TCR序列。在一些實施例中，還原新抗原特異性TCR序列。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含投與表現該新抗原特異性TCR序列之T細胞作為癌症療法的步驟。在一些實施例中，本文所述之方法用於診斷。在一些實施例中，該診斷為自感染或自體免疫之病理性部位中還原TCR組庫。在一些實施例中，本文所述之方法用於還原BCR/抗體組庫。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含分離來自包含TCR-α及β核苷酸序列之個體的核酸。在一些實施例中，該活化標記物為CD4或CD8 T細胞活化標記物。可使用任何CD4或CD8 T細胞活化標記物。在本文所述之方法的一些實施例中，該活化標記物選自由以下組成之群：CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF。在一些實施例中，在本文所述之方法中，自作為不同細胞類型之混合物或組織樣品(諸如血液或腫瘤組織)之一部分的T細胞群體分離DNA及RNA。在一些實施例中，該個體之樣品包含自體液分離之細胞。在一些實施例中，該等細胞為腫瘤特異性T細胞。在一些實施例中，該體液選自由以下組成之群：血液、尿液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、腦脊髓液、唾液、痰、黏膜分泌物、陰道液、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液及腹腔液。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含使用該等TCRαβ鏈序列治療患有癌症、免疫病症、自體免疫疾病或感染性疾病之個體。在一些實施例中，本文所述之方法的步驟IV係藉由以下中之至少一者達成：(i)基於至少一種活化標記物之鑑別或選擇；(ii)基於回應於抗原之增殖的鑑別或選擇；(iii)基於鑑別與未經刺激細胞相比，經抗原刺激細胞中較高豐度之TCR基因的鑑別或選擇；(iv)基於藉由TCR觸發之報導基因活化之鑑別或選擇；(v)基於選擇性存活之鑑別或選擇，該選擇性存活包括(但不限於) TCR信號傳導時之獲得性抗生素抗性；(vi)基於結合至一或多種MHC複合物之鑑別或選擇；(vii)使用基於單細胞之液滴PCR或微流體的鑑別或選擇；或其任何組合。在一些實施例中，步驟(vii)進一步包含確定活化相關基因之共表現。
在一些實施例中，本文揭示了創建多個T細胞庫之方法，該等方法包含：(a)根據本文所述之方法還原T細胞受體(TCR)之組庫；(b)選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。在一些實施例中，基於頻率範圍選擇TCRα鏈及β鏈序列。
在一些實施例中，本文描述了創建多個T細胞庫之方法，該等方法包含：(a)根據本文所述之方法還原T細胞受體(TCR)之組庫；(b)選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。
在一些實施例中，基於頻率範圍選擇TCRα鏈及β鏈序列。
在一些實施例中，本文描述了自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法，該等方法包含：I)確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸或胺基酸序列；II)選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集；III)藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及IV)自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法。該方法包含提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分。該方法進一步包含將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽。該方法進一步包含基於取決於至少600 bp之該連續部分的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法進一步包含分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集。該方法進一步包含確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列。該方法進一步包含基於該核苷酸序列鑑別至少600 bp之該連續部分。在一些實施例中，該方法亦可為其中至少600 bp之該連續部分分佈在600個鹼基對中。
在一些實施例中，該方法可包括下文所述之步驟(1)至(7)中之一或多者。步驟(1)得到樣品。該樣品可為來自患有感染性疾病、自體免疫疾病或癌症之患者的組織、血液或體液。該樣品可為活性的或無活性的。步驟(2)對該樣品之TCR-α及β鏈定序。步驟(3)選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫。步驟(4)將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池，例如Jurkat報導T細胞。步驟(5)用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾的該等報導細胞。至少一種所關注抗原可為自體或同種異體的。步驟(6)確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對。步驟(7)將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。在一些實施例中，該方法可涉及上文所述之步驟(1)至(7)中之一或多者。該等步驟中之任一者可視需要經本文所提供之其他實施例省略、重複或取代。亦可添加額外中間步驟。
一些實施例係關於一種核苷酸庫，其包含根據以上實施例中之任一者還原的該T細胞受體之組庫。在一些實施例中，一種核苷酸構築體，其包含根據以上實施例中之任一者鑑別的該核苷酸序列。在一些實施例中，一種細胞，其包含本文所述之核苷酸構築體。
在一些實施例中，提供一種自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法。該方法包含：確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸或胺基酸序列；選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集；藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。在一些實施例中，提供一種創建多個T細胞庫之方法。該方法包含根據以上方法還原T細胞受體(TCR)之組庫，選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法。該方法包含提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第一變異核苷酸子序列定義該連續部分之第一末端，且該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第二變異核苷酸子序列定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端；將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽；基於取決於該兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞；分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集；確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於該等核苷酸序列鑑別該兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少一個組合。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法包含：提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含：編碼TCRα變異胺基酸序列且定義該連續部分之第一末端的第一變異核苷酸子序列，與編碼TCRβ變異胺基酸序列且定義與該第一末端相對之該連續部分之第二末端的第二變異核苷酸子序列之組合。該方法可進一步包含將該庫引入永生化T細胞群體中，該永生化T細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈。該方法可進一步包含基於回應於使該等永生化T細胞與表現抗原之該等永生化B細胞接觸之高於臨限值含量的T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個T細胞。該方法可進一步包含分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集。該方法可進一步包含確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一與第二變異核苷酸子序列之至少一種組合。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼嵌合抗原受體(CAR)鉸鏈域、跨膜域及/或胞內信號傳導域之核苷酸序列的方法。該方法可包含：提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含以下中之兩者或更多者之組合：編碼CAR鉸鏈域之第一變異核苷酸子序列；編碼CAR跨膜域之第二變異核苷酸子序列；及編碼CAR胞內信號傳導域之第三變異核苷酸子序列。該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之一者定義該連續部分之第一末端，且其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之另一者定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端。該方法可進一步包含將該庫引入經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼之CAR的細胞群體中。該細胞群體包含永生化T細胞或初級人類T細胞群體。該方法可進一步包含基於回應於使該等細胞與表現對該CAR之抗原結合域具有特異性之抗原的抗原呈現細胞接觸之高於臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法可進一步包含分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集。該方法可進一步包含確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一、第二與第三變異核苷酸子序列之至少一種組合。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法。該方法可包含：提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分；將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽；基於取決於至少600 bp之該連續部分的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞；分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集；確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於該核苷酸序列鑑別至少600 bp之該連續部分。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法。該方法包含將庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法可進一步包含分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集。該方法可進一步包含確定該等變異核酸之核苷酸序列，及基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自樣品之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法可包含：對樣品中之TCR-α及β鏈定序，選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫，將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池，用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞(其中該抗原可來自相同宿主，該等TCRα鏈及TCRβ鏈來自該相同宿主)，確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對，及將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。
在一些實施例中，提供一種核苷酸庫，其包含根據以上方法中之任一項還原的該T細胞受體之組庫。
在一些實施例中，提供一種核苷酸構築體，其包含根據本文之方法中之任一項所鑑別的該核苷酸序列。
在一些實施例中，提供一種細胞，其包含根據本文所提供之核苷酸中之任一者的核苷酸構築體。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法。該方法可包含：將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該細胞庫之第一群體；及分離來自該庫之該第一群體的變異核酸之第一群體。在一些實施例中，該抗原可為一或多種抗原，且兩種抗原及TCRα及TCRβ序列可在單個個體中發現。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法可包含：將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；及基於相對於對照之該子集內之該核苷酸序列的富集，確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之核苷酸序列的方法。該方法可包含：將該核酸庫引入細胞群體中，以形成細胞庫；使該細胞庫與第一細胞群體接觸；基於藉由磁性珠粒富集的至少一種標記物之表現，選擇該細胞庫之亞群；及基於相對於對照之該亞群內之該等核苷酸序列的統計學上顯著之富集或耗乏，鑑別至少一個核苷酸序列。
在一些實施例中，提供一種細胞集合。該集合包含：一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ各自來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及一組至少兩個B細胞，其中該至少兩個B細胞中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。
在一些實施例中，提供一種表現TCR之細胞的庫。該表現TCR之細胞的庫包含：一組至少三個T細胞，其中該等T細胞中之至少兩者經設計以表現至少兩種TCRα及TCRβ對(至少兩種TCR對)，其中該至少兩種TCR對來自個體，其中該至少三個T細胞不表現內源性TCR，其中該至少三個T細胞經設計用於在結合至由B細胞呈現之抗原(或新抗原)時，活化一或多個T細胞活化標記物，其中如多個TCR細胞所反映，各TCR對之基因體複本的量使得在該樣品中之每個TCR上得到讀數，其中該等TCR中之至少一者不均勻地分佈在包含該庫之組合物中。
在一些實施例中，提供一種治療個體之方法。該方法包含鑑別患有腫瘤之個體；提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體，提供一組至少兩個B細胞，其中該一組B細胞經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同；使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個B細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；且向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。
在一些實施例中，提供一種治療個體之方法。該方法包含：鑑別患有腫瘤之個體；提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體，提供一組至少兩個抗原呈現細胞，其中該一組抗原呈現細胞源於該個體，經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同；使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個抗原呈現細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物。該組合物可包含：第一TCR對，其結合至個體之腫瘤的第一抗原(或新抗原)；及第二TCR對，其結合至該個體之腫瘤的第二抗原(或新抗原)。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物。該組合物可包含：第一TCR對，其結合至第一抗原且為MHC-I類限制型；及第二TCR對，其結合至第二抗原且為MHC-II類限制型。
在一些實施例中，提供一種細胞集合。該集合可包含：一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該對來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及一組至少兩個抗原呈現細胞(APC)，其中該至少兩個APC中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2019年7月15日申請之美國臨時專利申請案第62/874125號、於2020年2月13日申請之美國臨時專利申請案第62/975924號、於2020年5月13日申請之美國臨時專利申請案第63/024341號、於2020年6月3日申請之美國臨時專利申請案第63/034157號及於2020年6月15日申請之美國臨時專利申請案第63/039346號之優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表之參考
本申請案與電子格式之序列表一起申請。序列表以2020年7月13日創建的名稱為「NTBV001WOSEQLIST.txt」之文件提供，其大小為21,765個位元組。電子序列表中之資訊以全文引用之方式併入。
本發明提供用於自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法及組合物。該等方法之一些實施例提供鑑別及分離來自包括人類組織樣本之無活性物質的抗原特異性TCR。一些實施例根據圖31中之一些或全部。在一些實施例中，該方法可包括圖31中及本文所概述之步驟(1)至(7)中之一或多者。舉例而言，該方法可涉及(1)得到樣品。該樣品可為來自患有感染性疾病、自體免疫疾病或癌症之患者的組織、血液或體液。該樣品可為活性的或無活性的。步驟(2)對該樣品之TCR-α及β鏈定序。步驟(3)選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫。步驟(4)將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池，例如Jurkat報導T細胞。步驟(5)用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞。至少一種所關注抗原可為自體或同種異體的。步驟(6)確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對。步驟(7)將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。在一些實施例中，該方法可涉及上文所述之步驟(1)至(7)中之一或多者。在一些實施例中，該等步驟中之任一者可視需要經本文所提供之其他實施例省略、重複或取代。亦可添加額外中間步驟。
在一些實施例中，對於本文之任一方法，藉由結合至抗原(諸如新抗原)來選擇或鑑別TCR對及/或表現TCR對之T細胞，其中該抗原由B細胞或抗原呈現細胞表現。在一些實施例中，對於本文之方法中之任一者，該抗原或新抗原來自個體之腫瘤，且TCR對之TCRα及TCRβ亦來自個體。在一些實施例中，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個抗原。
在一些實施例中，以上方法所用及/或由以上方法產生之組合物中之任一者亦涵蓋為庫及/或套組及/或組合物，及/或用於其在醫學應用及/或篩選系統中之應用。在一些實施例中，組合物可為已藉由本文所提供之方法中之任一者選擇或產生之TCRα鏈與β鏈配對。在一些實施例中，組合物可為本文所提供之方法中之任一者涉及的組分中之任一者或來自本文所提供之方法中之任一者的產物。
亦提供各種細胞組合物、庫、細胞及蛋白質相關療法。在一些實施例中，共培養物包含至少第一及第二類型之細胞群體。在一些實施例中，共培養物中之第一及第二類型之細胞可接觸及誘導表現型變化。在一些實施例中，將共培養物維持於培養容器中。在一些實施例中，將共培養物維持於培養袋中。在一些實施例中，該第一類型之細胞及該第二類型之細胞為兩個或更多個不同類型之細胞群體。在一些實施例中，該細胞群體恰好為兩個不同細胞類型群體。在一些實施例中，來自本文所提供之方法中之任一者之細胞或中間物或所得細胞群體之集合中之任一者均涵蓋為特定組合物、庫、療法等。在一些實施例中，共培養物包含T細胞及B細胞。
在一些實施例中，共培養物中之第一類型之細胞為T細胞。在一些實施例中，該第一類型包含人類T細胞。在一些實施例中，該第一類型包含Jurkat T細胞。在一些實施例中，該第一類型包含Jurkat T細胞，其經工程改造以表現人類CD8a及CD8b且不具有內源性TCR表現。在一些實施例中，該第一類型包含表現一或多種變異核酸分子之Jurkat T細胞。在一些實施例中，該第一類型包含表現一或多種變異TCR之Jurkat T細胞。在一些實施例中，Jurkat T細胞由於在較低密度下之預先培養而表現較低的活化標記物(包括(但不限於) CD69)之背景含量。
在一些實施例中，該共培養物中之第二類型之細胞包含可呈現抗原之細胞。在一些實施例中，另一類型之細胞包含可呈現抗原之人類細胞。在一些實施例中，另一類型之細胞包含人類腫瘤細胞。在一些實施例中，另一類型之細胞包含人類B細胞。在一些實施例中，另一類型之細胞包含人類自體B細胞。在一些實施例中，另一類型之細胞包含人類自體永生化B細胞。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造以表現外源性抗原。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造以表現多種外源性抗原。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造以表現多種外源性新抗原。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造而以多種小型基因型式表現多種外源性新抗原。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造而以單TMG型式表現多種外源性新抗原。在一些實施例中，B細胞群體經工程改造而以多種TMG型式表現多種外源性新抗原。在一些實施例中，B細胞群體中之個別細胞僅表現單外源性小型基因或TMG。在一些實施例中，B細胞群體中之個別細胞可表現多個外源性小型基因或TMG。
在一些實施例中，提供一種組合物。該等組合物包含：i)如藉由一或多個T細胞活化標記物所量測之第一T細胞群體；及ii)作為參考群體之T細胞的另一選擇之第二群體，其表現相同TCR庫或在相同TCR庫之質體池中，其中一或多種TCR相對於該第二T細胞群體富集在該第一T細胞群體中。
在一些實施例中，提供一種細胞集合，該集合包含T細胞之組，其經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該對來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該T細胞之組經設計用於活化一或多種T細胞活化標記物；及 B細胞之組，其中該B細胞之組經設計以表現至少一個外源性新抗原，且其中該至少一個外源性新抗原來自該個體之腫瘤。
在一些實施例中，存在存在於集合中之至少兩個TCR對及至少兩個外源性新抗原。在一些實施例中，組合物中存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含該等對之細胞)。在一些實施例中，存在存在於集合中之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000個或1百萬個抗原(或表現此等抗原之B細胞)。在一些實施例中，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在存在於集合中之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個抗原。在一些實施例中，各對或其部分之序列不同。在一些實施例中，各TCR對不同。
在一些實施例中，兩種或更多種細胞群體存在於共培養物中之比率在1000:1至1:1000之範圍內。
在一些實施例中，兩種或更多種細胞群體存在於共培養物中之比率設置為允許誘導接觸誘導的表型。
在一些實施例中，B細胞群體及T細胞群體存在於共培養物中之比率允許T細胞活化。
在一些實施例中，B細胞群體與T細胞群體存在於共培養物中之比率允許T細胞活化表現特異性TCR之T細胞的子集。在一些實施例中，兩種或更多種細胞群體存在於共培養物中之比率在1000:1至1:1000之範圍內。在一些實施例中，該比率足以引起TCR細胞活化。
在一些實施例中，共培養物或組合物包含a)已經工程改造以表現人類CD8a、CD8b及TCR變異體庫且不具有內源性TCR表現之Jurkat T細胞；及b)永生化之自體人類B細胞，且其中自體人類B細胞以單小型基因或TMG形式表現多種抗原。在一些實施例中，將共培養物維持於培養容器或培養袋中，且B及T細胞群體以允許T細胞活化之比率存在。抗原特異性T細胞活化僅經由TCR庫中之特異性TCR介導。
在一些實施例中，存在至少2至2，例如至少10至10、至少1000 (TCR對)至10 (新抗原)、至少10,000 (TCR對)至10 (新抗原)、至少10,000 (TCR對)至100 (新抗原)、至少10,000 (TCR對)至1000 (新抗原)、至少100,000 (TCR對)至10、100、1000或10,000 (抗原)、至少50至50、至少100至100、至少1,000,000 (TCR)至10,000 (抗原)(包括定義於前述比率中之任兩者之間的任何範圍)之T細胞(表現TCR對)相對於B細胞(提供新抗原)之數目及/或比率。在一些實施例中，單TCR對及/或抗原存在於各細胞(T或B)中，使得以上數目中之每一者亦可表示細胞數量。
在一些實施例中，該組合物包含B與T細胞之共培養物，其中存在由該等T細胞表現之至少兩種不同TCR對，且其中存在由該等B細胞表現之至少兩種不同抗原。
在一些實施例中，在該等T細胞中存在大量TCR且在該等B細胞中存在大量抗原。在一些實施例中，該組合物經設計使得吾人可誘導由至少一種TCR及一種抗原(或至少兩種或更多種TCR及/或兩種或更多種抗原)介導之T細胞活化。在一些實施例中，組合物中存在CD69之較低背景含量。在一些實施例中，該組合物包括自體APC (或自體永生化B細胞)。在一些實施例中，T細胞經工程改造以表現TCR庫(及/或缺乏內源性TCR表現)。在一些實施例中，T細胞經設計使得其缺乏原生TCR表現，但能夠經由外源性TCR對進行TCR活化。
在一些實施例中，提供一種細胞集合。該集合包含：一組至少兩個T細胞。在一些實施例中，各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對。在一些實施例中，該TCRα及TCRβ各自來自個體，該等T細胞不表現內源性TCR，且該組經設計用於活化一或多種T細胞活化標記物。該集合進一步包含一組至少兩個B細胞。至少兩個B細胞中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且至少兩個外源性新抗原(或抗原)與個體中之彼等抗原相同。
在一些實施例中，在該細胞組合物中，該一組至少兩個B細胞包含：至少第一B細胞，其產生該外源性新抗原(或抗原)；及至少第二B細胞，其產生該第二外源性新抗原(或抗原)。
在一些實施例中，提供TCR (或表現TCR之細胞)之庫。該庫包含：一組至少三個T細胞，其中該等T細胞中之至少兩者經設計以表現至少兩種TCRα及TCRβ對(至少兩種TCR對)，其中該至少兩種TCR對來自個體，其中該至少三個T細胞不表現內源性TCR，其中該至少三個T細胞經設計用於在結合至由B細胞呈現之抗原(或新抗原)時，活化一或多個T細胞活化標記物，其中如多個TCR細胞所反映，各TCR對之基因體複本的量使得在該樣品中之每個TCR上得到讀數，其中該等TCR中之至少一者不均勻地分佈在包含該庫之組合物中。
在一些實施例中，至少一種T細胞之分佈藉由結合於B細胞所呈現之抗原而改變。在一些實施例中，至少兩種TCR對大致均勻地存在於該庫中。
在一些實施例中，提供一種細胞集合。該集合包含：一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該對來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多種T細胞活化標記物。該細胞集合可進一步包含一組至少兩個抗原呈現細胞(APC)，其中該至少兩個APC中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。
在一些實施例中，一組或套組包含第一T細胞群體及第二T細胞群體。在一些實施例中，第一T細胞群體由共用可量測之某一表型的T細胞組成。在一些實施例中，該第一T細胞群體包含共用T細胞活化之表型的T細胞。在一些實施例中，該第一T細胞群體可為經選擇T細胞群體。
在一些實施例中，該第一T細胞群體包含共用一或多個標記物之某一表現量的T細胞。在一些實施例中，第一T細胞群體包含共用一或多個T細胞活化標記物之表現的T細胞。
在一些實施例中，該等T細胞表現變異核酸分子之庫。在一些實施例中，該等T細胞表現TCR庫。
在一些實施例中，第二T細胞群體可為參考群體。該參考群體可為表現由第一經選擇T細胞群體表現之相同TCR庫的經選擇或未經選擇T細胞群體。在一些實施例中，參考為由第一T細胞群體表現之相同TCR庫的質體池。
在一些實施例中，一定量之各TCR使得有可能在樣品中之每個TCR上得到讀段，且其中存在至少一種不均勻地分佈在整個組合物中之TCR對。在一些實施例中，如多個TCR細胞所反映，各TCR對之基因體複本的量使得在該樣品中之每個TCR上得到讀段。在一些實施例中，該等TCR中之至少一者在整個包含該庫之組合物中不均勻地表現。在一些實施例中，大部分TCR在經選擇T細胞群體及參考中大致相等地表示。在一些實施例中，存在於TCR庫中之所有TCR中之超過90%表示於第一T細胞群體及第二T細胞群體(例如參考群體)兩者中。在一些實施例中，存在於TCR庫中之所有TCR中之大於99%表示於第一T細胞群體及第二T細胞群體兩者中。
在一些實施例中，相對於該第二群體，一或多個TCR富集於該第一群體中。在一些實施例中，相對於該第二群體，該一或多個TCR在統計學上顯著富集於該第一群體。
在一些實施例中，組合物包含來自篩選方法之前1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10%之TCR (或表現此等TCR之細胞)，例如頂部-底部比較。
在一些實施例中，在第一(經選擇) T細胞群體中存在超過99%之所有TCR。在一些實施例中，組合物中之大部分TCR大致均勻地分佈在第一T細胞群體及第二T細胞群體(例如在此情況下參考)中。
在一些實施例中，鑑別、分離及/或提供具有所需特徵之至少一個TCRαβ對。在一些實施例中，具有所需特徵之至少一個TCRαβ對源於腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。在一些實施例中，具有所需特徵之至少一個TCRαβ對源於腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)且用於相同個體之癌症療法。在一些實施例中，具有所需特徵之至少一個TCRαβ對源於周邊血液。在一些實施例中，所需特徵為對抗原具有特異性。在一些實施例中，所需特徵為鑑別到新抗原。在一些實施例中，所需特徵為鑑別到病毒抗原。在一些實施例中，所需特徵為鑑別到由腫瘤細胞表現之共用抗原。在一些實施例中，將所需特徵限制至MHC-I類或MHC-II類。在一些實施例中，所需特徵為對抗原具有親合力。在一些實施例中，所需特徵不存在對抗原之反應性。在一些實施例中，多個特徵為合乎需要的。在一些實施例中，該TCR對經設計用於此等特徵中之任何一或多者。
在一些實施例中，使用及/或製備及/或調節具有所需特徵之至少一個TCRαβ對用於療法。在一些實施例中，使用及/或製備及/或調節至少一個TCRαβ對用於療法。在一些實施例中，使用或設計至少一個TCRαβ對用於癌症療法。在一些實施例中，使用及/或製備及/或調節至少一個TCRαβ對用於傳染病之療法。在一些實施例中，使用及/或製備及/或調節至少一個TCRαβ對用於自體免疫疾病之療法。在一些實施例中，使用及/或製備及/或調節至少一個TCRαβ對以工程改造重組蛋白質用於療法。在一些實施例中，投與該重組蛋白質用於療法。
在一些實施例中，使用至少一個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用至少兩個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用超過兩個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用五個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用十個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用二十個TCRαβ對以工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，投與經工程改造T細胞用於療法。在一些實施例中，使用病毒將TCRαβ對引入T細胞中。在一些實施例中，該病毒為慢病毒。在一些實施例中，該病毒為反轉錄病毒。在一些實施例中，該病毒為腺病毒。在一些實施例中，該病毒介導將該TCR整合至該T細胞之基因體中。
在一些實施例中，該病毒引起該TCR之短暫表現。在一些實施例中，該病毒攜帶TCR DNA作為藉由同源介導修復(HDR)進行之T細胞中基因體雙股斷裂之修復模板。
在一些實施例中，使用非病毒基因遞送方法將TCRαβ對引入T細胞中。在一些實施例中，非病毒基因遞送方法係基於電穿孔。在一些實施例中，該非病毒基因遞送方法係基於可引入T細胞之細胞膜之臨時穿孔以將組分遞送至T細胞中的其他方法。在一些實施例中，該非病毒基因遞送方法涉及轉座酶。在一些實施例中，非病毒基因遞送方法涉及核酸酶。
在一些實施例中，該核酸酶為CRISPR/Cas9複合物。
在一些實施例中，經工程改造T細胞經TCR修飾且進一步經遺傳修飾以控制其表型及反應性。
在一些實施例中，將具有針對不同抗原之特異性之表現不同TCRαβ對的經工程改造T細胞組合成細胞組合物用於投與。在一些實施例中，該組合允許吾人靶向多種抗原，其可比單一療法更高效。在一些實施例中，該組合允許MHC-I類及MHC-II類限制型T細胞兩者共同，其可協同作用以用於實體癌症之療法。在一些實施例中，組合允許可將軀幹及分支腫瘤突變靶向在一起。在一些實施例中，該組合基於利用相等比率之各經工程改造T細胞群體。在一些實施例中，組合基於利用不同細胞數目個各經工程改造T細胞群體。
在一些實施例中，該組合物包含基於使用超過一個TCR基因之經工程改造T細胞產物。在一些實施例中，經工程改造T細胞包括以下中之至少一者：其為接受其之患者自體的；其為TIL衍生的；其採用至少一種I類及一種II類TCR；且其採用相同比率。
本文所提供之一些實施例避開還原TCRα鏈及β鏈之天然組合的需求且可應用於無活性細胞物質及無活性組織樣品。藉由產生組合TCRαβ庫，本發明之一些實施例允許自儲存或存檔樣品鑑別抗原特異性TCRαβ對。舉例而言，本發明之實施例可解決與混合來自不同T細胞之TCRα及TCRβ mRNA轉錄物相關之問題，該等問題由無活性T細胞之細胞膜整合之損失產生。在此類混合物中，關於初始TCRαβ對之資訊損失。本文所提供之方法之一些實施例解決由在高頻下使所還原TCR庫偏向TCR序列所引起的先前所述之TCR庫篩選技術的較低敏感性。本文所提供之方法之一些實施例消除在下游應用中對包括所還原TCR鏈之完整組庫的需要，允許將例如關鍵TCR遞送到具有所需特性之TCR鏈。不同於單細胞方法，諸如液滴PCR及微流體裝置，自本文所揭示之T細胞還原特異性TCRαβ對之方法不需要限制可擴展性之特定儀器及活細胞物質。不同於先驗不允許還原天然TCRαβ對之自T細胞群體還原TCRα及TCRβ序列之集合的批量PCR方法，本文所揭示之方法採用還原經鑑別TCR組庫之經定義部分，以還原所關注TCRαβ對的設計。
本文所揭示之方法可用於治療及診斷目的及/或組合物及/或藥劑。舉例而言，重組TCR基因可用於產生對免疫療法(包括癌症免疫療法)具有所需特異性之T細胞。對於癌症免疫療法應用，具有所需特異性之T細胞可藉由選擇TCR基因以藉由TCR基因轉移產生抗原特異性T細胞來產生。在一些實施例中，該方法係基於可藉由編碼TCRαβ對之基因的轉移在T細胞之間轉移抗原特異性之觀測結果。可藉由利用γ-反轉錄病毒或慢病毒載體、基於轉座子之基因遞送平台、mRNA遞送(例如藉由電穿孔或奈米粒子)或基因體工程改造工具(包括CRISPR/Cas9)將所關注TCR基因引入人類T細胞之基因體中。後者藉由將新穎TCR鏈位點特異性整合至內源性TCR基因座來實現內源性TCR鏈之同時基因剔除。
在一些實施例中，所得經選擇分子對用於治療個體及/或用於個體之藥劑，以用於本文所提供之病症中之任一者。
在一些實施例中，提供一種治療個體之方法。該方法包含：鑑別患有腫瘤之個體；提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體，提供一組至少兩個B細胞，其中該一組B細胞經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同；使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個B細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。在一些實施例中，本文所提供之T細胞與B細胞之數目中之任一者可用於該方法中。在一些實施例中，治療減小該腫瘤之尺寸。在一些實施例中，其使腫瘤大小減小至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%，包括介於任何兩個前述值之間的任何範圍。
在一些實施例中，提供一種治療個體之方法。該方法包含：鑑別患有腫瘤之個體；提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體，提供一組至少兩個抗原呈現細胞，其中該一組抗原呈現細胞源於該個體，經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同；使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個抗原呈現細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。在一些實施例中，存在超過兩種TCR對，例如可採用2、3、4、5、6、7或更多種TCR對。在一些實施例中，經由細胞療法投與該等TCR對。在一些實施例中，該等對具有不同於其他對之序列。
在一些實施例中，藉由該等方法中之任一者之本文所提供的經選擇TCR對或對之組合中之任一者可用於本文所提供之治療方法中。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物包含第一TCR對，其結合至個體之腫瘤的第一抗原(或新抗原)；及第二TCR對，其結合至該個體之腫瘤的第二抗原(或新抗原)。在一些實施例中，存在超過兩種TCR對，例如可採用2、3、4、5、6、7或更多種TCR對。在一些實施例中，經由細胞療法投與該等TCR對。在一些實施例中，該等對具有不同於其他對之序列。在一些實施例中，該第一TCR對為MHC-I類限制型且其中該第二TCR對為MHC-II類限制型。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物。其可包括第一TCR對，其結合至第一抗原且為MHC-I類限制型；及第二TCR對，其結合至第二抗原且為MHC-II類限制型。
在一些實施例中，該組合物可進一步包含第三TCR對。
在一些實施例中，第一TCR對結合至來自腫瘤之新抗原，其中第二TCR對結合至來自腫瘤之新抗原，且其中第一及第二TCR對兩者均存在於腫瘤之宿主中。
用於癌症之治療用途的重組TCR基因可自不同來源得到。首先，有可能自活性患者樣本(諸如血液或腫瘤組織)偵測到及分離出對腫瘤抗原具有特異性之T細胞。本領域中所述之技術包括分離結合T細胞之MHC多聚體以及分離表現某些表現型標記物之T細胞或在藉由流式細胞測量術或磁性珠粒選擇之抗原刺激之後分泌某些細胞激素。隨後，經分離抗原特異性T細胞可用於藉由單細胞基於PCR之技術、TCR批量鏈定序或基於微流體之PCR技術確定經表現TCR基因之序列。其次，allo-CTL系統或動物模型(例如HLA轉殖基因及/或人類TCR轉殖基因小鼠模型)為腫瘤抗原特異性T細胞/TCR提供替代來源。第三，治療性TCR基因可選自藉由噬菌體、酵母或T細胞呈現系統表現為重組TCR庫之活體外突變型TCR鏈。
可基於所需治療性準則選擇用於癌症療法之T細胞(或TCR)；首先，用於癌症療法之TCR基因理想地鑑別在重要組織中具有較低表現或不具有表現之腫瘤特異性抗原。其次，TCR應鑑別其具有較高敏感性之抗原，例如少量的抗原應觸發經TCR修飾之T細胞針對腫瘤細胞之效應功能，例如細胞溶解活性。第三，TCR應對在重要組織中表現之其他抗原不具有交叉反應性。
不同腫瘤抗原可藉由TCR基因轉移靶向，包括細胞譜系特異性抗原(例如MART-1)、經過度表現抗原(例如WT-1)、癌症/睪丸(C/T)抗原(諸如NY-ESO-1、MAGE-A4、MAGE-A10)、病毒抗原(例如HPV E6、E7)及突變型蛋白質(新抗原)。值得注意的是，新抗原特異性TCR序列可尤其適合於治療癌症。舉例而言，新抗原特異性T細胞已與免疫檢查點阻斷療法以及授受性T細胞療法兩者之後的晚期轉移性癌症之消退相關。因為腫瘤中絕大部分基因體突變為乘客突變(passenger mutation)且僅在小部分腫瘤中發現，且由於MHC限制，因此可由T細胞鑑別之腫瘤新抗原之組庫在個別患者之間很大程度上不同。因此，利用TCR基因轉移產生新抗原特異性T細胞用於療法將通常需要每一患者或腫瘤之一或多個新的新抗原特異性TCR序列。鑒於對用於TCR基因轉移之任何TCR的安全要求，商業可調式方法理想地依賴於自體組織，因為可假定直接源自患者之新抗原特異性TCR為安全的。此外，例如使用無活性組織，諸如存檔腫瘤樣品以實現商業可調式方法為較佳的，因為其避免處置活性患者細胞用於TCR分離之需要。本文所揭示之方法解決在每一患者基礎上鑑別具有較高敏感性之相關新抗原特異性TCR的顯著需求。另外，本文所述之方法所揭示之新抗原特異性TCR基因轉移可使不受益於其他療法(諸如免疫檢查點阻斷)之患者受益。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法包含：a)提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含：1)編碼TCRα變異胺基酸序列且定義該連續部分之第一末端的第一變異核苷酸子序列，與2)編碼TCRβ變異胺基酸序列且定義與該第一末端相對之該連續部分之第二末端的第二變異核苷酸子序列之組合。該方法進一步包含將該庫引入永生化T細胞群體中，該永生化T細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈；及基於回應於使該等永生化T細胞與表現抗原之永生化B細胞接觸之高於臨限值含量的T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個T細胞及/或分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集；及/或確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及/或基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一與第二變異核苷酸子序列之至少一種組合。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼嵌合抗原受體(CAR)鉸鏈域、跨膜域及/或胞內信號傳導域之核苷酸序列的方法。該方法包含：提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含以下中之兩者或更多者之組合：1)編碼CAR鉸鏈域之第一變異核苷酸子序列；2)編碼CAR跨膜域之第二變異核苷酸子序列；及3)編碼CAR胞內信號傳導域之第三變異核苷酸子序列。該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之一者定義該連續部分之第一末端，且該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之另一者定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端。該方法進一步包含將該庫引入經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼之CAR的細胞群體中，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級人類T細胞群體。該方法可進一步包括基於回應於使該等細胞與表現對該CAR之抗原結合域具有特異性之抗原的抗原呈現細胞接觸之高於臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法可進一步包含：分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集，及/或確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及/或基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一、第二與第三變異核苷酸子序列之至少一種組合。定義
貫穿本說明書，詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises/comprising)」之變型應理解為暗示包括所陳述之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群組，但不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群組。
提供術語及方法之以下解釋以便較好地描述本發明且指導一般技術者來實踐本發明。除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」係指一個或超過一個。舉例而言，術語「包含核酸分子」包括單個或複數個核酸分子且視為等效於短語「包含至少一個核酸分子」。除非上下文另外明確指明，否則術語「或」係指所述替代要素中之單個要素或兩種或更多種要素之組合。如本文所用，「包含(comprise)」意謂「包括(include)」。因此，「包含A或B」意謂「包括A、B或A及B」而不排除額外要素。除非另外說明，否則當本發明定義可能不同於其他可能的定義時，以本文所提供之定義為準。
除非另外解釋，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解含義相同的含義。本文所提及之所有HUGO基因命名委員會(HGNC)標識符(ID)均以全文引用之方式併入本文中。儘管與本文所述之方法及物質類似或等效之方法及物質可用於實踐或測試本發明，但在下文描述適合方法及物質。該等物質、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。
「T細胞受體」或「TCR」表示在T細胞或T淋巴細胞之表面上發現的分子，其鑑別作為肽與主要組織相容複合物(MHC)分子結合之抗原。MHC分子包括I類、II類及III類。I類及II類MHC分子在免疫反應中起關鍵作用。MHC I類分子表現於所有成核細胞以及血小板中，本質上除紅血細胞以外之所有細胞。其向殺手T細胞(亦稱為細胞毒性T淋巴細胞(CTL))呈現抗原決定基。MHC II類可由所有細胞類型條件性地表現，但通常僅在「專職性(professional)」抗原呈現細胞(APC)上出現：巨噬細胞、B細胞，且尤其樹突狀細胞(DC)。APC吸收抗原蛋白質，執行抗原加工，且返回其分子部分(稱為抗原決定基之部分)，且呈現於與MHC II類分子(抗原呈現)內偶合之APC之表面上。在細胞之表面上，抗原決定基可由如T細胞受體(TCR)之免疫結構鑑別。在一些實施例中，TCR包含兩條多肽鏈TCRα及TCRβ (分別由TRA及TRB編碼)。在一些實施例中，TCR包含TCRγ及TCRδ鏈(分別由TRG及TRD編碼)。在一些實施例中，該TCR包含胞外可變區及胞外恆定區。在一些實施例中，TCRα及TCRβ鏈之可變域包含三個高變互補決定區(CDR)，表示為CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，CDR3為主要抗原鑑別區域。在一些實施例中，TCRα鏈基因包含促進TCR多樣性之V及J基因片段，且TCRβ鏈基因包含V、D及J基因片段。
如本文所用，術語「TCR組庫」係指樣品或庫中之TCR鏈的集合。集合可包含至少兩種或更多種不同TCR鏈變異體。在一些實施例中，「TCR組庫」係指樣品或庫中之所有TCR鏈的集合。在一些實施例中，「TCR組庫」係指樣品或庫中之TCR鏈之子集的集合或選擇。在一些實施例中，「TCR組庫」係指樣品或庫中之TCRαβ對的集合。在一些實施例中，「TCR組庫」係指樣品或庫中之TCRαβ對之子集的集合或選擇。
TCR鏈之子集或選擇可基於例如TCR鏈之頻率。在一些實施例中，「TCR鏈之頻率」係指編碼所有TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之總計全部核酸當中編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)的核酸分子(RNA及/或DNA)之絕對數。在一些實施例中，編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數可基於獨特分子之計數使用「獨特分子標識符」(UMI)確定(作為例如Kivioja等人Nat Meth 2011及Islam等人Nat Meth 2013中所述之原理)。在一些實施例中，TCR鏈頻率可表示為百分比。所有TCR鏈之總數可僅包括編碼TCRα鏈、僅TCRβ鏈或TCRα與TCRβ鏈兩者之核酸分子。在一些實施例中，頻率表示為樣品中之頻率等於及大於、等於、大於或小於0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%之TCR鏈或鏈之間的任何數目或範圍。使用編碼TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數或相應百分比，可得到TCR鏈之排名次序。在一些實施例中，頻率表示為樣品中之按排名次序位於前1000、前900、前800、前700、前600、前500、前450、前400、前350、前300、前250、前200、前150、前140、前130、前120、前110、前100、前90、前80、前70、前60、前50、前40、前30、前20、前10、前5或其間之任何數目或範圍的TCR鏈。在一些實施例中，「TCR鏈之頻率」係指相對於樣品中之所有TCR鏈的TCR鏈之頻率。在一些實施例中，「TCR鏈之頻率」係指相對於少於樣品中之全部TCR鏈或相對於TCR鏈之子集的TCR鏈之頻率。
如本文所用，術語「頻率臨限值」係指既定TCR鏈在待包括於TCR鏈之子集或選擇中之樣品中出現的最小頻率。在一些實施例中，頻率臨限值包含樣品中之按排名次序位於前1000、前900、前800、前700、前600、前500、前450、前400、前350、前300、前250、前200、前150、前140、前130、前120、前110、前100、前90、前80、前70、前60、前50、前40、前30、前20、前10、前5或其間之任何數目或範圍的TCR鏈。在一些實施例中，頻率臨限值表示為包括樣品中之頻率等於及大於、等於及小於、等於、大於或小於0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%之TCR鏈或鏈之間的任何數目或範圍。在一些實施例中，「頻率臨限值」係指相對於樣品中之所有TCR鏈的臨限值。在一些實施例中，「頻率臨限值」係指相對於少於樣品中之全部TCR鏈或相對於TCR鏈之子集的臨限值。
如本文所用，術語「相對富集」係指一個樣品中之TCR鏈的豐度或頻率高於另一樣品。可進行比較之樣品包括例如腫瘤樣品及血液、不同腫瘤樣品、腫瘤樣品及非腫瘤樣品、來自相同腫瘤之不同區域的樣品、來自腫瘤核心及腫瘤邊界或界限之樣品、來自具有不同活化或分化狀態之T細胞的樣品等。
如本文所用，「開關受體」根據熟習此項技術者使用且包括：開關受體包括(但不限於)用於將通常與T細胞抑制或細胞凋亡相關之胞外信號轉換成T細胞活化信號的受體分子。此可藉由將結合抑制性或凋亡誘導配位體(例如(但不限於) TGFBR2、FAS或TIGIT)之胞外域(ECD)與來自T細胞活化受體(諸如CD3ε、CD28、IL2RB)之胞內信號傳導域(ISD)融合來達成。熟習此項技術者可瞭解，融合受體分子亦可經設計以藉由結合T細胞活化配位體之ECD與來自T細胞抑制性受體(例如PD-1或CTLA-4)之ISD組合來抑制T細胞功能。在一些實施例中，開關受體可含有(但不限於)與一個、兩個或甚至更多個信號傳導域融合之ECD。在一些實施例中，開關受體分子包括(但不限於)除ECD及ISD以外含有不同跨膜域(TM)之受體分子，或包括(但不限於)不同域之間的連接子或間隔子序列之任何其他新穎組分，包括(但不限於) ECD及TM及/或TM及ISD。
如本文所用，根據熟習此項技術者使用「單鏈TCR」。該術語進一步包括(但不限於)用連接子共價連接TCRα及TCRβ可變鏈片段。單鏈TCR包括(但不限於)用與TCRβ恆定域融合之連接子共價連接TCRα及TCRβ可變鏈片段且與TCRα恆定域反式共表現。在一些實施例中，單鏈TCR包括(但不限於)用與TCRα恆定域融合之連接子共價連接TCRα及TCRβ可變鏈片段且與TCRβ恆定域反式共表現。單鏈TCR之一些實施例包括(但不限於)用連接子共價連接TCRα及TCRβ可變鏈片段且與單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ε或CD3ζ信號傳導域融合。
如本文所用，術語「基因表現之空間模式」係指基因在特定區域或空間中之表現。在一些實施例中，「基因表現之空間模式」係指基因在諸如腫瘤之組織內的表現，亦即瘤內表現。在一些實施例中，「基因表現之空間模式」係指富集以一或多種表現型標記物之表現或不存在表現為特徵的區域或空間中之基因表現。在一些實施例中，表現型標記物可為與表型相關之任何標記物，包括(但不限於)一或多種表面標記物或其片段、一或多種蛋白質或其片段、一或多種RNA (諸如微RNA、siRNA或任何其他RNA)。在其他實施例中，「基因表現之空間模式」係指一種基因之表現或不存在表現與至少一種其他基因之表現或不存在表現組合。
如本文所用，術語「共表現模式」包括一或多個基因在相同細胞或相同組織樣品中之表現。在一些實施例中，術語「共表現模式」係指在相同細胞中或在相同組織樣品中不存在一或多個基因之表現。
術語「癌症」表示已經歷具有分化損失、生長速率增加、侵襲周圍組織之特徵性退行發育且能夠癌轉移之惡性贅瘤。術語「癌症」應視為包括以個體內細胞之不受控生長為特徵的疾病。在一些實施例中，術語「癌症」及「腫瘤」可互換使用。在一些實施例中，術語「腫瘤」係指良性或非惡性生長。
術語「庫」係指TCR鏈之集合。在一些實施例中，該庫包含組合以形成TCRαβ對之TCR鏈的集合。在一些實施例中，該庫包含組合以形成TCRαβ對之TCR鏈之子集的集合或選擇。
如本文所用，術語「新抗原」係指源自腫瘤特異性基因體突變之抗原。舉例而言，新抗原可由因非同義單核苷酸突變所致的突變型蛋白質在腫瘤樣品中表現，或可由因突變誘導之框架移位所致的替代性開放閱讀框架之表現產生。因此，新抗原可與病理學病狀相關。在一些實施例中，「突變型蛋白質」係指包含與典型胺基酸序列之相同位置處的胺基酸不同之至少一個胺基酸的蛋白質。在一些實施例中，突變型蛋白質包含相對於典型胺基酸序列，插入、缺失、取代、包括由閱讀框架移位產生之胺基酸或其任何組合。
術語「處理(治療)」涵蓋其在此項技術中之普通含義，且包括緩解病症之至少一個症狀或其他實施例，或降低疾病嚴重程度及其類似症狀。治療不需要實現完全治癒，或根除疾病之每一症狀或表現，即構成可行治療。如相關領域中認識到，用作治療劑之組合物可降低既定疾病病況之嚴重程度，但無需消除被視為適用之疾病的每一表現特徵。降低疾病之影響(例如藉由減少其症狀之數目或嚴重程度，或藉由增加另一治療之有效性，或藉由產生另一有益作用)，或降低個體之將出現疾病或惡化之可能性為足夠的。
「抗體」表示一種多肽，其包括特異性鑑別且結合抗原之抗原決定基的至少一個輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區。在一些實施例中，抗體由重鏈及輕鏈構成，該等鏈中之每一者具有可變區，稱為可變重鏈(VH )區及可變輕鏈(VL )區。共同地，VH 區及VL 區負責結合由抗體鑑別之抗原。術語抗體包括完整免疫球蛋白，以及其變異體及部分，諸如Fab'片段、F(ab)'2 片段，及源自完整免疫球蛋白之任何其他分子。
如本文所用，短語「B細胞受體(BCR)/抗體組庫」係指樣品中BCR或抗體鏈之集合。在一些實施例中，「BCR/抗體組庫」係指樣品中所有BCR或抗體鏈之集合。在一些實施例中，「BCR/抗體組庫」係指樣品中BCR或抗體鏈之子集的集合或選擇。
如本文所用，術語「鮮凍」或「急凍」意謂在收集後的較短時間段內冷凍組織或細胞樣品。在一些實施例中，在冷凍之前不儲存組織或細胞樣品。術語「鮮凍」或「急凍」可互換使用。
如本文所用，術語「TCR分離」涵蓋對TCRα與TCRβ鏈之特異性組合介導所需功能性的評估。術語「TCR分離」可指單鏈TCR分子之分離。TCR分離之方法可基於所需功能性及TCR盒之設計而不同。
術語「活化標記物」涵蓋熟習此項技術者所理解之術語的完整範疇，且進一步表示回應於外部刺激在胞內差異性地調節之一或多個基因。充當活化標記物之基因可為細胞基因體之天然部分或藉由熟習此項技術者已知之遺傳工程改造工具(例如病毒基因遞送)引入。值得注意地，差異性調節可描述在RNA層面上所偵測之基因的表現增加或降低。在某些情況下，轉錄物含量之此類變化可導致蛋白質含量之可偵測變化。藉助於非限制性實例，T細胞中與T細胞受體觸發相關之活化標記物可包括CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、OX40以及人工報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-嘌呤黴素抗性基因。
如本文所用，術語「TCR庫」係指編碼TCR之質體或含有彼等質體之細胞的多株集合。集合可包含至少兩種或更多種不同TCR鏈變異體。「TCR庫」可包括編碼TCR之質體之子集的集合或選擇。「TCR庫」可指可由編碼TCR之質體的集合表現之所有TCR的集合。在一些實施例中，「TCR庫」係指可由編碼TCR之質體的集合表現之TCR之子集的集合或選擇。在一些實施例中，「TCR庫」係指在編碼TCR之質體的多株集合中TCRαβ對的集合。在一些實施例中，「TCR庫」係指在編碼TCR之質體之多株集合中TCRαβ對之子集的集合或選擇。各種實施例之一般描述
本文所述之一些實施例係關於一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。在一些實施例中，該方法包含(I)提供包含複數個編碼TCRα鏈及TCRβ鏈之變異核酸的庫，(II)將該庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，(III)基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞；(IV)分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集，(V)確定該等變異核酸之核苷酸序列，及(VI)基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。在一些實施例中，富集可基於使用適當分析型軟體之統計富集。在一些實施例中，R DESeq2套裝軟體可用於鑑別富集之顯著性。在一些實施例中，用於顯著性之p值臨限值可定義為0.2、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、零，或在此等值中之任一者之間的任何值。
在一些實施例中，描述一種自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法。該方法可包含：(I) 確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸序列，(II) 基於至少一個準則，選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列的一或多個子集：(III) 藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及IV) 自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。該等方法之各種實施例提供於圖1至圖3。
在一些實施例中，如本文進一步描述，TCR鏈選擇將最初基於頻率臨限值。在一些實施例中，選擇將基於超過一個準則。可基於例如所分析腫瘤類型選擇超過一個選擇準則。在一些實施例中，TCR鏈選擇係基於篩選效率之臨限值。在一些實施例中，選擇準則基於可高效篩選多少個組合TCRαβ鏈來選擇。作為一實例，若可高效篩選1×106 個TCRαβ對，則可選擇至多1000個TCRα及1000個TCRβ鏈。在一些實施例中，可選擇不等數目個TCRα及TCRβ鏈，以例如補償大部分T細胞攜帶兩個框內TCRα重排之事實。在一些實施例中，TCRα與TCRβ之比率可為例如1百萬:1至1百萬:1百萬。在一些實施例中，該比率為在此等範圍之間的任何比率，包括例如100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10,000、1:100,000。
在一些實施例中，由本文所述之方法產生的庫中所鑑別之TCR鏈序列適用於治療或診斷已分離出TCR鏈序列之患者。在一些實施例中，由本文所述之方法產生的庫中所鑑別之TCR鏈序列適用於治療或診斷除已自TCR鏈序列分離之患者以外的患者。舉例而言，自一名患者分離之TCR鏈序列可鑑別另一名患者共有之腫瘤抗原。
在一些實施例中，藉由本文所述之方法產生大量庫。在一些實施例中，篩選大量庫允許TCR特徵之預測，因此允許例如TCR鏈之特異性選擇。
在一些實施例中，TCR庫可包含i)組合TCR庫；ii)此類表現細胞之庫；及/或iii)TCR擴增子定序庫。
在一些實施例中，該等TCR庫為以組合方式表現恰好一個α及一個β TCR鏈之質體的多株集合。該庫之性質使得與給定β鏈配對的給定α鏈之頻率與彼β鏈之總體表示成比例。相反，與給定α鏈配對的給定β鏈之頻率與彼α鏈之總體表示成比例(由此可見，吾人可控制庫中個別鏈之頻率)。在中值頻率+/- 1 log2單位範圍內之個別組合的頻率的百分比為25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、86%、97%、98%、99%、100%或前述值中之任兩者之間的任何值。
在一些實施例中，該庫可涉及表現相關核酸序列之細胞。表現可包括穩定或暫時性方法且可由DNA/RNA (或其衍生物)賦予。表現此類庫之多株池的細胞數目可為20、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、750、1,000、5,000、10,000、100,000、1,000,000倍池中存在之TCR變異體的數目。
在一些實施例中，該TCR擴增子定序庫為表示既定樣品中TCR頻率之DNA分子的集合。擴增子含有關於在既定細胞中表現之α及β鏈兩者之資訊，且需要超過600個連續核苷酸之延伸的序列來鑑別V及J區一致性以及B及β鏈兩者之CDR3序列。
在一些實施例中，該庫為約1.5 kb之變異體庫。
本文所述之方法中使用的不同T細胞群體可包含任何譜系之T細胞或其混合物。在一些實施例中，不同T細胞群體包含CD4或CD8 T細胞。在一些實施例中，該等不同T細胞群體包含未處理T細胞。在一些實施例中，該等不同T細胞群體包含效應T細胞。任何類型之效應T細胞可見於不同T細胞群體中，包括Th1 、Th2 、Th17 及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在一些實施例中，該等不同T細胞群體包含調節T細胞(Treg )。在一些實施例中，該等不同T細胞群體包含記憶T細胞。可在不同T細胞群體中發現任何記憶亞型，包括中心記憶T細胞(TCM 細胞)、效應記憶T細胞(TEM 細胞及TEMRA 細胞)、組織常駐記憶T細胞(TRM )、記憶幹細胞T細胞(TSCM )及虛擬記憶T細胞。在一些實施例中，虛擬記憶T細胞包含CD4陽性T細胞。在一些實施例中，虛擬記憶T細胞包含CD8陽性記憶T細胞。在一些實施例中，不同T細胞群體包含調節T細胞。在一些實施例中，不同T細胞群體包含功能異常T細胞。功能異常T細胞之特徵在於(1)較高含量之抑制受體，(2)缺乏經典效應功能(例如IFN-γ、IL-2及TNF-α)，同時分泌趨化細胞素CXCL13及(3)與細胞毒性相關之較高表現量的轉錄曲線，包括較高含量之顆粒酶B。在一些實施例中，不同T細胞群體包含αβ T細胞。在一些實施例中，不同T細胞群體包含γδ T細胞。不同T細胞群體可包含自然殺手T細胞(NKT)及黏膜相關恆定T細胞(MAIT)。T細胞群體可為不同細胞類型之混合物的一部分或組織樣品(諸如血液或腫瘤組織)的一部分。不同T細胞群體可包含不同譜系之T細胞的混合物或T細胞與非T細胞之混合物。
在一些實施例中，在個體之樣品內確定TCR-α及β核苷酸序列。可利用自樣品得到的DNA或RNA確定TCR-α及β核苷酸序列。在一些實施例中，確定該TCR-α及β核苷酸序列包含使用多重PCR。在一些實施例中，確定該TCR-α及β核苷酸序列包含藉由目標富集進行之TCR序列還原。舉例而言，TCR基因捕獲可用於目標富集(Linnemann等人，Nat Med 2013)。在一些實施例中，TCR序列還原包含利用5'RACE及PCR之還原。在一些實施例中，TCR序列還原包含利用空間定序。
在一些實施例中，自活細胞分離DNA或RNA。在一些實施例中，自所儲存細胞或所儲存組織樣品分離DNA或RNA。所儲存細胞或所儲存組織樣品可為活性的或無活性的。所儲存組織樣品可包含活性或無活性細胞或活性細胞與無活性細胞之組合。可自藉由任何儲存方法儲存之樣品或樣本分離DNA或RNA，該等儲存方法包括急凍細胞或組織及經固定或經福馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的樣品。用於細胞及組織樣品之儲存方法及DNA及RNA分離方法為熟習此項技術者已知。在一些實施例中，該樣品為腫瘤樣品。在一些實施例中，該腫瘤樣品為FFPE樣品。在一些實施例中，該腫瘤樣品為急凍樣品。在一些實施例中，該T細胞群體為不同細胞類型之混合物的一部分或組織樣品或體液的一部分，諸如血液、尿液、引流淋巴結或腫瘤組織。在一些實施例中，該樣品為無活性腫瘤樣本。在一些實施例中，該無活性腫瘤樣品為急凍樣品或FFPE樣品。
在一些實施例中，基於以下至少一個準則選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集：a)該T細胞群體內之頻率，b)與第二T細胞群體相比之相對富集，c)該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、親和力、輔受體依賴性或親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)，d)基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之初始區域或其他基因之表現模式，例如e)在多個樣品中共同出現或在類似頻率下出現，例如在多個腫瘤病變中出現，f)選擇分成多個組以分別還原該TCR組庫之特定部分，g)如不同實施例所定義之多個準則的組合。
在一些實施例中，選擇準則可用於排除而非包括(例如，包括在以上段落中之選擇方案b或選擇方案c中)。此可應用於本文所提供之實施例中之任一者。因此，其不可應用於投與或供應至個體，或排除其納入TCR集合。
在一些實施例中，基於既定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異，選擇來自總組庫之TCRα及β鏈序列。舉例而言，RNA衍生的與基因體複本數之間的比率可基於既定TCR鏈之基因體DNA及RNA之定量得到。在一些實施例中，選擇TCR鏈，其中RNA複本數比基因體DNA複本數高得多，得到大於1之比率。在一些實施例中，任何給定TCR之所得比率可相對於樣品中之所有其他TCR排名及選擇。舉例而言，與基於較低比率之較低排名TCR相比，可選擇基於較高比率之較高排名TCR，藉此選擇具有較大RNA複本數之TCR鏈。在一些實施例中，與基於較高比率之較高排名TCR相比，可選擇基於較低比率之較低排名TCR，藉此選擇具有較低RNA複本數之TCR鏈。可針對RNA衍生的與基因體複本數之間的比率將排名次序調節至任何數值。
在一些實施例中，選擇任何數目個TCRα及任何數目個TCRβ鏈，至多且包括1000個TCRα及TCRβ鏈。在一些實施例中，分別選擇超過1000個TCRα及TCRβ鏈。在一些實施例中，選擇TCRα及TCRβ鏈之數目以產生約1×106 個TCRαβ對。在一些實施例中，選擇TCRα及TCRβ鏈之數目以產生超過1×106 個TCRαβ對。
在一些實施例中，基於T細胞群體內之頻率選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，TCR序列之頻率的資料用於創建針對TCRα鏈及β鏈之單獨排名次序。舉例而言，可使用多重PCR、目標富集或5'-RACE及PCR確定含有T細胞之樣品的編碼不同TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數。在一些實施例中，DNA用於本文所述之方法中。在一些實施例中，RNA用於本文所述之方法中。將TCR鏈序列之所得集合分成TCRα鏈序列之集合及TCRβ鏈序列之集合。自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。在一些實施例中，編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數基於獨特分子之計數使用「獨特分子標識符」(UMI)確定，且按降序分選，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。在一些實施例中，使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的絕對數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。
在本文所提供之任一實施例中，可收集或創建RNA，且可定序RNA以替代DNA定序。
在一些實施例中，TCR序列之頻率的資料用於創建TCRα鏈及β鏈之組合排名次序。舉例而言，可使用多重PCR、目標富集或5'-RACE及PCR確定含有T細胞之樣品的編碼不同TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數。在一些實施例中，DNA用於本文所述之方法中。在一些實施例中，RNA用於本文所述之方法中。自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子(可能藉由使用「獨特分子標識符」(UMI)確定)的絕對數或在總TCR鏈之總組之間的對應百分比)按降序分選剩餘的TCR鏈序列，得到TCR鏈之排名。
在一些實施例中，基於TCR組庫還原之所需深度定義頻率臨限值。舉例而言，可使用多重PCR、目標富集或5'-RACE及PCR且可能使用「獨特分子標識符」(UMI)確定含有T細胞之樣品的編碼不同TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數。在一些實施例中，DNA用於本文所述之方法中。在一些實施例中，RNA用於本文所述之方法中。TCR鏈序列之所得集合將分成TCRα鏈序列之集合及TCRβ鏈序列之集合。自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的絕對數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。若意欲還原樣品中之十個最頻繁TCR，則僅可選擇前10個最頻繁TCRα鏈及β鏈。相比之下，若需要還原樣品中之較大部分TCR組庫，則可選擇超過前10個最頻繁的TCRα鏈及β鏈。較低頻率臨限值可在經選擇TCR鏈及所得TCR庫中引起較大深度以及較高多樣性。重要的是，亦可自本發明實施例中之一者所述之組合排名次序選擇TCRα鏈或TCRβ鏈。
在一些實施例中，該較低頻率臨限值用於基於頻率選擇TCRα鏈及β鏈之集合。在一些實施例中，不存在選擇相等數目個TCRα鏈及β鏈之要求。舉例而言，可使用多重PCR、目標富集或5'-RACE及PCR且可能使用「獨特分子標識符」(UMI)確定含有T細胞之樣品的編碼不同TCR鏈胺基酸序列(之一部分)之核酸分子的絕對數。在一些實施例中，DNA用於本文所述之方法中。在一些實施例中，RNA用於本文所述之方法中。TCR鏈序列之所得集合將分成TCRα鏈序列之集合及TCRβ鏈序列之集合。自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的絕對數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。所得排名次序可含有TCRα鏈或TCRβ鏈之發散數目，以防止選擇相等數目個TCRα鏈及TCRβ鏈，或可能需要自一個類別中選擇與其他類型相比更多的TCR鏈，例如因為細胞中之兩個TCRα基因座的特性經受產生性重排。此外，若選擇高於或低於某些頻率(表示為絕對數或百分比)之所有TCR鏈，則此可分別使得選擇TCRα鏈及TCRβ鏈之發散數目。重要的是，亦可自前述實施例中之一者所述的組合排名次序選擇TCRα鏈或TCRβ鏈。
在一些實施例中，基於定量頻率資料選擇前100種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於定量頻率資料選擇超過前100種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於頻率資料選擇前100、前200、前300、前400、前500、前600、前700、前800、前900、前1000種最豐富TCRα鏈及β鏈或其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，基於頻率資料選擇超過前1000種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於頻率資料選擇前5%、前10%、前20%、前30%、前40%、前50%、前60%、前70%、前80%、前90%、前100%之TCRα鏈及β鏈或其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，經選擇鏈充當構建塊，以組裝TCRαβ對之集合。
在一些實施例中，基於相比於第二T細胞群體之相對富集選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，基於相比於另一樣品時既定樣品中之最高富集倍數選擇前100種TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於相對富集選擇前100種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，最高富集倍數係相對於另一樣品。在一些實施例中，基於相對富集選擇超過前100種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於相對富集選擇前100、前200、前300、前400、前500、前600、前700、前800、前900、前1000種最豐富TCRα鏈及β鏈或其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，基於相對富集選擇超過前1000種最豐富TCRα鏈及β鏈。在一些實施例中，基於相對富集選擇前5%、前10%、前20%、前30%、前40%、前50%、前60%、前70%、前80%、前90%、前100%之TCRα鏈及β鏈或其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，基於與血液中之各別頻率相比之相對富集來選擇腫瘤病變之TCR鏈。在一些實施例中，基於與第二腫瘤病變相比之相對富集來選擇腫瘤病變之TCR鏈。在一些實施例中，同時對多個樣品進行TCR鏈之定量。舉例而言，可同時分析來自相同個體之多個腫瘤病變、匹配的腫瘤病變及血液樣品或較大腫瘤病變之多個離散取樣區段。藉由分析來自相同個體之多個樣品或匹配的樣品，可確定TCR鏈之生物相關性。舉例而言，相比於在末梢血液中在高頻率下發生或在單個腫瘤病變中發生的TCR鏈，在腫瘤中具有富集頻率之TCR鏈更可能與對腫瘤抗原之鑑別相關。在一些實施例中，與腫瘤邊界或腫瘤界限相比，基於腫瘤核心中之TCR鏈頻率選擇TCR鏈，其可包括腫瘤周圍之正常組織。在所揭示之實施例中之任一者中，基於相對頻率之倍數差異，相對頻率差異可用於得到排名次序。相對頻率之倍數差異可為10-6 與106 之間的任何數值。在一些實施例中，可優先選擇或排除在至少兩個比較樣品中之一者中發現的TCR鏈，以產生TCR庫。在一些實施例中，將排名前100之TCRα及TCRβ鏈用於TCR庫產生。在一些實施例中，將超過排名前100之TCRα及TCRβ鏈用於TCR庫產生。在一些實施例中，比較不同樣品中之TCR鏈組庫，用於具有新抗原特異性之較高可能性的TCR鏈之靶向選擇。在一些實施例中，基於相對富集對TCR鏈序列進行排序，接著根據基於頻率之排名次序進行選擇，例如如上文所述。任何準則次序及任何準則組合可用於TCR鏈選擇。
在本文所提供之實施例中之任一者中，亦可使用複合度量值。亦即，排序可藉由兩個或更多個態樣之組合進行，諸如藉由頻率及亦藉由腫瘤富集進行排序。在一些實施例中，該TCR在該腫瘤中為高頻的且富集於該腫瘤中。
在一些實施例中，基於TCR鏈之生物特性或序列特徵選擇來自該總組庫之TCRα及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，該TCR鏈之生物特性或序列特徵選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、親和力、輔受體依賴性或親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)。在一些實施例中，藉由基於電子雜交演算法之預測得到關於生物特性之資訊。
在一些實施例中，使用算法來鑑別樣品中之TCR簇。舉例而言，關於TCR簇之資訊可用於TCR鏈之目標選擇，以用於後續TCR庫產生。在一些實施例中，關於TCR簇之資訊用於選擇具有經定義特性之簇。在一些實施例中，關於TCR簇之資訊用於簇與公共TCR資料庫之比較。在一些實施例中，關於TCR簇之資訊用於移除具有較高機率之不相關TCR特異性的簇或TCR鏈。在一些實施例中，基於簇與公共TCR資料庫之比較移除簇。具有較高機率之例示性不相關TCR特異性包括例如鑑別源自流感、CMV、EBV及其他病毒及細菌感染物之病毒抗原決定基。已移除自不相關TCR鏈產生的TCR鏈之組可隨後用於TCR庫產生。在一些實施例中，關於TCR簇之資訊用於較佳地包括具有相關胺基酸序列之TCR鏈的簇。
在一些實施例中，基於TCR鏈之胺基酸序列鑑別TCR特性。在一些實施例中，基於TCRαβ複合物之結構特徵鑑別TCR特性。例示性特性包括例如HLA-限制、抗原特異性、輔受體依賴性、親本T細胞譜系、TCR之簇的共用特性等。
在一些實施例中，基於空間資訊選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，基於基因或蛋白質表現之空間模式選擇來自總組庫之TCRα鏈及β鏈序列的一或多個子集，其中空間基因或蛋白質表現模式源自以下中之至少一者：在組織中之初始區域或其他基因或蛋白質之共表現模式(為了避免疑問包括可能不存在共表現)。在一些實施例中，基於瘤內定位選擇TCR鏈。在一些實施例中，基於展現出某些表現型標記物之過度表現(或不存在表現)的空間富集選擇TCR鏈。表現型標記物可為與表型相關之任何標記物，包括(但不限於)一或多種表面標記物或其片段、一或多種蛋白質或其片段、一或多種RNA (諸如微RNA、siRNA或任何其他RNA)。
在一些實施例中，使用空間定序方法過濾TCR鏈。空間定序使得能夠自細胞以及組織內細胞之位置還原轉錄組或遺傳資訊，包括TCR序列資訊。舉例而言，還原相鄰細胞組且標記，以標記其在組織內之來源點，藉此在空間維度下連接轉錄組或遺傳資訊。自組織中之相同或鄰近空間位置還原的細胞形成空間簇。可基於某些資訊較佳地選擇來自某些空間簇之TCR鏈。可使用之資訊包括例如解剖學資訊。舉例而言，位於腫瘤中心或位於三級淋巴結構中之細胞簇可比腫瘤邊界處之簇更受關注。可使用之資訊包括例如轉錄組及或蛋白質表現資訊。舉例而言，相較於此類標記物較低表現之簇，具有較高PD-1及CD39表現之空間簇更可能富集新抗原特異性TCR鏈。因此，可選擇具有較高PD-1及CD39表現之簇以過濾TCR鏈。在一些實施例中，例如相較於腫瘤邊界，基於腫瘤中心之過度表現選擇簇。用於選擇之例示性參數展示於表1中。 表1.用於選擇標記物之例示性參數(包括其任何組合)
基因標記物 空間簇中表現的關係
PD-1 、 Tim-3 、 LAG-3 、 CD109 、 CD200 、 GITR 、 TNFRSF18 、 CD39 、 CD103 、 IFN-γ 、 IL-2 、 TNF-α 、 Ki67 、顆粒酶 B 、 CXCL13 CD8 、 CD4 、 CTLA-4 、 FoxP3 、 RBPJ 、 ZBED2 、 ETV1 、 ID3 、 MAF 、 PRDM1 、 EOMES 、 ITM2A 、 KIR2DL4 、 PTMS 、 FAM3C 、 AKAP5 、 CD7 、 PHLDA1 、 ENTPD1 、 CCL3 、 CCL4 、 TNFRSF9 、 ZBED2 、 XCL2 、 HMGB1P17 、 ILDR1 、 C10orf113 、 BTNL8 、 DLGAP5 、 MIR4298 、 CDC25C 、 KIF20A 、 E2F2 、 TSHZ2 CD45RA 、 KLRG1 、 IL7R 、 TCF7 、 CCR7 過度表現可標記可能的所關注簇                                  過度表現可標記不太關注的簇
  
  
  
TCR鏈之經選擇組可用於TCR庫產生。在一些實施例中，採用空間解析之RNA-或DNA-定序。在一些實施例中，舉例而言，將批量TCR鏈群體連同與T細胞表型相關之額外轉錄物還原。與T細胞表型相關之例示性轉錄物包括CTLA-4、PD-1、CD103、CD39、FoxP3、IFN-γ、IL-2、CXCL13等。在一些實施例中，自多個空間簇還原之解剖位置及T細胞特異性轉錄組用於鑑別所關注簇。
在一些實施例中，基於共同出現或以類似頻率出現在多個樣品中選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，基於在多個腫瘤病變中之出現選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。在一些實施例中，來自多個腫瘤病變之TCR鏈頻率資訊用於過濾所關注TCR鏈。在一些實施例中，用於過濾所關注TCR鏈之特定資訊包含排除僅存在於一個腫瘤病變中之TCR鏈。在一些實施例中，用於過濾所關注TCR鏈之特定資訊包含選擇性包涵在所測試之所有腫瘤病變中存在的TCR鏈。
在一些實施例中，基於選擇分成多個組，選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集，以分別還原該TCR組庫之特定部分。在一些實施例中，將具有高於經定義臨限值之頻率的所有TCRα鏈及β鏈序列一起選擇至一組中。舉例而言，可將包含一定百分比之總TCRα鏈及β鏈序列，例如高於及/或等於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%或此範圍之間的任何其他數目個所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一組。藉由類似原則，例如可將排名位置高於或等於10 (前10)、100 (前100)、1,000 (前1,000)或10,000 (前10,000)之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一組。在一些實施例中，將低於經定義臨限值或介於兩個經定義臨限值之間的所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一個組中。舉例而言，可將低於1%或1%與0.1%之間的所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一個組中。藉由類似原則，例如可將低於排名位置10或排名位置10與100之間的所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一組。在一些實施例中，將具有高於經定義臨限值之頻率的所有TCRα鏈及β鏈序列一起選擇至一個組中，且將低於經定義臨限值之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至另一組中。舉例而言，將高於及等於1%之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一個組中，且將低於1%之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至第二組中。藉由類似原則，將高於及等於排名位置10之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至一個組中，且將低於排名位置10之所有TCRα鏈及β鏈序列選擇至第二組中。
在一些實施例中，在不創建具有實質複雜性之TCR庫的情況下篩選更大數目個TCR。作為一實例，可產生多個子庫。在一些實施例中，TCR庫之複雜性低於由所有包含TCRα鏈及β鏈序列之隨機配對產生之複雜性。在一些實施例中，所產生TCR庫不含所有可能的TCRα與TCRβ組合。在一些實施例中，使數組TCR鏈隔離至個別池，以創建一或多個比將藉由隨機配對TCRα鏈與β鏈序列得到的複雜性更低的複雜性庫。在一些實施例中，基於排序臨限值合併TCR鏈。在一些實施例中，以排名次序之某一位置內的所有TCR形成用於TCR庫產生之池。舉例而言，排名前50之TCRα及β鏈可包括於池1中；排名前25至前75之TCRα及β鏈可包括於池2中；等等。作為另一實例，排名前50至前100之TCRα及β鏈可包括於池2中；等等。可使用任何排序準則，包括TCRα及β鏈之不同臨限值。在一些實施例中，基於頻率排序。在一些實施例中，基於相較於參考樣品之相對富集來排序。在一些實施例中，基於空間資訊合併TCR鏈。舉例而言，來自既定空間簇之所有TCRα鏈及β鏈可形成特異性池。在一些實施例中，基於TCR之特徵合併TCR鏈。任何TCR特徵可用於合併TCR。舉例而言，具有經定義序列特徵或經預測屬性之所有TCR均可形成特異性池。預測特性之實例包括例如輔受體依賴性、初始T細胞譜系、HLA-限制、特異性等。
在一些實施例中，基於如不同實施例中所定義之多個準則之組合選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集。
在一些實施例中，TCR組庫藉由經選擇TCRα與β鏈序列之組合配對產生。在一些實施例中，組合配對包含所有經選擇TCRα與β鏈序列之隨機配對。TCRαβ鏈之庫可藉由經選擇TCRα與β鏈序列之組合配對產生。在一些實施例中，經選擇TCR鏈序列用於合成TCRα鏈及β鏈DNA或RNA片段之庫。使用熟習此項技術者已知之選殖策略(例如包括(但不限於)吉布森(Gibson)分子組裝及Golden Gate組裝)，可藉由恰好一個TCRα鏈與一個β鏈DNA或RNA片段連接形成人工TCR基因。在一些實施例中，藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合。在一些實施例中，藉由用TCRα基因及β基因之單獨集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞表現一個TCRα鏈與一個β鏈。
在一些實施例中，藉由組合配對經選擇TCRα鏈與β鏈序列創建TCRαβ對之庫，以創建TCR組庫藉由以下中之至少一者達成：a)使用TCR鏈序列來合成TCRα鏈及β鏈DNA或RNA片段之單獨庫，該等片段隨後連接成一個DNA或RNA片段，其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接，b)藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合，c)藉由用TCRα基因及β基因之各別集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞將表現至少一個TCRα鏈與一個β鏈，及/或d) TCRα鏈與β鏈之組合連接於單鏈TCR構築體中，其中TCRα與TCRβ可變鏈片段兩者融合，且其中該單鏈TCR構築體可融合於(i)單獨跨膜域或(ii)另外含有胞內信號傳導域，包括但不限於單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ε或CD3ζ信號傳導域。
對於本文實施例中之任一者，在一些實施例中，還原I類及/或II類限制型TCR序列。
對於本文所提供之實施例中之任一者，在一些實施例中，還原以下中之至少一者：新抗原特異性TCR序列、病毒特異性TCR序列、共用腫瘤抗原特異性TCR序列及/或自身抗原特異性TCR序列。
在一些實施例中，該活化標記物選自由以下組成之群：CD25、CD69、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、OX40。
在一些實施例中，TCR組庫表示樣品中之所有TCRα及β鏈序列。在一些實施例中，TCR組庫表示自樣品還原之所有TCRα及β鏈序列。在一些實施例中，選擇TCR組庫作為來自樣品中存在之TCR序列之總組庫的TCRα及β鏈序列之子集。在一些實施例中，選擇TCR組庫作為來自樣品中還原之TCR序列之總組庫的TCRα及β鏈序列之子集。
在一些實施例中，該方法包含鑑別來自所創建TCR組庫之至少一個TCRαβ對。在一些實施例中，該TCRαβ對表示新產生之組合。在一些實施例中，該TCRαβ對表示並非新產生之組合。在一些實施例中，用該所產生TCRαβ對之庫修飾報導細胞或T細胞池。在一些實施例中，經修飾報導細胞或T細胞池可藉由負載有至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激。可使用報導細胞或T細胞之任何刺激分析。報導細胞或T細胞之刺激分析為熟習此項技術者所已知。在一些實施例中，基於至少一種活化標記物分離抗原反應性報導細胞或T細胞。舉例而言，可使用任何CD4或CD8 T細胞活化標記物。在一些實施例中，可使用任何CD標記物。在一些實施例中，活化標記物可包括標記物，諸如例如CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF。在一些實施例中，基於增殖分離抗原反應性報導細胞或T細胞。在一些實施例中，基於對抗生素選擇之抗性分離抗原反應性報導細胞或T細胞，該抗生素選擇經由報導細胞或抗性基因之T細胞活化依賴性表現獲得。可使用報導細胞或T細胞分離之任何方法，包括(但不限於)磁性珠粒富集或流式細胞測量術，例如熟習此項技術者已知。在一些實施例中，無需分離報導細胞或T細胞。舉例而言，報導細胞或T細胞增殖或抗生素選擇之使用可消除選擇需求。在一些實施例中，自批量抗原反應性報導細胞或T細胞得到RNA。自批量抗原反應性報導細胞或T細胞得到的RNA可用於產生TCRαβ特異性cDNA。在一些實施例中，藉由DNA定序分析TCRαβ特異性cDNA，以確定抗原反應性報導細胞或T細胞之TCRαβ基因序列。在一些實施例中，自批量抗原反應性報導細胞或T細胞得到DNA，以產生TCRα/β特異性PCR產物，其藉由DNA定序分析以確定抗原反應性報導細胞或T細胞之TCRαβ基因序列。在一些實施例中，經定義TCRαβ對可與可藉由對自RNA或DNA產生之特異性PCR產物進行定序來偵測的基於分子核酸之鑑別符(「條碼」)相關。
在一些實施例中，使用基於單細胞之方法確定TCRαβ對。舉例而言，基於單細胞之方法包括液滴-PCR。使用基於單細胞之方法，可分析抗原反應性T細胞之TCRαβ基因序列。在一些實施例中，藉由一或多種活化標記物鑑別抗原反應性T細胞。可使用任何CD標記物，包括例如CD4或CD8 T細胞活化標記物。在一些實施例中，活化標記物包括例如CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF。在一些實施例中，藉由其轉錄概況來鑑別抗原反應性T細胞。
在一些實施例中，藉由在批量T細胞中之TCRαβ基因插入的基因體PCR來確定TCRαβ對。在一些實施例中，使所產生PCR產物經受DNA-定序分析。
在一些實施例中，使用報導基因鑑別經TCR轉導的報導細胞或T細胞之活化。報導基因可報導TCR觸發。例示性報導基因包括例如NFAT-GFP或NFAT-YFP。在一些實施例中，基於對抗生素選擇之抗性分離抗原反應性報導細胞或T細胞，該抗生素選擇經由抗性基因之T細胞活化依賴性表現獲得。例示性報導基因包括例如NFAT-嘌呤黴素抗性或NFAT-潮黴素。在一些實施例中，使用報導基因之組合。
在一些實施例中，藉由結合至攜帶所關注抗原之MHC複合物來鑑別抗原反應性細胞。
在以上實施例中之任一者中，鑑別來自所創建TCR組庫之至少一種TCRαβ對。TCRαβ對之所需特徵可包括抗原特異性、TCR親和力、TCR輔受體依賴性、HLA-限制、TCR交叉反應性、TCR抗腫瘤反應性或其任何組合。
在以上實施例中之任一者中，所還原TCR鏈序列可定義為CDR3核苷酸序列連同足夠的5'-及3'-核苷酸序列資訊，以基於核苷酸序列比對選擇至少一個TCR V區段及一個TCR J區段家族，從而組裝完整TCR鏈序列。在一些實施例中，以2位數或4位數解析度鑑別J基因。在一些實施例中，核苷酸序列比對係基於65%序列一致性、70%序列一致性、75%序列一致性、80%序列一致性、85%序列一致性、90%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、99%序列一致性、100%序列一致性及其間之任何數目或範圍。在一些實施例中，得到足夠的序列資訊以鑑別來自具有所需特徵之所創建TCR庫的TCRα鏈及β鏈。
在一些實施例中，所還原TCR鏈由CDR3核苷酸序列定義。在一些實施例中，所還原TCR鏈由CDR3胺基酸序列定義。
在一些實施例中，所還原TCR鏈由足夠的5'-及3'-核苷酸序列資訊定義，以選擇至少一個TCR V區段及一個TCR J區段家族。在一些實施例中，所還原TCR鏈由足夠的胺基酸序列資訊定義，以選擇至少一個TCR V區段及一個TCR J區段家族。在一些實施例中，所還原TCR鏈定義為足夠核苷酸或胺基酸序列資訊，以在所創建TCR庫內明確鑑別TCRαβ對。在一些實施例中，所還原TCR鏈定義為在所創建TCR庫內明確鑑別TCRαβ對之獨特分子標識符，諸如基於核苷酸之條碼。
在一些實施例中，基於核苷酸序列比對定義TCR鏈序列。在一些實施例中，基於胺基酸序列比對定義TCR鏈序列。使用核苷酸或胺基酸序列比對，可組裝完整TCR鏈序列。
在一些實施例中，可使用來自個體之樣品，其包含如上所述之無活性起始物質。舉例而言，無活性起始物質可包含無活性細胞或無活性組織樣品。無活性起始物質可藉由此項技術中已知之任何方法儲存。
在前述實施例中之任一者中，可還原經鑑別TCR組庫之經定義部分。在一些實施例中，經鑑別TCR組庫之經定義部分包含還原TCR組庫之經選擇部分而非完整TCR組庫。經選擇TCR組庫可由上文所闡述之準則中之任一者定義，諸如T細胞群體內之經定義頻率、相比於第二T細胞群體之相對富集、TCR鏈之生物特性、基因表現之空間模式、共同出現或以類似頻率出現在多個樣品中、選擇至TCR鏈之多個群組或池中或其任何組合。在一些實施例中，經選擇TCR組庫由既定抗原特異性定義。在一些實施例中，抗原特異性包含針對新抗原之特異性。在一些實施例中，抗原特異性包含經預測抗原特異性。
在一些實施例中，還原抗原特異性TCR序列。在一些實施例中，還原新抗原特異性TCR序列。舉例而言，新抗原可為腫瘤中發現的由抗原特異性T細胞鑑別的突變型蛋白質。因此，可存在針對腫瘤之抗原特異性T細胞，其具有對腫瘤或其腫瘤抗原具有特異性之TCR序列。
在前述實施例中之任一者中，表現抗原特異性TCR序列之T細胞可用於診斷或治療感染或自體免疫病症。
在前述實施例中之任一者中，表現新抗原特異性TCR序列之T細胞可作為癌症療法投與。舉例而言，新抗原特異性T細胞可用於靶向表現新抗原之腫瘤。在一些實施例中，新抗原特異性T細胞藉由將新抗原特異性TCR鏈引入至T細胞中來產生。在一些實施例中，表現新抗原特異性TCR序列之T細胞可為自體或同種異體的。
在前述實施例中之任一者中，該方法可用於診斷。舉例而言，針對某一組織抗原之抗原特異性TCR的存在可指示自體免疫疾病。藉助於其他實例，針對某些病原體之抗原特異性TCR的存在可指示感染性疾病。
在一些實施例中，該診斷為自感染之病理性部位還原TCR組庫。在一些實施例中，該診斷為自自體免疫部位還原TCR組庫。舉例而言，感染或自體免疫部位處之細胞或組織可表現由某些T細胞鑑別之特定抗原。藉由確定可在感染或自體免疫位點處偵測特定抗原之T細胞的TCR序列，可還原與感染或自體免疫位點相關或對感染或自體免疫位點具有特異性之TCR組庫。為了鑑別針對介導自身抗原或病原體之自體免疫的TCR序列，可針對一組經選擇自身抗原或病原體衍生的抗原之反應性測試由經選擇TCRα鏈及β鏈產生之組合TCRαβ之庫。
在前述實施例中之任一者中，該方法可用於還原BCR/抗體組庫。舉例而言，可還原表現BCR受體或產生對特定抗原具有特異性之抗體的B細胞。因此，所還原B細胞之BCR/抗體組庫可藉由施加上文所述之方法中之任一者來還原、選擇及組合對免疫球蛋白重鏈及輕鏈以創建抗體組庫來確定。具有所關注特性之抗體可選自所創建抗體組庫。
在以上實施例中之任一者中，該方法可包含分離來自包含TCR-α與β核酸序列之患者樣品的核酸。該核酸可為DNA或RNA。核酸可自個體之任何組織或細胞分離，包括(但不限於)血液、皮膚、肝臟、骨髓、活檢物質等。在一些實施例中，該個體為人類。在一些實施例中，該個體為哺乳動物。在一些實施例中，該個體為動物。
在本文實施例中之任一者中，來自個體之樣品可包含自體液分離之細胞。在一些實施例中，該等細胞為腫瘤特異性T細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞。在一些實施例中，該體液選自由以下組成之群：血液、尿液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、腦脊髓液、唾液、痰、黏膜分泌物、陰道液、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液及腹腔液。
在一些實施例中，在一些實施例中，基於以下至少一個準則選擇來自該總組庫之該TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集：該T細胞群體內之頻率，與第二T細胞群體相比之相對富集，給定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異，該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、親和力、輔受體依賴性、親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)或TCR序列模體，基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之起始區域或其他基因之共表現模式，在多個樣品中共同出現或在類似頻率下出現，例如在多個腫瘤病變中出現，分配至多個組中以分別還原該TCR組庫之特定部分，如不同實施例所定義之多個準則的組合。
在一些實施例中，藉由以下中之至少一者確定TCR-α及β序列：多重PCR；藉由目標富集之TCR序列還原；藉由5'RACE及PCR之TCR序列還原；藉由空間定序之TCR序列還原；藉由RNA-seq之TCR序列還原，及使用獨特分子標識符(UMI)。
在一些實施例中，步驟III係藉由以下中之至少一者達成：使用TCR鏈序列來合成TCRα鏈及β鏈DNA或RNA片段之庫，該等片段連接於一個DNA或RNA片段(視情況其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接)，藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合，或藉由用TCRα基因及β基因之單獨集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞將表現至少一個TCRα鏈與一個β鏈，TCRα鏈與β鏈之組合連接於單鏈TCR構築體中，該單鏈TCR構築體含有TCR鏈片段以及單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ζ或CD3ε信號傳導域。
在一些實施例中，步驟IV係藉由以下中之至少一者達成：經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種活化標記物分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離；經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池用適合於追蹤細胞增殖之螢光染料標記，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於增殖分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離；將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池分成至少兩個樣品；藉由表現至少一種所關注抗原或不表現之抗原呈現細胞刺激樣品；在刺激之後，將兩個報導細胞群體培育一段時間，且隨後藉由TCR分離分析兩個報導細胞群體；比較自兩個樣品得到的TCRαβ對，以鑑別暴露於至少一種抗原之樣品中豐度較高的TCR基因；經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種報導TCR觸發的報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-YFP，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離；經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於按照選擇性存活對抗原特異性報導細胞的選擇，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離，該選擇性存活包括但不限於在TCR信號傳導時例如藉由使用NFAT嘌呤黴素轉殖基因之獲得性抗生素抗性；將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池暴露於一或多個攜帶所關注抗原之MHC複合物；分離結合於MHC複合物之報導細胞用於TCR分離；經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激；隨後，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體方法以使TCR分離與至少一種活化標記物之轉錄物含量的偵測組合來鑑別所關注TCRαβ對；藉此在該T細胞池內偵測到單報導細胞，其中TCRαβ轉錄物與增加含量的活化標記物共表現。
在一些實施例中，該活化標記物選自由以下組成之群：CD4或CD8 T細胞活化標記物、CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、OX40。
在一些實施例中，該活化標記物為CD69，且分離兩種細胞群體用於進一步分析，一種細胞群體具有較高表現之CD69及另一種細胞群體具有較低表現之CD69。
在一些實施例中，步驟IV係藉由以下中之至少一者達成：基於至少一種活化標記物之鑑別或選擇；基於回應於抗原之增殖的鑑別或選擇；基於鑑別與未經刺激細胞相比，經抗原刺激細胞中較高豐度之TCR基因的鑑別或選擇；基於藉由TCR觸發之報導基因活化之鑑別或選擇；基於選擇性存活之鑑別或選擇，該選擇性存活包括(但不限於) TCR信號傳導時之獲得性抗生素抗性；基於結合至一或多種MHC複合物之鑑別或選擇；使用基於單細胞之液滴PCR或微流體的鑑別或選擇；或其任何組合。
在一些實施例中，該等報導細胞為T細胞。
在一些實施例中，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體的鑑別或選擇；或其任何組合進一步包含確定活化相關基因之共表現。
在一些實施例中，本文描述了創建多個T細胞庫之方法，該等方法包含：(a)根據本文所述之方法還原T細胞受體(TCR)之組庫；(b)選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。
在一些實施例中，基於頻率範圍選擇TCRα鏈及β鏈序列。
在一些實施例中，基於圈選(gating)選擇或分選細胞。在一些實施例中，基於樣品中最高0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99.9%或其間之任何數目或範圍的單個活細胞分選細胞。在一些實施例中，基於樣品中最低0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99.9%或其間之任何數目或範圍的單個活細胞分選細胞。
在一些實施例中，將核酸庫引入細胞群體中。在一些實施例中，細胞群體為二倍體。在一些實施例中，細胞群體具有任何倍性。在一些實施例中，自該細胞群體庫選擇第一細胞群體。在一些實施例中，量測第一細胞群體中之核酸序列的富集及/或耗乏以鑑別所關注核酸序列。在一些實施例中，藉由將該群體與參考進行比較來量測第一群體中之核酸序列的富集及/或耗乏。在一些實施例中，參考可為第二細胞群體或核酸序列庫。在一些實施例中，第一細胞群體中之核酸序列的富集及/或耗乏藉由與超過一個參考進行比較來量測。
在一些實施例中，基於流式細胞測量術分選來分離該第一及/或第二群體。在一些實施例中，基於偵測表型變化進行流式細胞測量術分選。在一些實施例中，藉由使該細胞群體庫與另一細胞群體接觸來誘導表型變化。
在一些實施例中，藉由經螢光標記之探針結合至細胞來偵測表型變化。在一些實施例中，基於臨限值進行流式細胞測量術分選。在一些實施例中，該臨限值基於藉由流式細胞測量術分選來自總細胞之部分還原具有最高螢光信號之細胞的百分比之意圖。在一些實施例中，分離基於螢光信號之細胞的前0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99.9%。在一些實施例中，該臨限值基於藉由流式細胞測量術分選來自總細胞之部分還原具有較低螢光信號之細胞的百分比之意圖。在一些實施例中，分離基於螢光信號之細胞的後0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99.9%。在一些實施例中，多個臨限用於將樣本分離成第一與第二群體。
在一些實施例中，該臨限值基於意欲藉由流式細胞測量術基於螢光信號強度自細胞之總池還原最小數目個細胞，例如若自10×10e6還原至少1×10e6個細胞，則基於螢光信號分離前10%或後10%細胞。
在一些實施例中，該臨限值基於第二細胞群體之螢光信號強度。在一些實施例中，該臨限值基於高於參考群體之螢光信號強度。在一些實施例中，該臨限值基於低於參考群體之螢光信號強度。在一些實施例中，該參考群體中之螢光信號強度基於具有第二標記物表現之該群體的子集。
在一些實施例中，基於磁性珠粒富集分離該第一及/或第二群體。在一些實施例中，磁性珠粒富集基於表型之變化進行。在一些實施例中，藉由使該細胞群體庫與另一細胞群體接觸來誘導表型變化。
在一些實施例中，使該細胞群體庫與另一細胞群體(其可稱為「其他細胞群體」)接觸為與經遺傳工程改造以改變表型之另一細胞群體接觸。在一些實施例中，另一細胞群體為經遺傳工程改造細胞之多株池。在一些實施例中，另一細胞群體經遺傳工程改造以表現變異分子。在一些實施例中，另一細胞群體經遺傳工程改造以表現一或多種抗原。在一些實施例中，另一細胞群體經遺傳工程改造而以小型基因形式表現一或多種抗原。在一些實施例中，另一細胞群體經遺傳工程改造而以串列小型基因形式表現一或多種抗原。
在一些實施例中，另一細胞群體為可呈現抗原之細胞(抗原呈現細胞；APC)。在一些實施例中，另一細胞群體為樹突狀細胞。在一些實施例中，另一細胞群體為單核細胞。在一些實施例中，另一細胞群體為經MHC-I類及/或II類對偶基因工程改造之細胞。在一些實施例中，另一細胞群體可為B細胞。在一些實施例中，另一細胞群體可為自體細胞。在一些實施例中，另一細胞群體可為自體B細胞。在一些實施例中，另一細胞群體可為永生化自體B細胞。在一些實施例中，另一細胞群體可為藉由EBV感染永生化之自體B細胞。
在一些實施例中，使細胞群體庫與另一細胞群體接觸觸發在屬於細胞群體中之任一者之細胞上表現的因子之間的特異性相互作用。在一些實施例中，因子之間的相互作用為受體-配位體相互作用。在一些實施例中，受體-配位體相互作用中之受體為T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，受體-配位體相互作用中之配位體為在主要組織相容複合物(MHC)上呈現之抗原。在一些實施例中，該細胞群體庫與另一細胞群體之間的受體-配位體相互作用觸發可偵測之表型變化。
在一些實施例中，在該細胞群體庫中表現之變異體的集合為分別表現單TCRα與單TCRβ鏈組合的質體庫。在一些實施例中，藉由以組合方式接合TCRα與TCRβ鏈之集合來構建該TCR庫。在一些實施例中，TCRα與TCRβ之所有組合可存在於TCR庫中。在一些實施例中，使用複雜性較低之多個庫來創建複雜性較高之庫。在一些實施例中，該經組合較高複雜性庫之該複雜性低於具有存在於該經組合較高複雜性庫中之TCRα與TCRβ之所有組合的庫。在一些實施例中，在複雜性較低之多個庫設計中使用配對資訊或配對可能性資訊，以最大化在TCR庫中呈現之此等TCRα-TCRβ對之機率。在一些實施例中，複雜性較低之庫可含有一或多個TCRα與一或多個TCRβ鏈之所有組合。在一些實施例中，藉由首先產生編碼TCRα及TCRβ鏈兩者之單核苷酸分子的多個變異體，且隨後混合兩種或更多種編碼TCRα及TCRβ鏈之分子的不同變異體來構建該TCR庫。
在一些實施例中，藉由使探針結合至細胞來偵測表型之變化。在一些實施例中，該等細胞在探針結合之前不需要用任何固定劑處理。在一些實施例中，該探針允許將磁性珠粒偶合至該細胞。在一些實施例中，磁性珠粒富集允許自細胞群體庫分離第一及/或第二細胞群體。在一些實施例中，該第一或該第二細胞群體為由磁體保留之細胞。在一些實施例中，該第一或該第二細胞群體為不被磁體保留之細胞。在一些實施例中，多個探針之結合用於藉由依序磁性珠粒富集來分離第一及/或第二群體。在一些實施例中，使探針結合至CD62L。在一些實施例中，使探針結合至CD69。在一些實施例中，至少一個核苷酸序列在該第一細胞群體中統計學上顯著增濃或耗乏。在一些實施例中，相對於參考群體確定統計學上顯著之富集或耗乏。在一些實施例中，至少一個核苷酸序列相對於該第二細胞群體在該第一細胞群體中統計學上富集。在一些實施例中，組合流式細胞測量術分選與磁性珠粒富集。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之核苷酸序列的方法。該方法包含將該庫引入細胞群體中；使該細胞庫與第二細胞群體接觸，基於至少一種標記物之表現藉由磁性珠粒富集選擇該細胞庫之第一群體，相對於對照基於該經選擇第一群體內之核苷酸序列之統計學上顯著之富集或耗乏鑑別至少一個核苷酸序列。在一些實施例中，富集或耗乏之實體為核酸庫內含有的核苷酸序列。在一些實施例中，該第一細胞群體中之至少一些經設計以表現一或多種由核酸庫之成員編碼的多肽。在一些實施例中，將標記物表現與來自庫之所引入核酸連接。在一些實施例中，「連接」表示所引入核酸改變標記物表現。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之核苷酸序列的方法。該方法包含：將該核酸庫引入細胞群體中，以形成細胞庫；使該細胞庫與第一細胞群體接觸；基於藉由磁性珠粒富集的至少一種標記物之表現，選擇該細胞庫之亞群；及基於相對於對照之該亞群內之該等核苷酸序列的統計學上顯著之富集或耗乏，鑑別至少一個核苷酸序列。在一些實施例中，細胞亞群中之至少一些經設計以表現由該核酸庫之成員編碼的一或多個多肽。
在一些實施例中，選擇係基於高於第一臨限值含量之標記物表現。在一些實施例中，標記物適合於磁性珠粒富集，其可意謂(但不限於)可藉由胞外表現藉由磁性珠粒標記之標記物(例如其必須可胞外得到)。在一些實施例中，核苷酸序列編碼經表現多肽。
在一些實施例中，引入細胞群體中之核酸庫會引起變異分子之表現。在一些實施例中，此類變異分子為T細胞受體序列。在一些實施例中，此類變異分子為開關受體。在一些實施例中，此類變異分子為CAR分子。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之(視情況)組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法包含：將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；及基於相對於對照之該子集內之該核苷酸序列的富集，確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性。在一些實施例中，自第一細胞群體分離該至少一個核酸。在一些實施例中，基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該第一細胞群體。
在一些實施例中，本文所提供之方法中之任一者進一步包含投與表現該等抗原特異性TCR序列之T細胞，以診斷或治療感染或自體免疫之步驟。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，T細胞可為自體或同種異體。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，活化標記物為CD69。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，分離兩種細胞群體，一種細胞群體具有較高表現之CD69及另一種細胞群體具有較低表現之CD69。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，提供一種核苷酸庫，其包含根據本文所提供之方法中之任一者還原的T細胞受體之組庫。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，提供一種核苷酸構築體，其包含根據本文所提供之方法中之任一者鑑別的核苷酸序列。
在一些實施例中，對於本文所提供之方法或組合物中之任一者，提供一種細胞，其包含根據上述之核苷酸構築體。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自樣品之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法。該方法包含：a)對樣品中之TCR-α及β鏈定序，b)選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫，c)將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池，d)用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞，(在一些實施例中，其可經由恰好本文所述之雙池方法(two-pool process)進行)，e)確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對，及f)將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法。該方法包含：a)將庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，b)基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，(其可視情況在抗原呈現細胞中)，其中該亞群包含複數個細胞，c)分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集，d)確定該等變異核酸之核苷酸序列，及e)基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。在一些實施例中，該方法進一步包含提供包含編碼TCRα及TCRβ鏈之該複數個變異核酸的該庫。
在一些實施例中，所分選之細胞的百分比係基於在對照培養物及與表現新抗原之細胞的培養物中具有標記物表現之T細胞的百分比之比較。任何標記物可用於細胞分選。在一些實施例中，用於分選細胞之標記物包含例如CD4、CD8及CD69。
額外實施例展示於圖35A-35E中，其展示自藉由基因合成產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。此等實施例展示藉由增加E:T比率來增加TCR庫篩選平台之敏感性的想法。此等項目亦體現於以下實例中之一些中。
如本文所用，「步驟」的數字僅指示在所述特定章節中論述的實施例，字母指示方法自身的步驟。因此，舉例而言，「步驟35」指示標題為35之實施例，而「a」指示該實施例之步驟「a」。術語「步驟」指示方法的一部分，且不一定要求在開始另一步驟之前完成任一個步驟。
步驟 35A) 篩選設計之示意圖。 使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及95個未經表徵TCR創建100×100個設計之組合TCR庫。藉由Twist Bioscience使用人類V、CDR3及J區段組裝庫，而恆定(C)區具有鼠類來源。該庫用於Jurkat報導T細胞之反轉錄病毒轉導。多株報導T細胞與經工程改造而以TMG型式呈現同源抗原之抗原呈現細胞(APC)共培養。對於此實例，在共培養物中使用表現TMG的EBV-LCL細胞及未經工程改造以呈現特異性抗原之EBV-LCL。
步驟 35B) 篩選之分選策略。 將表現如35A)中所概述產生的100×100個設計TCR庫之Jurkat報導T細胞以1:1/1:2及1:3比率與35A中所提及之APC共培養21小時。在共培養之後，使用基於B細胞上CD20表現之磁性珠粒選擇使共培養APC耗乏。在細胞耗乏之後，接著藉由FACS使用CD69標記物進行分選細胞用於T細胞活化。在一些實施例中，可藉由任何方法分選該庫。分選策略包括(自左至右)依序圈選以選擇淋巴細胞，圈選以選擇單能細胞，圈選以排除CD20+ 細胞，及兩個分選圈選門(「頂部」及「底部」)分別捕獲表現較高及較低CD69之細胞。結果展示於圖35B之圖表中。
步驟 35C) 檢索 TCR 表現盒。 在一些實施例中，吾人可藉由各種技術中之任一者檢索相關TCR表現盒。在一些實施例中，來自圖35B)之頂部及底部樣品之TCR表現盒可使用10C)中所述之PCR策略，接著條碼PCR來檢索。亦包括質體TCR庫之對照PCR。使用Agilent TapeStation分析第二輪PCR之後的PCR產物。結果展示於圖35C中。
步驟 35D) 篩選資料之 TCR 富集分析。 在一些實施例中，可以任何若干方式分析來自步驟35C)之PCR產物池。舉例而言，來自35C)之PCR產物池用於庫製備且使用奈米孔(Nanopore)技術定序。還原TCRα及β鏈鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表示的TCR組合。針對1:1、1:2及1:3之效應與目標(E:T)比率表示在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下篩選之經Rlog轉換的讀段計數。五個經表徵抗原反應性TCR在圖35D中描繪為較大灰色點。
步驟 35E) 五個經表徵抗原反應性 TCR 之特徵。 使用DESeq2 R套裝軟體鑑別來自35D)中之資料的最具差異性表示之TCRα×β鏈組合之排名以及伴隨p值。差異性表示分析為熟習此項技術者已知，且基於線性模型，其假定富集的TCR定義為在抗原所呈現之「頂部」樣品中富集且在「底部」樣品中耗乏，相對於未呈現抗原之「頂部」及「底部」樣品兩者。該等特徵列表於圖35E中。
額外實施例展示於圖36中，其展示自藉由基因合成產生之TCR庫中回收抗原特異性TCR。此等實施例展示使用基於珠粒分選而非基於流體分選作為分離細胞之方式用於TCR庫篩選的想法。基於珠粒之細胞分選之優勢為其增加之可擴展性優於基於FACS之細胞分選。
步驟 36A) 篩選設計之示意圖。 使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及95個未經表徵TCR創建100×100個設計之組合TCR庫。藉由Twist Bioscience使用人類V、CDR3及J區段組裝庫，而恆定(C)區具有鼠類來源。該庫用於Jurkat報導T細胞之反轉錄病毒轉導。多株報導T細胞與經工程改造而以TMG型式呈現特異性抗原之抗原呈現細胞(APC)共培養。
步驟 36B) 篩選之分選策略。 將表現如36A)中所概述產生的100×100個設計TCR庫之Jurkat報導T細胞以1:1比率與36A)中所提及之APC共培養21小時。在共培養之後，來自Miltenyi之AutoMACS用於依序細胞分離。首先，使用死亡細胞移除套組移除死亡細胞。利用活細胞，使用基於B細胞上CD20表現之磁性珠粒選擇使APC耗乏。在B細胞耗乏之後，使用CD62L表現來分離CD20-細胞，此為在未經活化Jurkat細胞上表現之標記物。CD62L-及CD62L+隨後分開被抗CD69生物素標記的抗體染色，其後使用抗生物素微珠分離細胞。用於檢索TCR盒之最終部分為CD20-、CD62L-、CD69+細胞，表示「頂部」部分及CD20-、CD62L+、CD69-細胞，表示「底部」部分。細胞分離方法之示意圖描繪於圖36B)中。
步驟 36C) 檢索 TCR 表現盒。 在一些實施例中，吾人可藉由各種技術中之任一者檢索相關TCR表現盒。在一些實施例中，來自圖36B)之頂部及底部樣品之TCR表現盒使用10C)中所述之PCR策略，接著條碼PCR來檢索。亦包括質體TCR庫之對照PCR。使用Agilent TapeStation分析第二輪PCR之後的PCR產物。結果展示於圖36C中。
步驟 36D) 篩選資料之 TCR 富集分析。 在一些實施例中，可以任何若干方式分析來自步驟36C)之PCR產物池。舉例而言，來自36C)之PCR產物池用於庫製備且使用奈米孔技術定序。藉由與庫中存在的鏈比對來還原TCRα及β鏈鑑別，且使用DESeq2 R套裝軟體鑑別差異性表示的TCR組合。用灰色表示每一TCR在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下篩選之平均經Rlog轉換的讀段計數，且五個經表徵抗原反應性TCR表示為黑點。
步驟 36E) 前 7 個最顯著富集 TCR 之特徵。 使用DESeq2 R套裝軟體鑑別來自36D)之資料的差異性表示之TCRα×β鏈組合。差異性表示分析為熟習此項技術者已知，且基於線性模型，其假定富集的TCR定義為在表現TMG之「頂部」樣品中富集且在表現TMG之「底部」樣品中耗乏，相對於不表現抗原之「頂部」及「底部」樣品兩者。前7個最顯著命中之α及β鏈以及其表示、其經log2轉換變化倍數及差異性表示之顯著性列表於圖36E)中。
額外實施例展示於圖37中，其展示遺傳篩選之額外分析，以鑑別來自結腸直腸癌(CRC)患者2及4 (pt2/pt4)之新抗原反應性TCR。此等實施例展示使用組合串列小型基因(TMG)編碼以針對大量小型基因高效篩選TCR庫之想法。
步驟 37A) 6×6 組合 TMG 編碼設計之示意圖。 鑒於TCR庫需要針對表現36個TMG之進行APC篩選的篩選，可創建分別表現6個TMG之獨特組合的APC池。舉例而言，池C1由表現TMG1、TMG2、TMG3、TMG4、TMG5及TMG6之APC組成。池R1由表現TMG1、TMG7、TMG 13、TMG19、TMG25及TMG 31之APC組成。可針對APC池中之每一者執行單獨的TCR庫篩選。自藉由篩選方法中之TCR鑑別之兩個池的組合，可將經鑑別之TMG確定為以兩個池表示之TMG。
步驟 37B) 所有 TCR α × β 組合之排名次序隨 pt2 TCR 庫篩選之重複數目而變的分析。 使用所有3次重複或3次重複中之2者分析來自圖10G)之pt2 TCR庫篩選資料。對於兩種條件，使用DESeq2 R套裝軟體鑑別差異性表示的TCR組合。富集顯著性之排名基於如使用指派至最高Wald統計值之具有最高排名(排名1)之DESeq2計算的Wald統計值。基於2或3個基於重複之分析的排名分別表示於y、x軸。圖10G)中鑑別的新抗原反應性TCR前導表示為較大黑色點。
步驟 37C) 基於 CRC TCR 庫篩選之 2 次或 3 次重複之統計分析的概述表。 來自圖37B)之分析將應用於圖10G)中進行之所有患者TCR庫篩選。對圖37B)中所鑑別之所有新抗原反應性TCR前導連同其經邦費羅尼(Bonferroni)調節之p值進行列表，以便在頂部樣品中相對於底部樣品TCR富集之統計顯著性。表示基於3次篩選重複，或3次篩選重複中之2個的組合中之任一者之分析的p值。最後一行之檢查標記表示將已經挑選相同的排名最高的TCR前導，不論是否已在篩選分析中包含2次或3次篩選重複，且亦不論將已選擇3次重複中之2者的哪些組合。實例表示於圖37B)中，其中來自經選擇用於進一步驗證(參見圖10G)之pt4的7個排名最高的新抗原反應性TCR與基於僅使用2次重複之分析的7個排名最高的TCR相同。
步驟 37D) 用於成對 TCR 富集分析之 pt4 樣品之表。 包括六個樣品(各自表示為頂部及底部樣品)用於成對TCR富集分析。樣品包括將表現TCR庫之報導T細胞與單獨地表現TMG1、TMG2、TMG3或TMG4之B細胞株(分別為樣品1-4)共培養，以及與以1:1:1:1比率混合之此等B細胞株池(樣品5)共培養。對於樣品6，用未經工程改造以表現任何外源性抗原之B細胞進行共培養。
步驟 37E) 成對 TCR 富集分析結果。 使用DESeq2分析圖19D)中之所有可能的樣品對相對於底部樣品在頂部樣品中之TCR富集。差異性表示分析為熟習此項技術者已知，且基於線性模型，其假定富集的TCR定義為在表現TMG之「頂部」樣品中富集且在表現TMG之「底部」樣品中耗乏，相對於不表現抗原之「頂部」及「底部」樣品兩者。分選經邦費羅尼調節之P值，且按遞增次序標繪。淺灰色點表示來自α43.β16 TCR之分析的p值，且深灰色點表示來自涉及α9. β14 TCR之分析的p值。前離群值為在圖10G)中鑑別之相同TCR。TCRα9. β14反應性可歸因於自TMG4表現之抗原，因為此為樣品4及5中共用的TMG。TCRα43.β16反應性可歸因於TMG3，因為此為樣品3及5中共用的TMG。
額外實施例展示於圖38中，其展示遺傳篩選之額外分析，以鑑別來自結腸直腸癌(CRC)患者2之新抗原反應性TCR。此等實施例展示平台之敏感性，且支持TCR特徵(諸如TCR敏感性)可自遺傳篩選資料確定之觀點。
步驟 38A)TCR 活化與 TCR 背景活化在篩選與驗證資料之間的相關性。 基於來自圖10G)之資料鑑別遺傳篩選方法中TCR反應性不同的十六種CRC pt2 TCR。首先，使用DESeq2 R套裝軟體計算經Rlog轉換的讀段計數，且自頂部樣品之Rlog值減去底部樣品之Rlog值且表示在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下進行之共培養(圖38)。此等TCR在報導T細胞中表現，且與在獨立驗證實驗中表現相關TMG (TMG2)之EBV-B細胞共培養。藉由FACS分析，使用CD69標記物，量測T細胞活化。為了比較驗證資料與TCR庫篩選資料，將篩選中TCR之活化倍數定義為源自與表現TMG2之EBV-B細胞的共培養物之頂部樣品及底部樣品的Rlog值之間的差值(y軸；中間圖)。驗證實驗中之活化倍數定義為在與表現TMG2相對於未經工程改造EBV-B細胞共同培養後CD69+細胞之比率(x軸；中間圖)。篩選之背景定義為源自與未經工程改造EBV-B細胞共培養之頂部相對於底部的既定TCR之富集(y軸；右側圖)。驗證實驗之背景定義為與未經工程改造EBV-B細胞共培養之後的CD69+細胞百分比(x軸；右側圖)。
在一些實施例中，自TCRαβ中還原抗原反應性TCR可經由基於對抗原之反應分離一或多個亞群。在一些實施例中，此方法需要以下步驟中之一或多者：i)對報導T細胞進行遺傳工程改造以允許表現TCRαβ之TCR；ii)將此等細胞與表現至少一種抗原之抗原呈現細胞共培養；iii)基於T細胞活化標記物使細胞分離成a)表現T細胞活化之一或多種標記物的「頂部」群體；及b)缺乏T細胞活化之一或多種標記物之表現(或較低)的「底部」群體；iv)使用基因體DNA上之PCR及後續深度定序對來自頂部及底部樣品進行TCR鑑別；及v)鑑別相對於底部樣品富集於頂部樣品中之至少一種抗原反應性TCR。T細胞活化之標記物的表現可為定界經活化T細胞(例如CD69)之標記物的相對較高表現量，或定界未經活化T細胞(例如CD62L)之標記物的相對較低表現量。
在一些實施例中，頂部為前1、5、10、20、30、40或50%且底部為後1、5、10、20、30、40或50%，包括頂部及底部之任何兩個指定值之間的任何範圍對。在一些實施例中，本文所提供之實施例中之任一者中之頂部/底部方法(其中採用頂部群體及底部群體兩者)。
在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法。該方法包含a)將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；b)基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該細胞庫之第一群體；及c)分離來自該庫之該第一群體的變異核酸之第一群體。在一些實施例中，該方法進一步包含a)確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性；及b)基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。在一些實施例中，該臨限值含量基於以下中之至少一者： a)     基於標記物之表現還原細胞之總池的百分比；或 b)     自該細胞之總池中還原最小數目之細胞；或 c)     基於磁性探針與至少一種回應於抗原表現之標記物的結合，還原由磁體保留之細胞。
在一些實施例中，該對照為低於第二臨限值之第二細胞群體。在一些實施例中，該對照為以下中之一或多者：參考細胞群體，引入該細胞群體中的核酸之該組合庫，基於低於第二臨限值之表現標記物，自與該第一群體相同之細胞群體分選的細胞群體，及/或自表現相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞之共培養物得到的至少一個細胞群體。在一些實施例中，該底部(或對照)樣品自與該頂部樣品相同但具有較低活化標記物表現之細胞群體分選，或其中該底部樣品自表現該相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物得到。在一些實施例中，在頂部部分與底部部分之間不存在重疊。在一些實施例中，該方法進一步包含向該細胞群體添加抗原。在一些實施例中，該分離第一群體及/或該對照藉由a)磁性珠粒富集、b)流式細胞測量術分選或c)兩者中之至少一者達成。在一些實施例中，該對照為以下中之一或多者：參考細胞群體，引入該細胞群體中的核酸之該組合庫，基於低於第二臨限值之表現標記物，自與該第一群體相同之細胞群體分選的細胞群體，或自表現相關TCR庫之報導T細胞與未呈現任何外源性抗原之抗原呈現細胞，諸如B細胞之共培養物得到的至少一個細胞群體。
在一些實施例中，頂部-底部方法經設置使得抗原反應性TCR在抗原刺激時將變為活化標記物陽性，且因此此類TCR將在頂部群體中相對於底部群體富集。頂部-底部方法由實例24中所述之各種附圖說明。
在一些實施例中，該底部樣品(或對照)可為任何參考細胞群體或TCR質體之參考庫。可自與頂部樣品相同但具有較低活化標記物表現之細胞群體分選底部樣品。底部樣品可自表現相關TCR庫之報導T細胞及未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物得到。底部樣品可為用於創建自其分選頂部樣品之報導T細胞的TCR質體庫。在一些實施例中，在差異TCR表示分析期間，可將頂部及底部樣品之TCR表示與任何其他其他樣品之TCR表示進行比較。在一些實施例中，此類額外樣品可為質體TCR庫。在一些實施例中，此類額外樣品可源自表現相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物。
在一些實施例中，該方法為自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法。該方法可包含：確定個體之樣品內配對TCRα及TCRβ鏈之核苷酸或胺基酸序列；選擇來自整個組庫之TCRαβ對序列；藉由創建經選擇TCRα/β對之庫來創建TCR組庫；及鑑別具有所需特徵之來自該所創建TCR庫的至少一種TCRα/β對。
在一些實施例中，TCRα/β對可包括TCR序列模體。
在一些實施例中，本發明提供TCRαβ對之庫。在一些實施例中，此等庫可藉由本文所提供之方法中之任一者創建。在一些實施例中，該等庫來自無活性樣品。
在一些實施例中，本發明提供具有細胞群體及/或引入到報導細胞池中之TCRαβ對之庫的庫。因此，在一些實施例中，提供包括經選擇及組合配對TCRα鏈及β鏈序列(TCRαβ對之庫)的報導細胞池。
在一些實施例中，該庫可為經刺激庫。在一些實施例中，該庫可包括經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞，且可進一步包括呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞。在一些實施例中，至少一種所關注抗原可為自體或同種異體的。
在一些實施例中，本發明提供涉及來自樣品之一或多個TCRαβ對的庫或無活性樣品之特徵。關於篩選之額外實施例
揭示本發明之其他實施例。本發明實施例中之任一者可與本文所提供之其他實施例中之任一者組合。本文提供用以經由高通量核酸定序鑑別藉由遺傳功能獲得型/功能損失型篩選(亦稱為「遺傳變異體庫篩選」)之變異序列中之所關注序列的方法(在本文中亦描述為「篩選方法」)。篩選方法可用於篩選變異核苷酸序列庫，其中僅可藉由鑑別至少600 bp之變異核苷酸序列明確地區分個別核酸序列。
在一些實施例中，適當方法中之任一者可採用鑑別涉及經合併抗原之方法。舉例而言，在一些實施例中，鑑別或刺激包含：a)選擇多個抗原；b)創建各抗原恰好存在於兩個抗原池中之抗原庫；c)評估表現至少一種T細胞受體之報導細胞針對抗原池中之每一者的反應性；及d)藉由評估針對恰好兩個抗原池之反應性確定至少一種T細胞受體是否對經選擇抗原中之任一者具有反應性。在一些實施例中，藉由成對富集分析偵測針對恰好兩個抗原池之反應性。在一些實施例中，該庫為TCR庫。在一些實施例中，一種採用活化標記物。在一些實施例中，採用頂部-底部比較(如本文所述)，以評估反應性。在一些實施例中，儘管其他方法可使用針對單個池之反應性以創建獨特反應性模式，此方法可使用成對分析以藉由特異性分析重複來增加信號強度。
本發明之篩選方法可為高通量方法。多株遺傳庫篩選可允許在單次實驗中篩選大量(例如數十萬)蛋白質變異體，而非需要產生及分析個別純系。另外，相比於個別變異基因之合成，變異基因庫之產生可能成本較低且耗費時間較低。篩選方法之一些實施例允許變異體之功能選擇，且可基於一或多種功能特性選擇蛋白質變異體。本發明之篩選方法可為敏感性篩選方法。雖然基於功能性表型選擇所關注變異體，但基於可偵測具有較高敏感性之甚至罕見變異體之DNA定序方法鑑別所關注變異體之序列一致性。在一些實施例中，本文所提供之實施例的敏感性可允許吾人區分所需量，包括1:1000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000或甚至更低。在一些實施例中，較高敏感性為可能的，其限制條件為：(i)分析足夠數目個細胞且(ii)可產生足夠序列讀段。在一些實施例中，考慮因素為解多重。然而，此可藉由(例如)：i)非多重或ii)以捨棄較多讀段為代價提高條碼臨限值(例如，定序較多)來解決。
該等篩選方法之一些實施例為對蛋白質變異體執行高通量遺傳變異體庫篩選之方法，其中基於＞200個胺基酸之延伸及基於多株群體分析區分變異體。在一些實施例中，本發明篩選方法包括在一些NGS定序讀數，諸如藉由Oxford奈米孔平台產生之彼等NGS定序讀段中克服較高錯誤率之篩選方案及生物資訊方法。
本發明之篩選方法可包括獨立於大小及不限制序列多樣性位置鑑別任何適合之變異蛋白質。在一些實施例中，該方法包括自較大TCR集合選擇所關注T細胞受體(TCR)序列，其中不同TCRα與TCRβ鏈之配對為未知或不明確的，且包括確定編碼TCRα及TCRβ可變區之變異基因盒的全部序列。在一些實施例中，本發明篩選方法允許基於由TCR介導之報導細胞的功能反應(例如CD69上調)，以高通量篩選TCR庫(例如藉由避免產生純系)。
在一些實施例中，該方法包括鑑別來自較大CAR變異體集合之特性增強的嵌合抗原受體(CAR)序列，該等較大CAR變異體集合在分子設計上基本上不同，例如藉由選自若干不同信號傳導域之池的至多三個不同信號域之組合性組裝。在一些實施例中，本發明之篩選方法允許全面CAR增強在整個CAR分子中具有突變多樣性之篩選變異體。
對於本文所提供之實施例中之任一者，適當時，可存在超過一個CAR胞內信號傳導域。在一些實施例中，存在至少兩個CAR胞內信號傳導域。在一些實施例中，以下中之至少兩者為該至少兩個CAR胞內信號傳導域：CD3ε、CD3ζ ITAM1、CD3ζ ITAM12、CD3ζ ITAM123；具有CD3δ、CD3ε及CD3γ之任何ITAM的CD3ζ；CD8α、CD28、ICOS、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27及CD2。
在一些實施例中，本發明之篩選方法包括分析多株報導細胞群體，而不衍生單細胞純系。在一些實施例中，篩選方法可用於篩選含有＞10,000個變異體之庫，以鑑別所關注組合(例如在100倍之覆蓋度下)，而不產生單細胞純系。
在一些實施例中，覆蓋度量取決於數個因素，包括篩選之主要焦點(富集(較低覆蓋度)或耗乏篩選(較高覆蓋度))、庫內個別變異體之表示的散佈、選擇程序期間之細胞損失等。一般而言，可使用50至10,000之範圍，包括100至2000或例如100至400倍之富集篩選。
在一些實施例中，本發明之篩選方法提供對在整個完整蛋白質中具有突變多樣性之較大蛋白質的分子前導鑑別及增強的遺傳篩選方法。與其他可用方法相比，在一些實施例中，該方法可在鑑別分子前導中提供高通量(降低成本及時線)及較高敏感性。
一般而言，篩選方法可包括(1)產生含有至少兩個可(或僅可)藉由確定其總核苷酸序列之至少600 bp來明確鑑別之變異核苷酸序列的變異核苷酸序列庫；(2)將變異核苷酸序列庫引入報導細胞中；(3)基於至少一種功能特性選擇報導細胞；(4)分離來自經選擇報導細胞之變異核苷酸序列；(5)確定至少600 bp之經分離變異核苷酸序列的總核苷酸序列；及(6)選擇至少一種所關注變異核苷酸序列。
對於本文所提供之實施例中之任一者(其提供對600 bp之延伸或胺基酸之等效長度的參考)，庫之序列變異性可存在於總計超過600 bp之延伸中。在一些實施例中，該庫將含有或由或基本上由長於1500 bp之擴增子組成或包含該等擴增子。在一些實施例中，該庫將包含/由或基本上由至少30、40、50、60、70、80、90、95、98、99或100%之長於1500 bp的擴增子組成。
參看圖8，提供本發明之篩選方法的一些實施例。該方法可包括提供810 組合庫811 ，該庫包括複數種變異核酸(此處由812a 、812b 、812c 例示)。庫中之變異核酸中之每一者可含有長度為至少600 bp之連續部分814 。
如本文中參見生物聚合物(例如核酸或多肽)所用之「連續」係指不具有插入序列(例如不具有插入核苷酸或核苷酸序列之核苷酸序列、不具有插入胺基酸或胺基酸序列之胺基酸序列)之生物聚合物的個別構建塊(例如核苷酸或胺基酸)之序列。連續部分814 可含有兩種或更多種變異核苷酸子序列。
如本文所用，「變異核苷酸子序列」可包括定義核酸及/或由核酸編碼之多肽之功能活性單元的核苷酸序列家族中之任一者。在一些情況下，變異核苷酸子序列可賦予及/或促進核酸及/或由核酸編碼之多肽的離散功能活性(例如結合親和力、特異性)。在一些情況下，核苷酸序列家族藉助於以下賦予及/或促成離散功能活性：核酸內之變異核苷酸子序列的位置；具有與共同序列之序列相似性；及/或具有可變及不可變區域，其中不可變區域由相同核苷酸序列家族之其他成員共用。在一些實施例中，TCR庫包括具有對應於TCRα鏈之變異核苷酸子序列或其一或多個功能域(例如TCRα V區、TCRα互補決定區3 (CDR3)、TCRα J區段、TCRα恆定區)及對應於TCRβ鏈之變異核苷酸子序列或其功能域(例如TCRβ V區、TCRβ互補決定區3 (CDR3)、TCRβ J區段、TCRβ恆定區)之變異核酸子序列。在一些實施例中，CAR庫包括具有對應於CAR功能域(例如，抗原結合域、鉸鏈域、跨膜域及胞內信號傳導域，其可包括2至3個信號傳導模組)中之一或多者之變異核苷酸子序列的變異核酸。
進一步參見圖8，庫之核酸812a 可含有變異核苷酸子序列816a ，該變異核苷酸子序列為庫中之多個可能種類(816a 、816b )中之一者。核酸812a 亦可在不同位置含有另一變異核苷酸子序列818a ，其為多種可能種類中之一者(818a 、818b )。庫中之另一核酸812b可含有來自第一組合816a /818a 之變異核苷酸子序列之不同組合816a /818b 。然而，第三核酸812c 可含有來自第一組合816a /818a 或第二組合816a /818b 之變異核苷酸子序列之不同組合816b /818b 。另外，連續部分之一個末端(例如，5'或3'端)可由變異核苷酸子序列中之一者定義，且連續部分之另一末端(例如，分別為3'或5'端)可由變異核苷酸子序列中之另一者定義。
該連續部分可由以下式表示：5'-A*-X-B*-3'，其中A*及B*表示變異核苷酸子序列之不同家族，且X可不存在(在此情況下，連續部分為5'-A*-B*-3')，或若存在，則可為任何長度之任何核苷酸序列。在一些實施例中，A*可為變異核苷酸子序列家族之任何成員(例如A1、A2、A3等)。在一些實施例中，B*可為變異核苷酸子序列家族之任何成員(例如B1、B2、B3等)。在一些實施例中，X可包括變異核苷酸子序列之一或多個家族之成員(例如C、D等)。
篩選方法可進一步包括將庫引入820 細胞群體822 中，該群體可表現由複數種變異核酸之成員826a 、826b 編碼的一或多種基因產物(例如多肽)824a 、824b 。
篩選方法可包括基於至少一種功能特性832 (例如經表現多肽與配位體之結合)選擇830 細胞群體之亞群，其中該功能特性視引入細胞中之核酸成員826a 、826b 中之變異核苷酸子序列的組合而定。細胞亞群可包括複數個細胞。在一些實施例中，細胞亞群可包括複數個變異核酸之複數個不同成員，其中不同成員藉由具有變異核苷酸子序列之不同組合而彼此不同。
在一些實施例中，篩選方法可包括例如藉由自細胞提取基因體DNA而分離840 來自細胞亞群之複數個變異核酸之子集842 。
在一些實施例中，篩選方法可進一步包括確定850 複數個變異核酸之子集的個別成員之連續部分的核苷酸序列，例如藉由子集842 中之變異核酸之至少連續部分的高通量定序。
在一些實施例中，該方法可進一步包括鑑別860 存在於細胞亞群中之變異核苷酸子序列816a/818a 的組合。在一些實施例中，鑑別包括分析在細胞亞群中發現的兩個或更多個組合當中變異核苷酸子序列之組合與預定臨限值含量相比，或與對照細胞亞群中之彼特定組合之豐度相比是否富集。在一些實施例中，富集之組合經鑑別為賦予細胞功能特性，基於該功能特性，選擇細胞亞群。
參看圖9，提供本發明篩選方法之一些實施例。方法900 可包括提供910 含有複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者具有至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第一變異核苷酸子序列定義該連續部分之第一末端，且該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第二變異核苷酸子序列定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端。可將組合庫引入920 至經設計以表現由複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽之細胞群體中。隨後，該方法可包括基於取決於該兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的至少一種功能特性來選擇930 該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法可包括分離940 來自該亞群之複數個變異核酸之子集(例如一或多個)，及確定950 子集之個別成員之連續部分的核苷酸序列。隨後可基於所確定核苷酸序列鑑別960 兩個或更多個變異核苷酸子序列之一或多個組合。
在一些實施例中，對於每一篩選，存在「參考」及「頂部」樣品。「頂部」樣品含有呈現最高CD69表現之分選細胞，而「參考」樣品含有呈較現低CD69表現之分選細胞。在一些實施例中，樣品可基於任何其他活化標記物分離，該活化標記物包括(但不限於) CD25、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF合成啟動子報導標記物或增殖標記物。為此，對於庫中具有複雜性Y之變異體中之每一者，可以最小100-200倍覆蓋度隔離變異體。此可總計每一樣品＞100-200*Y變異體/細胞。
當一個核酸之變異核苷酸序列編碼與由另一核酸中之對應變異核苷酸序列編碼的胺基酸序列不同的胺基酸序列時，可將一個核酸視為「不同於」(different/distinct)組合庫中之另一核酸。在一些實施例中，基於一個核酸在編碼相同胺基酸序列時其核苷酸序列的差異，可將其視為「不同於」(different/distinct)組合庫中之另一核酸。
組合庫可包括任何適合數目個不同(或「變異」)核酸。在一些實施例中，該組合庫包含約100或更多，例如，約200或更多、約300或更多、約400或更多、約500或更多、約600或更多、約700或更多、約800或更多、約900或更多、約1,000或更多、約2,000或更多、約3,000或更多、約4,000或更多、約5,000或更多、約7,500或更多、約10,000或更多、約20,000或更多、約50,000或更多、約1×105 或更多、約2×105 或更多、約5×105 或更多、約1×106 或更多、約1×107 或更多、約1×108 或更多、約1×109 或更多、約1×1010 或更多，包括約1×1011 或更多個不同核酸，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的多個不同核酸。在一些實施例中，該組合庫包括約100至約200、約200至約500、約500至約1,000、約1,000至約5,000、約5,000至約1×104 、約1×104 至約2×104 、約2×104 至約5×104 、約5×104 至約1×105 、約1×105 至約1×106 、約1×106 至約1×107 、約1×107 至約1×108 、約1×108 至約1×109 、約1×109 至約1×1010 、約1×1010 至約1×1011 之間，或更多個不同核酸。在一些實施例中，該庫包含至少100，例如至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少7,500、至少10,000、至少20,000、至少50,000、至少1×105 、至少2×105 、至少5×105 、至少1×106 、至少1×107 、至少1×108 、至少1×109 、至少1×1010 ，包括該兩個變異核苷酸子序列之至少1×1011 個不同組合。
在一些實施例中，該一或多個多肽(在一些實施例中，由組合庫之變異核酸編碼)包含：T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈；嵌合抗原受體(CAR)；開關受體；或抗體或其抗原結合片段之一或多個鏈。在一些實施例中，該第一變異核苷酸子序列編碼TCRα變異胺基酸序列且該第二變異核苷酸子序列編碼TCRβ變異胺基酸序列。在一些實施例中，該兩個或更多個變異核苷酸子序列編碼以下中之一或多者：TCR V區、TCR互補決定區3 (CDR3)、TCR J區段及TCR恆定區。在一些實施例中，兩個或更多個變異核苷酸子序列中之每一者編碼CAR之抗原結合域、鉸鏈域、跨膜域或一或多個胞內信號傳導域。在一些實施例中，使庫中複數個變異核酸之連續部分之間的編輯距離最大化。在一些實施例中，使組合庫之任何兩個變異核酸之間的編輯距離最大化，例如藉由控制密碼子使用。在一些實施例中，此可包括密碼子最佳化。在一些實施例中，本文所提供之涉及庫之方法中之任一者可包括使庫中之核苷酸序列(例如複數個變異核酸之核苷酸序列)基於以下各者中之至少一者而最佳化：引入用於宿主細胞之較佳密碼子使用、最佳化mRNA結構穩定性、避免重複序列、避免均聚物之較長延伸及避免給定變異核酸序列內之局部GC含量的較大差異。
在一些實施例中，基於以下中之至少一者使庫中之複數個變異核酸的核苷酸序列最佳化：1)本文所提供之任何方法，其中細胞群體之細胞經遺傳修飾，或2)本文所提供之任何方法，其中細胞經CD4及/或CD8重建且用於篩選I類及/或II類限制型TCR序列。
在一些實施例中，所採用細胞為T細胞。
在一些實施例中，亞群及對照細胞群體為非重疊的。在一些實施例中，非重疊表示兩個群體中之細胞具有不同活化狀態，但可攜帶相同變異核酸。
在一些實施例中，該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRβ恆定區。
在一些實施例中，確定包含得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少25、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少1,000。
在一些實施例中，涉及反應性評估或可進一步包含反應性評估之方法中的任一者可採用頂部-底部比較來評估反應性。
在一些實施例中，本文所提供之涉及庫之方法中之任一者可包括使庫中之核苷酸序列(例如複數個變異核酸之核苷酸序列)基於以下各者中之至少一者而最佳化：引入用於宿主細胞之較佳密碼子使用、最佳化mRNA結構穩定性、避免重複序列、避免均聚物之較長延伸及避免給定變異核酸序列內之局部GC含量的較大差異。
在一些實施例中，經由抗原呈現細胞呈現該抗原。
在一些實施例中，該庫為組合庫。
在一些實施例中，該抗原由細胞提供。
在一些實施例中，該方法涉及高度的抗原多樣性及/或複雜性。
在涉及庫的一些實施例中，該庫為組合庫。在一些實施例中，該組合庫為TCR庫。
該連續部分之任何適合長度可為至少600 bp。在一些實施例中，該連續部分之長度取決於用於在基於功能特性選擇細胞亞群之後對連續部分進行定序的定序平台之讀段長度(例如，精確讀段長度)。在一些實施例中，該連續部分之長度為至少600 bp，例如至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp、至少1,000 bp、至少1,100 bp、至少1,200 bp、至少1,300 bp、至少1,400 bp、至少1,500 bp、至少1,750 bp、至少2,000 bp、至少2,500 bp、至少3,000 bp、至少4,000 bp、至少5,000 bp、至少6,000 bp、至少7,000 bp、至少8,000 bp、至少9,000 bp、至少10,000 bp、至少11,000 bp、至少12,000 bp、至少13,000 bp、至少14,000 bp或至少15,000 bp，或由前述值中之任何兩者界定之範圍內的長度。在一些實施例中，該連續部分之長度為約600 bp至約15,000 bp，例如約800 bp至約12,000 bp、約1,000 bp至約10,000 bp、約1,000 bp至約8,000 bp、約1,000 bp至約6,000 bp、約1,000 bp至約5,000 bp，包括約1,000 bp至約4,000 bp。
組合庫中之變異核酸可具有任何合適數目個變異核苷酸序列。在一些實施例中，組合庫中之所有核酸具有相同數目個變異核苷酸序列。在一些實施例中，組合庫中之變異核酸具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多個變異核苷酸序列，其中之每一者可以具有可以組合方式組裝以組裝變異核酸之連續部分的變異體。
組合庫可包括用於各變異核苷酸序列之任何合適數目個變異體。在一些實施例中，組合庫中之變異核苷酸序列之變異體的數目為2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、12個或更多個、14個或更多個、16個或更多個、18個或更多個、20個或更多個、25個或更多個、30個或更多個、35個或更多個、40個或更多個、45個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、125個或更多個、150個或更多個、175個或更多個、200個或更多個、250個或更多個、300個或更多個、350個或更多個、400個或更多個、450個或更多個、500個或更多個、600個或更多個、700個或更多個、800個或更多個、900個或更多個、1,000個或更多個、1,500個或更多個、2,500個或更多個、3,000個或更多個、4,000個或更多個、5,000個或更多個、7,500個或更多個，包括10,000個或更多個，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的多個變異體。在一些實施例中，組合庫中之變異核苷酸序列之變異體數目在2至10之間、在10至20之間、在20至30之間、在30至40之間、在40至50之間、在50至100之間、在100至200之間、在200至500之間、在500至1,000之間、在1,000至2,000之間、在2,000至5,000之間或在5,000至10,000之間。在一些實施例中，個別變異體在庫內之頻率分佈使得彼等變異體之＞80%具有在自中間頻率/8開始且在中間頻率*8結束之範圍內的頻率。
在一些實施例中，對於本文所提供之篩選及/或庫相關方法中之任一者，藉由結合於抗原(諸如新抗原)選擇或鑑別TCR對及/或表現TCR對之T細胞，其中抗原由B細胞或抗原呈現細胞表現。
在一些實施例中，對於本文所提供之篩選及/或庫相關方法中之任一者，抗原或新抗原來自個體之腫瘤，且TCR對之TCRα及TCRβ亦各自來自個體(意謂單個個體具有抗原序列及TCRα及TCRβ序列兩者)。
在一些實施例中，對於本文所提供之篩選及/或庫相關方法中之任一者，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000個或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000個或1百萬個抗原。
在一些實施例中，對於本文所提供之篩選及/或庫相關方法中之任一者，a)藉由結合至抗原(諸如新抗原)選擇或鑑別TCR對及/或表現TCR對之T細胞，其中該抗原由B細胞或抗原呈現細胞表現，b)該抗原或新抗原來自個體之腫瘤，且TCR對之TCRα及TCRβ亦各自來自個體(意謂單個個體具有抗原序列及TCRα及TCRβ序列兩者)，及c)存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個抗原。
組合庫可為任何適合之生物分子(例如蛋白質、核酸、核蛋白等)庫。在一些實施例中，適合之生物分子為序列(例如蛋白質及/或核酸序列)可在對應於至少600個核苷酸之序列單元(例如胺基酸或核苷酸)之連續部分上變化的生物分子。適合之組合庫包括(但不限於)用於TCR、CAR、抗體、RNA引導型核酸酶等之組合庫。
在一些實施例中，組合庫包括來自不同T細胞群體之T細胞受體(TCR)的組庫。在一些實施例中，組合庫之複數個核酸包括編碼一或多個TCRα功能域(例如，TCRα V區、TCRα互補決定區3 (CDR3)、TCRα J區段、TCRα恆定區)及一或多個TCRβ功能域(例如，TCRβ V區、TCRβ互補決定區3 (CDR3)、TCRβ J區段、TCRβ恆定區)之變異核苷酸序列。在一些實施例中，組合庫TCR之核酸的連續部分之長度在600 bp與2,000 bp之間，例如在800 bp與1,900 bp之間、在1,000 bp與1,900 bp之間、在1,200 bp與1,900 bp之間、在1,400 bp與1,900 bp之間、在1,500 bp與約1900 bp之間、在1,600 bp與1900bp之間、在1700 bp與1900 bp之間或為約1,800 bp。
在一些實施例中，組合庫之複數個核酸包括編碼一或多個嵌合抗原受體(CAR)功能域(例如，抗原結合域、鉸鏈域、跨膜域及胞內信號傳導域，其可包括2至3個信號傳導模組)之變異核苷酸序列。在一些實施例中，組合庫CAR之核酸的連續部分之長度在600 bp與2,000 bp之間，例如在800 bp與1,900 bp之間、在1,000 bp與1,800 bp之間、在1,200 bp與1,800 bp之間、在1,400 bp與1,700 bp之間或為約1,500 bp。
在一些實施例中，組合庫包括抗體重鏈及輕鏈序列之組庫。在一些實施例中，組合庫之複數個核酸包括編碼一或多個抗體重鏈功能域(例如重鏈可變區(包括一或多個CDR、構架區)及/或重鏈恆定區(包括CH1、CH2、CH3及鉸鏈區中之一或多者)的變異核苷酸序列。在一些實施例中，組合庫之複數個核酸包括編碼一或多個抗體輕鏈功能域(例如，輕鏈可變區(包括一或多個CDR、構架區)及/或輕鏈恆定區之變異核苷酸序列。
在一些實施例中，組合庫之核酸包括含有變異核酸之適合載體。在一些實施例中，組合庫之核酸含有適合之調節及/或非編碼序列。適合之非編碼序列包括(但不限於)啟動子、信號肽、剪接位點、終止密碼子及聚(A)信號序列。在一些實施例中，核酸含有選擇標記物(例如抗生素抗性基因、螢光分子或細胞表面標記物)。
在一些實施例中，該篩選方法包括產生組合庫。可使用任何適合之選擇方案來製造組合庫。在一些實施例中，產生該組合庫包括：鑑別編碼該一或多個多肽之兩組或更多組變異胺基酸序列的兩組或更多組變異核苷酸子序列，其中該至少一種功能特性取決於該兩組或更多組變異胺基酸序列中之每一者的變異胺基酸序列之組合；藉由組合來自該兩組或更多組變異核苷酸子序列中之每一者的變異核苷酸子序列來組裝該連續部分，藉此產生該複數個變異核酸之成員。
在一些實施例中，產生該組合庫包括鑑別編碼待由報導細胞表現的多肽之變異胺基酸序列的變異核苷酸子序列之多個變異體。在多肽包括兩個或更多個變異核苷酸子序列之情況下，可藉由組合來自變異核苷酸子序列中之每一者的變異體組裝該連續部分。在一些實施例中，產生該組合庫包括電腦模擬設計庫之核酸，例如以經由控制密碼子使用使編輯距離最大化。可使用任何適合之演算法來使編輯距離最大化。組合庫可使用任何適合之選擇方案基於例如電腦模擬產生之設計來合成。在一些實施例中，該組合庫包含來自不同T細胞群體之T細胞受體(TCR)的組庫。
可使用將組合庫引入細胞中之任何適合的選擇方案。適合之選擇方案包括(但不限於)病毒轉導、轉位子介導之基因遞送、轉換、電穿孔、核酸酶介導之位點特異性整合(例如，CRISPR/Cas9、TALEN)。在一些實施例中，將組合庫引入細胞中包括病毒轉導、基於轉位子之基因遞送或核酸酶介導之位點特異性整合。
組合庫可引入經設計以表現由庫之核酸編碼的多肽之任何適合細胞，例如報導細胞中。適合之細胞包括(但不限於)哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母及細菌。在一些實施例中，適合之載劑包括病毒、酵母、細菌及噬菌體。儘管為簡單起見，本發明通篇使用術語「細胞」，本文中涵蓋本文所有「細胞」之此類揭示內容不僅包括各種形式之T細胞(諸如永生化T細胞)、酵母及細菌，而且可更一般地與任何載劑(包括病毒及噬菌體)一起使用。因此，本發明關於本文所用之「細胞」(參考可引入組合庫之細胞)可包括真核細胞、原核細胞，且指示亦可用作載劑之病毒及噬菌體的選擇方案。細胞可為細胞株、永生化細胞或初級細胞。在一些實施例中，該等細胞為人類細胞，或源自人類細胞。在一些實施例中，該細胞群體包含永生化T細胞或初級T細胞。在一些實施例中，該等永生化T細胞或初級T細胞為人類T細胞。在一些實施例中，將組合庫引入永生化T細胞或初級T細胞中(例如藉由病毒轉導)。在一些實施例中，該等細胞不展現該功能特性中或幾乎不展現該功能特性，該功能特性基於將選擇該等細胞以鑑別所關注變異核苷酸子序列之組合。在一些實施例中，該等細胞不展現該功能特性中或幾乎不展現該功能特性，該功能特性由該庫之核酸編碼的多肽介導且取決於變異核苷酸子序列之組合。在一些實施例中，細胞群體之細胞經工程改造，例如經遺傳工程改造。在一些實施例中，該等細胞經工程改造(例如經遺傳修飾)以減少或消除細胞對功能特性之內源性或背景表現。在一些實施例中，細胞經工程改造(例如經遺傳修飾)以增強細胞在與組合庫一起引入時展現功能特性之能力。在一些實施例中，細胞經工程改造(例如經遺傳修飾)以促進培養物中之群體的生長及/或維持。在一些實施例中，細胞群體不包含賦予該等細胞至少一種功能特性之內源性多肽。在一些實施例中，該等細胞經遺傳修飾以引入或消除或減少CD4、CD8及CD28中之一或多者之表現。在一些實施例中，經遺傳修飾細胞為T細胞。
在一些實施例中，引入組合庫之細胞群體中之各細胞平均包括複數個核酸中之一個核酸。在一些實施例中，該細胞群體經該組合庫以10或更低，例如7或更低、5或更低、3或更低、2或更低，包括1或更低之感染倍率(MOI)轉導。在一些實施例中，引入包含以5或更低之感染倍率(MOI)病毒轉導該細胞群體。在一些實施例中，核酸酶介導之位點特異性整合(例如，CRISPR/Cas9、TALEN)用於將恰好一個或兩個核酸引入細胞群體之各細胞中。
引入組合庫之細胞群體中之大小可包括任何合適數目個細胞。在一些實施例中，細胞數目取決於以下中之一或多者：庫之大小、庫中變異核酸之相對表示、群體中各變異核酸之所需表示量(亦稱為「覆蓋度」)、執行之篩選類型(例如，執行「富集」篩選(主要目標為鑑別富集變異體)抑或執行「耗乏」篩選(主要目標為鑑別耗乏變異體))、庫內個別變異體之表示及錯誤率，及基於與細胞損失相關之至少一種功能特性選擇總細胞群體之亞群所需的方法步驟。此類方法步驟之實例包括(但不限於)選擇經成功轉導的細胞細胞及/或選擇藉由流式細胞測量術由經表現多肽介導之功能特性。在一些實施例中，該篩選方法包括基於該庫中該兩個或更多個變異核苷酸子序列之多個不同組合調節該細胞群體之大小。
在一些實施例中，該篩選方法包括基於包括於該等核酸中之選擇標記物鑑別藉由已接受庫之核酸而成功修飾之細胞。在一些實施例中，該篩選方法包括使用標記物來選擇或篩選該細胞群體中表現該複數個變異核酸中之至少一者的細胞。在一些實施例中，該標記物為細胞毒素抗性標記物及/或細胞表面標記物。取決於所用可選標記，可使用任何適合之方法選擇經成功修飾細胞。在一些實施例中，基於抗生素抗性選擇細胞，例如(但不限於)對嘌呤黴素或殺稻瘟菌素之抗性。在一些實施例中，基於可偵測標記物表現，例如(但不限於)藉由可用於利用流式細胞測量術分選之細胞表面標記物或螢光分子來選擇細胞。在一些實施例中，基於細胞表面標記物選擇細胞，該細胞表面標記物例如適合於基於磁性珠粒富集。
可基於藉由變異核酸編碼之多肽之任何適合的功能特性選擇細胞群體之亞群。適合之功能特性包括(但不限於)配位體結合(例如抗原結合)、回應於刺激(例如對抗原結合起反應)之信號轉導。信號轉導可包括(但不限於)磷酸化、位移、信號傳導域相互作用或轉錄變化。可使用任何適合之選擇方案來執行基於取決於變異核苷酸子序列之組合的功能特性選擇細胞群體之亞群。在一些實施例中，使用(但不限於)標記物之表現或回應於刺激之細胞增殖來量測適合之功能輸出。
在一些實施例中，選擇包含基於可偵測標記物之表現選擇亞群，其中該表現取決於該一或多個多肽之至少一種功能特性。在一些實施例中，該可偵測標記物包含細胞表面標記物、細胞激素標記物、細胞增殖標記物、轉錄報導子、信號轉導報導子及/或細胞毒性報導子。在一些實施例中，該細胞表面標記物包含以下中之一或多者：CD69、CD62L、CD137；該細胞激素標記物包括以下中之一或多者：IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF；該轉錄報導子包含以下中之一或多者：NF-κB、NFAT、AP-1；該信號轉導報導子包含以下中之一或多者：ZAP70、ERK1/2；及該細胞毒性報導子包含以下中之一或多者：CD107A、CD107B、顆粒酶B。
在一些實施例中，選擇細胞群體之亞群包括選擇展現出功能特性(例如在功能分析中陽性反應)之細胞。在一些實施例中，選擇細胞群體之亞群包括選擇未展現功能特性(例如在功能分析中陰性反應)之細胞。在一些實施例中，該篩選方法包括選擇展現出該功能特性之該細胞群體之亞群，及選擇未展現該功能特性之該細胞群體之另一亞群。在一些實施例中，選擇細胞群體之亞群包括基於藉由各亞群之細胞展現的功能特性之含量或程度的分層選擇細胞之多個亞群。
在一些實施例中，選擇亞群包含使細胞群體與以下中之一或多者接觸：第二細胞群體；一或多個多肽之配位體；一或多個多肽之促效劑或拮抗劑；及小分子，其中藉由該接觸誘導之亞群之變化取決於該一或多個多肽之該至少一種功能特性。在一些實施例中，選擇該亞群包含偵測該變化之存在或不存在，及/或該變化之幅度；及基於該偵測選擇該亞群。在一些實施例中，該第二細胞群體包含抗原呈現細胞。在一些實施例中，該等抗原呈現細胞包含B細胞及/或樹突狀細胞。在一些實施例中，該第二細胞群體包含初級細胞或永生化細胞。在一些實施例中，該庫之變異核苷酸子序列源自表現變異多肽的細胞，該變異多肽包含由該等變異核苷酸子序列編碼之胺基酸，其中自個體得到該等細胞，且其中該第二細胞群體源自該個體。
在一些實施例中，選擇包含基於高於或低於臨限值之該至少一種功能特性的度量選擇該細胞群體之第一亞群。在一些實施例中，基於該細胞群體之未經選擇亞群中之該功能特性的度量確定該臨限值。在一些實施例中，選擇進一步包含基於高於或低於第二臨限值之該至少一種功能特性的第二度量選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第一亞群與該第二亞群為非重疊的。在一些實施例中，鑑別該至少一個組合包含比較該第一亞群與該第二亞群之間的該至少一個組合的豐度。
在一些實施例中，其中組合庫為含有TCRα及TCRβ變異體之TCR庫，基於藉由一或多種標記物之表現變化之細胞對抗原呈現起反應的能力選擇細胞亞群。適合之標記物包括(但不限於) CD69、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α及GM-CSF。在一些實施例中，標記物為啟動子活性報導子，包括(但不限於) NF-κB、NFAT及AP-1。
在一些實施例中，抗原由包括(但不限於) B細胞(例如永生化B細胞)及樹突狀細胞之抗原呈現細胞呈現。在一些實施例中，抗原之鑑別為未知的。在一些實施例中，抗原為新抗原。
在一些實施例中，其中該組合庫為含有CAR功能域之變異體的CAR庫，基於藉由細胞增殖之變化及/或標記物表現之變化的細胞對抗原呈現起反應之能力選擇細胞亞群。適合之標記物包括(但不限於) CD69、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α及GM-CSF。在一些實施例中，標記物為信號轉導報導子，包括(但不限於) ZAP70及ERK1/2磷酸化。在一些實施例中，標記物為細胞毒性報導子，諸如(但不限於) CD107A及CD107B。在一些實施例中，標記物為啟動子活性報導子，諸如(但不限於) NF-κB、NFAT及AP-1。
在一些實施例中，該亞群包含複數個細胞。在一些實施例中，該分離不包含基於該至少一種功能特性分離該亞群之單一純系。在一些實施例中，該亞群包含至少1,000個細胞(例如，在100個變異體上之10倍覆蓋度)。
在一些實施例中，基於取決於變異核苷酸子序列之組合的功能特性選擇之亞群包括約1,000個或更多個細胞，例如約2,000個或更多個細胞、約3,000個或更多個細胞、約4,000個或更多個細胞、約5,000個或更多個細胞、約7,500個或更多個細胞、約10,000個或更多個細胞、約20,000個或更多個細胞、約50,000個或更多個細胞、約1×105 個或更多個細胞、約2×105 個或更多個細胞、約5×105 個或更多個細胞、約1×106 個或更多個細胞、約1×107 個或更多個細胞、約1×108 個或更多個細胞、約1×109 個或更多個細胞、約1×1010 個或更多個細胞、約1×1011 個或更多個細胞，包括約1×1012 個或更多個細胞，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的多個細胞。在一些實施例中，基於取決於變異核苷酸子序列之組合的功能特性選擇之亞群包括約1,000至約1×1012 個細胞，例如約2,000至約1×1012 個細胞之間、約3,000至約1×1010 個細胞之間、約5,000至約1×109 個細胞之間、約5,000至約1×109 個細胞之間、包括約1×104 至約1×109 個細胞。
在一些實施例中，TCR對之該功能為結合至抗原。
在一些實施例中，該亞群為初始群體之一部分，例如低於10-14 、10-13 、10-12 、10-11 、10-10 、10-9 、10-8 、0.0000001、0.000001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90%之初始群體(包括任何兩個前述值之間界定之範圍)。
在一些實施例中，基於取決於變異核苷酸子序列之組合的功能特性選擇之亞群的大小足夠大，使得庫中之變異核酸在亞群中充分表示。在一些實施例中，該亞群之大小的覆蓋度倍數為該庫中之變異核酸之變異體的總數目之約10或更高，例如約20或更高、約30或更高、約40或更高、約50或更高、約60或更高、約70或更高、約80或更高、約90或更高、約100或更高、約120或更高、約140或更高、約160或更高、約180或更高、約200或更高、約250或更高、約300或更高、約400或更高、約500或更高，包括約1,000或更高，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的覆蓋度倍數。在一些實施例中，該亞群之大小的覆蓋度倍數為該庫中之變異核酸之變異體的總數目之約10至約1,000之間，例如約20至約1,000之間、約30至約750之間、約40至約500之間、約50至約500之間、約50至約400之間、約60至約300之間、約70至約250之間，包括約80至約200。
可使用任何適合之方法使變異核酸與亞群分離。在一些實施例中，分離該等變異核酸包括使用任何適合之方法自亞群提取基因體DNA。在一些實施例中，分離該等變異核酸包括自該亞群提取批量基因體DNA。在一些實施例中，分離變異核酸不包括使個別純系與該亞群分離且使基因體DNA與個別純系分離。在一些實施例中，分離該等變異核酸不包括使個別純系與該亞群分離且擴增該等個別純系，藉此使基因體DNA與經擴增純系群體分離。在一些實施例中，分離變異核酸包括自該亞群提取批量基因體DNA，而不自亞群分離或擴增個別純系。在一些實施例中，分離該等變異核酸包括使用任何適合之方法自亞群提取RNA。在一些實施例中，分離該等變異核酸包括自該亞群提取批量RNA。在一些實施例中，分離該等變異核酸包括自該亞群提取mRNA。在一些實施例中，分離變異核酸不包括使個別純系與該亞群分離且使RNA與個別純系分離。在一些實施例中，分離該等變異核酸不包括藉由單細胞PCR方法分析單細胞。在一些實施例中，分離該等變異核酸不包括使個別純系與該亞群分離且擴增該等個別純系，藉此使RNA與經擴增純系群體分離。在一些實施例中，分離變異核酸包括自該亞群提取RNA，而不自亞群分離或擴增個別純系。術語「RNA」為屬術語且包括例如RNA之天然及人工型式。雖然本說明書通常概述相對於「DNA」之選擇方案，但應理解，所有此類選擇方案及實施例可替代地用於RNA。
在一些實施例中，自該亞群提取之基因體DNA之量足以提供庫中之變異核酸中之各變異體的適當覆蓋度。在一些實施例中，自該亞群提取之基因體DNA之量的覆蓋度倍數足以為該庫中之變異核酸之變異體的總數目之約10或更高，例如約20或更高、約30或更高、約40或更高、約50或更高、約60或更高、約70或更高、約80或更高、約90或更高、約100或更高、約120或更高、約140或更高、約160或更高、約180或更高、約200或更高、約250或更高、約300或更高、約400或更高、約500或更高，包括約1,000或更高，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的覆蓋度倍數。在一些實施例中，自該亞群提取之基因體DNA之量的覆蓋度倍數足以為該庫中之變異核酸之變異體的總數目之約10至約1,000之間，例如約20至約1,000之間、約30至約750之間、約40至約500之間、約50至約500之間、約50至約400之間、約60至約300之間、約70至約250之間，包括約80至約200。在一些實施例中，該確定包含在該等個別成員之任何擴增之前或不存在該等個別成員之任何擴增下，得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少10。
在一些實施例中，使該等變異核酸與該亞群分離包括擴增該等經提取變異核酸。可擴增變異核酸之任何適合部分。在一些實施例中，實質上僅擴增該等變異核酸之連續部分。在一些實施例中，擴增編碼整個多肽之變異核酸的部分。在一些實施例中，擴增產物(或擴增子)之大小為至少600 bp，例如至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp、至少1,000 bp、至少1,100 bp、至少1,200 bp、至少1,300 bp、至少1,400 bp、至少1,500 bp、至少1,750 bp、至少2,000 bp、至少2,500 bp、至少3,000 bp、至少4,000 bp、至少5,000 bp、至少6,000 bp、至少7,000 bp、至少8,000 bp、至少9,000 bp、至少10,000 bp、至少11,000 bp、至少12,000 bp、至少13,000 bp、至少14,000 bp或至少15,000 bp，或由前述值中之任何兩者界定之範圍內的長度。在一些實施例中，擴增產物(或擴增子)之大小為約600 bp至約15,000 bp，例如約800 bp至約12,000 bp、約1,000 bp至約10,000 bp、約1,000 bp至約8,000 bp、約1,000 bp至約6,000 bp、約1,000 bp至約5,000 bp、約1,000 bp至約4,000 bp、約1,000 bp至約3,000 bp，包括約1,000 bp至約2,000 bp。
在一些實施例中，確定包含擴增該複數個核酸之該等個別成員的至少連續部分。在一些實施例中，擴增包含使用雜交至恆定核苷酸子序列之擴增引子，其中該複數個變異核酸中之每一者包含該恆定核苷酸子序列，且其中該恆定核苷酸子序列編碼該一或多個多肽之恆定胺基酸序列。在一些實施例中，擴增包含使用雜交至該變異核苷酸序列(包括(但不限於)該基因載體之非編碼核苷酸序列)外之核苷酸子序列的擴增引子。在一些實施例中，該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRα恆定區。
在一些實施例中，進行擴增以在經擴增擴增子庫中之組合庫之變異核酸中提供各變異體之足夠覆蓋度。在一些實施例中，擴增該等經分離變異核酸以提供覆蓋度倍數為所得擴增子庫中之組合庫之變異核酸之變異體的總數之約1,000或更高，例如約2,000或更高、約3,000或更高、約4,000或更高、約5,000或更高、約6,000或更高、約7,000或更高、約8,000或更高、約9,000或更高、約10,000或更高、約12,000或更高、約14,000或更高、約16,000或更高、約18,000或更高、約20,000或更高、約25,000或更高、約30,000或更高、約40,000或更高、約50,000或更高，包括約100,000或更高，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的覆蓋度倍數。在一些實施例中，擴增該等經分離變異核酸以提供覆蓋度倍數為所得擴增子庫中之組合庫之變異核酸之變異體的總數之約1,000至約100,000之間，例如約2,000至約100,000之間、約3,000至約75,000之間、約4,000至約50,000之間、約5,000至約50,000之間、約5,000至約40,000、約6,000至約30,000之間、約7,000至約25,000，包括約8,000至約20,000個之間。在一些實施例中，該確定包含得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少1,000。
在一些實施例中，以減小所得擴增子庫中之擴增偏差之方式進行擴增。在一些實施例中，藉由減少擴增之週期數目來減小擴增偏差。在一些實施例中，藉由具有減少擴增之週期數目的足夠大亞群之細胞來減小擴增偏差。在一些實施例中，獨特分子標識符(UMI)用於減小定序資料中由於擴增偏差之偏差。
在一些實施例中，使該等變異核酸與該亞群分離不包括擴增該等經分離變異核酸。
在一些實施例中，使該等變異核酸與該亞群分離包括使用基於CRISPR之選擇性庫製劑。可使用用於基於CRISPR之選擇性庫製劑的任何合適的選擇方案。在一些實施例中，該分離包含使用來自該亞群之基因體DNA的CRISPR/Cas9介導之靶向片段化。在一些實施例中，使該等變異核酸與該亞群分離包括使自亞群提取之基因體DNA去磷酸化、在側接所關注序列(例如變異核酸之連續部分)之位置引入CRISPR/Cas9介導之雙股斷裂及在雙股斷裂下之接合接附子(例如定序接附子)。接附子接合的序列可隨後使用任何適合之方法定序。在一些實施例中，確定該子集之個別成員之該連續部分的該等核苷酸序列包括對該子集之各個別成員進行條碼編碼。
確定該子集之個別成員之該連續部分的該等核苷酸序列可使用任何適合之選擇方案進行。在一些實施例中，確定該連續部分之該等核苷酸序列包括對該連續部分進行定序。可使用任何適合之定序平台。適合之定序平台包括(但不限於)桑格定序、焦磷酸定序、單分子定序、離子半導體定序、藉由合成定序、組合探針錨定合成定序、藉由接合定序、單分子即時(SMRT)定序及/或奈米孔定序。在一些實施例中，確定該連續部分之該等核苷酸序列包括使用允許較長定序讀段之定序平台。在一些實施例中，確定包含藉由產生該連續部分之至少600 bp之定序讀段來定序該等個別成員。在一些實施例中，該等定序讀段之長度在600 bp與15,000 bp之間。在一些實施例中，確定該連續部分之該等核苷酸序列涉及產生或得到該連續部分之以下定序讀數：至少600 bp，例如至少700 bp、至少800 bp、至少900 bp、至少1,000 bp、至少1,100 bp、至少1,200 bp、至少1,300 bp、至少1,400 bp、至少1,500 bp、至少1,750 bp、至少2,000 bp、至少2,500 bp、至少3,000 bp、至少4,000 bp、至少5,000 bp、至少6,000 bp、至少7,000 bp、至少8,000 bp、至少9,000 bp、至少10,000 bp、至少11,000 bp、至少12,000 bp、至少13,000 bp、至少14,000 bp或至少15,000 bp，或在由前述值中之任兩者界定之範圍內的序列讀段。在一些實施例中，該等定序讀數為該連續部分之約600 bp至約1,000 bp、約1,000 bp至約2,000 bp、約2,000 bp至約3,000 bp、約3,000 bp至約4,000 bp、約4,000 bp至約5,000 bp、約5,000 bp至約7,000 bp、約7,000 bp至約10,000 bp及/或約10,000 bp至約15,000 bp。
基於該等核苷酸序列鑑別兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少一個組合可使用任何適合之選擇方案進行。在一些實施例中，藉由確定基於功能特性選擇之亞群中之組合富集或耗乏來鑑別所關注組合。組合之相對豐度可基於自亞群確定之核苷酸序列中之組合豐度與豐度之參考量的任何適合之比較。豐度之適合的參考量包括(但不限於)：基於缺乏功能特性、不同反應量或不同類型之反應選擇之另一細胞亞群之組合的豐度；或尚未選擇之亞群中之組合的豐度。在一些實施例中，藉由確定相比於陰性選擇之亞群，陽性選擇之亞群中之組合富集或耗乏來鑑別所關注組合。在一些實施例中，藉由確定相比於組合庫中之組合豐度基於功能特性選擇之亞群中之組合富集或耗乏來鑑別所關注組合。
在一些實施例中，鑑別該至少一個組合包含相對於對照細胞群體量測該亞群中之該至少一個組合的富集。在一些實施例中，該細胞群體包含該對照細胞群體，且其中該亞群與對照細胞群體為非重疊的。在一些實施例中，基於不同於該至少一種功能特性之第二功能特性選擇該對照細胞群體。
在一些實施例中，該篩選方法包括：提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含：編碼TCRα變異胺基酸序列且定義該連續部分之第一末端的第一變異核苷酸子序列，與編碼TCRβ變異胺基酸序列且定義與該第一末端相對之該連續部分之第二末端的第二變異核苷酸子序列之組合；將該庫引入永生化T細胞群體中，該永生化T細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈；基於回應於使該等永生化T細胞與表現抗原之永生化B細胞接觸之高於臨限值含量的T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個T細胞；分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集；確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一與第二變異核苷酸子序列之至少一種組合。在一些實施例中，該方法進一步包括：基於回應於使該等永生化T細胞與永生化B細胞接觸之低於第二臨限值含量之T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個T細胞，且其中該亞群與該第二亞群為非重疊的；分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集；及確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列，其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。
在一些實施例中，該篩選方法包括：提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含以下中之兩者或更多者之組合：編碼CAR鉸鏈域之第一變異核苷酸子序列；編碼CAR跨膜域之第二變異核苷酸子序列；及編碼CAR胞內信號傳導域之第三變異核苷酸子序列，其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之一者定義該連續部分之第一末端，且其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之另一者定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端；將該庫引入經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼之CAR的細胞群體中，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級人類T細胞群體；基於回應於使該等細胞與表現對該CAR之抗原結合域具有特異性之抗原的抗原呈現細胞接觸之高於臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞；分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集；確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一、第二與第三變異核苷酸子序列之至少一種組合。在一些實施例中，該方法進一步包括：基於回應於使該等細胞與該等抗原呈現細胞接觸之低於第二臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個細胞，且其中該亞群與第二亞群為非重疊的；分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集；確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列，且其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。
在本發明內，各種實施例常常描述為涉及包含兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的連續部分。此外，此等實施例常常涉及第一變異核苷酸子序列及第二變異核苷酸，且基於取決於兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的至少一種功能特性選擇細胞群體之亞群。然而，明確考慮涉及兩個或更多個變異核苷酸之所有此類實施例的替代實施例為涉及單功能序列(亦即單變異核苷酸)之實施例。在此類實施例中，600 bp序列將為單核酸序列上之序列，其可編碼例如具有單一功能之單一蛋白質。因此，對於本文所揭示之涉及「兩個或更多個變異核苷酸子序列」之所有實施例，亦設想將該等方法應用於再次僅存在「變異核苷酸子序列」之情形，其中序列本身為600 bp或更大。舉例而言，在一些實施例中，提供一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法。該方法包含提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分。該方法進一步包含將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽。該方法進一步包含基於取決於至少600 bp之該連續部分的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞。該方法進一步包含分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集。該方法進一步包含確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列。該方法進一步包含基於該核苷酸序列鑑別至少600 bp之該連續部分。在一些實施例中，該方法亦可為其中至少600 bp之該連續部分分佈在600個鹼基對中。
提供本發明篩選方法之其他實施例。在一些實施例中，本發明之篩選方法可用於任何蛋白質變異體篩選，其中(a)蛋白質序列意欲在200或更多個胺基酸之連續區域中變化；(b)蛋白質變異體可表現於可暴露於選擇性壓力之報導細胞(包括酵母及細菌)或另一功能載劑(例如病毒、噬菌體)中；及(c)表現所關注蛋白質變異體之報導細胞可在選擇性壓力(例如抗原結合、回應於抗原之基因表現等)之後在至少一種功能特性上選擇。產生含有至少兩個僅可藉由確定其總核苷酸序列之至少 600 bp 來明確鑑別之變異核苷酸子序列的變異核苷酸序列庫
在一些實施例中，變異核苷酸序列之庫由任何適合之電子雜交設計及蛋白質工程改造方法產生。各變異體可編碼於將導致胞內之變異核苷酸序列表現之基因載體中。取決於待進行之準確篩選，變異核苷酸序列可與適當啟動子、信號肽、剪接供體/受體、終止密碼子及聚(A)信號序列組合。表現構築體亦可含有選擇標記物，例如抗生素抗性基因、螢光分子或細胞表面標記物。
在一些實施例中，為了增強以較高可信度鑑別變異體之能力，電子雜交演算法可用以控制密碼子使用，藉此最大化任何兩種變異體之間的編輯距離(其可為所涉及之將既定核苷酸序列轉換成庫中之任何其他變異核苷酸序列的核苷酸變化之數目)及增強區分變異核苷酸序列之能力。變異序列庫可藉由任何適合之選擇方案產生，諸如(但不限於) DNA合成。
在一些實施例中，本發明之篩選方法可用於篩選任何適合之蛋白質，其中變異體可僅藉由確定超過200個胺基酸來確信地鑑別。實例包括(但不限於) TCR、CAR、抗體、RNA介導之核酸酶、合成開關受體及定向蛋白質演進。
在一些實施例中，該庫為含有TCRα及TCRβ變異體之TCR庫。TCR庫可為任何適合庫，其中任何既定TCRα及TCRβ鏈可在超過一個互補二聚搭配物之情況下發生或該二聚搭配物為未知的。在兩種情況下，僅可藉由對TCRα及TCRβ可變序列進行定序明確鑑別TCR變異體。
在一些實施例中，庫為含有CAR變異體之CAR庫。CAR庫可為任何適合庫，其中需要定序超過200個胺基酸以在可信度條件下鑑別任何既定CAR變異體。實例包括具有高度多樣之抗原結合域的任何CAR庫或使用CAR蛋白域中之一些或全部的任何其他組合構造，例如其中組合鉸鏈域、跨膜域及兩個信號傳導域之變異體以產生具有500個或更多個變異體之庫的庫。
在一些實施例中，該庫為含有抗體變異體之抗體庫。變異核苷酸序列可包括編碼在一個表現構築體中配對的抗體重鏈及輕鏈之核酸，該構築體僅可藉由對重鏈及輕鏈序列進行定序鑑別。在一些實施例中，可將抗體變異體之庫引入報導細胞(或另一功能性媒劑)中且基於至少一種功能性特性(諸如抗原結合)選擇。將變異核苷酸序列之庫引入報導細胞中
可藉由任何適合方法將變異核苷酸序列之庫引入報導細胞中。在一些實施例中，反轉錄或慢病毒基因遞送用於將該庫引入報導細胞(或如本文中所指出之任何載劑)中。可使用任何適合之方法將庫引入報導細胞中。報導細胞可為任何適合之細胞(或載體)。在一些實施例中，可基於若干準則來選擇報導細胞：(1)其依賴於所引入變異核苷酸序列及回應於外部選擇壓力展現可量測功能獲得/功能損失之能力；(2)用於量測對選擇壓力反應之標記物分子的最小背景表現及(3)培養物中報導細胞之增殖及細胞存活。適合之報導細胞包括(但不限於)用於篩選之永生化Jurkat T細胞或初級人類T細胞，例如免疫受體(TCR/CAR)庫。本文中亦注意到其他載劑選擇方案。
在一些實施例中，平均而言，各報導細胞僅用變異核苷酸序列轉導，因此病毒轉導用較低MOI進行。在一些實施例中，為保持多株報導細胞庫中之各變異核苷酸序列之表示量(下文：覆蓋度)，待轉導之報導細胞之數目與庫變異體之數目直接相關。
在一些實施例中，在用庫修飾之後，成功修飾之報導細胞可例如基於抗生素抗性選擇(例如嘌呤黴素或殺稻瘟菌素)。此類選擇可藉由在較低MOI轉導之後消除來自群體之未經轉導的細胞來減小總體細胞數目。在一些實施例中，選擇強度取決於變異序列庫之多樣性。在一些實施例中，將該庫引入至報導細胞之較大群體中，其中該庫具有較高多樣性以維持該群體內之庫覆蓋度。在一些實施例中，足夠數目個多株報導細胞用於在選擇後維持指定覆蓋度量。
在一些實施例中，庫可藉由轉位子介導之基因遞送引入報導細胞中。在一些實施例中，可藉由DNA核酸酶介導之位點特異性整合(例如使用CRISPR/Cas9及TALEN)將庫引入報導細胞中。
在一些實施例中，經修飾報導細胞可藉由經修飾報導細胞對細胞表面標記物之基於珠粒的富集進行選擇。在一些實施例中，經修飾報導細胞可藉由細胞表面標記或螢光分子之流式細胞測量術分選來選擇。
在一些實施例中，報導細胞經遺傳修飾以便(1)增強其回應於外部選擇壓力而展現功能獲得/功能損失之能力；(2)降低用於量測對選擇壓力反應之標記物分子的背景表現；及/或(3)增強維持細胞培養物中之報導細胞群體的能力。基於至少一種功能特性選擇報導細胞
在一些實施例中，向報導細胞之多株群體施加選擇性壓力以便取決於經表現蛋白質變異體藉由報導細胞量測功能獲得/功能損失。舉例而言，報導細胞可用表現抗原之細胞刺激。隨後，回應於刺激報導細胞可基於適合之標記物分離。舉例而言，回應於表現抗原之細胞的經TCR轉導的Jurkat細胞上之CD69上調可用於進行報導細胞之流式細胞測量術分選。反應及非反應群體兩者可經分離而具有足夠的覆蓋度且分別分析。藉此，既定變異核苷酸序列之相對富集倍數可藉由確定陽性群體中之富集及陰性群體中之耗乏來量測。
在一些實施例中，以以下方式中之一或多者在報導細胞上施加選擇性壓力：用受體促進劑或拮抗劑刺激；暴露於小分子；暴露於超過一種同時刺激。在一些實施例中，基於蛋白質標記物上調或下調分離報導細胞，例如用於流式細胞測量術或標記物陽性及陰性報導細胞之基於珠粒的分選。在一些實施例中，報導細胞基於抗藥性/敏感性分離，其導致報導細胞之選擇性存活或細胞死亡。在一些實施例中，基於多個標記物分子分離報導細胞。
在一些實施例中，分離僅一個群體，而非分離陽性及陰性反應報導細胞兩者。既定變異核苷酸序列之富集倍數可藉由與不暴露於選擇性壓力之多株報導細胞比較來建立。
可使用選擇報導細胞之上文所述之方法中的任一者或組合。分離來自經選擇報導細胞之變異核苷酸序列
在一些實施例中，為了在批量水準上分析經分離多株報導細胞群體，使用任何適合之方法分離基因體DNA (gDNA)。隨後，藉由PCR擴增變異核苷酸序列。可針對完整變異核苷酸序列或僅針對變異體展現出突變多樣性之區域進行此類擴增。可製備PCR擴增子用於平台上之NGS分析，該平台可提供足夠的定序讀段之讀段長度及總數，諸如(但不限於) Oxford奈米孔技術。在一些實施例中，PCR方案可使用任何適合的選擇方案(例如，使用獨特分子標識符(UMI)及最小數目之PCR週期)得到改進，以避免任何經定義變異核苷酸序列之偏向擴增。
在一些實施例中，作為防止變異核苷酸序列偏向擴增之手段，分離來自經選擇報導細胞之gDNA且經受基於CRISPR之選擇性庫製備。可對基因體DNA去磷酸化，且可將CRISPR/Cas9介導之雙股斷裂引入側接所關注序列之序列中。與雙股斷裂緊鄰之核苷酸可在此處理之後保持磷酸化，其可允許後續庫製備步驟中之磷酸化依賴性銜接子接合。取決於前間隔序列鄰近基序(PAM)之取向及所用前間隔子序列，可使用適合之定序選擇方案(例如Oxford奈米孔技術)對插入物專門定序。確定經分離變異核苷酸序列之總核苷酸序列的至少 600 bp
在一些實施例中，PCR擴增子利用適合之NGS平台定序。取決於遺傳變異體庫特性，可使用任何適合之定序平台對擴增子進行定序。適合之定序平台包括(但不限於)奈米孔技術。選擇至少一個所關注變異核苷酸序列
在一些實施例中，如藉由兩個細胞群體中之變異體讀段計數所確定，藉由確定經陽性選擇(標記物分子為陽性)報導細胞群體中之變異體富集及經陰性選擇(標記物分子為陰性)報導細胞群體中之變異體耗乏基於相對富集來選擇例如TCR及CAR之所關注變異核苷酸序列。在一些實施例中，基於以下中之一或多者選擇所關注變異核苷酸序列：相對富集；在不同選擇性壓力(例如不同抗原劑量)下發生的相對富集；基於不同標記物分子分離之多個細胞群體的相對富集；基於標記物分子之組合分離之細胞群體的相對富集；在多個細胞群體中發生之相對富集，此類細胞群體由不同類型之報導細胞構成；相對於初始基因變異體庫，在報導細胞之經分離群體中變異核苷酸序列，例如TCR或CAR之富集。
在一些實施例中，以下配置或其子部分中之任一者可為本文所提供之實施例的部分或與本文所提供之實施例組合。使配置編號為1至145如下： 1.  一種自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法，該方法包含： 確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸或胺基酸序列； 選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集； 藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及 自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。 2.  如配置1之方法，其中在一些實施例中，基於以下至少一個準則選擇來自該總組庫之該TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集： 該T細胞群體內之頻率， 與第二T細胞群體相比之相對富集， 給定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異， 該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、抗原親和力、輔受體依賴性、親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)或TCR序列模體， 基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之起始區域或其他基因之共表現模式， 在多個樣品中共同出現或在類似頻率下出現，例如在多個腫瘤病變中出現， 分配至多個組中以分別還原該TCR組庫之特定部分， 如不同實施例所定義之多個準則的組合。 3.  如配置2之方法，其中基於該T細胞群體內之頻率的選擇係基於TCR序列之頻率的資料，該資料用於創建針對TCRα鏈及β鏈之單獨排名次序或針對TCRα鏈與β鏈之組合排名次序。 4.  如配置1至3中之任一項之方法，其進一步包含確定頻率臨限值，該頻率臨限值係基於針對TCR組庫還原之所需深度定義的且用於基於頻率選擇TCRα鏈及β鏈之集合。 5.  如配置1至4中之任一項之方法，其中藉由以下中之至少一者確定TCR-α及β序列： 多重PCR； 藉由目標富集之TCR序列還原； 藉由5'RACE及PCR之TCR序列還原； 藉由空間定序之TCR序列還原； 藉由RNA-seq之TCR序列還原； 及使用獨特分子標識符(UMI)。 6.  如配置1至5中之任一項之方法，其中所還原TCR鏈序列經定義為CDR3核苷酸序列連同足夠的5'-及3'-核苷酸序列資訊，以基於核苷酸序列比對選擇至少一個TCR V區段及一個TCR J區段家族，從而組裝完整TCR鏈序列。 7.  如配置1至6中之任一項之方法，其中藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫係藉由以下中之至少一者達成： 使用TCR鏈序列來合成TCRα鏈及β鏈DNA或RNA片段之單獨庫，該等片段隨後連接成一個DNA或RNA片段，其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接， 藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合， 藉由用TCRα基因及β基因之各別集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞將表現至少一個TCRα鏈與一個β鏈，及/或 TCRα鏈與β鏈之組合連接於單鏈TCR構築體中，其中TCRα與TCRβ可變鏈片段兩者融合，且其中該單鏈TCR構築體可融合於(i)單獨跨膜域或(ii)另外含有胞內信號傳導域，包括但不限於單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ε或CD3ζ信號傳導域。 8.  如配置1至7中之任一項之方法，其中自該經創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對係藉由以下中之至少一者達成： 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種活化標記物分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池用適合於追蹤細胞增殖之螢光染料標記，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於增殖分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池分成至少兩個樣品；藉由表現至少一種所關注抗原或不表現之抗原呈現細胞刺激樣品；在刺激之後，將兩個報導細胞群體培育一段時間，且隨後藉由TCR分離分析兩個報導細胞群體；比較自兩個樣品得到的TCRαβ對，以鑑別暴露於至少一種抗原之樣品中豐度較高的TCR基因； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種報導TCR觸發的報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-YFP，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於按照選擇性存活對抗原特異性報導細胞的選擇，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離，該選擇性存活包括但不限於在TCR信號傳導時例如藉由使用NFAT嘌呤黴素轉殖基因之獲得性抗生素抗性； 將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池暴露於一或多個攜帶所關注抗原之MHC複合物；分離結合於MHC複合物之報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激；隨後，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體方法以使TCR分離與至少一種活化標記物之轉錄物含量的偵測組合來鑑別所關注TCRαβ對；藉此在該T細胞池內偵測到單報導細胞，其中TCRαβ轉錄物與增加含量的活化標記物共表現。 9.      如配置1至8中之任一項之方法，其中該個體之樣品包含無活性起始物質。 10.     如配置1至9中之任一項之方法，其中還原經鑑別TCR組庫之經定義部分。 11.     如配置1至10中之任一項之方法，其中還原抗原特異性TCR序列。 12.     如配置1至11中之任一項之方法，其中還原I類及/或II類限制型TCR序列。 13.     如配置1至12中之任一項之方法，其中還原以下中之至少一者： 新抗原特異性TCR序列， 病毒特異性TCR序列， 共用腫瘤抗原特異性TCR序列， 自身抗原特異性TCR序列。 14.     如配置12之方法，其進一步包含投與表現該等新抗原特異性TCR序列之T細胞作為癌症療法的步驟。 15.     如配置1至13中之任一項之方法，其中該方法用於診斷。 16.     如配置15之方法，其中該診斷為自感染或自體免疫之病理性部位中還原TCR組庫。 17.     如配置1至15中之任一項之方法，其中該方法用於還原BCR/抗體組庫。 18.     如配置1至16中之任一項之方法，其進一步包含分離來自包含TCR-α及β核苷酸序列之個體的核酸。 19.     如配置8之方法，其中該活化標記物選自由以下組成之群：CD25、CD69、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、OX40。 20.     如配置1至18中之任一項之方法，其中DNA及RNA分離T細胞群體，該T細胞群體來自作為不同細胞類型之混合物或組織樣品(諸如血液或腫瘤組織)之一部分。 21.     如配置1至19中之任一項之方法，其中該個體之樣品包含自體液分離之細胞。 22.     如配置20之方法，其中該等細胞為腫瘤特異性T細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞。 23.     如配置20至21之方法，其中該體液選自由以下組成之群：血液、尿液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、腦脊髓液、唾液、痰、黏膜分泌物、陰道液、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液及腹腔液。 24.     如配置1之方法，其進一步包含使用該等TCRαβ鏈序列治療患有癌症、免疫病症、自體免疫疾病或感染性疾病之個體。 25.     如配置1至7中之任一項之方法，其中自該經創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對係藉由以下中之至少一者達成： 基於至少一種活化標記物之鑑別或選擇； 基於回應於抗原之增殖的鑑別或選擇； 基於鑑別與未經刺激細胞相比，經抗原刺激細胞中較高豐度之TCR基因的鑑別或選擇； 基於藉由TCR觸發之報導基因活化之鑑別或選擇； 基於選擇性存活之鑑別或選擇，該選擇性存活包括(但不限於) TCR信號傳導時之獲得性抗生素抗性； 基於結合至一或多種MHC複合物之鑑別或選擇； 使用基於單細胞之液滴PCR或微流體的鑑別或選擇； 或其任何組合。 26.     如配置8之方法，其中TCR分離藉由自批量抗原反應性T細胞分離DNA或RNA以產生TCRαβ特異性PCR產物來達成，該TCRαβ特異性PCR產物藉由DNA定序或RNA定序分析以確定抗原反應性T細胞之TCRαβ基因序列，或藉由基於單細胞之液滴PCR或微流體方法分析以分析在所分析單T細胞中表現的該等TCRαβ基因序列。 27.     如配置8之方法，其中該等報導細胞為T細胞。 28.     如配置24之方法，其中使用基於單細胞之液滴PCR或微流體之鑑別或選擇進一步包含確定活化相關基因之共表現。 29.     一種創建多個T細胞庫之方法，該方法包含：根據如配置1之方法還原T細胞受體(TCR)之組庫；選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。 30.     如配置29之方法，其中基於頻率範圍選擇TCRα鏈及β鏈序列。 31.     一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第一變異核苷酸子序列定義該連續部分之第一末端，且該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第二變異核苷酸子序列定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端； 將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽； 基於取決於該兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於該等核苷酸序列鑑別該兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少一個組合。 32.     如配置1之方法，其中該一或多種多肽包含： T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈； 嵌合抗原受體(CAR)； 開關受體；或 抗體或其抗原結合片段之一或多個鏈。 33.     如配置31或32之方法，其中該第一變異核苷酸子序列編碼TCRα變異胺基酸序列且該第二變異核苷酸子序列編碼TCRβ變異胺基酸序列。 34.     如配置31至33中之任一項之方法，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列編碼以下中之一或多者：TCR V區、TCR互補決定區3 (CDR3)、TCR J區段及TCR恆定區。 35.     如配置31或32之方法，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之每一者編碼CAR之抗原結合域、鉸鏈域、跨膜域或一或多個胞內信號傳導域。 36.     如配置31至35中之任一項之方法，其中該等連續部分之長度為600 bp至15,000 bp。 37.     如配置31至36中之任一項之方法，其中提供包含產生該庫。 38.     如配置37之方法，其中產生該庫包含： 鑑別編碼該一或多個多肽之兩組或更多組變異胺基酸序列的兩組或更多組變異核苷酸子序列，其中該至少一種功能特性取決於該兩組或更多組變異胺基酸序列中之每一者的變異胺基酸序列之組合； 藉由組合來自該兩組或更多組變異核苷酸子序列中之每一者的變異核苷酸子序列來組裝該連續部分，藉此產生該複數個變異核酸之成員。 39.     如配置31至38中之任一項之方法，其中使該庫中之該複數個變異核酸之連續部分之間的編輯距離最大化。 40.     如配置31至39中之任一項之方法，其中該庫包含該兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少100個不同組合。 41.     如配置31至40中之任一項之方法，其中引入包含經由病毒轉導、基於轉座子之基因遞送或核酸酶介導之位點特異性整合來引入該庫。 42.     如配置41之方法，其中引入包含以5或更低之感染倍率(MOI)病毒轉導該細胞群體。 43.     如配置31至42中之任一項之方法，其包含基於該庫中之該兩個或更多個變異核苷酸子序列之多個不同組合來調整該細胞群體之大小。 44.     如配置31至43中之任一項之方法，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級T細胞。 45.     如配置44之方法，其中該等永生化T細胞或初級T細胞為人類T細胞。 46.     如配置31至45中之任一項之方法，其進一步包含使用標記物以選擇或篩選表現該複數個變異核酸中之至少一者的該細胞群體中之細胞。 47.     如配置46之方法，其中該標記物為細胞毒素抗性標記物及/或細胞表面標記物。 48.     如配置31至47中之任一項之方法，其中該細胞群體之細胞經遺傳修飾。 49.     如配置31至47中之任一項之方法，其中該群體之細胞不包含賦予該等細胞至少一種功能特性之內源性多肽。 50.     如配置1至49中之任一項之方法，其中該等細胞經遺傳修飾以消除或減少CD4、CD8及CD28中之一或多者的表現。 51.     如配置48或49之方法，其中該等細胞用CD4及/或CD8重建且用於篩選I類及/或II類限制型TCR序列。 52.     如配置50或51之方法，其中該等細胞為T細胞。 53.     如配置31至52中之任一項之方法，其中選擇包含基於可偵測標記物之表現選擇該亞群，其中該表現取決於該一或多個多肽之該至少一種功能特性。 54.     如配置53之方法，其中該可偵測標記物包含細胞表面標記物、細胞激素標記物、細胞增殖標記物、轉錄報導子、信號轉導報導子及/或細胞毒性報導子。 55.     如配置54之方法，其中 該細胞表面標記物包含以下中之一或多者：CD25、CD69、CD62L、CD137、OX40； 該細胞激素標記物包括以下中之一或多者：IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-8、GM-CSF； 該轉錄報導子包含以下中之一或多者：NF-κB、NFAT、AP-1； 該信號轉導報導子包含以下中之一或多者：ZAP70、ERK1/2；及 該細胞毒性報導子包含以下中之一或多者：CD107A、CD107B。 56.     如配置31至55中之任一項之方法，其中選擇包含使該細胞群體與以下中之一或多者接觸： 第二細胞群體； 該一或多個多肽之配位體； 該一或多個多肽之促效劑或拮抗劑；及 小分子， 其中藉由該接觸誘導之亞群之變化取決於該一或多個多肽之該至少一種功能特性。 57.     如配置56之方法，其中選擇進一步包含： 偵測該變化之存在或不存在，及/或該變化之幅度；及 基於該偵測選擇該亞群。 58.     如配置56或57之方法，其中該第二細胞群體包含抗原呈現細胞。 59.     如配置58之方法，其中該等抗原呈現細胞包含B細胞及/或樹突狀細胞。 60.     如配置56至59中之任一項之方法，其中該第二細胞群體包含初級細胞或永生化細胞。 61.     如配置56至60中之任一項之方法，其中該庫之變異核苷酸序列源自表現變異多肽的細胞，該變異多肽包含由該等變異核苷酸子序列編碼之胺基酸，其中自個體得到該等細胞，且其中該第二細胞群體源自該個體。 62.     如配置31至61中之任一項之方法，其中選擇包含基於高於或低於臨限值之該至少一種功能特性的度量選擇該細胞群體之第一亞群。 63.     如配置62之方法，其中基於該細胞群體之未經選擇亞群中之該功能特性的度量確定該臨限值。 64.     如配置62之方法，其中選擇進一步包含基於高於或低於第二臨限值之該至少一種功能特性的第二度量選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第一亞群與該第二亞群為非重疊的。 65.     如配置64之方法，其中鑑別該至少一個組合包含比較該第一亞群與該第二亞群之間的該至少一個組合的豐度。 66.     如配置31至64中之任一項之方法，其中鑑別該至少一個組合包含相對於對照細胞群體量測該亞群中之該至少一個組合的富集。 67.     如配置66之方法，其中該細胞群體包含該對照細胞群體。 68.     如配置67之方法，其中該亞群及對照細胞群體為非重疊的，其中非重疊表示兩個群體之細胞具有不同活化狀態，但可攜帶相同變異核酸。 69.     如配置66之方法，其中基於不同於該至少一種功能特性之第二功能特性選擇該對照細胞群體。 70.     如配置31至69中之任一項之方法，其中該亞群包含複數個細胞。 71.     如配置31至70中之任一項之方法，其中該分離不包含基於該至少一種功能特性分離該亞群之單一純系。 72.     如配置31至71中之任一項之方法，其中該亞群包含至少1,000個細胞。 73.     如配置31至72中之任一項之方法，其中確定包含藉由產生該連續部分之至少600 bp的定序讀段來定序該等個別成員。 74.     如配置73之方法，其中該等定序讀段之長度在600 bp與15,000 bp之間。 如配置31至74中之任一項之方法，其中確定包含擴增該等個別成員之至少該連續部分。 76.     如配置75之方法，其中擴增包含使用雜交至恆定核苷酸子序列之擴增引子，其中該複數個變異核酸中之每一者包含該恆定核苷酸子序列，且其中該恆定核苷酸子序列編碼該一或多個多肽之恆定胺基酸序列。 77.     如配置76之方法，其中該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRα恆定區。 78.     如配置76之方法，其中該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRβ恆定區。 79.     如配置31至78中之任一項之方法，其中該分離包含使用來自該亞群之基因體DNA的CRISPR/Cas9介導之靶向片段化。 80.     如配置31至78中之任一項之方法，其中該確定包含在該等個別成員之任何擴增之前或不存在該等個別成員之任何擴增下，得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少10。 81.     如配置31至80中之任一項之方法，其中該確定包含得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少25、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少1,000。 82.     一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含： 編碼TCRα變異胺基酸序列且定義該連續部分之第一末端的第一變異核苷酸子序列，與 編碼TCRβ變異胺基酸序列且定義與該第一末端相對之該連續部分之第二末端的第二變異核苷酸子序列之組合； 將該庫引入永生化T細胞群體中，該永生化T細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈； 基於回應於使該等永生化T細胞與表現抗原之永生化B細胞接觸之高於臨限值含量的T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個T細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一與第二變異核苷酸子序列之至少一種組合。 83.     如配置82之方法，其進一步包含： 基於回應於使該等永生化T細胞與永生化B細胞接觸之低於第二臨限值含量之T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個T細胞，且其中該亞群與該第二亞群為非重疊的； 分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集；及 確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列， 其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。 84.     一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼嵌合抗原受體(CAR)鉸鏈域、跨膜域及/或胞內信號傳導域之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含以下中之兩者或更多者之組合： 編碼CAR鉸鏈域之第一變異核苷酸子序列； 編碼CAR跨膜域之第二變異核苷酸子序列；及 編碼CAR胞內信號傳導域之第三變異核苷酸子序列， 其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之一者定義該連續部分之第一末端，且其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之另一者定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端； 將該庫引入經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼之CAR的細胞群體中，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級人類T細胞群體； 基於回應於使該等細胞與表現對該CAR之抗原結合域具有特異性之抗原的抗原呈現細胞接觸之高於臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一、第二與第三變異核苷酸子序列之至少一種組合。 85.     如配置84之方法，其中存在超過一個CAR胞內信號傳導域。 86.     如配置85之方法，其中存在至少兩個CAR胞內信號傳導域。 87.     如配置84之方法，其中以下中之至少兩者為該至少兩個CAR胞內信號傳導域：CD3ε、CD3ζ ITAM1、CD3ζ ITAM12、CD3ζ ITAM123；具有CD3δ、CD3ε及CD3γ之任何ITAM的CD3ζ；CD8α、CD28、ICOS、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27及CD2。 88.     如配置84之方法，其包含： 基於回應於使該等細胞與該等抗原呈現細胞接觸之低於第二臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個細胞，且其中該亞群與第二亞群為非重疊的； 分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集； 確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列，及 其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。 89.     一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分； 將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽； 基於取決於至少600 bp之該連續部分的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於該核苷酸序列鑑別至少600 bp之該連續部分。 90.     如配置89之方法，其中至少600 bp之該連續部分之變化性分佈在600個鹼基對中。 91.        一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法，其包含： 將庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中， 基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集， 確定該等變異核酸之核苷酸序列，及 基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。 92.        如配置90之方法，其進一步包含提供包含編碼TCRα及TCRβ鏈之該複數個變異核酸的該庫。 93.        一種鑑別來自樣品之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，其包含： 對樣品中之TCR-α及β鏈定序， 選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫， 將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池， 用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞， 確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對，及 將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。 94.     如配置14之方法，其進一步包含投與表現該等抗原特異性TCR序列之T細胞，以診斷或治療感染或自體免疫之步驟。 95.     如配置14之方法，其中該等T細胞可為自體或同種異體的。 96.     如配置8之方法，其中該活化標記物為CD69，且其中分離出兩種細胞群體，一種細胞群體具有較高表現之CD69及另一種細胞群體具有較低表現之CD69。 97.     一種核苷酸庫，其包含如配置1至30及95、96中任一項還原的該T細胞受體之組庫。 98.     一種核苷酸構築體，其包含如配置1至96中任一項所鑑別之該核苷酸序列。 99.     一種細胞，其包含如配置98之核苷酸構築體。 100.   一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法，其包含： 將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫； 基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該細胞庫之第一群體；及 分離來自該庫之該第一群體的變異核酸之第一群體。 101.   如配置100之方法，其進一步包含： 確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性；及 基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。 102.   如配置100或101之方法，其中該臨限值含量基於以下中之至少一者： a)基於標記物之表現回收細胞之總池的百分比；或 b)自該細胞之總池中回收最小數目之細胞；或 c)基於磁性探針與至少一種回應於抗原表現之標記物的結合，回收由磁體保留之細胞。 103.   如配置66至69、82、84、91或101之方法，其中該對照為低於第二臨限值之第二細胞群體。 104.   如配置66至69、82、84、91或101之方法，其中該對照為以下中之一或多者： 參考細胞群體， 引入該細胞群體中的核酸之該組合庫， 基於低於第二臨限值之表現標記物，自與該第一群體相同之細胞群體分選的細胞群體， 自表現相關TCR庫之報導T細胞與未呈現任何外源性抗原之抗原呈現細胞，諸如B細胞之共培養物得到的至少一個細胞群體。 105.   如配置104之方法，其中該對照(或底部樣品)自與該頂部樣品相同但具有較低活化標記物表現之細胞群體分選，或其中該底部樣品自表現該相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物得到。 106.   如配置100至105中之任一項之方法，其進一步包含向該細胞群體添加抗原。 107.   如配置100至106中之任一項之方法，其中該分離第一群體及/或該對照藉由a)磁性珠粒富集、b)流式細胞測量術分選或c)兩者中之至少一者達成。 108.   一種鑑別來自核酸庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，該方法包含： 將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；及 基於相對於對照之該子集內之該核苷酸序列的富集，確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性。 109.   如配置108之方法，其中自第一細胞群體分離該至少一個核酸 110.   如配置109之方法，其中基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該第一細胞群體。 111.   一種鑑別來自核酸庫之核苷酸序列的方法，其包含： 將該核酸庫引入細胞群體中，以形成細胞庫； 使該細胞庫與第一細胞群體接觸； 基於藉由磁性珠粒富集的至少一種標記物之表現，選擇該細胞庫之亞群；及 基於相對於對照之該亞群內之該等核苷酸序列的統計學上顯著之富集或耗乏，鑑別至少一個核苷酸序列。 112.   如配置111之方法，其中細胞亞群中之至少一些經設計以表現由該核酸庫之成員編碼的一或多個多肽。 113.   如配置111之方法，其中標記物表現與自該庫引入之核酸關聯，其中關聯表示所引入核酸改變標記物表現。 114.   如配置111之方法，其中選擇係基於高於臨限值含量之標記物表現。 115.   如配置111之方法，其中選擇係基於高於臨限值含量之至少兩種標記物之表現。 116.   如配置8、82、91、93或100中之任一項之方法，其中鑑別或刺激或提供抗原包含以下中之一或多者： a)  選擇多種抗原； b)  創建抗原池，其中各抗原恰好存在於兩個抗原池中， c)  評估表現至少一種T細胞受體之報導細胞針對該等抗原池中之每一者的反應性；及 d)  藉由評估針對恰好兩個抗原池之反應性，確定該至少一個T細胞受體是否對該等經選擇抗原中之任一者具有反應性。 117.   如配置116之方法，其中藉由成對富集分析偵測針對恰好兩個抗原池之反應性。 118.   如配置111之方法，其中該庫為TCR庫。 119.   如配置111之方法，其中一種採用活化標記物。 120.   如配置111之方法，其中一種採用頂部-底部比較來評估反應性。 121.   如前述配置中之任一項之方法，其涉及反應性之評估或進一步包含反應性之評估，其中一種採用頂部-底部比較來評估反應性。 122.   如前述配置中之任一項之方法，其涉及庫，其中該庫中之該複數個變異核酸的該核苷酸序列基於以下中之至少一者最佳化： 引入較佳密碼子使用用於宿主細胞， 最佳化mRNA結構穩定性， 避免重複序列， 避免均聚物之較長延伸，及 避免給定變異核酸序列內局部GC含量之較大差異。 123.   如配置91之方法，其中經由抗原呈現細胞呈現該抗原。 124.   如配置91之方法，其中該庫為組合庫。 125.   如前述配置中之任一項之方法，其中該抗原由細胞提供。 126.   如前述配置中之任一項之方法，其中該方法涉及高度的抗原多樣性及/或複雜性。 127.   如前述方法中之任一項之方法，其涉及庫，該庫為組合庫。 128.   如以上方法，其中該組合庫為TCR庫。 129.   一種細胞集合，該集合包含： 一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ各自來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及 一組至少兩個B細胞，其中該至少兩個B細胞中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。 130.   如配置129之組合物，其中該一組至少兩個B細胞包含： 至少第一B細胞，其產生該外源性新抗原(或抗原)；及 至少第二B細胞，其產生第二外源性新抗原(或抗原)。 131.   一種表現TCR之細胞的庫，該表現TCR之細胞的庫包含：一組至少三個T細胞， 其中該等T細胞中之至少兩者經設計以表現至少兩種TCRα及TCRβ對(至少兩種TCR對)， 其中該至少兩種TCR對來自個體， 其中該至少三個T細胞不表現內源性TCR， 其中該至少三個T細胞經設計用於在結合至由B細胞呈現之抗原(或新抗原)時，活化一或多個T細胞活化標記物， 其中如多個TCR細胞所反映，各TCR對之基因體複本的量使得在該樣品中之每個TCR上得到讀數， 其中該等TCR中之至少一者不均勻地分佈在包含該庫之組合物中。 132.   如配置131之表現TCR之細胞的庫，其中藉由結合至由B細胞呈現之抗原而改變至少一種T細胞之分佈。 133.   如配置131之表現TCR之細胞的庫，其中至少兩種TCR對大致均勻地存在於該表現TCR之細胞的庫中。 134.   一種治療個體之方法，該方法包含： 鑑別患有腫瘤之個體； 提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體， 提供一組至少兩個B細胞，其中該一組B細胞經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同； 使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個B細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及 向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。 135.   如配置134之方法，其中治療減小該腫瘤之尺寸。 136.   一種治療個體之方法，該方法包含： 鑑別患有腫瘤之個體； 提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體， 提供一組至少兩個抗原呈現細胞，其中該一組抗原呈現細胞源於該個體，經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同； 使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個抗原呈現細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及 向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。 137    一種醫藥組合物，其包含： 第一TCR對，其結合至個體之腫瘤的第一抗原(或新抗原)；及 第二TCR對，其結合至該個體之腫瘤的第二抗原(或新抗原)。 138.   如配置137之醫藥組合物，其中該第一TCR對為MHC-I類限制型且其中該第二TCR對為MHC-II類限制型。 139.   一種醫藥組合物，其包含： 第一TCR對，其結合至第一抗原且為MHC-I類限制型；及 第二TCR對，其結合至第二抗原且為MHC-II類限制型。 140.   如配置137至139中任一項之醫藥組合物，其進一步包含第三TCR對。 141.   如配置137至140中任一項之醫藥組合物，其中該第一TCR對結合至來自腫瘤之新抗原，其中該第二TCR對結合至來自該腫瘤之新抗原，且其中該第一及第二TCR對均存在於該腫瘤之宿主中。 142.   一種細胞集合，該集合包含： 一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該對來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及 一組至少兩個抗原呈現細胞(APC)，其中該至少兩個APC中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。 143    如上文之方法中任一項之方法，其中，藉由結合至抗原(諸如新抗原)選擇或鑑別TCR對及/或表現TCR對之T細胞，其中該抗原由B細胞或抗原呈現細胞表現。 144.   如上文之方法中任一項之方法，其中該抗原或新抗原來自個體之腫瘤，且其中該等TCR對之TCRα及TCRβ亦各自來自該個體。 145.   如上文之方法中任一項之方法，其中存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個抗原。額外實施例
各種方法之各種實施例亦呈現於圖10A-10J中。在一些實施例中，圖10A-圖10J中之圖展示一種方法，且有可能使新抗原反應性TCR與作為其他腫瘤之示例性的錯配功能正常型結腸直腸癌(MMRp-CRC)腫瘤分離。此等腫瘤一般具有較低突變負荷。存在大量證據表明突變負荷與對免疫腫瘤學療法(諸如抗PD1/PD-L1檢查點抑制療法)之反應良好相關。實際上，在用免疫檢查點抑制劑處理之MMRp-CRC組中觀測到不良反應率。
類似於免疫檢查點抑制劑療法，藉由免疫系統鑑別腫瘤細胞來驅動T細胞療法。鑒於MMRp-CRC中之較低突變負荷，吾人將預期發現T細胞對腫瘤新抗原之有限反應性。出乎意料地，發現(如下文所概述及以下實例13中所展現)鑑別所篩選之所有四種MMRp-CRC患者樣品之腫瘤新抗原的TCR，藉此使得能夠針對此患者組使用TCR T細胞療法(其另外將具有有限治療選擇方案)。
在一些實施例中，該方法可涉及該等步驟中之一或多者，其概述為下文方法10A-10J (及該等實施例中之一些附圖)。步驟中之任一者可視需要經本文所提供之其他實施例重複或取代。亦可添加額外中間步驟。
步驟 10A) 篩選方法之示意圖。 在一些實施例中，使錯配功能正常型結腸直腸癌(例如MMRp-CRC)患者樣品經受TCR鑑別平台，開始自常規無活性腫瘤切片得到遺傳資訊。自腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)檢索批量TCR定序資訊且用於組裝α及β鏈表現盒之組合配對庫。此等在Jurkat報導T細胞中表現，且針對表現腫瘤新抗原之自體B細胞以串列小型基因(TMG)型式篩選為小型基因。藉由檢索經活化報導T細胞且分離其TCR，可鑑別新抗原反應性TCR。
步驟 10B) 在人類 MMRp-CRC 樣品中浸潤淋巴細胞之批量 TCR 定序。 在一些實施例中，來自10A之產物可經受該等TCR之批量定序。在一些實施例中，使人類MMRp-CRC腫瘤樣品pt1藉由Milaboratory經受批量TCR定序。在比對及TCR鑑別之後，基於其CDR3胺基酸序列及其V及J鑑別使純系型崩塌。表示α鏈及β鏈二者獨特純系型之數目。結果展示於圖10B中之圖表中。
步驟 10C) TCR 庫之 品質控制。 在一些實施例中，可採用視情況選用之品質控制檢查。在一些實施例中，選擇來自10A)中之腫瘤樣品的100個最普遍α鏈及β鏈且用於創建組合庫。藉由Twist Bioscience使用人類V、CDR3及J區段組裝庫，而恆定(C)區具有鼠類來源。側接可變TCRα及β鏈域之引子對用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序揭開兩個鏈之鑑別。表示10,000 α×β組合中之每一者之表示。結果展示於圖10C中之圖表中，其中在y軸上表示機率密度。
步驟 10D) Jurkat 報導 T 細胞中之庫表現。 在一些實施例中，以上庫可表現於報導T細胞，諸如Jurkat中。將來自10C)之庫轉染至Phoenix細胞中用於病毒產生，且所得病毒上清液用於CD8+ TCR-KO Jurkat報導T細胞之反轉錄病毒轉導。使用殺稻瘟菌素選擇細胞，且使用針對鼠類TCRβ恆定區之抗體測試TCR表現之陽性。結果展示於圖10D之圖表中。
步驟 10E) 篩選之分選策略。 在一些實施例中，可藉由任何方法分選該庫。將來自10D)之Jurkat報導T細胞與表現呈多個串列小型基因(TMG)形式之pt1突變組的B細胞以1:1比率共培養21小時。隨後藉由FACS使用CD69標記物分選細胞用於T細胞活化。分選策略包括(自左至右)依序圈選以選擇淋巴細胞，圈選以選擇單能細胞，圈選以排除CD20+ 細胞，及兩個分選圈選門(「頂部」及「底部」)分別捕獲表現較高及較低CD69之細胞。結果展示於圖10E之圖表中。
步驟 10F) 檢索 TCR 表現盒。 在一些實施例中，吾人可藉由各種技術中之任一者檢索相關TCR表現盒。在一些實施例中，來自10E)之頂部及底部樣品之TCR表現盒(三次重複，且包括在Jurkat報導T細胞與不表現TMG之B細胞的共培養物上之三次對照篩選)使用10C)中所述之PCR策略，隨後條碼PCR來檢索。亦包括質體TCR庫之對照PCR。使用Agilent TapeStation (左)分析PCR產物。以1:1比率合併PCR產物且在TapeStation(右)上分析。結果展示於圖10F中。
步驟 10G) 篩選分析。 在一些實施例中，可以任何若干方式分析來自步驟F之PCR產物池。舉例而言，來自10F)之PCR產物池用於庫製備且使用奈米孔技術定序。還原TCRα及β鏈鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表現之TCR組合。對於在10B)-10F)中所述之pt1腫瘤樣品以及以相同方式處理之三種額外MMRp-CRC樣品(pt2、pt3及pt4)，由在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下篩選的經Rlog轉換的讀段計數表示。新抗原反應性TCR前導描繪為圖10G中的環繞的較大黑點。
步驟 10H) 相關 TMG 之去卷積。 在一些實施例中，相關TMG可以任何數目之方式去卷積。舉例而言，使用表現單TMG構築體之B細胞再篩選(單次重複)在10G)中鑑別之新抗原反應性TCR。作為一實例，表示用於pt1樣品之解多重篩選。pt1 TCR前導鑑別pt1-TMG1但不鑑別pt1-TMG2。結果展示於圖10H中之曲線中。
步驟 10I) 鑑別 pt1 TCR 前導抗原。 可以多種方式鑑別TCR前導抗原(例如pt1)。舉例而言，藉由使B細胞負載以pt1-TMG1表示之單小型基因之肽來鑑別由pt1 TCR前導鑑別之新抗原。作為陽性對照，使用表現pt1-TMG1之B細胞。使APC與Jurkat報導T細胞共培養，該等Jurkat報導T細胞表現10G)中所鑑別之pt1新抗原反應性TCR前導。相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)，量測CD69陽性之活化。圖10I展示了藉由對照(PARVA-P70R)以及AKAP8L-R191W肽進行之活化。
步驟 10J) 鑑別 pt3 TCR 前導抗原。 可以多種方式鑑別TCR前導抗原(例如pt3)。舉例而言，藉由使B細胞負載以pt3-TMG1表示之單小型基因之肽來鑑別由pt3 TCR前導鑑別之新抗原。作為陽性對照，使用表現pt3-TMG1之B細胞。使APC與Jurkat報導T細胞共培養，該等Jurkat報導T細胞表現10G)中所鑑別之pt3新抗原反應性TCR前導。相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)，量測CD69陽性之活化。圖10J展示了藉由對照(ETS1-P70R)以及TP53-R282W肽進行之活化。
步驟 10K) 鑑別 pt4 TCR 前導抗原。 可以多種方式鑑別TCR前導抗原(例如pt4)。舉例而言，藉由在B細胞中表現小型基因(MG91，其編碼HSPA9-p.K654RfsX42)來鑑別由第一pt4 TCR前導鑑別之新抗原。作為陽性對照，使用表現pt4-TMG3之B細胞。使APC與Jurkat報導T細胞共培養，該等Jurkat報導T細胞表現10G)中所鑑別之第一pt4新抗原反應性TCR前導。相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)，量測CD69陽性之活化。圖10K展示了藉由對照(不表現MG或TMG之B細胞)以及MG91/TMG3樣品進行之活化。
步驟 10L) 鑑別第二 pt4 TCR 前導抗原。 可以多種方式鑑別第二TCR前導抗原(例如pt4)。舉例而言，藉由在B細胞中表現小型基因(MG132，其編碼ITPR3-p.L2379M)來鑑別由第二pt4 TCR前導鑑別之新抗原。作為陽性對照，使用表現pt4-TMG4之B細胞。使APC與Jurkat報導T細胞共培養，該等Jurkat報導T細胞表現10G)中所鑑別之第二pt4新抗原反應性TCR前導。相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)，量測CD69陽性之活化。圖10L展示了藉由對照(不表現MG或TMG之B細胞)以及MG132/TMG4樣品進行之活化。
一些其他實施例描繪在12A-12C中：自黑素瘤中還原TCR組庫以產生TCRαβ庫。圖12A描繪浸潤性淋巴細胞在人類黑色素瘤樣品中之批量TCR定序。兩個人類腫瘤樣品(pt5及pt6)藉由Milaboratory (莫斯科/俄羅斯)經受批量TCR定序。在比對及TCR鑑別之後，基於其CDR3胺基酸序列及其V及J鑑別使純系型崩塌。表示各腫瘤樣品之α及β鏈二者獨特純系型之數目。在圖12B中，描繪100×100庫之品質控制。選擇來自A)中之腫瘤樣品的100個最普遍α鏈及β鏈且用於創建組合庫。合成B)中之TCRβ及TCRα區域且以由Twist Bioscience執行之組合選殖方法插入圖11B中表示之反轉錄病毒構築體中。側接可變TCRα及β鏈域之引子對用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序鑑別兩個鏈之鑑別。表示每個患者庫的10,000 α×β組合中之每一者之表示。在圖12C中，提供患者庫之TCR表示之特徵。對於12B)中之各患者庫，表示每TCR之讀段量、平均覆蓋度及處於中值+/-2 log-單位範圍內的TCR之百分比的範圍。
一些其他實施例提供於圖13A-13E中(作為一些實施例之步驟)。圖13 (A-E)展示自藉由質體之人工混合產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。在步驟13A)中，藉由TCR質體之人工混合產生庫。藉由質體之人工混合產生TCR庫。將分別表現單一經表徵TCR之六個質體混合至11個分別表現單一未經表徵卵巢癌(OVC) TCR之質體池及13個質粒表現單一未經表徵結腸直腸癌(CRC) TCR之質體池。將經表徵TCR、CMV1及CDK4-8 TCR質體以1:10.000莫耳比混合至此池中且將CMV2、CDK4-17、GCN1L1及NY-ESO 1G4 TCR質體以1:100.000莫耳比混合至此池中。該等頻率展示於圖13A中。在步驟13B)中，Jurkat報導T細胞中之庫表現。在一些實施例中，來自步驟13A)之TCR之混合可表現於報導T細胞，諸如Jurkat中。將來自13A)之TCR質體池轉染至Phoenix細胞中用於病毒產生，且所得病毒上清液用於TCR-KO Jurkat報導T細胞之反轉錄病毒轉導。使用嘌呤黴素選擇細胞，且使用針對鼠類TCRβ恆定區之抗體測試TCR表現之陽性。結果展示於圖13B之圖表中。在步驟13C)中，提供用於篩選之分選策略。在一些實施例中，可藉由任何方法分選該庫。將來自步驟13B)之Jurkat報導T細胞與表現呈多個串列小型基因(TMG)形式之經表徵TCR的同源抗原中之每一者的B細胞以1:1比率共培養21小時。隨後藉由FACS使用CD69標記物分選細胞用於T細胞活化。分選策略包括(自左至右)依序圈選以選擇淋巴細胞，圈選以選擇單能細胞，圈選以排除CD20+ 細胞，及兩個分選圈選門(「頂部」及「底部」)分別捕獲表現較高及較低CD69之細胞。結果展示於圖13C之圖表中。
在步驟13D中，提供關於TCR表現盒之資訊。在一些實施例中，吾人可藉由各種技術中之任一者檢索相關TCR表現盒。在一些實施例中，來自步驟13C)之頂部及底部樣品之TCR表現盒(一種重複使用表現TMG之B細胞篩選及一種重複使用不表現外源性抗原之B細胞篩選)使用10C)中所述之PCR策略，接著條碼PCR來檢索。亦包括質體TCR庫之對照PCR。使用Agilent TapeStation分析第二輪PCR之後的PCR產物。結果展示於圖13D中。
在步驟13E中，提供篩選資料之分析。在一些實施例中，可以任何若干方式分析來自步驟13D)之PCR產物池。舉例而言，來自13D)之PCR產物池用於庫製備且使用奈米孔技術定序。還原TCRα及β鏈鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表現之TCRα×β鏈組合。相對於經量測TCR之頻率(x軸)，表示頂部樣品相對於底部樣品之標準化讀段計數之間的經log2轉換比率(y軸)。在13E圖中，經表徵(抗原特異性)TCR以灰色表示，而未經表徵(非相關)TCR以黑色表示。
額外實施例展示於圖14中，其展示自藉由基因合成產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。在步驟14A (圖14A)中，提供篩選設計之示意圖。使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及45或95個未經表徵TCR分別創建50×50及100×100個設計之組合TCR庫。藉由Twist Bioscience使用人類V、CDR3及J區段組裝庫，而恆定I區具有鼠類來源。該庫用於Jurkat報導T細胞之反轉錄病毒轉導。多株報導T細胞與經工程改造而以各種方式呈現本發明抗原之抗原呈現細胞(APC)共培養。APC包括負載有肽之JY細胞、分別表現不同小型基因之混合物、表現TMG之EBV-LCL細胞及尚未經工程改造以呈現本發明特異性抗原之EBV-LCL。
在步驟14B中，提供用於篩選之分選策略。將表現如14A)中所概述產生的50×50個設計TCR庫之Jurkat報導T細胞以1:1比率與14A)中所提及之APC共培養21小時。隨後藉由FACS使用CD69標記物分選細胞用於T細胞活化。在一些實施例中，可藉由任何方法分選該庫。分選策略包括(自左至右)依序圈選以選擇淋巴細胞，圈選以選擇單能細胞，圈選以選擇活細胞，圈選以排除CD20+ 細胞，及兩個分選圈選門(「頂部」及「底部」)分別捕獲表現較高及較低CD69之細胞。結果展示於圖14B之圖表中。
步驟14C (圖14C)展示TCR表現盒之檢索。在一些實施例中，吾人可藉由各種技術中之任一者檢索相關TCR表現盒。在一些實施例中，來自圖14B)之頂部及底部樣品之TCR表現盒使用10C)中所述之PCR策略，接著條碼PCR來檢索。亦包括質體TCR庫之對照PCR。使用Agilent TapeStation分析第二輪PCR之後的PCR產物。結果展示於圖14C中。
步驟14D)展示50×50篩選資料之分析。在一些實施例中，可以任何若干方式分析來自步驟14C)之PCR產物池。舉例而言，來自14C)之PCR產物池用於庫製備且使用奈米孔技術定序。還原TCRα及β鏈鑑別且對於每一TCR，頂部樣品及底部樣品中之TCR表示之間的變化倍數(y軸)表示為TCR之平均表示(x軸)的函數。
步驟14E)展示前10個最顯著富集TCR之特性。使用DESeq2 R套裝軟體鑑別來自14D)之資料的差異性表示之TCRα×β鏈組合。差異性表示分析為熟習此項技術者已知，且基於線性模型，其假定富集的TCR定義為在表現抗原之「頂部」樣品中富集且在表示抗原之「底部」樣品中耗乏，相對於未呈現抗原之「頂部」及「底部」樣品兩者。前10個最顯著命中之α及β鏈以及其表示、其經log2轉換變化倍數及差異性表示之顯著性列表於圖14E中。
步驟14F)展示100×100篩選資料之分析。類似於14)-14E)中所述之50×50庫篩選100×100庫。TCRα及β鏈鑑別之後，使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表現之TCR組合。差異性表示分析為熟習此項技術者所已知。由在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下之100×100庫篩選的經Rlog轉換的讀段計數表示於圖14F中。5個摻入有表徵TCR描繪為環繞的較大黑點。
步驟14G展示經表徵TCR之排名次序。如14E)中所述進行統計分析之100×100庫中表示的所有TCR組合之富集顯著性之排名次序。使用DESeq2 R套裝軟體計算Wald統計值且將其表示為具有減小的Wald統計值(機率量測；y軸)之排序曲線。以灰色色度表示摻入有表徵TCR。插圖：前20個最統計學上顯著富集之TCR的放大。
圖15A-15D描繪使用基因合成創建TCR組庫之一些實施例。在步驟15A)中(圖15A)提供TCR庫之示意性佈局。含有β及α TCR鏈以及嘌呤黴素選擇標記物之反轉錄病毒構築體用作用於創建庫之架構。α及β TCR鏈之可變區(V-CDR3-J)分別合成為100個寡核苷酸池之池。隨後，在組合選殖反應中使用α及β鏈池，得到庫之總複雜度為10,000。TCR鏈合成及組合選殖均藉由Twist Bioscience (San Francisco/USA)進行。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於2A位點處之肽裂解，其引起TCRα及β鏈之轉譯以及puro抗性標記物。
在步驟15B)中，提供100α及100β鏈之組合TCR庫之品質控制。側接可變TCRα及β鏈域之引子對用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序鑑別兩個鏈之鑑別。表示100個α鏈(左側曲線)、100個β鏈(中間曲線)或10,000個α×β組合中之每一者之表示。
在步驟15C中，存在創建來自複雜性較低之多個庫的複雜性較高庫。此示意圖描繪創建來自複雜性較低之多個庫的複雜性較高庫之想法。在一些實施例中，複雜性較低之庫不含α鏈與β鏈之任何可能重疊組合。在一些其他實施例中，複雜性較低之庫不含α鏈與β鏈之可能的重疊組合。在此實例中，藉由以等莫耳比率混合四個100×100庫來創建200α及200β鏈之組合庫(200×200庫)。在此實例中，四種子庫作為以下之組合庫產生：i) TCRα編號1至100及TCRβ編號1至100；ii) TCRα編號101至200及TCRβ編號1至100；iii) TCRα編號1至100及TCRβ編號101至200；及iv) TCRα編號101至200及TCRβ編號101至200。在一些實施例中，庫之複雜性可在50×50至2000×2000之間變化。
步驟15D) (如圖15D描繪)藉由基於配對資訊或配對可能性之設計減少TCR庫。此示意圖描繪減小TCR庫之複雜性，而不影響或對存在於庫中之抗原特異性TCR鏈對之數目具有有限影響的想法。作為一實例，可藉由等莫耳混合10×10個設計之10個組合子庫來減小100×100庫之10,000的複雜性。此導致10倍的TCR庫複雜性降低。關於TCRα鏈與β鏈之配對資訊或α鏈與β鏈之間的配對可能性資訊可包括於此庫之設計中，其方式為使得以實驗方式鑑別或以其他方式已知之TCRα-β對之所有α及β鏈或可能配對之彼等TCRα-β在單一組合子庫內表示。在一些實施例中，此原理可應用於較高或較低複雜性之複合庫。在一些實施例中，組合子庫之複雜性可能較高或較低。在一些實施例中，組合子庫可含有重疊的TCR鏈組合。在一些實施例中，複合庫之範圍可為100 (10×10)至90,000 (300×300)。在一些實施例中，子庫之尺寸範圍可為1 (1×1)至100 (50×50)。
其他實施例展示於圖16A-16E中，提供用於鑑別來自TCR組庫之TCRα/β對的共培養條件。
圖16A)描繪使用CD69作為活化Jurkat細胞之選擇標記物的結果。用CMV#1 TCR轉導表現hCD8之Jurkat細胞，其轉導效率為21%。在37℃下用不同量之CMVpp65 肽(如在0-10ug/ml範圍內所指示)或用1 ug/ml MART-1不相關肽(IRR)脈衝JY細胞1小時。在1小時之後，洗滌細胞且在37℃下將1×105 個細胞與1×105 個經轉導的Jurkat細胞/孔共培養於U形底96孔板中20小時。收穫細胞，用抗人類CD69(純系：FN50)染色且藉由FACS分析。
圖16B)描繪取決於接種密度之CD69的背景表現。將表現hCD8及CMV#1 TCR的Jurkat細胞在不同密度下(0.25×106 /ml、0.5×106 /ml及1×106 /ml)培養2天。收穫細胞，用抗人類CD69(純系：FN50)染色且藉由FACS分析。
圖16C描繪在不同培養容器中且在各種效應與目標比率下經活化Jurkat細胞之CD69表現。將表現hCD8及TCR庫之Jurkat細胞(由4種經表徵抗原特異性TCR之α及β鏈組成之4×4組合庫)與表現同源小型基因(TMG2.1)，同時維持每0.32 CM2 培養面積2.5×105 個效應細胞之目標B細胞共培養。使用1:1或1:2效應與目標細胞比率在U形底96孔板中培養細胞。或者，細胞在T25培養燒瓶中以另外用於此表面區域之細胞總量的1/3或1/2，同時維持效應與目標細胞之1:1比率培養。另外，在T75培養燒瓶中以1:2及3:1效應與目標細胞比率培養細胞。培育20小時之後，收穫細胞，用抗人類CD69(純系：FN50)染色且藉由FACS進行分析。
圖16D描繪在各種共培養密度下之CD69表現。在U形底96孔板中以1:1比率將表現hCD8與CDK4-17或CDK4-8 TCR之Jurkat細胞與用指定量之CDK423-32(24L) 肽或用無關MART-126-35(27L) 肽脈衝之JY細胞共培養。效應細胞之接種密度為每孔125×103 、250×103 或500×103 。20小時之後，收穫細胞，用抗人類CD69(純系：FN50)染色且藉由FACS進行分析。
圖16E描繪使用CD69作為遺傳篩選中之T細胞活化的標記物以鑑別反應性TCR。將相等比率之表現具有未知特異性之TCR的Jurkat hCD8+細胞池與在指定頻率下表現CDK4-17、CDK4-8、CMV#1、CMV#2或GCN1L1 TCR之Jurkat hCD8+細胞混合。此細胞混合物與表現所有同源小型基因之目標B細胞共培養。在20小時之後，收穫細胞，用抗人類CD69(純系：FN50)染色且分別分選為表現較高及較低CD69量之「頂部」及「底部」細胞群體。此等樣品中之每一者含有約10%之所分選細胞總量。檢索來自此等細胞之基因體DNA，且藉由PCR擴增TCRB可變域。使樣品經受Illumina定序，且將所得讀段定位於參考TCRB序列上。富集倍數計算為頂部樣品相對於底部樣品中讀段之標準化數目。
額外實施例展示於圖17-27中。
圖17及圖27描述使用CD69來偵測抗原活化T細胞。瞭解CD69表現模式允許在T細胞受體(TCR)庫篩選中偵測及選擇活化T細胞。
圖18、圖25a及25b及圖26描述使用殺稻瘟菌素選擇經TCR基因轉導之Jurkat報導T細胞，藉此在引入TCR庫之後提供報導T細胞之有效選擇。
圖19描述在TCR庫篩選方法期間允許刺激經TCR庫轉導之大量報導T細胞的細胞培養袋中之Jurkat報導T細胞刺激。使用較大細胞數目可藉由維持足夠的覆蓋度來提高TCR庫篩選之敏感性。
圖20描述經不同TCR轉導之Jurkat報導T細胞上CD69、CD25及CD62L表現之縱向分析。理解表現標記物之縱向表現允許選擇單個(或多個)活化標記物以特異性偵測抗原活化T細胞且例如藉由磁性珠粒富集進行雙步驟選擇程序。
圖21至圖24描述使用不同NFAT報導系統用於偵測抗原活化T細胞，其提供對NFAT報導基因盒之設計、遞送類型及其基因體插入位點控制報導基因之抗原非依賴性背景表現之功能性及程度的理解。資料表明不同病毒遞送載體、純系報導T細胞群體、不同報導T細胞或不同報導系統可產生更佳報導功能。
在一些實施例中，該方法可包括下文所述之步驟(1)-(7)(且下文圖31)。步驟(1)得到樣品。該樣品可為來自患有感染性疾病、自體免疫疾病或癌症之患者的組織、血液或體液。該樣品可為活性的或無活性的。步驟(2)對該樣品之TCR-α及β鏈定序。步驟(3)選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫。步驟(4)將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池，例如Jurkat報導T細胞。步驟(5)用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞。至少一種所關注抗原可為自體或同種異體的。步驟(6)確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對。步驟(7)將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。
在一些實施例中，該方法可涉及上文所述之步驟(1)至(7)中之一或多者。該等步驟中之任一者可視需要經本文所提供之其他實施例省略、重複或取代。亦可添加額外中間步驟。舉例而言，一些實施例包括步驟(2)及步驟(3)。其他實施例包括步驟(5)及步驟(6)。其他包括步驟(7)。一些實施例包括步驟(1)-(7)，且進一步包括將含有TCRαβ對之細胞投與至患者中用於治療。在一些實施例中，可藉由將新抗原庫引入B細胞中得到抗原呈現細胞。新抗原庫可為自體或同種異體的。一些實施例係關於藉由選擇TCR鏈子集來創建TCR組庫。一些實施例係關於一種B細胞，其包含來自新抗原庫之任何新抗原。一些實施例係關於基於富集/耗乏之遺傳篩選的應用。一些實施例係關於使用較大尺寸擴增子進行遺傳篩選。一些實施例係關於一種偵測經TCR修飾之T細胞的方法。一些實施例組合前述實施例中之更多者中之任一者。
一些實施例係關於一種核苷酸庫，其包含根據以上實施例中之任一者還原的T細胞受體之組庫。
在一些實施例中，一種核苷酸構築體，其包含根據以上實施例中之任一者鑑別的該核苷酸序列。在一些實施例中，一種細胞，其包含本文所述之核苷酸構築體。
一些實施例係根據圖28。在一些實施例中，新抗原特異性TCR鑑別藉由應用可調式及最小侵入性之遺傳篩選方法來達成。使用少量無活性存檔腫瘤組織作為瘤內TCR序列而非TIL之來源。隨後，反轉錄病毒基因轉移用於將瘤內TCR之鑑別庫引入永生化T淋巴細胞細胞株中，稱為Jurkat報導T細胞株。富含表現TCR庫之Jurkat細胞(效應細胞，簡稱為E)且隨後篩選其針對突變表現患者衍生之APC (目標細胞，簡稱為T)之反應性。在流式細胞測量術分選之後，基於其早期T細胞活化標記物CD69之表現選擇Jurkat細胞(作為一實例)，該早期T細胞活化標記物涉及細胞增殖及下游信號傳導32 。在一些實施例中，樣品可基於任何其他活化標記物分離，該活化標記物包括(但不限於) CD25、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF合成啟動子報導標記物或增殖標記物。作為最終步驟，藉由下一代定序鑑別新抗原特異性TCR。當前TCR分離平台提供10,000種TCR庫之篩選。為了能夠鑑別來自此類庫之具有較高敏感性之新抗原特異性TCR且確保在不同處理步驟期間未損失TCR，各獨特TCR必須在篩選方法期間表示多次以維持TCR覆蓋度。因此，必須篩選33 大量經TCR轉導的Jurkat細胞及APC。
在將反轉錄病毒TCR庫轉導至Jurkat TCR KO細胞之後，高效且高通量選擇程序適用於富集成功地經TCR轉導之Jurkat細胞(＞80% mTCRβ+ CD8+ 細胞)，而不導致毒性及損失TCR覆蓋度。在一些實施例中，96孔圓底板可用於APC-Jurkat共培養物。在一些實施例中，GMP袋可用於APC-Jurkat共培養物。在一些實施例中，共培養可在封閉系統中進行。在一些實施例中，與168×106 個Jurkat細胞及APC之共培養物可設置於GMP袋中。在一些實施例中，共培養可為16、20、24、48或32小時。在一些實施例中，讀出可關於CD69、CD25或CD62L。在一些實施例中，讀出可為CD69與CD25之組合。在一些實施例中，讀出可為CD69與CD62L之組合。一些實施例係關於選擇與CD69組合之CD25+ CD62L- Jurkat細胞。在一些實施例中，可採用GMP袋。
抗生素選擇為富集經TCR轉導的Jurkat T細胞之有吸引力的策略。在一些實施例中，可使用殺稻瘟菌素選擇。一些實施例係根據圖30。在一些實施例中，在選擇第4天，細胞在具有或不具有對應濃度之殺稻瘟菌素之培養基中以其起始密度再接種。在一些實施例中，殺稻瘟菌素之濃度為4 ug/ml。一些實施例為7日選擇，起始細胞密度為0.25×106 個細胞/毫升，殺稻瘟菌素濃度為4 ug/ml，在第4天移除抗生素。在一些實施例中，吾人可在0.5 e6/ml下培養細胞且添加6 ug/mL殺稻瘟菌素且在第4天以0.5e6/ml再接種細胞而不添加殺稻瘟菌素。
在一些實施例中，報導系統可為AP-1或NFkB信號傳導路徑。
一些實施例係根據圖29。在一些實施例中，一個目標為擴大庫中之TCR數目以允許超過10,000種TCR之較高敏感性篩選。此強調藉由最佳化各種方法步驟以允許大量細胞之更高效處理同時仍維持TCR覆蓋度來增強TCR探索平台之可擴展性的需要。在一些實施例中，使用四種已知的HLA-A*02:01-限制型TCR，CDK4 TCR純系8及17 (簡稱為CDK4-8及17)及CMV TCR純系1及2 (簡稱為CMV-1及2)。兩個CDK4 TCR對突變型細胞週期素依賴性激酶4 (CDK4R24C )肽具有特異性。在多發性黑色素瘤患者34 中鑑別此突變衍生之新抗原抗原決定基。此外，兩個CMV TCR靶向由人類巨細胞病毒(CMV)之組分，pp6535 編碼的肽。對於CDK4與CMV抗原決定基，使用兩個在研究中具有潛在不同親和力之不同TCR純系。此允許吾人評估同源肽之TCR親和力對篩選方法之作用。其他實施例 - 實例 19 之結果
TCR基因療法涉及工程改造自體T細胞以表現對癌症抗原具有所需特異性之TCR。一類癌症抗原為非同義體細胞突變衍生之新抗原，其僅在惡性細胞上表現且因此為TCR基因療法之有吸引力的目標。然而，大部分新抗原對既定患者之腫瘤而言為獨特的且靶向其使個人化方法成為必要。為克服此挑戰，藉由併入用以鑑別來自患者之TCR基因庫的此類TCR之遺傳篩選方法來提供完全個人化新抗原特異性基因療法，該等TCR基因為自腫瘤切片分離之TCR基因。當前TCR分離平台允許篩選10,000個TCR，該等TCR涉及處理大量經TCR庫轉導的報導Jurkat T細胞及新抗原表現抗原呈現細胞(APC)以使篩選敏感性最大化。然而，大量細胞之處置可影響平台之可擴展性。因此，此研究旨在增強篩選平台之可擴展性，同時藉由檢查用於處理較大細胞數目之替代方法維持其敏感性。首先，表明殺稻瘟菌素選擇引起表現TCR之Jurkat細胞的高效且最低毒性富集。隨後，將來自所建立96孔板型式之Jurkat細胞與APC共培養物擴大至更高通量之MACS GMP細胞分化袋設置產生類似的Jurkat細胞活化。此外，不同方法用以檢查用更可調式基於珠粒之選擇替換當前用於篩選過程中之流式細胞測量術分選。因此，除CD69之外，檢測兩個額外T細胞活化標記物CD25及CD62L之表現概況，且發現用於雙步驟基於珠粒之富集與CD69之組合的潛在適合候選物。另外，評估基於NFAT (活化T細胞之核因子家族)之報導系統，其將藉由利用適用於基於珠粒之選擇的報導基因(諸如抗生素抗性盒)或細胞表面標記物來避開流式細胞術分選之使用。然而，NFAT報導系統呈現出較高含量之背景信號。
在腫瘤細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)內主要負責腫瘤消退1 。T細胞表現獨特T細胞受體(TCR)，其為由α及β鏈組成之雜二聚體。各α鏈與β鏈由恆定及可變區組成2 。可變區賦予在其主要組織相容複合物(MHC)上既定T細胞對由抗原呈現細胞(APC)呈現之同源肽的特異性及親和力。MHC分子亦稱為人類之人類白血球抗原(HLA)2 、 3 。CD8/CD4及CD28為使TCR-HLA複合物穩定且與CD3ζ一起起始下游信號傳導之T細胞輔受體的實例，該信號傳導涉及蛋白質酪胺酸磷酸化及細胞質鈣釋放。此下游信號傳導誘導轉錄因子NFAT之核移位(活化T細胞之核因子家族)、AP-1及NF-κB，及對T細胞活化具有特異性之基因的後續轉錄4 、 5 。經活化CD8+ T細胞能夠藉由產生多種發炎性細胞激素，諸如介白素-2 (IL-2)、IFN-γ及TNF-α來殺死表現病毒、細菌或癌症抗原之目標細胞。分泌型IL-2結合至T細胞上之IL-2受體，藉由刺激產生更多IL-2且增強T細胞之增殖來產生正反饋迴路5 、 6 。
迄今為止，已表明癌症免疫療法為治療晚期腫瘤之最高效方法中之一者。許多免疫療法方法採用細胞毒性T細胞之殺死特性7 、 8 。一個實例為免疫檢查點分子CTLA-4及PD-1之阻斷，其抑制腫瘤微環境中CD8+ T細胞之細胞毒性活性9 、 10 。檢查點阻斷為已在具有高速率非同義突變11 (諸如黑色素瘤12 、 13 及非小細胞肺癌(NSCLC)14 、 15 )之癌症中最高效的可調式常規投與療法。此外，活體外擴增且補充有IL-2之自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼細胞轉移已表明黑色素瘤16 、 17 及子宮頸癌18 、 19 之治癒性潛力。然而，腫瘤抗原特異性TIL為經常終端分化之T細胞且可能在活體外擴增過程期間出現半衰期縮短及損失7 、 20 。
上文提及之免疫療法中無一者鑑別腫瘤消退中涉及之腫瘤抗原反應性TCR。偵測彼等TCR適用於對具有針對腫瘤抗原之TCR的T細胞進行遺傳工程改造。此類療法稱為TCR基因療法且提供優於其他免疫治療策略之優點，因為其允許產生具有所需抗原決定基21 之多種「裝配」T細胞。腫瘤抗原可為非自身抗原或自身抗原7 、 21 。自身抗原已為癌症疫苗試驗之主要焦點，但可能歸因於針對自身抗原之中部耐受性，彼等試驗已無效果22 。然而，靶向異常表現之自身抗原的一些TCR基因療法試驗已展現出臨床功效。舉例而言，對患有滑膜細胞肉瘤及黑素瘤之患者的癌症生殖系NY-ESO-1抗原決定基的靶向展現出治癒性潛力23 。然而，靶向腫瘤相關之自身抗原亦經常引起嚴重的目標毒性24 、 25 ，其潛在地需要靶向非自身抗原之免疫療法。一種類型為突變衍生之新抗原7 、 8 、 21 。
新抗原由非同義體細胞突變產生且導致在健康組織中不存在之新穎多肽的產生。此使得免疫療法之新抗原適用的目標在健康組織中完全不存在將防止目標毒性。另外，新抗原特異性T細胞之發現將不受針對較高親和力自身抗原反應性T細胞之中心耐受性影響。新抗原主要自不賦予惡性細胞任何存活優勢之隨從基因的突變出現。此等突變對於各患者通常為獨特的且因此新抗原之靶向需要涉及基因體定序方法之個人化處理8 、 26 。
在近期研發之全外顯子組定序(WES)及RNA定序之情況下，在TIL中發現新生抗原反應性T細胞且其可介導腫瘤消退變得顯而易見27 、 28 。舉例而言，與高度特異性及敏感性肽-MHC (pMHC)多聚體29 偶合之WES已引起黑素瘤患者13 、 30 之來自TIL物質之新抗原特異性T細胞的鑑別。儘管此方法為可調式的，但其依賴於有限HLA等位基因覆蓋度且需要算法來預測pMHC結合。此等限制可能導致忽視掉一些新抗原反應性TCR。為了避開pMHC多聚體之限制，研究已使用質譜分析來鑑別結合MHC之新抗原。將此方法與作為參考之WES及轉錄組定序組合已導致鼠類腫瘤細胞株31 中之新抗原的發現。然而，此設置為較低通量且頻繁地產生錯誤陰性8 。儘管有可能使用以上提及之方法同時鑑別多種新抗原特異性TCR，但仍需要用於發現此類TCR之更可調式且敏感的平台。
新抗原特異性TCR鑑別藉由應用可調式及最小侵入性之遺傳篩選方法來達成。使用少量無活性存檔腫瘤組織作為瘤內TCR序列而非TIL之來源。隨後，反轉錄病毒基因轉移用於將瘤內TCR之鑑別庫引入永生化T淋巴細胞細胞株中，稱為Jurkat報導T細胞株。富含表現TCR庫之Jurkat細胞(效應細胞，簡稱為E)且隨後篩選其針對突變表現患者衍生之APC (目標細胞，簡稱為T)之反應性。在流式細胞測量術分選之後，基於其早期T細胞活化標記物CD69之表現選擇Jurkat細胞，該早期T細胞活化標記物涉及細胞增殖及下游信號傳導32 。作為最終步驟，藉由下一代定序鑑別新抗原特異性TCR。在一些實施例中，當前TCR分離平台提供10,000種TCR庫之篩選。與上文一致，實例19提供支持此方法之其他結果及證據。
可以多種方式達成TCR之選擇。變異體富集可使用適合之分析工具確定，包括(但不限於)DESeq2 R套裝軟體。變異體富集可包括頂部-底部配對，其中報導T細胞與表現具有頂部-底部配對之TMG的B細胞接觸，其中報導T細胞與未經工程改造以表現TMG之B細胞接觸。變異體富集可包含按遞減次序基於DESeq2 Wald測試統計對TCR組合排序。變異體富集可包括基於排名較高TCR組合之經邦費羅尼調節的p值確定統計顯著性。至少一種TCR組合之選擇可基於經調節p值及其他統計度量值。在此實例中，程序可以單次重複形式或一式兩份、一式三份或超過三次重複形式執行，以提高TCR反應性之敏感性。對於自與表現TMG之APC共培養物衍生之樣品及對於自與未經工程改造以表現TMG之APC共培養物衍生之樣品，可改變重複之數目。此等選擇方案中之任一者可與本文所提供之方法中之任一者組合。
在以下實例中進一步說明本發明之實施例，該等實施例僅出於說明之目的給出且不意欲以任何方式限制所主張之標的物之範疇。 實例 實例1
此實例描述自無活性腫瘤樣本中還原TCR組庫以鑑別新抗原特異性TCR序列。
自鮮凍或固定或福馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的腫瘤樣本分離DNA或RNA且用於進行批量TCRα鏈及β鏈定序。基於獨特分子之計數使用「獨特分子標識符」(UMI)確定編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)的核酸分子之絕對數。在替代方案中，TCRα鏈及β鏈定序中不包括UMI，且基於下一代定序讀段計數而非UMI計數量測TCR鏈之頻率。藉由應用諸如瘤內TCR鏈豐度之準則，例如TCRα鏈及β鏈之定義組選自經鑑別TCR序列之總組。隨後，藉由DNA或RNA合成分別產生經選擇TCRα鏈及β鏈之DNA或RNA片段。可藉由標準技術使RNA片段轉化成cDNA。經由將所有經選擇TCRα鏈及β鏈組合成編碼TCRαβ基因之單一表現構築體，重建瘤內TCRαβ對之原始組庫的經定義部分。可使用單一表現構築體表現單一TCRα及TCRβ鏈之既定組合。或者，TCRα及TCRβ鏈可由單獨的表現構築體表現。可使用任何適合之表現載體，包括病毒載體。為了穩定表現，使用反轉錄病毒或慢病毒載體或粒子。TCRαβ基因之所得庫表現於報導T細胞池中。藉由新抗原刺激活化表現庫之T細胞，且新抗原特異性T細胞基於T細胞活化標記物富集。隨後，藉由經抗原刺激之樣品相對於未經抗原刺激之樣品的富集，鑑別經表現新抗原特異性TCRαβ基因。經鑑別TCR基因或TCR基因組用於工程改造新抗原特異性T細胞以用於癌症療法。 實例2
此實例描述還原TCR組庫用於產生TCRαβ庫。
自鮮凍或固定或福馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的樣本分離DNA或RNA且用於進行批量TCRα鏈及β鏈定序。基於獨特分子之計數使用「獨特分子標識符」(UMI)確定編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)的核酸分子之絕對數。藉由應用諸如TCR鏈豐度之準則，例如TCRα鏈及β鏈之定義組選自經鑑別TCR序列之總組。隨後，藉由DNA或RNA合成分別產生經選擇TCRα鏈及β鏈之DNA或RNA片段。可藉由標準技術使RNA片段轉化成cDNA。經由使所有經選擇TCRα鏈及β鏈組合配對成TCRαβ基因，重建TCRαβ對之原始組庫的經定義部分。配對TCRα及TCRβ鏈表示包含經選擇TCR組庫之TCRαβ庫。 實例3
此實例描述利用所還原TCR組庫庫用免疫療法治療癌症患者。
還原TCR組庫且藉由實例1及2中所概述之方法產生TCRαβ庫。TCRαβ基因庫表現於報導T細胞池中。新抗原特異性T細胞藉由抗原刺激活化且基於T細胞活化來分離。隨後，鑑別經表現新抗原特異性TCRαβ基因。經鑑別TCR基因或TCR基因之組用於藉由在T細胞中表現TCR基因來工程改造新抗原特異性T細胞用於癌症療法。將經工程改造新抗原特異性T細胞作為免疫療法輸注至癌症患者中以治療癌症。癌症患者可為定序其TCRαβ組庫之患者或具有或表現相同新抗原之癌症的患者。用於療法之細胞可為自體或同種異體的。 實例4
此實例描述自感染或自體免疫位點還原TCR組庫。
自鮮凍或固定或福馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的樣本(獲自感染或自體免疫位點)分離DNA或RNA且用於進行批量TCRα鏈及β鏈定序。藉由應用諸如TCR鏈豐度之準則，例如TCRα鏈及β鏈之定義組選自經鑑別TCR序列之總組。隨後，藉由DNA或RNA合成分別產生經選擇TCRα鏈及β鏈之DNA或RNA片段。可藉由標準技術使RNA片段轉化成cDNA。經由使所有經選擇TCRα鏈及β鏈組合配對成TCRαβ基因，重新創建TCRαβ對之原始組庫的經定義部分。藉由確定可在感染或自體免疫位點處偵測特定抗原之T細胞的TCR序列，可還原與感染或自體免疫位點相關或對感染或自體免疫位點具有特異性之TCR組庫。
TCRαβ基因之所得庫表現於報導T細胞池中。抗原特異性T細胞藉由抗原刺激活化且基於T細胞活化來分離。隨後，鑑別經表現抗原特異性TCRαβ基因。經鑑別TCR基因或TCR基因之組用於診斷或治療感染或自體免疫。 實例5
此實例描述自藉由TCR質體之人工混合產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。
以TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性之型式產生TCR表現盒(圖6展示TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性盒之示意性實例；以此類型式表現之TCR的實例給出SEQ ID NO: 1，圖32、圖40)。藉由以若干比率混合一種新抗原特異性TCR與各種非相關TCR來產生多個TCR庫。所得TCR庫以1:10、1:100、1:1,000及1:10,000之頻率含有一個HLA-A*02:01限制型新抗原特異性TCR。為了創建在1:10之頻率下含有新抗原特異性TCR之TCR庫，將編碼反轉錄病毒表現載體中之新抗原特異性TCR的一個質體複本與九個其他反轉錄病毒載體中之每一者的一個質體複本混合，該等其他反轉錄病毒載體各自編碼其他特異性之不同TCR。因此，將編碼反轉錄病毒表現載體中之新抗原特異性TCR的一個質體複本與九個其他反轉錄病毒載體中之每一者的1、11、111及1,111個質體複本混合，該等其他反轉錄病毒載體各自編碼其他特異性之不同TCR，得到分別在1:10、1:100、1:1,000及1:10,000之頻率下含有新抗原特異性TCR之TCR庫。
在一些實施例中，可採用任何一或多種編碼SEQ ID NO: 1之核酸。在一些實施例中，吾人可藉由在5種經表徵TCR中混合且在1:16、1:100、1:2500及1:10,000頻率下改變以上。最後，可使用24種而非9種其他TCR質體用於混合。
藉由熟習此項技術者已知之方法將各TCR庫分別轉染於諸如Phoenix-Ampho (ATCC CRL-3213)之雙嗜性病毒生產細胞中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞株缺乏內源性TCR表現(例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。使用較低MOI用個別TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，以便將經TCR轉導的Jurkat T細胞之頻率限制於總T細胞之25%至30%。藉由在轉導之後向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
在一些實施例中，可採用任何一或多種編碼SEQ ID NO: 2 (圖33)之核酸。圖41描繪SEQ ID NO: 2，CD8α-P2A-CD8β轉殖基因之圖式。
一般熟習此項技術者將進一步瞭解，本文所述之方法可包括在無嘌呤黴素之情況下選擇，諸如藉由FACS或基於磁性珠粒之選擇分選經TCR轉導的細胞。因此，TCR盒可能缺乏嘌呤黴素選擇基因。
經TCR轉導的Jurkat T細胞用表現重組HLA-A*02:01-IRES-FusionRed轉殖基因(K562-HLA-A*02:01-IRES-FusionRed；SEQ ID NO: 3；圖34、圖42)之負載抗原的K562細胞刺激。已描述表現轉殖基因之K562細胞的產生(例如Hirano等人Clin Canc Res 2006；Butler等人Int Immunol 2010；Butler等人Clin Canc Res 2007；Lorenz等人Hum Gene Ther 2017)且為熟習此項技術者已知。藉由在37℃下用所關注肽脈衝90分鐘且隨後洗滌得到負載肽的K562-HLA-A2細胞。熟習此項技術者應瞭解，本文所提及的呈現肽之HLA-A*02:01陽性K562細胞株可經其他HLA-A*02:01陽性抗原呈現細胞取代。在替代方案中，可使用變異體(在經HLA-A02*01轉導的K562細胞中之表現)。
以下刺激條件將分別用於各TCR庫： 1.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 2.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽
隨後，收穫共培養物且對CD4、CD8及CD69用螢光標記的抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件： 1.  活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69hi (CD69hi 包括最高5-50%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於CD69螢光信號) 2.  活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69lo (CD69lo 包括5-50%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於較低CD69螢光信號)
或者，以下刺激條件可分別用於各TCR庫： 1.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 2.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 3.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽 4. 使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽
隨後，收集共培養物且對CD4、CD8及CD69用經螢光染色抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，分選各樣品之單活細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69+ 細胞。
自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且用作PCR之模板以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb且可使用Oxford奈米孔MinIon定序器進行定序，以比較經分選T細胞群體(CD69lo 或CD69hi 或CD69+ )中之新抗原特異性TCR序列的相對豐度。
在一些實施例中，可藉過其他定序器替換Oxford奈米孔MinIon定序器或可採用其他定序策略。 實例6
此實例描述自藉由基因合成產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。
藉由基因合成產生含有兩個HLA-A*02:01限制型新抗原特異性TCR的多個TCR庫。為此，合成源自新抗原特異性TCR之兩個TCRα及兩個TCRβ鏈片段及源自具有其他特異性之TCR之98個TCRα及98個TCRβ鏈片段。在替代方案中，可採用5 + 95個TCR。隨後，使用所得片段產生含有以TCRβ-P2A-TCRα型式之TCR表現盒的TCR庫。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段混合且接合至編碼TCRβ-P2A-TCRα盒之連續核酸分子。重要的是，每TCR盒僅可接合一個TCRβ片段及TCRα片段。藉由選擇及混合不同數目個TCRα及TCRβ片段，可產生具有不同複雜性之TCR庫： 1.  源自新抗原特異性TCR之兩個TCRα及兩個TCRβ鏈片段將創建具有複雜性4 (4個不同TCRαβ對)之TCR庫 2.  源自新抗原特異性TCR之兩個TCRα及兩個TCRβ鏈片段及源自具有其他特異性之TCR之八個TCRα及八個TCRβ鏈片段將創建具有複雜性100 (100個不同TCRαβ對)之TCR庫 3.  源自新抗原特異性TCR之兩個TCRα及兩個TCRβ鏈片段及源自具有其他特異性之TCR的48個TCRα及48個TCRβ鏈片段將創建具有複雜性2,500 (2,500個不同TCRαβ對)之TCR庫 4.  源自新抗原特異性TCR之兩個TCRα及兩個TCRβ鏈片段及源自具有其他特異性之TCR的98個TCRα及98個TCRβ鏈片段將創建具有複雜性10,000 (10,000個不同TCRαβ對)之TCR庫
在替代方案中，對於TCRα及TCRβ鏈片段之選擇方案可為：4+0；5+5；5+45及5+95個設計
所得TCR庫將含有呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性(SEQ ID NO: 1，圖40)之型式的TCR表現盒。
藉由熟習此項技術者已知之方法將各TCR庫分別轉染於諸如Phoenix-Ampho (ATCC CRL-3213)之雙嗜性病毒生產細胞中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞株缺乏內源性TCR表現(例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。使用較低MOI用個別TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，以便將經TCR轉導的Jurkat T細胞之頻率限制於總T細胞之25%至30%。藉由在轉導之後向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
一般熟習此項技術者將進一步瞭解，本文所述之方法可包括在無嘌呤黴素之情況下選擇，諸如藉由FACS或基於磁性珠粒之選擇分選經TCR轉導的細胞。因此，TCR盒可能缺乏嘌呤黴素選擇基因。
經TCR轉導的Jurkat T細胞用表現重組HLA-A*02:01-IRES-FusionRed轉殖基因(K562-HLA-A*02:01-IRES-FusionRed；SEQ ID NO: 3)之負載抗原的K562細胞刺激6小時。已描述表現轉殖基因之K562細胞的產生(例如Hirano等人Clin Canc Res 2006；Butler等人Int Immunol 2010；Butler等人Clin Canc Res 2007；Lorenz等人Hum Gene Ther 2017)且為熟習此項技術者已知。藉由在37℃下用所關注肽脈衝90分鐘且隨後洗滌得到負載肽的K562-HLA-A2細胞。熟習此項技術者應瞭解，本文所提及的呈現肽之HLA-A*02:01陽性K562細胞株可經其他HLA-A*02:01陽性抗原呈現細胞取代。
將使用以下刺激條件： 1.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 2.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽
隨後，收集共培養物且對CD4、CD8及CD69用經螢光染色抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件： 1.    活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69hi (CD69hi 包括最高5-60%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於CD69螢光信號) 2.    活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69lo (CD69lo 包括5-50%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於較低CD69螢光信號)
或者，以下刺激條件可分別用於各TCR庫： 1.    使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 2.    使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 3.    使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽 4.    使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽
隨後，收集共培養物且對CD4、CD8及CD69用經螢光染色抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，分選各樣品之單活細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69+ 細胞。
自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且用作PCR之模板以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb且可使用Oxford奈米孔MinIon定序器進行定序，以比較經分選T細胞群體(CD69lo 或CD69hi 或CD69+ )中之新抗原特異性TCR序列的相對豐度。
在一些實施例中，可藉過其他定序器替換Oxford奈米孔MinIon定序器或可採用其他定序策略。 實例7
此實例描述自由鮮凍黑素瘤損害產生之TCR庫中還原新抗原特異性TCR。
自鮮凍黑素瘤樣本分離DNA及RNA且使用兩倍：
首先，利用DNA及/或RNA進行批量TCRα鏈及β鏈定序。基於獨特分子之計數使用「獨特分子標識符」(UMI)確定編碼特定TCR鏈胺基酸序列(之一部分)的核酸分子之絕對數。在替代例中，可使用讀段計數。將TCR鏈序列之所得集合分成TCRα鏈序列之集合及TCRβ鏈序列之集合。自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的絕對數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。選擇前100個最豐富TCRα鏈及β鏈且藉由DNA合成產生為片段。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段混合且接合至編碼TCRβ-P2A-TCRα盒之連續核酸分子。重要的是，每個盒僅可接合一個TCRα及TCRβ片段。所得TCR庫將含有呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性(SEQ ID NO: 1)之型式的約10,000個TCR表現盒。
其次，使用完整外顯子組定序(WES)腫瘤衍生以及健康的組織DNA及RNA用於確定腫瘤特異性突變之組，且藉由利用RNA-seq建立經表現突變基因之組。可產生在串列陣列中編碼多個腫瘤衍生之突變型肽的串列小型基因(TMG)構築體。使用TMG構築體產生活體外經轉錄mRNA (例如Stevanović等人Science 2017)。在替代方案中，TMG表現構築體可用於B細胞(APC)之病毒產生/轉導。
同時，來自黑素瘤患者之匹配自體血液用於產生永生化B細胞。人類B細胞之EBV永生化為熟習此項技術者已知(例如Traggiai等人，Methods Mol Biol 2012)。使用永生化自體B細胞藉由用TMG-mRNA電穿孔B細胞來產生抗原表現B細胞。抗原呈現細胞(APC)之電穿孔先前已描述且為熟習此項技術者已知。一般熟習此項技術者應瞭解，其他方法亦將使自體B細胞永生化且藉由此類自體永生化B細胞誘導抗原表現，例如用肽脈衝、用編碼TMG之DNA質體轉染或用編碼TMG之病毒粒子轉導。
藉由熟習此項技術者已知之方法將TCR庫轉染於諸如Phoenix-Ampho (ATCC CRL-3213)之雙嗜性病毒生產細胞中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞株缺乏內源性TCR表現(例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。使用較低MOI用TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，以便將經TCR轉導的Jurkat T細胞之頻率限制於總T細胞之25%至30%。藉由向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。一般熟習此項技術者將進一步瞭解，本文所述之方法可包括在無嘌呤黴素之情況下選擇，諸如藉由FACS或基於磁性珠粒之選擇分選經TCR轉導的細胞。因此，TCR盒可能缺乏嘌呤黴素選擇基因。
使用以下條件，藉由負載抗原的B細胞刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞6小時： 1.  經4e7 TCR轉導的JurkatT細胞+ 4e7 負載抗原的自體B細胞 2.  經4e7 TCR轉導的JurkatT細胞+ 4e7 自體B細胞
隨後，收集共培養物且對CD4、CD8及CD69用經螢光染色抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件： 1.  活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69hi (CD69hi 包括最高5-50%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於CD69螢光信號) 2.  活單細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69lo (CD69lo 包括5-50%活單細胞，CD4+ 、CD8+ 細胞，基於較低CD69螢光信號)
或者，以下刺激條件可分別用於各TCR庫： 1.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 2.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug新抗原肽 3.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 4e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽 4.  使經4e7 TCR轉導的Jurkat T細胞+ 8e7 K562-HLA-A2負載1 ug不相關對照肽
隨後，收集共培養物且對CD4、CD8及CD69用經螢光染色抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，分選各樣品之單活細胞，CD4+ 、CD8+ 、CD69+ 細胞。
自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且用作PCR之模板以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb且可使用Oxford奈米孔MinIon定序器進行定序，以比較經分選T細胞群體(CD69lo 或CD69hi 或CD69+ )中之新抗原特異性TCR序列的相對豐度。
在一些實施例中，可經由一些其他定序器替換Oxford奈米孔MinIon定序器或可採用其他定序策略。 實例8
此實例描述使用基因合成創建TCR組庫。
TCR可表現於如3圖所提供之盒設計中。為了合成大量此類TCR盒，將各TCR鏈之高度可變部分合成為片段，諸如例如CDR3-J區段。其他組分可為「現成的」構建塊。為了重建所有所關注TCR鏈，合成可變/獨特片段且與「現成的」構建塊混合。該原理描繪於圖7中。隨後，將所有組分混合在一起且組裝將產生如圖3中所描繪之TCR盒。該組裝受特定序列突出物控制：特異性CDR3-J區段將僅融合至某些V片段且由於不同片段之間的重疊，因此每一TCR盒將最終呈型式TCRβ-P2A-TCRα。每一TCRα可與每一TCRβ片段配對。最後，將所有TCRβ-P2A-TCRα盒選殖至表現載體中。在一些情況下，可使用作為可變部分之V-CDR3-J(α鏈與β鏈兩者)及作為現成構建塊之Cβ-P2A。
或者，藉由基因合成完全產生任何及所有可能的TCRβ-P2A-TCRα組合。以此方式，有可能以組合方式對所有TCRα及TCRβ片段進行配對。
另一方法包括如上文所述藉由組合合成或藉由基因合成產生TCRα及TCRβ片段。然而，並非產生TCRβ-P2A-TCRα盒，將TCRα及TCRβ鏈之所得集合選殖於獨立表現載體中。細胞經載體集合修飾，其方式為使得每一T細胞平均表現一個TCRα及一個TCRβ，類似於上文所述之組合配對。
作為替代方法，可採用經修飾TCR，諸如僅單獨與CD28信號傳導域組合與CD3ε或CD3ζ信號傳導域融合的單鏈TCR構築體，而非僅TCRα及TCRβ。 實例9
此實例描述鑑別來自TCR組庫之TCRαβ對。
經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種活化標記物分離抗原反應性T細胞用於TCR分離。或者，T細胞池標記有適合於追蹤細胞增殖之螢光染料，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於增殖分離抗原反應性T細胞用於TCR分離。活化T細胞之純化可藉由抗體標記及後續分離(基於流式細胞測量術分選、基於磁性珠粒之選擇或基於任何其他抗體結合之選擇方法)來達成。
在又一方法中，將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的T細胞池分成至少兩個樣品。樣品藉由表現至少一種所關注抗原或不表現之抗原呈現細胞刺激。在刺激之後，將兩個T細胞群體培育一段時間且隨後藉由TCR分離分析兩個T細胞群體。自兩個樣品得到的TCRαβ對之比較將在暴露於至少一種抗原之樣品中鑑別具有較高豐度之TCR基因。增殖之偵測可基於偵測螢光染料(諸如CFSE或Cell Tracer Violet)之稀釋度。基於經稀釋螢光信號藉由流式細胞測量術分選增殖細胞。
在另一方法中，經該所產生TCRαβ對之庫修飾的T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種報導TCR觸發的報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-YFP分離抗原反應性T細胞用於TCR分離。
在又一方法中，經該所產生TCRαβ對之庫修飾的T細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於在TCR信號傳導時例如使用NFAT嘌呤黴素轉殖基因之獲得性抗生素抗性使用抗原特異性T細胞之選擇分離抗原反應性T細胞用於TCR分離。或者，使經修飾T細胞池暴露於攜帶所關注抗原之一或多種MHC複合物。分離結合至MHC複合物之T細胞用於TCR分離。基於MHC複合物結合之分離可藉由流式細胞測量術分選或磁性珠粒富集進行。
以上方法中之任一者中的TCR分離可藉由以下實現：(i)自批量抗原反應性T細胞分離DNA或RNA，產生TCRαβ特異性PCR產物，其藉由DNA定序或RNA定序分析以確定抗原反應性T細胞之TCRαβ基因序列，或(ii)分析在所分析單T細胞中表現之TCRαβ基因序列的基於單細胞之液滴PCR或微流體方法。以此方式，偵測到其中TCRαβ轉錄物與增加之活化標記物量共表現之T細胞池中的單T細胞。
在另一方法中，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該所產生TCRαβ對之庫修飾的T細胞池。隨後，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體方法鑑別所關注TCRαβ對，以組合TCR分離與至少一種活化標記物之轉錄物量的偵測。藉此，偵測到其中TCRαβ轉錄物與增加之一或多種活化標記物量共表現之T細胞池中的單T細胞。 實例10
此實例描述一種篩選方法，其用於鑑別來自編碼TCRα及TCRβ多肽之核酸序列的組合庫之功能性TCRα/TCRβ組合。
為了鑑別來自無活性腫瘤之新抗原特異性TCR，研發一種藉由腫瘤衍生之TCRα與TCRβ之組合組裝來產生TCR庫的方法。此等TCR鏈藉由自腫瘤組織分離之DNA或RNA的TCR批量鏈定序鑑別。將TCRαβ對編碼為約1.5 kb轉殖基因且引入報導細胞中。藉由用表現抗原之細胞刺激，可在遺傳變異體庫篩選中選擇表現抗原反應性TCRαβ組合之報導細胞。在組合組裝下，僅可藉由確定TCRα及TCRβ可變序列來明確鑑別各TCR變異體。因此，在遺傳篩選期間分離之報導細胞中編碼的轉殖基因以PCR擴增子形式還原約1.5 kb，使用Oxford奈米孔定序進行全長定序，且使用生物資訊分析管道分析。
此過程可鑑別可進一步針對癌症療法中之潛在用途評估的TCR導引。產生變異核苷酸序列庫
如本文一或多個實例所述選擇TCRα及TCRβ鏈，且以組合方式配對，藉此產生TCR變異體之總組。由於組合配對，僅可藉由確定TCRα及TCRβ可變序列來明確鑑別任何既定TCR變異體。此可涉及定序約1.5 kb之PCR擴增子。將變異核苷酸序列之庫引入報導細胞中
將步驟1)中所述之組合TCR庫轉染至產生病毒之Phoenix-ampho細胞中，產生編碼存在於庫中之所有TCR變異體的反轉錄病毒。隨後使用病毒轉導缺乏內源性TCR表現之Jurkat T細胞。在TCR庫內編碼殺稻瘟菌素選擇標記物，其允許表現TCR池之經轉導的報導T細胞之抗生素選擇。基於至少一種功能特性選擇報導細胞
以較低密度接種表現各種TCR之報導T細胞的多株混合物，且隨後與表現潛在新抗原之永生化B細胞共培養。報導T細胞之量使得所有TCR變異體表示為至少100之平均覆蓋度。隨後，收穫共培養物且基於T細胞活化標記物CD69之較高或較低表現經受FACS分選。收穫此等各別「頂部」及「底部」群體且進一步分析。其他活化標記物可用於FACS分選，其中CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α及GM-CSF可代替CD69或與其組合以選擇經活化報導T細胞。另外，各種啟動子活性報導細胞可用於選擇經活化細胞。分離來自經選擇報導細胞之變異核苷酸序列
分離基因體DNA且經受編碼TCR之反轉錄病毒插入序列的PCR擴增。PCR引子在反轉錄病毒載體中且在TCRα鏈之恆定區中，得到約1500個鹼基之擴增子。足夠的基因體DNA用於表示平均覆蓋度為至少100之所有TCR變異體。使擴增最小化以防止特異性TCR變異體之擴增偏差，但應得到對庫中所表示之各TCR至少10000之平均覆蓋度。對頂部及底部樣品進行來自基因體DNA之TCR擴增。確定經分離變異核苷酸序列之總核苷酸序列的至少 600 bp
進一步處理經擴增TCR序列用於Oxford奈米孔定序。在第一PCR反應中，使用尾部引子。此等含有用於第二PCR的新結合位點，其中帶條碼的外部引子經快速連接化學反應修飾。不同條碼用於頂部及底部樣品上之PCR。在所有PCR步驟中，使擴增最小化以防止特異性TCR變異體之擴增偏差。然而，足夠的PCR產物用於表示平均覆蓋度為至少10000之所有TCR變異體。
在以上之替代方案中，進一步處理經擴增TCR序列用於Oxford奈米孔定序。在第一PCR反應中，用非尾部引子擴增TCR盒。在後續PCR輪中，使用尾部引子。此等含有用於第三PCR的新結合位點，其中帶條碼的外部引子經快速連接化學反應修飾。不同條碼用於頂部及底部樣品上之PCR。在所有PCR步驟中，使擴增最小化以防止特異性TCR變異體之擴增偏差。然而，足夠的PCR產物用於表示平均覆蓋度為至少10000之所有TCR變異體。一般熟習此項技術者將認識到可採用替代性PCR擴增策略。
將來自頂部及底部樣品之帶條碼的PCR產物以等莫耳比合並且在最終步驟中，將快速1D定序銜接子接合至此池，得到準備用於定序之庫製劑。將此庫負載至Oxford奈米孔R9.4.1流量槽上，且定序庫中所編碼之每個TCR達至少100個讀段之平均覆蓋度。
對於生物資訊分析，使用Oxford奈米孔guppy套組。使用guppy_basecaller自原始資料檢索序列讀段。使用guppy_barcoder對樣品解多重。或者，對於基於GridIon之定序，使用MinKnow套裝軟體得到解多重的序列讀段。序列讀段使用guppy_aligner與由個別α及β鏈序列組成之參考比對，且自所得比對檔案提取各讀段之α及β鏈鑑別。在最終步驟中，計算各TCR之出現頻率且將其用於進一步分析。選擇至少一個所關注變異核苷酸序列
為了鑑別所關注變異核苷酸序列，如藉由兩個細胞群體中之變異體讀段計數所確定，藉由確定經陽性選擇(標記物分子為陽性)報導細胞群體中之變異體富集及經陰性選擇(標記物分子為陰性)報導細胞群體中之變異體耗乏基於相對富集選擇TCR。 實例11
此實例描述一種篩選方法，其用於鑑別來自編碼變異CAR蛋白質域之核酸序列之組合庫的功能性CAR變異體。
為了鑑別具有最佳功能特性之CAR設計，CAR分子域可以組合方式組裝。CAR分子包含(i)抗原結合域、(ii)鉸鏈域、(iii)跨膜域及(iv)胞內信號傳導域(通常包含2至3個信號傳導模組)，創建約1.5 kb之合成分子。CAR變異體之庫可引入報導細胞中且藉由用表現抗原之細胞刺激，可在遺傳篩選中選擇表現產生所需活化表型之CAR變異體的報導細胞。考慮到若干分子域之組合組裝，各變異體僅可藉由確定所有可變分子部分之序列明確鑑別。因此，在遺傳篩選期間分離之報導細胞中編碼的轉殖基因以PCR擴增子形式還原約1.5 kb，使用Oxford奈米孔定序進行全長定序，且使用定製化生物資訊分析管道分析。
此方法可鑑別CAR前導，其可進一步用於潛在治療用途，例如癌症之評估。 1.產生變異核苷酸序列庫
CAR變異體庫由若干CAR蛋白質域之組合組裝產生：2個鉸鏈域、12個跨膜域及13個信號傳導域(其中3個信號傳導域併入各變異體中)，產生具有超過50,000個蛋白質變異體之庫。為了明確鑑別任何既定CAR變異體，可對1.3 kb之PCR擴增子定序。 2.將變異核苷酸序列之庫引入報導細胞中
將步驟1中所述之CAR變異體庫轉染至產生病毒之Phoenix-ampho或293T細胞中，以分別產生存在於庫中之所有CAR變異體的反轉錄病毒或慢病毒。病毒隨後用於轉導永生化Jurkat T細胞或活體外活化之初級人類T細胞。細胞表面標記物及/或抗生素選擇標記物共編碼於CAR變異體庫內，其允許選擇表現CAR變異體池之經轉導的報導T細胞。 3.基於至少一種功能特性選擇報導細胞
表現CAR變異體庫之報導T細胞的多株混合物用細胞增殖染料標記，以較低密度接種，且與表現CAR抗原結合域之同源配位體的抗原呈現細胞共培養。報導T細胞之量使得所有CAR變異體表示為至少100之平均覆蓋度。隨後，收穫共培養物且經受基於已分成至少一次或未分次之T細胞的流式細胞測量術分選。收穫此等各別「頂部」及「底部」群體且進一步分析。其他活化標記物可用於單獨或組合形式之反應及非反應T細胞(諸如CD69、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α及GM-CSF)之基於流式細胞測量術的分選。另外，各種轉錄因子活性報導子(NF-κB、NFAT、AP-1)、信號轉導報導子(ZAP70、ERK1/2磷酸化)或細胞毒性報導子(CD107A表現)可用於選擇反應及非反應T細胞。 4.分離來自經選擇報導細胞之變異核苷酸序列
自經選擇CAR變異體表現報導T細胞分離基因體DNA且經受編碼CAR之反轉錄或慢病毒插入序列的PCR擴增。PCR引子結合於CAR插入序列之不可變區域，得到約1300個鹼基之平均擴增子大小。
或者，可應用類似的基於獨特分子標識符(UMI)之方法。足夠的基因體DNA用於表示平均覆蓋度為至少100之所有CAR變異體。使PCR週期的量最小化以防止特異性CAR變異體之擴增偏差，但應得到對庫中所表示之各CAR至少10000之平均覆蓋度。針對反應及非反應報導T細胞(頂部及底部樣品)進行來自基因體DNA之CAR變異體擴增。 5.確定經分離變異核苷酸序列之總核苷酸序列的至少 600 bp
進一步處理經擴增CAR序列用於Oxford奈米孔定序。在第一PCR反應中，使用尾部引子。此等含有用於第二PCR的新結合位點，其中帶條碼的外部引子經快速連接化學反應修飾。不同條碼用於頂部及底部樣品上之PCR。在所有PCR步驟中，使擴增最小化以防止特異性CAR變異體之擴增偏差。然而，足夠的PCR產物用於表示平均覆蓋度為至少10000之所有CAR變異體。
將來自頂部及底部樣品之帶條碼的PCR產物以等莫耳比合並且在最終步驟中，將快速1D定序銜接子接合至此池，得到準備用於定序之庫製劑。將此庫負載至Oxford奈米孔R9.4.1流量槽上，且定序庫中所編碼之每個CAR的至少100個讀段之平均覆蓋度。
對於生物資訊分析，使用Oxford奈米孔guppy套組。使用guppy_basecaller自原始資料檢索序列讀段。使用guppy_barcoder對樣品解多重。序列讀段使用guppy_aligner與由個別CAR變異序列組成之參考比對，且自所得比對檔案提取各讀段之CAR變異體鑑別。在最終步驟中，計算各CAR變異體之出現頻率且將其用於進一步分析。作為避開來自PCR之擴增偏差的選擇方案，可應用CAR變異體之基於UMI的計數。 6.選擇至少一個所關注變異核苷酸序列
為了鑑別所關注變異核苷酸序列，如藉由兩個細胞群體中之變異體讀段計數所確定，藉由確定經陽性選擇(標記物分子為陽性)報導細胞群體中之變異體富集及經陰性選擇(標記物分子為陰性)報導細胞群體中之變異體耗乏基於相對富集選擇CAR。 實例12
此實例描述藉由如實例10及11所述之本發明篩選方法篩選的細胞數目之計算。
對於大小為100個組合之組合庫，可藉由在選擇陽性反應者時還原10,000個細胞及還原10,000個陰性反應者來達成100倍覆蓋度。因此，細胞群體在選擇之前可大於20,000。
對於大小為1000個組合之組合庫，可藉由在選擇陽性反應者時還原100,000個細胞及還原100,000個陰性反應者來達成100倍覆蓋度。因此，細胞群體在選擇之前可大於200,000。
對於大小為1×109 個組合之組合庫，可藉由在選擇陽性反應者時還原1×1011 個細胞及還原1×1011 個陰性反應者來達成100倍覆蓋度。因此，細胞群體在選擇之前可大於2x1011 。 實例13
此實例描述自錯配功能正常型結腸直腸癌(MMRp-CRC)腫瘤中還原新抗原特異性T細胞受體序列(圖10A)。
自鮮凍MMRp-CRC樣本分離DNA及RNA且以以下兩種方式使用：
首先，利用DNA及/或RNA進行批量TCRα鏈及β鏈定序(藉由MiLaboratory (莫斯科/俄羅斯)進行)。將TCR鏈序列之所得集合分成TCRα鏈及TCRβ鏈序列之集合，得到每個樣品約10,000-30,000 TCRα鏈及TCRβ鏈(圖10B及11A)。
圖10B及圖11A描繪在人類腫瘤樣品中浸潤淋巴細胞之批量TCR定序。使四種人類MMRp-CRC腫瘤樣品藉由Milaboratory經受批量TCR定序。在比對及TCR鑑別之後，基於其CDR3胺基酸序列及其V及J鑑別使純系型崩塌。表示各腫瘤樣品之α及β鏈二者獨特純系型之數目。
自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段(亦稱為TCR基因元件)在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的讀段計數或獨特分子標識符(UMI)計數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。
選擇前100個最豐富TCRα鏈及β鏈用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成產生呈片段形式之經選擇TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒之連續核酸分子(圖11B TCR表現質體之示意性圖示。含有β及αTCR鏈以及殺稻瘟菌素選擇標記物之反轉錄病毒構築體可以架構形式使用來創建庫。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯)。每個盒可接合一個呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性型式的TCRβ片段及TCRα片段(圖11B) (SEQ ID NO: 4) (圖43)。所得TCR庫一般含有在極窄頻率範圍下之無下降的10,000種TCR變異體(圖10C；圖11C及11D)。100×100庫之品質控制。選擇來自11A)中之各樣品的100個最普遍α鏈及β鏈且用於創建組合庫。以由Twist Bioscience進行之組合選殖方法合成11B)中之TCRβ及TCRα區且插入11B)之載體中。側接可變TCRα及β鏈域之引子對用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序鑑別兩個鏈之鑑別。
表示每個患者庫的10,000 α×β組合中之每一者之表示(圖11D)。患者庫之TCR表示的特徵。對於11C)中之各患者庫，表示每TCR之讀段量、平均覆蓋度及處於中值+/-2 log -單位範圍內的TCR之百分比的範圍。其次，使用完整外顯子組定序(WES)和RNA定序，腫瘤衍生以及健康組織DNA及RNA用於確定腫瘤特異性突變之組，以建立經表現突變基因之組。用以鑑別及選擇腫瘤特異性突變之管道可提供選擇方案。已預先描述基於WES及RNA-seq鑑別此類突變之方法且為熟習此項技術者已知。隨後，產生在串列陣列中編碼多個腫瘤衍生之突變型肽的串列小型基因(TMG)構築體。TMG構築體將12個個別腫瘤突變編碼成25聚體多肽小型基因，該等小型基因經串聯且包括LAMP-1信號傳導及跨膜域(例如Gros等人，Nat Med 2016中描述；不同之處在於pt4)及使用2A元件稠合至LAMP-1細胞質域之嘌呤黴素抗性標記物。對於Pt4，使用編碼33或34種不具有LAMP-1信號傳導及跨膜域但含有嘌呤黴素抗性標記物之不同串聯小型基因的串列小型基因設計。同時，來自MMRp-CRC患者之匹配自體血液用於產生永生化B細胞。人類B細胞之EBV永生化為熟習此項技術者已知(例如Traggiai等人，Methods Mol Biol 2012)。使用永生化自體B細胞，藉由用編碼TMG之病毒粒子進行反轉錄病毒轉導來產生抗原表現B細胞。藉由不同於TMG之其他基因的初級人類B細胞之反轉錄病毒轉導的方案已描述於文獻(例如Kwakkenbos等人，Nat Med 2010)且為熟習此項技術者已知。可基於嘌呤黴素抗性選擇經TMG轉導的B細胞。熟習此項技術者已知用於嘌呤黴素選擇之方法。使用Fugene轉染劑及熟習此項技術者已知之方案將TCR庫轉染至Phoenix-Ampho病毒生產細胞(ATCC CRL-3213)中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞株缺乏內源性TCR表現(此類遺傳基因剔除之產生，例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。Jurkat報導T細胞經TCR庫轉導，得到總活T細胞之10-60%經TCR修飾的T細胞(圖10D)。使用TCR庫中之鼠類TCR恆定域序列允許藉由流式細胞測量術使用鼠類TCRβ恆定域特異性抗體偵測經TCR修飾Jurkat T細胞。藉由向細胞培養基中添加殺稻瘟菌素將經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞陽性選擇至較高純度(圖10D)。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
隨後，藉由與經TMG轉導的B細胞共培養來刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞。在共培養之前三天，以較低密度(0.1×106 個細胞/毫升)接種Jurkat報導T細胞。以相等(1:1)比率混合表現各種TMG之B細胞均。將90×106 經合併B細胞(或不具有TMG表現之對照B細胞)與90×106 Jurkat報導T細胞(1:1比率)在72 ml總體積之培養基中混合。將200 ul (0.5×106 個細胞/孔)此混合物分佈於經TC處理的U形底96孔板之約360個孔中。使該等板在1000 rpm下離心1分鐘，且在37℃下培育20至22小時。
隨後，收穫共培養物且對CD20及CD69用螢光標記的抗體進行染色。隨後，使用含有4%甲醛之固定緩衝液固定細胞。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件(圖10E)：
淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69hi (CD69hi 包括基於CD69螢光信號之最高10-15%單細胞、CD20- 細胞)
淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69lo (CD69lo 包括基於較低CD69螢光信號之10-15%單細胞、CD20- 細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且以有限循環量用作多輪PCR之模板，以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb (圖10F)且可使用Oxford奈米孔MinIon或GridIon定序器進行定序。至此點之整個篩選程序在100倍之最小覆蓋度下進行，且在TMG表現之情形下三次重複，且在不存在TMG情形下三次重複。還原TCRα及β鏈鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表現之TCR組合。B細胞在存在及不存在TMG表現下之經Rlog轉換的讀段計數用於描繪新抗原反應性TCR前導。新抗原反應性TCR前導描繪為環繞的較大黑點(圖10G)。
為瞭解卷積由TCR前導鑑別的TMG，使用表現單一TMG構築體之B細胞(而非表現TMG之B細胞的混合物)以單次重複形式篩選TCR庫(圖10H)。隨後，為確定由TCR前導鑑別之精確新抗原，使用負載有在TMG中編碼之單25聚體肽的B細胞(圖10I及10J)。使用表現在TMG中編碼之單小型基因的B細胞確定由TCR前導鑑別的準確新抗原(圖10K及10L)。
綜合而言，此實例表明所述平台可成功鑑別自鮮凍腫瘤物質之新抗原特異性TCR。 實例14
此實例描述自黑素瘤腫瘤樣品中還原TCR序列用於產生患者特異性TCRαβ庫(圖12A-12C)。
自兩種鮮凍黑素瘤腫瘤樣本分離DNA及RNA且以以下兩種方式使用：
首先，利用DNA及/或RNA進行腫瘤樣品中浸潤淋巴細胞之批量TCRα鏈及β鏈定序(藉由MiLaboratory(莫斯科/俄羅斯)進行)。將TCR鏈序列之所得集合分成TCRα鏈及β鏈序列之集合，得到每個樣品約5,000-10,000 TCRα鏈及TCRβ鏈(圖12A)。使兩種人類黑素瘤腫瘤樣品藉由Milaboratory經受批量TCR定序。在比對及TCR鑑別之後，基於其CDR3胺基酸序列及其V及J鑑別使純系型崩塌。表示各腫瘤樣品之α及β鏈二者獨特純系型之數目。
自集合移除任何非產生性TCR鏈序列，其中TCR片段(亦稱為TCR基因元件)在胺基酸序列層面上框外接合，及/或其中引入終止密碼子，及/或其中存在框架移位突變，及/或其中存在缺陷性剪接位點。使用編碼特定TCR鏈之核酸分子的讀段計數或獨特分子標識符(UMI)計數(或分別在總TCRα鏈或TCRβ鏈之間的對應百分比)按降序分選各集合，得到TCRα鏈及β鏈之排名次序。選擇前100個最豐富TCRα鏈及β鏈用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成產生呈片段形式之經選擇TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒之連續核酸分子(圖11B TCR表現質體之示意性圖示。含有β及αTCR鏈以及殺稻瘟菌素選擇標記物之反轉錄病毒構築體可以架構形式使用來創建庫。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯)。每個盒可接合一個呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性型式的TCRβ片段及TCRα片段(圖11B) (SEQ ID NO: 4)。所得TCR庫一般含有在極窄頻率範圍下之無下降的10,000種TCR變異體(圖12B)。100×100庫之品質控制。選擇來自12A)中之各樣品的100個最普遍α鏈及β鏈且用於創建組合庫。可以由Twist Bioscience進行之組合選殖方法合成12A)中之TCRβ及TCRα區且插入11B)之載體中。側接可變TCRα及β鏈域之引子對可用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序鑑別兩個鏈之鑑別。表示每個患者庫的10,000 α×β組合中之每一者之表示。12C)患者庫之TCR表示的特徵。對於12B)中之各患者庫，表示每TCR之讀段量、平均覆蓋度及處於中值+/-2 log-單位範圍內的TCR之百分比的範圍。
綜合而言，此實例表明可基於批量TCR定序合成及選殖組合TCR庫。 實例15
此實例描述自藉由TCR質體之混合產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。
藉由將編碼編碼單一經表徵TCR之6個質體與分別編碼單一未經表徵TCR之24個質體混合來產生TCR庫(圖13A)。TCR表現質體設計描繪於圖15A中。使用Fugene轉染劑及熟習此項技術者已知之方案將TCR庫轉染至Phoenix-Ampho病毒生產細胞(ATCC CRL-3213)中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞株缺乏內源性TCR表現(此類遺傳基因剔除之產生，例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。Jurkat報導T細胞經TCR庫轉導，得到總活T細胞之80%經TCR修飾的T細胞。使用TCR庫(圖15A)中之鼠類TCR恆定域序列允許藉由流式細胞測量術使用鼠類TCRβ恆定域特異性抗體偵測經TCR修飾Jurkat T細胞。藉由向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞至較高純度(圖13B)。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
隨後，藉由與經TMG轉導的B細胞共培養來刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞。在共培養之前三天，以較低密度(0.1×106 個細胞/毫升)接種Jurkat報導T細胞。將90×106 經合併表現TMG之B細胞(或不具有TMG表現之對照B細胞)與90×106 Jurkat報導T細胞(1:1比率)在72 ml總體積之培養基中混合。將200 ul (0.5×106 個細胞/孔)此混合物分佈於經TC處理的U形底96孔板之約360個孔中。使該等板在1000 rpm下離心1分鐘，且在37℃下培育20至22小時。
隨後，收穫共培養物且對CD20及CD69用螢光標記的抗體進行染色。隨後使用含有4%甲醛之固定緩衝液固定細胞。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件(圖13C)： 1.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69hi (CD69hi 包括基於CD69螢光信號之最高10-15%單細胞、CD20- 細胞) 2.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69lo (CD69lo 包括基於較低CD69螢光信號之10-15%單細胞、CD20- 細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且以有限循環量用作多輪PCR之模板，以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb (圖13D)且可使用Oxford奈米孔MinIon或GridIon定序器且可使用熟習此項技術者已知之技術進行定序。使用熟習此項技術者已知之比對技術還原TCR鑑別，且對於各TCR，頂部相對於底部樣品中之標準化讀段計數的經log2轉換富集倍數表示為經log10轉換TCR頻率之函數(圖13E；在TMG表現之情況下單次重複，且在不存在TMG表現下單次重複)。
綜合而言，此實例表明可自TCR質體之混合物分離抗原反應性TCR。 實例16
此實例描述自藉由基因合成產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。
選擇五個經表徵已知抗原反應性之TCR以及45或95個未經表徵TCR (分別為50×50及100×100庫；圖14A)用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成來合成呈片段形式之來自此等TCR的TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒(SEQ ID 1)之連續核酸分子。含有β及αTCR鏈以及嘌呤黴素選擇標記物之反轉錄病毒構築體用作用於創建庫之架構。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯。TCRβ片段及TCRα片段以TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性之型式每盒接合(SEQ ID NO: 1)。以由Twist Bioscience進行之組合選殖方法合成50或100個TCR中之每一者的TCRβ及TCRα區且插入載體中。
使用Fugene轉染劑及熟習此項技術者已知之方案將50×50庫轉染至Phoenix-Ampho病毒生產細胞(ATCC CRL-3213)中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。使用熟習此項技術者已知之方法在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導之後，Jurkat報導T細胞經修飾以表現人類CD8α及CD8β。用TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，產生總活T細胞之15%經TCR修飾的T細胞(基於轉導之後4天(在puro選擇之後且在分析當天)染色，純度＞60%)。使用TCR庫中之鼠類TCR恆定域序列(SEQ ID NO: 1)允許藉由流式細胞測量術使用鼠類TCRβ恆定域特異性抗體偵測經TCR修飾Jurkat T細胞。藉由向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞至較高純度。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
接下來，用經工程改造而以各種方式呈現抗原之APC刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞。APC包括負載有肽之JY細胞，分別表現不同小型基因之EBV-LCL細胞、表現TMG之EBV-LCL細胞及尚未經工程改造以表現特異性抗原之EBV-LCL的混合物。在共培養之前三天，以較低密度(0.1×106 個細胞/毫升)接種Jurkat報導T細胞。以1:1比率濃度為2.5×106 個細胞/毫升使APC與Jurkat報導T細胞混合。將200 ul (0.5×106 個細胞/孔)此混合物分佈於經TC處理的U形底96孔板之約40個孔中。使該等板在1000 rpm下離心1分鐘，且在37℃下培育20至22小時。
隨後，收穫共培養物且對CD8、CD20及CD69用螢光標記的抗體進行染色。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件(圖14B)： 1.  淋巴細胞，單細胞，活細胞，CD20- 、CD8+ 、CD69hi (CD69hi 包括基於CD69螢光信號之最高10-15%單細胞，活細胞，CD20- 、CD8+ 細胞) 2.  淋巴細胞，單細胞，活細胞，CD20- 、CD8+ 、CD69lo (CD69lo 包括基於較低CD69螢光信號之10-15%單細胞，活細胞，CD20- 、CD8+ 細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且以有限循環量用作多輪PCR之模板，以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb (圖14C)且可使用Oxford奈米孔MinIon定序器使用熟習此項技術者已知之技術進行定序。使用熟習此項技術者已知之比對技術還原TCR鑑別，且對於各TCR，頂部相對於底部樣品中之標準化讀段計數的富集倍數(y軸)表示為平均TCR表示之函數(x軸；圖14D)。圖14D；分別在存在外源性抗原之條件下單次重複；在不存在外源性抗原表現下單次重複)。使用DESeq2 R套裝軟體鑑別富含於「頂部」相對於「底部」樣品之TCR組合，如使用線性模型所述，其假定富集的TCR定義為在呈現抗原之「頂部」樣品中富集且在呈現抗原之「底部」樣品中耗乏，相對於未呈現抗原之「頂部」及「底部」樣品兩者。表示TCRα及β鏈鑑別以及關鍵統計度量值(圖14E)。
以與50×50篩選類似之方式進行100×100庫篩選，不同之處在於Jurkat報導T細胞經工程改造而缺乏內源性TCR表現且外源地表現人類CD8α及CD8β。與50×50庫篩選相比，在表現TMG之B細胞情形下進行篩選之三次重複，且在未經工程改造以表現TMG之B細胞情形下進行一次重複。Jurkat報導T細胞經TCR庫轉導，得到總活T細胞之14%經TCR修飾的T細胞。使用DESeq2 R套裝軟體計算經Rlog轉換的讀段計數，且自底部樣品之所有重複中之各TCR的平均Rlog值減去底部樣品之所有重複中之各TCR的平均Rlog值，且表示在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下之共培養物(圖14F)。5個摻入有表徵TCR描繪為環繞的較大黑點。將Wald統計值用作分選的機率量測曲線之量度(圖14G)。
綜合而言，此實例表明可篩選50×50及100×100個設計之組合庫以鑑別抗原反應性TCR。 實例17
此實例描述使用基因合成創建TCR組庫。
選擇五個經表徵已知抗原反應性TCR以及95個未經表徵TCR用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成產生呈片段形式之經選擇TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒之連續核酸分子(SEQ ID NO: 1；含有β及α TCR鏈以及嘌呤黴素選擇標記物之反轉錄病毒構築體可用作用於創建庫之架構。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯)。每個盒可接合一個呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性型式的TCRβ片段及TCRα片段(SEQ ID NO: 1，圖15A)。側接可變TCRα及β鏈域之引子對可用於擴增兩個鏈，且使用奈米孔定序鑑別兩個鏈之鑑別。TCR鏈鑑別為熟習此項技術者所已知。表示100×100庫之10,000 α×β組合中之每一者的表示。所得TCR庫含有所有10,000種TCR變異體，而不會在極窄頻率範圍內下降(圖15B)。
設想構成組合庫之替代方式，其中較高複雜性庫可藉由多個重疊或非重疊組合子庫創建，該等字庫共同但個別地表示複合庫中需要存在之所有TCR組合(圖15C)。或者，可藉由構成較小組合子庫之較大庫降低庫之複雜性，其方式為使得未表示複合物庫中之所有α鏈及所有β鏈之所有可能組合。使用配對資訊或配對可能性資訊，熟習此項技術者可設計組合子庫，其方式為使得配對鏈或可能構成一對之鏈皆含於組合子庫中之一者內(圖15D)。
圖15E描繪鑑別存在於兩個200×200個TCR庫中之TCR組合，該等TCR組合藉由四個100×100庫之合成及以1:1:1:1比率混合此等庫創建。各可能TCR組合之出現(x軸)表示為其密度(y軸)。屬於中值+/- log2-單位範圍內之TCR組合的數目分別為92%及88%。對兩個患者庫測試如圖15C)所描繪自以1:1:1:1比率混合的四個100×100庫來創建200×200庫之原理(圖15E)。此組合較高複雜性之組合TCR庫可由與較低複雜性之多個組合TCR庫混合創建。
圖15F表示在200×200庫篩選中在不存在及存在新抗原下之pt2 TCR反應性。200×200庫藉由以組合方式接合193個最頻繁表現之TCRα及TCRβ鏈創建，如使用來自圖10A)至10H)之批量TCR定序資料所量測。另外，包括7個先前經表徵TCRα及TCRβ鏈。以與如10A)-10H)所述之100×100庫類似之方式篩選200×200庫，不同之處在於gDNA分離之後的覆蓋度在57-133範圍內，且在TMG表現之情形下兩次重複，且在不存在TMG之情形下兩次重複。另一不同為在FACS分選之前使用抗CD20或-Ly6G微珠粒耗乏B細胞。TCRα及β鏈鑑別之後，使用DESeq2 R套裝軟體來鑑別差異性表現之TCR組合。差異性表示分析為熟習此項技術者所已知。由在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下之200×200庫篩選的經Rlog轉換的讀段計數表示於圖15F中。六個摻入有表徵TCR描繪為較大深灰色點。未表示一種經表徵TCR，因為其受限於未在pt2 EBV-LCL中表現之HLA-對偶基因。在10A)至10H)中使用100×100庫篩選鑑別之TCR表示為較大淺灰色點。i)在200×200庫篩選中鑑別的且ii)未在100×100庫中表示的額外TCR前導表示為較大淺灰色點。
此表明在200×200篩選方法中鑑別摻入至庫中之六個TCR。另外，此表明未在100×100庫中表示之新TCR前導可使用200×200庫篩選鑑別。因此，自200×200個或另外比使用100×100個TCR庫之篩選更複雜的飽和庫篩選中之TCR庫鑑別更多新抗原反應性TCR。
圖15G表示在100×100及200×200庫篩選兩者中使用100×100庫篩選之六個經表徵TCR以及在10A)至10H)中鑑別之TCR的統計度量值。如藉由DESeq2基線平均值度量所量測，使用100×100庫篩選在10A)至10H)中鑑別的TCR之表示在200×200篩選中比在100×100篩選中低超過6倍。此為無法鑑別此等TCR之可能的解釋，且強調了TCR庫中之TCR變異體之相同表示的重要性。
綜合而言，此實例表明可如何使用基因合成創建TCR庫，且可基於組合多個組合子庫之想法如何增加或降低庫複雜性。 實例18
此實例描述優化用於鑑別來自TCR組庫之TCRα/β對的共培養條件。
在此實例中，調節共培養條件且用於鑑別來自經高度稀釋之抗原反應性TCR的TCR組庫之TCRαβ對。為了測試CD69作為T細胞活化標記物用於篩選目的之適用性，使表現hCD8及CMV#1 TCR之Jurkat T細胞與負載變化量的CMV肽之JY細胞共培養。APC之肽負載為熟習此項技術者所已知。如由FACS所量測之CD69陽性取決於抗原肽之濃度而增加(圖16A)。
為了測試接種密度是否影響Jurkat T細胞之CD69染色的背景，以各種密度接種細胞。如藉由FACS所量測，較低密度接種減少CD69之背景表現(圖16B)。為了測試最佳共培養板為何者，將TCR+ Jurkat報導T細胞與表現相關抗原之B細胞在T75或T25燒瓶或U形底96孔板中共培養。當共培養在U形底96孔板中進行時，Jurkat T細胞之活化最顯著(圖16C)。為了測試共培養物密度對T細胞活化之作用，在各種密度下共培養TCR+ Jurkat T細胞。當在共培養物中接種250,000或125,000個效應細胞時，Jurkat T細胞活化最為高效(圖16D)。為了測試在遺傳篩選環境中圖16A-16D中所確定之共培養條件，藉由混合分別表現五個經表徵中之一者或四個未經表徵(不相關) TCR中之一者的Jurkat T細胞株創建Jurkat報導基因T細胞之多株池。進行混合以使得表現經表徵TCR之細胞以1:10,000與1:1,000,000之間的頻率存在。將細胞在共培養之前以較低密度(100,000個細胞/毫升)接種3天，且在U形底96孔板中以250,000個細胞之接種密度共培養。
在20小時之後，收穫共培養物且對CD20及CD69用螢光標記的抗體進行染色。隨後，使用含有4%甲醛之固定緩衝液固定細胞。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件： 1.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69hi (CD69hi 包括基於CD69螢光信號之最高10-15%單細胞、CD20- 細胞) 2.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69lo (CD69lo 包括基於較低CD69螢光信號之10-15%單細胞、CD20- 細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且以有限循環量用作多輪PCR之模板，以擴增TCRβ盒。所得PCR產物之大小為約0.5 kb且可使用Illumina定序器使用熟習此項技術者已知之技術進行定序。使用熟習此項技術者已知之比對技術還原TCR鑑別，且對於各TCR，表示前相對於底部樣品中之標準化讀段計數的富集倍數(圖16E)。
綜合而言，此實例表明使用所述共培養條件之遺傳篩選可用於鑑別具有1:1,000,000或更高之頻率的抗原反應性TCR。 實例19
為了能夠鑑別來自此類庫之具有較高敏感性之新抗原特異性TCR且確保在不同處理步驟期間未損失TCR，各獨特TCR必須在篩選方法期間表示多次以維持TCR覆蓋度。因此，必須篩選33 大量經TCR轉導的Jurkat細胞及APC。另外，一個目標為擴大庫中之TCR數目以允許超過10,000種TCR之較高敏感性篩選。此強調藉由最佳化各種方法步驟以允許大量細胞之更高效處理同時仍維持TCR覆蓋度來增強TCR探索平台之可擴展性的需要。因此，此研究之目的為進一步優化多個此等方法步驟以增強可擴展性，同時維持TCR隔離平台之敏感性。
在此等研究中，使用四種已知的HLA-A*02:01-限制型TCR，CDK4 TCR純系8及17 (簡稱為CDK4-8及17)及CMV TCR純系1及2 (簡稱為CMV-1及2)。兩個CDK4 TCR對突變型細胞週期素依賴性激酶4 (CDK4R24C )肽具有特異性。在多發性黑色素瘤患者34 中鑑別此突變衍生之新抗原抗原決定基。此外，兩個CMV TCR靶向由人類巨細胞病毒(CMV)之組分，pp6535 編碼的肽。對於CDK4與CMV抗原決定基，使用兩個在研究中具有潛在不同親和力之不同TCR純系。此將可能允許吾人評估TCR對同源肽之親和力對篩選方法之作用。
作為較大細胞數目之處理的第一步驟，評定殺稻瘟菌素選擇作為在反轉錄病毒轉導之後富集TCR表現Jurkat細胞的方法。觀測到殺稻瘟菌素選擇引起經轉導的Jurkat細胞之高效富集且引起最小毒性。另外，發現將來自96孔(96W)圓底板之共培養物型式擴大至GMP袋，允許至少170×106 個效應細胞及目標細胞之高通量處理，同時維持效應細胞之相當活化。
隨後，探索用基於珠粒之選擇步驟替換TCR庫篩選方法中之流式細胞測量術分選步驟的不同方法。除CD69之外，在縱向共培養分析中評估T細胞活化標記物CD25及CD62L。CD25充當IL-2受體α鏈且已知在活化32 之後藉由T細胞表現，而CD62L在未處理T細胞上表現且在T細胞活化後下調，使得效應T細胞能夠重新進入血流36 。CD25及CD62L展現出有前景的表現概況，且因此與CD69組合為雙步驟基於珠粒之選擇的候選物。
最終，評定基於NFAT之報導系統之功效。已建立含有多個人類NFAT結合位點接著最小啟動子及報導基因之載體，研究T細胞之抗原特異性反應37-40 。最小啟動子不含有任何NFAT結合位點且其唯一目的為在轉錄因子與NFAT結合位點結合後起始報導基因之轉錄。經此等構築體轉導的Jurkat細胞將僅在T細胞活化時表現報導基因。可將適用於基於珠粒之選擇或抗生素抗性基因之細胞表面標記物作為報導基因引入，以避開流式細胞測量術選擇步驟。然而，結果表明使用此報導系統產生高背景，且因此不太可能併入至篩選平台中。篩選
肽滴定分析表明，在CDK4 TCR純系8與17之間及CMV TCR純系1與2之間的親和力方面不存在差異或存在最小差異。
四種模型TCR (CDK4 TCR純系8及17及CMV TCR純系1及2)對其同源肽之親和力在其用於研究之前表徵。此藉由在共培養分析中進行肽滴定來達成。
藉由反轉錄病毒基因轉移將四種TCR引入至Jurkat TCR基因剔除(KO) CD8+ 細胞株中。經轉導的Jurkat TCR KO細胞為35-45% mTCRβ+ CD8+ 且呈現出CD8- 群體(圖17a，前側圖)。為了避免在共培養分析期間校正轉導效率，分選經TCR轉導的Jurkat細胞，得到約90% mTCRβ+ CD8+ 細胞之群體(圖17a，後側圖)。
使用CD69作為讀數，負載有分級濃度之CDK4突變型肽之經CDK4-8及17轉導的Jurkat TCR KO細胞與表現HLA-A*02:01之JY細胞的20小時共培養物揭露，CDK4-17 TCR對其同源肽之親和力比CDK4-8 TCR略微更高(圖17b，CDK4-8之EC50：43 ng/ml，CDK4-17之EC50：23 ng/ml)。在CMV TCR之情況下，當將表現此等TCR之Jurkat TCR KO細胞與負載有分級濃度之CMVpp65肽之表現HLA-A*02:01的JY細胞共同培養時，CMV-1及2 TCR對CMVpp65肽呈現出類似親和力(圖17c，CMV-1之EC50：2.2 ng/m，CMV-2之EC50：1.2 ng/ml)。
因此，資料表明，CDK4-8及17對CDK4突變型肽具有類似(或最小不同)親和力且CMV-1及2對CMVpp65肽具有相當(或最小不同)親和力。然而，此等不同TCR純系具有有限值作為研究TCR親和力對篩選方法之影響的工具。因此，在繼續測試TCR庫之前，將CDK4 TCR中之一者及CMV TCR中之一者標準化地包括於研究中。
使用殺稻瘟菌素高效選擇具有不同TCR轉導效率之Jurkat細胞。
在將反轉錄病毒TCR庫轉導至Jurkat TCR KO細胞之後，高效且高通量選擇程序適用於富集成功地經TCR轉導之Jurkat細胞(＞80% mTCRβ+ CD8+ 細胞)，而不導致毒性及損失TCR覆蓋度。抗生素選擇為富集經TCR轉導的Jurkat T細胞之有吸引力的策略且對其進行評定。
出於此目的，殺稻瘟菌素選擇最初藉由使用CDK4-17 TCR來評定。由於TCR庫之轉導效率變化(通常為10-56% mTCRβ+ CD8+ 細胞)，因此藉由具有不同CDK4-17轉導效率之Jurkat TCR KO細胞(10與30% mTCRβ+ CD8+ 細胞)評估殺稻瘟菌素選擇。以0.25×106 個細胞/毫升之密度接種細胞且使用6 µg/ml殺稻瘟菌素選擇七天使得相比於使用較低抗生素濃度(2及4 µg/ml)及較高起始細胞密度(0.5及1×106 個細胞/毫升)得到最高擴增倍數。另外，上文所提及之選擇條件得到約90% mTCRβ+ CD8+ 細胞(資料未示出)。
為了驗證CDK4-17之最佳殺稻瘟菌素選擇條件是否亦可應用於其他TCR，檢查CMV TCR、CMV-1中之一者。另外，若在較早時間點移除殺稻瘟菌素允許選擇繼續且改進擴增倍數，則進行評定。為達成，在選擇第4天，以其起始密度在具有或不具有對應濃度之殺稻瘟菌素之培養基中再接種細胞(分別稱為「在第4天移除殺稻瘟菌素」及「在第4天添加新的殺稻瘟菌素」)。
用不同體積之反轉錄病毒上清液轉導Jurkat TCR KO細胞以便達成不同轉導效率(6、20及60% mTCRβ+ CD8+ 細胞，圖18a)。
將經TCR轉導的細胞以0.25×106 個細胞/毫升之濃度接種且使用不同濃度之殺稻瘟菌素選擇(0、4、5及6 µg/ml)。在選擇之後六天，在第4天在具有或不具有移除殺稻瘟菌素之細胞之間的擴增倍數方面不存在明顯差異。與CDK4-17 TCR之資料相反，使用較低殺稻瘟菌素濃度(4及5 µg/ml)選擇之差異轉導的Jurkat細胞似乎具有比選擇使用6 µg/ml此抗生素之細胞略微更高的擴增倍數(圖18b、圖25a展示未經轉導的細胞之擴增倍數)。儘管擴增倍數存在此等差異，但不同殺稻瘟菌素濃度始終得到80-90% mTCRβ+ CD8+ 細胞之選擇效率(圖18c、圖25b展示，4 µg/ml條件中之NT細胞的百分比係由於存在極少存活細胞，其中一些呈現於mTCRβ+ CD8+ 圈選門中)。最後，在第4天移除殺稻瘟菌素對擴增倍數及選擇效率不具有任何作用(圖18b、c)。基於此資料，在第7天量測結果僅在使用4 µg/ml殺稻瘟菌素選擇之Jurkat細胞繼續存在，因為此抗生素濃度引起較高擴增倍數及80-90% mTCRβ+ CD8+ 細胞。此外，推論使用4 µg/ml殺稻瘟菌素將自三種測試濃度引起最小毒性。
選擇之後七天，對於總活細胞及mTCRβ+ CD8+ 細胞，在第4天移除殺稻瘟菌素之經TCR轉導的Jurkat細胞揭露了比在第4天添加殺稻瘟菌素之細胞略微更高的擴增倍數(圖18d)。然而，在所有測試條件下，在第4天移除殺稻瘟菌素並不對選擇效率有影響(＞90% mTCRβ+ CD8+ 細胞)(圖18e)。
值得注意的是，在CD8及mTCRβ雙陽性Jurkat細胞之mTCRβ MFI中觀測到的差異取決於在第4天移除或添加滅殺稻瘟菌素。在第4天，添加殺稻瘟菌素之細胞比移除殺稻瘟菌素之細胞呈現出更高的MFI。此差異在選擇之後第7天比在第6天更顯而易見(圖26)。
總之，使用三種不同殺稻瘟菌素濃度(4、5及6 µg/ml)高效選擇具有不同CMV-1轉導效率之Jurkat TCR KO細胞。在擴增倍數方面，較低殺稻瘟菌素濃度似乎毒性較小，即使三種經測試抗生素濃度之間的差異較小。此外，已表明在較早時間點移除殺稻瘟菌素使選擇繼續且產生比在完全7天選擇期間使細胞暴露於抗生素略微更佳之擴增倍數。
GMP 袋中之 Jurkat 細胞與 APC 共培養物使得 CD69 活化標記物與於 96 孔圓底板中之共培養物的表現相當。
提高篩選平台之可擴展性亦需要將經建立96孔圓底板共培養型式最佳化至大量效應及目標細胞之更高效處理同時維持TCR覆蓋度之設置。進行的前述研究表明，在具有比96孔板之孔更大的表面積之平底細胞培養容器中進行共培養使得Jurkat細胞之CD69表現降低。另外，不同的E:T比率及此類共培養物之起始細胞密度不引起效應細胞之CD69上調增加(資料未示出)。此資料表明，圓底培養容器，諸如96孔圓底板產生更高效之效應與目標接觸。因此，決定鑑別將增強在單一培養基容器中之效應與目標接觸且允許處理較高細胞數目個更大規模共培養系統。
為了比較不同共培養系統，使用其中40-50%之CD8+ Jurkat細胞為TCR陽性的作為效應細胞，以便得到透明CD69陽性及陰性群體(圖19a、19b、19c、19d，左側)。作為目標細胞，利用表現HLA-A*02:01之EBV永生化B細胞(EBV LCL)，其經工程改造以表現由TCR表現Jurkat細胞(EBV LCL TMG2.1)鑑別之抗原。
增強效應與目標接觸首先藉由在安置於托架上之15及50 ml Falcon管中進行共培養來檢查。由於Falcon管未經細胞培養物處理，故在共培養20小時之後，使用少量細胞(≤2×106 個細胞，基於96孔板之孔與15/50 ml Falcon管之間的直徑按比例擴大)來評定細胞存活率及效應細胞活化。活細胞及CD69+ 細胞之百分比在96孔板及Falcon管中之共培養物之間相當(圖19a)。然而，將細胞數目增加至38×106 使得細胞存活率急劇降低(圖19a)。
值得注意的是，因為CD69上調為Jurkat細胞活化之唯一量度，所以若抗人類CD69抗體(純系FN50)具有CD69表現之準確表示，則進行檢驗。抗人類CD69抗體針對不同抗原決定基(純系CH/4)之共同染色揭露了兩種不同抗體純系之間的類似量之染色(圖27)。
隨後，檢查Falcon管共培養物中之細胞損失是否歸因於與氛圍接觸之培養基的較小表面積阻礙了高效的氣體交換。為了評定，將Falcon管短暫離心且自具有38×106 個細胞之管取出14 ml培養基，得到1 ml總體積。然而，在與38×106 細胞共培養物之Falcon管中觀測到細胞存活率急劇下降(圖19b)。另外，進一步測試250 ml管中之共培養物，因為此等容器具有更寬直徑且可允許發生更高效的氣體交換(未短暫離心，因為適當離心轉子不可用)。儘管250 ml管共培養物產生與96孔板共培養物類似之CD69上調，但細胞死亡增加(圖19b)。
得出結論，由於細胞死亡增加，在(Falcon)管中進行大量細胞之共培養物無法存活。此對細胞存活率之作用可能歸因於低效的氣體交換及放置於(Falcon)管中之較大細胞數目。因此，在MACS GMP細胞分化袋500 (簡言之，GMP袋)中評估細胞存活率及效應與目標接觸，該分化袋為可容納大量細胞且允許在袋子之整個表面區域中發生氣體交換的培養容器。
當前TCR庫篩選平台允許篩選10,000個TCR且需要170×106 效應與目標細胞之共培養物以便維持TCR覆蓋度。因此，將與170×106 個Jurkat細胞及APC之共培養物設置於GMP袋中。
在替代方案中，篩選平台可包括80×10^6個效應細胞及80×10^6個目標細胞，因此該值可為160×10^6。在替代方案中，共培養物可設置有90×10^6個細胞，因為由於使用多通道，可損失約10%且可希望確保一者保持至少80×10^6個細胞。
為了增強效應與目標接觸且允許高效的氣體交換，將GMP袋水平置放於圓形濾器中(圖19c)。在20小時共培養之後，在GMP袋與96孔板共培養物之間觀測到相當的細胞存活率及CD69上調。然而，在GMP袋條件中CD69 MFI略微降低(圖19c)。因此，評定短暫離心GMP袋是否會增加CD69 MFI。為了能夠短暫離心GMP袋，將其垂直置放於離心轉子中且移動至濾器而不干擾細胞。未短暫離心之GMP袋亦直立放置。CD69+ Jurkat細胞之百分比及MFI在GMP袋與96孔板共培養物之間相當。另外，取決於在20小時共培養之前是否短暫離心效應與目標細胞，在CD69表現方面未觀測到重大差異(圖19d)。然而，在GMP袋中在共培養20小時之後細胞存活率降低。出人意料地，在不同GMP袋之間細胞損失之量不同(圖19d)。
總而言之，資料表明，GMP袋中之共培養物產生與已建立之96孔板共培養型式類似的效應細胞活化。然而，需要進一步研究(例如置放袋之不同方式)以便檢查圖19d中細胞死亡增加之原因。
CD25及CD62L展現出與CD69組合之雙步驟基於珠粒之選擇的有前景的表現概況。
迄今為止，在20小時共培養及流式細胞測量術分選之後，已將CD69用作選擇TCR庫篩選平台中之經活化Jurkat細胞的活化標記物。為了評定更可調式基於珠粒之選擇方法，除了CD69之外，亦探究兩個補充T細胞活化標記物CD25及CD62L之表現概況。出於彼目的，在與表現同源抗原之目標細胞共培養之後，進行經TCR轉導的Jurkat細胞之CD69、CD25及CD62L表現之縱向分析。
在共培養開始之後，Jurkat細胞之CD69上調似乎保持穩定16至32小時(圖20a)。相比之下，CD25+ 及CD69+ CD25+ 效應細胞之表現概況展現出24小時時間點之略微上調(圖20b、20c)。進一步觀測到CD62L下調在共培養起始之後的16與20小時時間點之間略微增加，且保持穩定直至32小時時間點。然而，當使用CD62L作為活化標記物時，背景信號較高，因為未經刺激經TCR轉導的及未經轉導的Jurkat細胞在開始共培養之後所分析之不同時間點處在20-40% CD62L陰性之間(圖20d)。CD69與CD62L之共表現分析揭露，非特異性下調之CD62L表現的效應細胞不上調CD69。此外，可在共培養起始之後16至32小時觀測到具有上調的CD69但缺乏CD62L表現之經活化Jurkat細胞群體(圖20e)。
CD25及CD62L在此基本縱向分析中展現出有前景的表現概況，此係因為其表現與CD69上調相關，表明其可潛在地用於與CD69組合之雙步驟基於珠粒的選擇方法。
慢病毒NFAT報導系統在Jurkat及初級T細胞中產生較高背景信號。
在TCR庫篩選過程中使用內源性細胞表面活化標記物以選擇反應性TCR之替代方法為在Jurkat細胞中設置基於NFAT之報導系統。設置此報導系統可允許經活化Jurkat細胞之抗生素選擇，其將避開流式細胞測量術分選。或者，抗生素抗性盒可由適用於基於珠粒之富集的任何細胞表面標記物替換。
設計出四種不同的基於NFAT之慢病毒報導載體。自身不活化(SIN)慢病毒質體含有截短的無活性5' LTR啟動子，且因此在整合至基因體中後，嘌呤黴素抗性報導基因之轉錄應僅取決於NFAT轉錄因子與NFAT結合位點41 之結合。構築體中之三者含有兩個、四個或六個相同NFAT結合位點，接著為最小IL2啟動子。第四載體由包含至少三個不同NFAT結合位點之完整IL2啟動子製成(圖21a)6 。研究不同的基於NFAT之報導質體以確定最敏感的報導子。
將基於NFAT之慢病毒載體與額外pmaxGFP質體共轉染至HEK293T細胞中。在轉染後三天，將產生病毒之細胞的暫時性GFP表現用作轉染效率之量度。HEK293T細胞為100% GFP+ ，表明慢病毒轉染為成功的(圖21b)。隨後，將慢病毒上清液轉導至Jurkat TCR KO細胞中，隨後使其暴露於非生理PMA/離子黴素刺激24小時，以評估報導系統之功效。已表明，NFAT活化在刺激38 後72小時達到最大。因此，PMA/離子黴素刺激之後為3天嘌呤黴素選擇。然而，經NFAT轉導的Jurkat細胞之細胞存活率急劇下降且在經暴露的嘌呤黴素轉導之與未經轉導的細胞之間相當(圖21c，前側圖)。活化細胞為＞99% CD69+ ，意指刺激為高效的(圖21c，後側圖)。
將經NFAT轉導的經嘌呤黴素選擇之細胞擴增20天且進行第二輪刺激及選擇。應注意，此實驗中未經轉導的Jurkat細胞與圖21c中未經轉導的細胞不同。使用各種濃度之嘌呤黴素刺激PMA/離子黴素，繼之以4天選擇，在經刺激及未經刺激經NFAT轉導的細胞之間的細胞存活率方面無顯著差異(圖21d)。出人意料地，經轉導的細胞之CD69表現低於未經轉導的細胞之表現(圖21d)。一種解釋可能為，經NFAT轉導的Jurkat細胞並未自第一輪非生理PMA/離子黴素刺激完全還原。
綜合而言，此資料表明，在T細胞刺激之後不存在嘌呤黴素抗性經NFAT轉導的Jurkat細胞之富集。儘管pmaxGFP質體之轉染為高效的，但慢病毒構築體之轉染及轉導可能不成功(圖21b)。其他可能的解釋可為次佳抗生素選擇或漏泄報導系統。為了解決以上提及之情境中的一些，用含有EGFP報導基因之NFAT報導基因構築體進行以下實驗(圖22a)。在替代方案中，報導基因可為適用於基於珠粒之選擇/抗生素抗性基因之任何細胞表面標記物。
藉由使用EGFP NFAT質體，慢病毒轉染效率可藉由HEK293T細胞之CMV驅動式GFP表現讀數直接評定。此揭露了PEI為比FuGENE更高效的慢病毒轉染劑(圖22b)。為了研究報導系統之功效，用PMA/離子黴素刺激經NFAT轉導的Jurkat TCR KO細胞(PEI轉染) 24小時且每24小時讀出GFP表現持續三天。就GFP+ 細胞之百分比及MFI而言，在經刺激及未經刺激Jurkat細胞之間未觀測到任何基於NFAT之載體的顯著差異(圖22c)。在活化時CD69上調揭露了PMA/離子黴素刺激為高效的(圖22c)。總而言之，此資料表明，慢病毒NFAT報導系統在Jurkat細胞中具有極高背景信號。
隨後評價在經NFAT轉導的初級T細胞中是否亦觀測到類似的背景信號。出於彼目的，使用兩種基於NFAT之慢病毒載體：NFAT4x及新的NFAT4x。相對於NFAT4x，新的NFAT4x不含最小IL2啟動子，但為較不複雜的，稱為minP。MinP先前已由Jutz等人38 描述。將來自兩個健康供體之初級T細胞用NFAT慢病毒上清液轉導且隨後用PMA/離子黴素刺激24小時。每24小時量測GFP表現持續三天。與Jurkat細胞之資料相反，與未經刺激之條件相比，在經刺激條件下觀測到GFP+ 細胞之百分比及MFI略微較高，即使此等差異並非高度顯著的(圖23)。另外，使用具有不同最小啟動子之NFAT4x構築體不引起經轉導的T細胞中更特異性GFP表現。儘管PMA/離子黴素刺激時CD69未上調，但在經刺激及未經刺激經NFAT轉導的細胞之間的GFP表現之變化為高效的(圖23)。
總而言之，資料表明，基於NFAT之報導載體的慢病毒遞送在Jurkat及初級細胞兩者中產生較高背景信號。
將NFAT報導基因構築體非病毒遞送至Jurkat細胞中引起較高背景信號。
隨後藉由設計出兩種不同構築體(NFAT0x及NFAT4x)研究非病毒NFAT報導系統在Jurkat細胞中之功效(圖24a)。NFAT0x不含任何NFAT結合位點且因此充當評定最小啟動子之背景信號的對照。兩種質體均含有EGFP報導基因且組成性表現為E2深紅及嘌呤黴素抗性基因。藉由用兩個NFAT質體電極化Jurkat細胞，該等構築體將隨機變成線性化的且將整合至基因體中之任意位置中。因此，預期轉染效率較低。然而，質體在其基因體中之穩定整合的Jurkat細胞將藉由進行嘌呤黴素選擇而富集。將藉由刺激經選擇Jurkat細胞進一步評估NFAT背景信號。
用NFAT構築體轉染之表現CDK4-17之Jurkat TCR KO細胞隨時間推移未呈現出細胞存活率之主要降低(圖24b)。出人意料地，在電穿孔後兩天，觀測到GFP+ 及GFP+ E2深紅+ 細胞增加，其對於經NFAT0x轉染的Jurkat細胞更為顯著。在轉染之後六天此等兩個細胞群體之減少暗示雙陽性及GFP單陽性表現為暫時的(圖24c)。在轉染後六天，起始嘌呤黴素選擇持續七天。在選擇期間，E2深紅及GFP單及雙陽性Jurkat細胞之百分比增加(圖24c)。在嘌呤黴素處理之後七天，因為不存在存活的未經電穿孔的Jurkat細胞，所以選擇似乎為完全的(圖24d)。然而，GFP+ 及GFP+ E2深紅+ 細胞之百分比與經NFAT轉染的Jurkat細胞之E2深紅表現相當。此表明NFAT報導質體之非病毒遞送亦產生較高背景信號。關於實例 19 之論述
藉由集中於新抗原特異性TCR之鑑別來治療癌症之完全個人化TCR基因療法非常有用。此方法依賴於遺傳篩選且因此需要大量表現TCR之Jurkat細胞及APC之處理。為了能夠治療許多患者，篩選平台應允許高效處理效應細胞及目標細胞，而不影響篩選敏感性。此處，提出所進行之研究，以增強新抗原反應性TCR分離平台之可擴展性。經 TCR 轉導的 Jurkat TCR KO 細胞之 殺稻瘟菌素選擇
在將TCR庫之反轉錄病毒基因轉移至Jurkat TCR KO細胞中之後，高效選擇方法適用於富集表現TCR之Jurkat細胞而不會造成毒性及損失TCR覆蓋度。為此目的，已表明，抗生素殺稻瘟菌素使得高效選擇CMV-1及CDK4-17經TCR轉導的Jurkat TCR KO細胞(圖18及資料未展示)。即使不同殺稻瘟菌素濃度與所測試之殺稻瘟菌素選擇方法之間的差異並非主要的，但選擇經CMV-1轉導的細胞持續七天(起始密度為0.25×106 個細胞/毫升)及在培養第4天移除4 µg/ml殺稻瘟菌素，產生＞90% mTCRβ+ CD8+ Jurkat細胞之富集及最高擴增倍數(圖18)。
然而，此選擇方法產生用10,000個TCR轉導的約70% mTCRβ+ CD8+ Jurkat細胞。另外，在共培養分析之前，在Jurkat細胞擴增時mTCRβ+ CD8+ 細胞之百分比進一步下降(資料未示出)。因此，對於用源自患者之TCR庫轉導的Jurkat細胞之富集，使用6 µg/ml殺稻瘟菌素選擇及在第4天添加新的殺稻瘟菌素標準化地應用以達成＞70% mTCRβ+ CD8+ Jurkat細胞群體(資料未示出)。此外，應用0.5×106 個細胞/毫升之起始細胞密度，以便降低所需培養燒瓶之量。
使用兩種已知TCR進行殺稻瘟菌素選擇研究，而患者篩選涉及轉導10,000個未經表徵TCR。因此，表現TCR庫之Jurkat細胞的抗生素選擇可能需要比表現單TCR之細胞的富集更苛刻的處理。在Spindler等人之研究中進行類似觀測，其中使用嘌呤黴素選擇表現TCR庫之Jurkat細胞持續14天。在選擇42 之後CD3+ TCRαβ+ 細胞富集約10%至約50%。
若在第4天添加殺稻瘟菌素導致具有較低mTCRβ MFI之表現TCR的細胞之損失，或若觀測到的MFI之差異僅為由於較長抗生素處理引起之Jurkat細胞之表型變化之結果，則仍解決該問題(圖26)。此外，若較低轉導效率(＜10% mTCRβ+ CD8+ )引起TCR覆蓋度減少，則將適用於測試。此等問題可藉由將不同TCR庫轉導成Jurkat細胞且對富含殺稻瘟細胞之TCR進行定序來解決。
總之，用以發現富集經TCR轉導的Jurkat細胞之最最佳且高效選擇方法之方法表明使用已知TCR之研究為有用的。然而，來自實驗之發現將進一步證實且可涉及在篩選未知TCR庫時之額外調節。GMP 袋中之 Jurkat 細胞與 APC 共培養物
為了進一步增強篩選平台之可擴展性，Jurkat細胞與APC共培養物型式涉及自經建立96孔圓底板型式擴大。
吾人理解此研究首先為檢查GMP袋中新的共培養物型式在產生與96孔板中之共培養物類似的CD69表現之功效(圖19c、19d)。GMP袋可以模擬96孔板之圓底孔的方式摺疊且因此增強效應與目標接觸。此外，GMP袋允許在其整個表面積上之高效的氣體交換以防止細胞損失。然而，如圖19d所見，與96孔板共培養物相比，GMP袋中之共培養物引起細胞死亡增加。細胞存活率之降低可能歸因於較短自旋步驟所需之GMP袋的不同放置。在GMP袋底部收集細胞，該等GMP袋可能為不允許高效氣體交換之培養容器的唯一部分。應注意，在圖19c中，未短暫離心GMP袋，且在袋之側面收集細胞，其可能為細胞存活率不受影響之原因。儘管GMP袋共培養物之重複序列適用於進一步檢查圖19h中之細胞死亡的原因，觀察結果強調需要建立在培育箱中置放可撓性GMP袋之一致方式。舉例而言，可設計具有適當形狀同時亦維持CO2 透過率之澆鑄件。
將GMP袋用於Jurkat細胞與APC共培養物之另一益處為可添加更多細胞同時維持類似的細胞密度。此可允許篩選大於10,000種TCR。另外，GMP袋為將大幅度降低交叉污染之可能性的封閉系統。
值得注意的是，評定僅基於T細胞活化標記物CD69之表現的不同共培養系統之功效。此實驗設置不考慮GMP袋共培養物可能具有TCR覆蓋度之效應。為研究其，可將表現TCR庫之Jurkat細胞與APC在GMP袋及96孔板中同時培養。此後將為所建立的經活化Jurkat細胞之基於CD69的流式細胞測量術分選及下一代定序以比較特異性TCR之富集。
額外實驗將評定在GMP袋中進行共培養對TCR分離方法之影響。然而，初步資料表明一種將提供至少10,000個TCR之庫篩選中效應與目標細胞之高效處理的有前景之共培養系統。用基於珠粒之選擇替換基於流式細胞測量術之分選
一些TCR篩選平台目前涉及在共培養之後對表現CD69之Jurkat T細胞進行流式細胞測量術分選，以鑑別新抗原特異性TCR。然而，經活化Jurkat細胞的基於珠粒之選擇將增強TCR篩選平台之可擴展性。因此，決定評估用於基於珠粒之選擇的額外或替代性活化標記物，其較佳在經活化及未經活化Jurkat群體之間產生明顯分離。
用兩個額外T細胞活化標記物(CD25及CD62L)進行縱向共培養分析揭露了CD25表現之非均質性大於經活化Jurkat細胞之CD69表現的非均質性(圖20a、20b)。另外，CD62L下調不僅僅對經活化Jurkat細胞具有特異性，因為一些未經轉導的及未經刺激之經TCR轉導的效應細胞對於CD62L為陰性的(圖20d)。因此，對於單標記物基於珠粒之選擇方法，此等兩個活化標記物並非有吸引力的候選物。然而，CD25及CD62L可用於依序基於珠粒之選擇程序中，涉及CD62L+ 或CD25+ 效應細胞之耗乏或富集，繼之以藉由CD69陽性選擇分別捕獲經活化細胞。值得注意的是，CD25+ 及CD69+ CD25+ 群體在24小時時間點之後略微升高。然而，考慮到CD25已表現為晚期活化標記物43 ，此並非出人意料的。此亦表明後續時間點將為最理想的，以便使用此等兩種活化標記物分析效應細胞。據報導CD62L排出在T細胞活化之後約四小時達到峰值，且因此為早期活化標記44 、 45 。一項研究表明，在4小時峰值之後，CD62L經歷動態表現概況44 。然而，此處在20小時共培養之後觀測到CD62L之極穩定下調，該下調遵循與CD69上調類似之模式(圖20a、20d)。此將允許吾等在Jurkat細胞活化之後用CD69及CD62L進行共表現分析持續16-32小時(圖20e)。然而，此縱向分析需要用不表現同源肽之EBV LCL共培養經TCR轉導的Jurkat TCR KO細胞重複。此將允許對三種活化標記物之背景信號的更準確估計。
最後，檢查允許經活化Jurkat細胞之抗生素選擇或基於珠粒之富集的慢病毒NFAT報導系統之功效。然而，NFAT載體之慢病毒遞送在Jurkat及初級細胞兩者中產生較高背景信號(圖22及圖24)。採用此報導系統之研究主要依賴於具有最小背景信號之純系群體37 、 38 。使具有嘌呤黴素抗性報導基因之經NFAT轉導的Jurkat細胞暴露於兩輪抗生素選擇(圖21)。然而，儘管在初始抗生素治療之後得到半純系群體之假設，但在第二次選擇之後經刺激及未經刺激Jurkat細胞之間不存在明顯差異。另一解釋可能為在第二次嘌呤黴素選擇之前的次佳非生理性PMA/離子黴素刺激，其得到＜30% CD69+ 經NFAT轉導的Jurkat細胞(圖21d)。另外，經刺激及未經刺激EGFP經NFAT轉導的Jurkat細胞之間不存在明顯差異(圖22)。因此，選擇純系將為不可行的，因為此缺乏差異性GFP表現。結果表明報導系統滲漏並非由最小IL2啟動子引起，因為另一最小啟動子minP揭露了類似背景量(圖23)。因此，得出結論，滲漏可能為慢病毒遞送系統之特徵。
已成功使用及設置SIN NFAT反轉錄病毒載體以研究抗原特異性T細胞反應37 、 38 、 40 。NFAT質體之非病毒遞送亦產生較高背景信號，因為報導EGFP基因之表現在未經刺激Jurkat細胞中升高(圖24)。然而，需要T細胞活化來進一步評定經NFAT轉染的Jurkat細胞之滲漏。另外，可使E2深紅單陽性群體經受流式細胞測量術分選，隨後在T細胞刺激分析中評估此群體之功效及GFP滲漏。未來研究之領域可為研究AP-1及NF-κB報導系統之敏感性，因為此等轉錄因子利用可能對背景信號38 具有不同作用之不同信號傳導路徑。舉例而言，NF-κB報導系統已成功地應用於篩選Jurkat細胞40 中之嵌合抗原受體庫。
此研究旨在增強新抗原特異性TCR分離平台之可擴展性。此等實驗適用作報導Jurkat T細胞之更高效處理，且APC將最終允許治療更多癌症患者。首先，將經反轉錄病毒TCR轉導的Jurkat TCR KO細胞之殺稻瘟菌素選擇鑑別為最高效且最低毒性效應細胞富集程序。此外，將Jurkat細胞APC共培養物自96孔型式擴大至更可調式GMP袋設置產生與Jurkat細胞活化相當的量。最後，已安排應允許用TCR發現平台中之表現新抗原反應性TCR之Jurkat細胞的更可調式基於珠粒之選擇來置換流式細胞測量術分選。 物質與方法—實例19細胞株
人類Jurkat細胞株(純系E6-1，TIB-152)購自ATCC且人類EBV永生化HLA-A2陽性B細胞株(稱為JY)購自ECACC。在RPMI-1640培養基，補充有10%胎牛血清加熱未活化HEPES (Gibco)、100 U/ml青黴素(Gibco)及100 μg/ml鏈黴素(Gibco)中培養Jurkat及JY細胞株兩者。人類胚胎腎293T (HEK293T，CRL-3216)及Phoenix Ampho細胞株購自ATCC且在補充有10% FBS、100 U/ml青黴素(Gibco)及100 μg/ml鏈黴素之DMEM培養基(Gibco)中培養。所有細胞株均維持在37℃及5% CO2 下。自人類健康供體分離 T 細胞及 B 細胞
在知情同意之後，自Sanquin Blood Supply (The Netherlands)得到健康人類供體之白血球層。使用Ficoll Paque Plus (Sigma-Aldrich)自白血球層分離外周血液單核細胞(PBMC)。
使用利用MojoSort人類PanB細胞分離套組(BioLegend)之陰性選擇分離HLA-A2陽性B細胞且隨後使用人類γ疱疹病毒4 (HHV-4，ATCC VR-1492)進行EBV永生化。EBV永生化B細胞(EBV LCL)在RPMI-1640培養基，補充有20% FBS、100 U/ml青黴素(Gibco)及100 μg/ml鏈黴素(Gibco)中培養。
T細胞用CD3/CD28戴諾磁性珠粒(Dynabead)(歐洲Life Technologies)分離且活化，且在RPMI-1640培養基，補充有10%人類血清(Sigma-Aldrich)、100 U/ml青黴素(Gibco)、100 μg/ml鏈黴素(Gibco)及細胞激素(5 ng/ml人類IL-15及100 IU/ml人類IL-2，Peprotech)之HEPES (Gibco)中培養。所有初級細胞均維持在37℃及5% CO2 下。流式細胞測量術及細胞分選
FACS緩衝液藉由用2% FBS補充PBS (Gibco)來製造。為了進行流式細胞量測分析，將細胞在4℃下在暗處染色20分鐘且用FACS緩衝液洗滌一次。使用活/死的Fixable Near-IR (歐洲Life Technologies，1:1000稀釋度)或DAPI (Sigma-Aldrich，1:1000稀釋度)作為活/死的染料。產生病毒之細胞在4℃下用Cytofix (BD Biosciences)固定30分鐘且在量測之前用PBS洗滌一次。在BD LSR Fortessa上量測樣品且使用FlowJo v10.6.1軟體分析。
對於分選，使收集管塗佈FBS。將20×106 個細胞在15 ml管中每0.5 ml抗體溶液染色。在4℃下在暗處進行染色20分鐘且隨後用10 ml FACS緩衝液洗滌細胞。隨後，在FACS緩衝液中將細胞濃度調節至15-20×106 個細胞/毫升且使樣品通過35 µm細胞過濾器。在分選之前立刻添加DAPI (Sigma-Aldrich，1:1000稀釋度)作為活/死的染料。樣品在FACSAria Fusion上分選。
用於流式細胞測量術及分選之抗體在FACS緩衝液中稀釋。使用以下抗體及稀釋液：抗人類CD8 APC (純系SK1，BD Biosciences，1:300稀釋度)及抗人類CD8 APC-R700 (純系RPA-T8，BD Biosciences，1:600稀釋度)、抗小鼠TCRβ PE (純系H57-597，BD Biosciences，1:150稀釋度)、抗人類CD69 PE/APC/BV510 (純系FN50，BD Biosciences，分別為1:100、1:200及1:300稀釋度)及與CD69 PE (純系CH/4，ThermoFisher Scientific，1:100)、抗人類CD20 FITC (純系2H7，BD Biosciences，1:25稀釋度)及與抗人類CD20 PE-Cy7 (純系L27，BD Biosciences，1:200稀釋度)、抗人類CD25 BV711 (純系2A3，BD Biosciences，1:200稀釋度)、抗人類CD62L APC (純系DREG-56，BD Biosciences，1:25稀釋度)、抗人類CD3 PerCPCy5.5 (純系SK7，BD Biosciences，1:25稀釋度)。注意：除非另外說明，否則抗人類 CD69 純系 FN50 抗體用於 CD69 讀出。 反轉錄病毒轉染及轉導
為了執行反轉錄病毒轉染，將約1.8×106 Phoenix Ampho細胞接種於10 cm培養皿中且在24小時之後使用FuGENE-6 (Promega)作為轉染劑用10 μg pMP71-TCR質體轉染。經轉導的TCR由小鼠恆定區及人類可變區構成，以防止經轉導的TCR與Jurkat細胞株之內源性TCR發生二聚化。因此，不同TCR之轉導效率可藉由用針對小鼠TCRβ (mTCRβ)區之單抗體染色來量測。在轉染之後48小時收集病毒上清液且使其通過0.45 μm過濾器。為了進行反轉錄病毒轉導，用0.5 ml/孔重組人纖維蛋白片段(RN，Takara)塗佈未經TC處理之24孔板，且在4℃下培育隔夜或在室溫下培育2小時。在室溫下用0.5 ml/孔阻斷緩衝液(補充有5% FBS之PBS)阻斷板30分鐘且用PBS洗滌一次。將0.5 ml培養基中之2×105 個Jurkat細胞接種於塗佈有RN之24孔板中且與0.5 ml病毒上清液混合。使板在880xg下短暫離心90分鐘(acc 3，dec 0)。在3至4天之後藉由流式細胞測量術量測轉導效率。慢病毒轉染及轉導
為了進行慢病毒轉染，將約3×106 HEK293T細胞接種於10 cm培養皿中且隨後用10 μg基於pSMPUW-NFAT-IL-2之報導基因構築體藉由使用第三代封裝構築體(pRSV-Rev及pCgpV封裝載體及pCMV-VSV-G封裝載體，Cell Biolabs)及轉染劑聚伸乙亞胺(PEI，1 mg/ml，Polysciences)或Lifpofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific)轉染24小時。對於一些慢病毒轉染，將pmaxGFP (來自SE細胞株4D-Nucleofector X Kit L，Lonza)共轉染為轉染效率之量度。在轉染之後48及72小時收集病毒上清液且使其通過0.45 μm過濾器。在轉導之前，分離初級T細胞且在補充有IL-2及IL-15之培養基存在下用CD3/CD28戴諾磁性珠粒活化(參見「自人類健康供體分離T細胞及B細胞」) 48小時。如「反轉錄病毒轉染及轉導」部分(24孔板中2.5×105 個初級T細胞/孔)中所述，藉由經RN塗佈之板的自旋轉導進行初級T細胞之慢病毒轉導。為了執行Jurkat細胞之慢病毒轉導，將2×105 個細胞再懸浮於1 ml具有凝聚胺(Sigma-Aldrich)之病毒上清液中。將細胞接種於24孔板中且在3至4天之後藉由流式細胞測量術量測轉導效率。經轉導的初級T細胞每3至4天接受具有細胞激素之新鮮培養基。產生 Jurkat TCR KO CD8+ 細胞株
用pMP71-CD8α-P2A-CD8β使Jurkat E6-1細胞株反轉錄病毒轉導以表現CD8。另外，如Scheper等人46 之研究中所述，內源性TCR表現藉由基因剔除TCRα及β鏈來消除。對具有較高CD8表現之單細胞純系進行分選及擴增。電穿孔 Jurkat 細胞
為了達成pMKRQ-NFAT質體非病毒遞送至Jurkat細胞中(圖24)，遵循來自Lonza (目錄號V4XC-1024) Jurkat純系E6.1 ATCC之Amaxa 4D-Nucelofaector方案。共培養分析
自Pepscan訂購CDK4突變型(ALDPHSGHFV)及CMVpp65 (NLVPMVATV)肽。在37℃及5% CO2 下培育1小時之後，將肽以1×106 個細胞/毫升之密度負載在JY細胞上。隨後，用培養基洗滌JY細胞兩次。用編碼一串25聚體多肽之反轉錄病毒載體轉導EBV LCL。此等多肽含有所關注抗原決定基(例如CDK4突變及CMVpp65肽)且稱為串列小型基因(TMG) 2.1。將不具有同源肽或負載有無關肽及未經轉導的EBV LCL之JY細胞用作陰性對照。
效應細胞及目標細胞在共培養之前24小時以較低密度(0.25/0.5×106 個細胞/毫升)接種。除非另外說明，否則在96孔圓底板中用200,000個效應細胞及目標細胞(總體積為200 µl；E:T比率為1:1)進行共培養20小時；在20小時培育之前，將板在1100 rpm下短暫離心1分鐘。圖中包括抗人類CD20抗體，以圈選出目標細胞。
圖19c、19d中所用之MACS GMP細胞分化袋500購自Miltenyi Biotec。試劑
使用以下額外試劑：50 ng/ml佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，Sigma-Aldrich)、1 μM離子黴素鈣鹽(Sigma-Aldrich)、嘌呤黴素二鹽酸鹽(Gibco)、殺稻瘟菌素S HCl (Gibco)。擴增倍數
圖18中之擴增倍數值用作毒性之量度且藉由在選擇之後使總細胞計數除以在選擇開始時之總細胞計數來計算。在第4天針對再接種校正所得值。統計分析
EC50值及統計分析之計算用GraphPad Prism 8進行。在圖23中，執行雙向方差分析，繼之以Sidak之多重比較，且將P值≤0.05視為統計學顯著的(*P≤0.05，**P≤0.01)。參考文獻 1.        Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, et al. IFNγ, and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.Nature . 2001;410(6832):1107-1111. doi:10.1038/35074122 2.        Davis MM, Bjorkman PJ. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.Nature . 1988;334(6181):395-402. doi:10.1038/334395a0 3.        Neefjes J, Jongsma MLM, Paul P, Bakke O. Towards a systems understanding of MHC class i and MHC class II antigen presentation.Nat Rev Immunol . 2011;11(12):823-836. doi:10.1038/nri3084 4.        Weiss A, Littman DR. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors.Cell . 1994;76(2):263-274. doi:10.1016/0092-8674(94)90334-4 5.        Crabtree GR, Clipstone NA. 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此實例描述使用不同效應與目標(E:T)比率自TCR庫還原抗原特異性TCR。
選擇五個經表徵已知抗原反應性TCR (100×100個庫；圖35A)以及95個未經表徵TCR用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成來合成呈片段形式之來自此等TCR的TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒(SEQ ID NO: 1)之連續核酸分子。含有β及α TCR鏈以及嘌呤黴素選擇標記物之反轉錄病毒構築體可用作用於創建庫之架構。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯。每個盒可接合一個呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性型式的TCRβ片段及TCRα片段(SEQ ID NO: 1)。以由Twist Bioscience進行之組合選殖方法合成100個TCR中之每一者的TCRβ及TCRα區且插入載體中。
使用Fugene轉染劑及熟習此項技術者已知之方案將100×100庫轉染至Phoenix-Ampho病毒生產細胞(ATCC CRL-3213)中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞缺乏內源性TCR表現(此類遺傳基因剔除之產生，例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。用TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，產生總活T細胞之25%經TCR修飾的T細胞(基於轉導之後4天(在puro選擇之後且在分析當天)染色，純度＞80%)。使用TCR庫中之鼠類TCR恆定域序列(SEQ ID NO: 1)允許藉由流式細胞測量術使用鼠類TCRβ恆定域特異性抗體偵測經TCR修飾Jurkat T細胞。藉由向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞至較高純度。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
接下來，用經工程改造以呈現抗原之APC刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞。表現TMG之EBV-LCL細胞摻入有10%未經工程改造以表現特異性抗原之EBV-LCL。在共培養之前三天，以較低密度(0.1×106 個細胞/毫升)接種Jurkat報導T細胞。以1:1、1:2及1:3比率濃度為2.5×106 個細胞/毫升使APC與Jurkat報導T細胞混合。進行各E:T比率之單次重複(存在TMG表現)，且包括單次陰性對照重複(不存在TMG表現)。將200 uL (0.5×106 個細胞/孔)分別分佈於經TC處理的U形底96孔板之約360、540或720個孔中。使該等板在1000 rpm下離心1分鐘，且在37℃下培育20至22小時。
隨後，收穫共培養物且用來自Miltenyi之抗CD20微珠粒標記該等細胞且轉移至置放於磁體上之LS管柱中。使用磁性珠粒選擇，將CD20+ 細胞保持在管柱中，同時使CD20細胞穿過管柱且收集於陰性部分中。隨後對CD20細胞用CD20及CD69之螢光標記的抗體進行染色。隨後，使用含有4%甲醛之固定緩衝液固定細胞。使用BD Biosciences ARIAFusion流式細胞測量術分選儀，使以下群體用於各刺激條件(圖35B)： 1.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69hi (CD69hi 包括基於CD69螢光信號之最高10-15%單細胞、CD20- 細胞) 2.  淋巴細胞，單細胞，CD20- 、CD69lo (CD69lo 包括基於較低CD69螢光信號之10-15%單細胞、CD20- 細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且以有限循環量用作多輪PCR之模板，以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb (圖35C)且可使用Oxford奈米孔MinIon或GridIon定序器且可使用熟習此項技術者已知之技術進行定序。使用熟習此項技術者已知之比對技術還原TCR鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體鑑別差異性表現之TCR組合。使用DESeq2 R套裝軟體計算經Rlog轉換的讀數計數，且自頂部樣品之Rlog值減去底部樣品之Rlog值且表示在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下之共培養(圖35D)。5個經表徵TCR描繪為環繞的較大黑點。表示五個經表徵TCR之TCR鑑別以及關鍵統計度量值(圖35E)。
綜合而言，此實例表明，增加目標細胞與效應細胞之比率改進了TCR庫篩選平台之敏感性。 實例21
此實例描述使用基於珠粒之細胞分選策略自藉由基因合成產生之TCR庫中還原抗原特異性TCR。
選擇五個經表徵已知抗原反應性TCR以及95個未經表徵TCR (100×100庫，圖36A)用於TCR庫產生(藉由Twist Bioscience；舊金山/USA進行)。簡言之，藉由DNA合成來合成呈片段形式之來自此等TCR的TCRα鏈及β鏈。對於庫產生，將所有經選擇TCRα及TCRβ片段以組合方式接合於編碼TCRβ-P2A-TCRα盒(SEQ ID NO: 1)之連續核酸分子。含有β及α TCR鏈以及嘌呤黴素選擇標記物之反轉錄病毒構築體可用作用於創建庫之架構。使用此構築體之反轉錄病毒轉導最終引起單一轉錄物之表現，由於在2A位點處之肽裂解，該轉錄物產生TCRβ及α鏈，以及殺稻瘟菌素抗性標記物之轉譯。每個盒可接合一個呈TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性型式的TCRβ片段及TCRα片段(SEQ ID NO: 1)。以由Twist Bioscience進行之組合選殖方法合成100個TCR中之每一者的TCRβ及TCRα區且插入載體中。
使用Fugene轉染劑及熟習此項技術者已知之方案將100×100庫轉染至Phoenix-Ampho病毒生產細胞(ATCC CRL-3213)中。所得反轉錄病毒粒子用於轉導Jurkat報導T細胞株。Jurkat報導T細胞缺乏內源性TCR表現(此類遺傳基因剔除之產生，例如描述於Mezzadra等人Nature 2017中)且使用熟習此項技術者已知之方法經修飾以在用CD8α-P2A-CD8β轉殖基因(SEQ ID NO: 2)轉導後表現人類CD8α及CD8β。用TCR庫轉導Jurkat報導T細胞，產生總活T細胞之25%經TCR修飾的T細胞(基於轉導之後4天(在puro選擇之後且在分析當天)染色，純度＞80%)。使用TCR庫中之鼠類TCR恆定域序列(SEQ ID NO: 1)允許藉由流式細胞測量術使用鼠類TCRβ恆定域特異性抗體偵測經TCR修飾Jurkat T細胞。藉由向細胞培養基添加嘌呤黴素來正向選擇經修飾以表現TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性轉殖基因之Jurkat T細胞至較高純度。經遺傳修飾細胞的抗生素選擇為一般熟習此項技術者所已知。
接下來，用經工程改造而以各種方式呈現源自腫瘤之抗原的APC刺激經TCR轉導的Jurkat T細胞(各1次重複)。在共培養之前三天，以較低密度(0.1×106 個細胞/毫升)接種Jurkat報導T細胞。以1:1比率濃度為2.5×106 個細胞/毫升使APC與Jurkat報導T細胞混合。將200 ul (0.5×106 個細胞/孔)分佈於經TC處理的U形底96孔板之約360個孔中。使該等板在1000 rpm下離心1分鐘，且在37℃下培育20至22小時。
隨後，收穫共培養物且使用死亡細胞移除套組移除死亡細胞。基於多步驟分離策略分離活細胞(圖36B)，用抗CD20微珠粒標記且轉移至AutoMACS (Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)上。使用磁性珠粒選擇，將CD20+ 細胞保持在管柱中，同時使CD20- 細胞穿過管柱且收集於陰性部分中。隨後用CD62L微珠粒標記此等CD20- 細胞以使用autoMACS將未經活化Jurkat細胞與經活化Jurkat細胞分離。在此分離之後，用CD69- 生物素抗體標記陰性(CD62L-細胞)及陽性部分(CD62L+細胞)，且使用抗生物素微珠粒分離CD69-及CD69+部分兩者。收集以下群體用於進一步分析(圖36B)： 1.  CD20- 、CD62L+、CD69-(「頂部」部分未經活化Jurkat T細胞) 2.  CD20- 、CD62L-、CD69+(「底部」部分經活化Jurkat T細胞)
使用熟習此項技術者已知之PCR方法，自基於珠粒之分選經TCR轉導的Jurkat T細胞分離基因體DNA且用作多輪PCR之模板以擴增TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分。所得PCR產物之大小為約1.5 kb (圖36C)且可使用Oxford奈米孔MinIon或GridIon定序器且可使用熟習此項技術者已知之技術進行定序。使用熟習此項技術者已知之比對技術還原TCR鑑別且使用DESeq2 R套裝軟體鑑別差異性表現之TCR組合。使用DESeq2 R套裝軟體計算經Rlog轉換的讀數計數，且自頂部樣品之Rlog值減去底部樣品之Rlog值且表示在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下之共培養(圖36D)。表示頂部樣品中之前7個最具差異性表示之TCR的TCRα及β鏈鑑別以及關鍵統計度量值(圖36E)。
綜合而言，此實例表明，基於珠粒之分選對於使經活化細胞與未經活化細胞分離為成功的，且此技術可用作基於FACS之細胞分離的替代方案使用遺傳篩選方法來鑑別來自TCR庫之抗原特異性TCR的方式。 實例22
此實例描述組合TMG編碼可使用成對TCR富集分析進行解析。此實例表明使用組合TMG編碼之表現TMG-之APC的混合池，及表現由來自TCR庫之TCR鑑別的抗原之TMG之解析的可能性。
組合TMG編碼允許吾人高效地篩選大量TMG而不相應地調整篩選數目，同時維持鑑別來自TCR庫篩選資料之由TCR前導鑑別的TMG之潛能。組合TMG編碼基於製造表現TMG之APC池的原理，且各TMG精確地表示於池之一個組合中。由於池之組合對於各TMG為獨特的，此允許鑑別TCR庫篩選中由TCR鑑別的TMG。可使用成對TCR富集分析來鑑別編碼由來自TCR庫篩選之既定TCR前導鑑別之抗原的TMG，其用以藉由分別特異性分析數對池而非單個池來增加信號強度。
組合TMG設計之一個實例表示於圖37A)中。36個TMG表現於12個池(C1-6及R1-6)中，各池表現6個TMG。表現TMG之APC池可藉由多株APC工程改造(例如多株病毒產生及APC轉導或單株病毒產生、將病毒混合至池中及多株APC轉導)或藉由混合分別表現單TMG之經工程改造APC細胞株產生。作為一實例，若成對TCR富集分析表明APC池C1及R1均可活化既定TCR，則TCR鑑別自TMG1表現之抗原。此係因為TMG1為兩個庫中表示之唯一TMG。雖然在圖37A)中，組合TMG編碼基於恰好兩個池中之TMG的存在，可進行類似組合TMG編碼設計，其中每一TMG存在於恰好3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個池中。在各TMG存在於恰好3個池中之情況下，由既定TCR鑑別之3個池的鑑別將允許鑑別之TMG之推斷。經鑑別之TMG為由所有3個池共用之TMG。
在圖10G)中，顯示三次重複篩選之結果，其包括3個對照篩選，其中表現TCR之報導T細胞與未經工程改造以表現TMG的APC一起共培養；及基於與分別表現單一TMG之APC細胞株之池的共培養物的3次篩選。如上文所述之組合TMG編碼(其中各TMG恰好表示於2個池中)涉及基於兩次重複之篩選方法中足夠TCR鑑別敏感性。為了統計分析來自圖10G)中之資料的差異性表示之TCRα×β鏈組合，使用DESeq2 R套裝軟體。如圖37B)及37C)中所示，基於3次重複中之2次，吾人測試在CRC患者篩選(圖10G)中鑑別之TCR前導的排名或顯著性是否為類似的。如圖37B)中所示，當選取7個TCR前導用於pt2時，將基於3次重複中之2次的任何組合之組合分析來選取相同TCR。以類似方式，針對圖10G)中所鑑別之TCR前導中之任一者，將已基於使用3次重複中之2次選取相同TCR (之組)(圖37C；「Rank」管柱)用於統計分析。另外，對於4種CRC患者TCR庫篩選中所鑑別之TCR前導中之任一者，基於2或3次重複之統計分析的經調節p值為類似的(圖37C)。此表明2次重複足夠進行TCR鑑別且對使用3次重複之篩選具有類似敏感性。此允許使用組合TMG設計鑑別經鑑別TMG，其中每一TMG在TMG池中準確地表示兩次。
為了測試成對TCR富集分析之敏感性以解析來自組合TMG編碼設計之TMG鑑別，選擇六個pt4樣品(各自由頂部及底部樣品組成)用於分析(圖37D)。對於頂部樣品相對於底部樣品中之TCR的差異性表示，使用DESeq2分析6個樣品之所有15種可能成對組合。使用相互作用模型用於分析，其中將頂部樣品相對於底部樣品中之TCR富集與頂部樣品相對於所有其他池之底部樣品中之TCR富集進行對比。所有經調節p值均按自最低至最高p值的順序排列，且表示於圖37E)。其餘兩個經調節p值突出。此等表示樣品4及5之成對TCR富集分析中之TCRα9.β14，及樣品3及5之成對TCR富集分析中之TCRα43.β16。此等結果顯示，在樣品4及5中表示之TMG4及在樣品3及5中表示之TMG3編碼由此等相應TCR鑑別之抗原。
綜合而言，此實例表明分別表現多個TMG之APC池可用於針對大量小型基因執行TCR庫篩選，且此組合TMG編碼方法允許鑑別抗原反應性TCR以及表現經鑑別抗原之TMG。 實例23
此實例描述TCR特徵可源自遺傳篩選資料。此實例表明，TCR庫篩選方法對推導TCR特徵具有足夠敏感性。為此目的，將來自TCR鑑別平台之功能性遺傳篩選資料與關於TCR之誘導活化及背景活化的獨立驗證實驗進行比較。
評定圖10G)中鑑別之十六個CRC pt2 TCR對所鑑別TMG (TMG2)之反應性。在遺傳篩選方法中觀測到之活化與驗證實驗中觀測到之活化之間觀測到良好相關性(圖38)；中間圖)。另外，在遺傳篩選方法中觀測到之背景活化與驗證實驗中觀測到之背景活化之間觀測到良好相關性(圖38)；右側圖)。
此等資料表明，可在TCR鑑別之後使用TCR庫篩選方法之獨立實驗中確定之TCR特徵可在篩選階段期間自功能性遺傳篩選資料確定。舉例而言，相對TCR敏感性以及在抗原不存在下之TCR活化可自如圖38)中例示之TCR庫篩選確定。相對TCR敏感性對於確定用於工程改造用於治療癌症患者之T細胞產物的最佳TCR可為至關重要的。在抗原不存在下之TCR活化可構成陰性選擇準則，因為表現此類TCR之經工程改造T細胞可鑑別非癌細胞上呈現之抗原。
可在TCR庫篩選階段期間包括額外篩選以減少需要在篩選階段之後進行TCR表徵分析之數目。此等包括(但不限於) i)使用表現APC之野生型TMG作為對照來篩選，以確定TCR庫篩選階段期間的TCR之突變特異性；ii)使用經工程改造以缺乏I類或II類呈現之必需組分(B2M或CIITA/CD74)及以經工程改造以表現作為對照之TMG的APC來篩選，以確定TCR之I/II類限制；iii)用來自具有不同強度之啟動子的表現TMG之APC來篩選，以確定TCR敏感性。
總之，此實例表明，TCR特徵可由TCR庫篩選確定，該TCR庫篩選之益處為減少需要在TCR庫篩選階段之後進行TCR表徵之實驗數目，且因此可減少自篩選直至且包括TCR表徵所需之總時間量。 實例24：經由分離報導 T 細胞之亞群來自 TCR αβ 庫中還原抗原反應性 TCR ( 「頂部及底部方法」 )
此實例描述經由基於對抗原之反應分離一或多個亞群來自TCRαβ庫中還原抗原反應性TCR。簡而言之，此方法需要以下步驟：i)對報導T細胞進行遺傳工程改造以允許表現TCRαβ庫之TCR；ii)將此等細胞與表現至少一種抗原之抗原呈現細胞共培養；iii)基於T細胞活化標記物使細胞分離成a)表現T細胞活化之一或多種標記物的「頂部」群體；及b)缺乏T細胞活化之一或多種標記物之表現(或較低)的「底部」群體；iv)使用基因體DNA上之PCR及後續深度定序對來自頂部及底部樣品進行TCR鑑別；及v)鑑別相對於底部樣品富集於頂部樣品中之至少一種抗原反應性TCR。T細胞活化之標記物的表現可為定界經活化T細胞(例如CD69)之標記物的相對較高表現量，或定界未經活化T細胞(CD62L)之標記物的相對較低表現量。
頂部-底部方法背後之原理為：抗原反應性TCR在抗原刺激時將變為活化標記物陽性，且因此此類TCR將在頂部群體中相對於底部群體富集。頂部-底部方法由下文所述之各種附圖說明。
在替代性實施例中，底部樣品可為任何參考細胞群體或TCR質體之參考庫。可自與頂部樣品相同但具有較低活化標記物表現之細胞群體分選底部樣品。底部樣品可自表現相關TCR庫之報導T細胞及未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物得到。底部樣品可為用於創建自其分選頂部樣品之報導T細胞的TCR質體庫。在一些實施例中，在差異TCR表示分析期間，可將頂部及底部樣品之TCR表示與任何其他其他樣品之TCR表示進行比較。在一些實施例中，此類額外樣品可為質體TCR庫。在其他實施例中，此類額外樣品可源自表現相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物。
圖39)中之rlog值表示TCR表示之量度。該圖展示經其同源抗原刺激之五個經表徵TCR相對於其他樣品中之任一者富集於頂部樣品中(最淺灰色陰影)。源自與表現TMG之B細胞之共培養物的底部樣品展現出比來自與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞之共培養物的前或底部樣品更低的rlog值。基於此等結果，熟習此項技術者將認識到，使用頂部-底部方法鑑別抗原反應性TCR將對以下各者更為敏感：i)源自與頂部樣品相同之細胞群體，但具有較低活化標記物表現(底部+TMG)之底部樣品；ii)源自與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物之底部樣品。此係因為頂部+TMG與底部+TMG樣品之間的差異大於頂部+TMG與頂部/底部-TMG樣品之間的差異，允許使用前一比較對TCR反應性進行更敏感的偵測。底部樣品(亦即參考TCR表示)可源自相關質體TCR庫(圖39中之黑點)，其與來自與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物之前或底部樣品中之TCR表示相關。
此實例之額外態樣展示於圖39中，其展現來自圖14F、G)之100×100組合庫上之遺傳篩選之額外分析。此實例說明頂部及底部方法，其中底部樣品中之細胞理想地自與頂部樣品中之細胞相同的群體分選，但活化標記物為陰性。在圖39)中，來自圖14F、G)之資料使用DESeq2 R套裝軟體經Rlog轉換且針對五個經表徵TCR中之每一者表示。各點表示獨立重複，且點根據樣品類型著色。頂部樣品表示具有最高CD69表現之前10%細胞，而底部樣品表示自相同細胞群體分選但呈現出較低CD69表現之細胞。在圖16E)中，將頂部及底部方法應用於由24個T細胞株產生之Jurkat hCD8+細胞池上，該等細胞株分別表現具有已知鑑別但具有未知特異性之不同TCR。將此等細胞株以1:1比率混合且將表現CDK4-17、CDK4-8、CMV#1、CMV#2或GCN1L1 TCR之Jurkat hCD8+細胞以1:10,000-1:1,000,000之各種頻率範圍混合。在與表現此等5種TCR之同源抗原之B細胞共培養之後，針對CD69 (T細胞活化標記物)對細胞進行染色。將表現最高CD69之前10% T細胞FACS分選至頂部樣品中，且將表現較低量CD69之大致相等量之T細胞FACS分選至底部樣品中。使用PCR分析基因體DNA上之兩個樣品的TCR含量，接著使用Illumina平台進行下一代定序。計算頂部樣品相對於底部樣品之TCR的相對豐度，且使用此方法觀測到具有已知特異性之所有五個TCR的富集。
在圖13A)-E)，TCR庫藉由將以1:10,000-1:100,000頻率表現六種抗原特異性TCR之質體混合至具有已知鑑別但未知特異性之質體庫中而創建。此質體池用於產生反轉錄病毒且感染Jurkat hCD8+ TCR KO細胞。在報導T細胞之此多株池與表現同源抗原之抗原特異性TCR的B細胞之間進行共培養。將表現最高CD69之前10% T細胞分選至底部樣品中，且將表現較低量CD69之大致相等量之T細胞分選至底部樣品中。(圖13C)。使用PCR分析基因體DNA上之兩個樣品的TCR含量(圖13D)，接著使用Illumina平台進行下一代定序。計算頂部樣品相對於底部樣品之TCR的相對豐度，且使用此方法觀測到具有已知特異性之所有五個TCR的富集(圖13E)。
在圖10A)-J)，組合TCR庫由使用結腸直腸癌(CRC)樣本之批量TCR定序得到的最流行TCRα及TCRβ鏈創建。此庫用於Jurkat hCD8+ TCR KO細胞之反轉錄病毒轉導(圖10D)，其與表現腫瘤特異性新抗原之EBV-B細胞共培養。將表現最高CD69之前10% T細胞FACS分選至頂部樣品中，且將表現較低量CD69之大致相等量的T細胞分選至底部樣品中(圖10E)。使用PCR分析基因體DNA上之所以樣品的TCR含量(圖10F)，接著使用Oxford奈米孔技術進行下一代定序。計算頂部樣品相對於底部樣品之TCR的相對豐度。使用此方法用於三種額外CRC樣本，吾人總共鑑別11種候選新抗原反應性TCR (圖10G)。此等之四者已在獨立共培養實驗中進一步證實(圖10H-K)。
在圖36A)-E)，使用基於珠粒之分選使用autoMACS (Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)分離頂部及底部樣品。使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及95個未經表徵TCR創建100×100個設計之組合TCR庫，其表現於報導T細胞中。在與表現五個經表徵TCR之同源抗原的B細胞共培養之後，使用CD20-微珠粒耗乏B細胞。隨後使用基於珠粒之分選使用CD62L及CD69標記物得到頂部及底部樣品。CD62L為在未經活化T細胞上表現之標記物，且CD69為在經活化T細胞上表現之標記物。將不結合CD62L微珠粒且結合CD69微珠粒之細胞分離至頂部樣品中，且將結合CD62L微珠粒且不結合CD69微珠粒之細胞分離至底部樣品中。使用PCR分析基因體DNA上之兩種樣品的TCR含量(圖36C)，接著使用Oxford奈米孔技術及篩選分析進行下一代定序(圖36D、E)。五個經表徵TCR在相對於底部樣品之頂部樣品中之7個最顯著富集的TCR中。此表明基於珠粒之分選可用作在TCR庫篩選方法中分離頂部及底部樣品之替代策略。
此實例表明頂部及底部方法一般可應用於表現多種TCR之報導T細胞，以允許對抗原反應性TCR進行功能性遺傳篩選。可獨立於創建表現多種TCR之多株報導T細胞之方式應用頂部及底部方法。此藉由鑑別以各種方式得到的來自表現TCR之報導T細胞的抗原反應性TCR來支持：i)藉由混合分別表現單一經定義TCR之報導T細胞株；ii)藉由混合編碼經定義TCR之質體及報導T細胞之多株病毒產生及轉導；及iii)藉由使用TCR庫用於多株病毒產生及轉導報導T細胞。
另外，此實例表明可將頂部-底部方法應用於各種細胞分離及TCR鑑別技術：i)用各種T細胞活化標記物(單獨CD69或CD62L/CD69組合)染色；ii)用各種細胞分選技術(FACS分選及基於珠粒之分選)分離；及iii)用各種下一代定序技術(Illumina及Oxford技術)分析。
在一些實施例中，可將以上實例中之方法(頂部-底部方法)應用於創建TCR庫之任何方法，包含(但不限於)i)圖15中所述之庫設計的各種方式；ii)基於鑑別表現於單細胞內之TCRα及TCRβ鏈序列之TCR定序技術(成對TCR定序)的庫設計；iii)基於TCRα及TCRβ序列之細胞內連接及後續選殖的庫設計。頂部-底部方法可基於藉由任何T細胞活化標記物或T細胞活化標記物之組合進行的細胞分離，該等T細胞活化標記物包括(但不限於)CD69、CD62L、CD137、CD25、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF。頂部-底部方法可應用於任何增殖標記物，包括(但不限於) CellTrace染色。頂部-底部方法可應用於基於任何T細胞活化報導子之細胞分離，包括(但不限於) CD69(啟動子)-EGFRt及CD69(啟動子)-LNGFR報導子。頂部-底部方法可應用於任何細胞分離技術，包括(但不限於)基於FACS之分選、基於微流體之細胞分選及基於珠粒之細胞分選。可使用任何下一代定序技術分析頂部-底部方法，該技術包括(但不限於)使用Illumina、Oxford奈米孔或太平洋生物科學技術(Pacific Biosciences technology)之定序。
810:提供 811:組合庫 814:連續部分 820:引入 822:細胞群體 830:選擇 832:功能特性 840:分離 842:子集 850:確定 860:鑑別 900:方法 910:提供 920:引入 930:選擇 940:分離 950:確定 960:鑑別 812a:變異核酸；核酸 812b:變異核酸；核酸 812c:變異核酸；核酸 816a:變異核苷酸子序列 816b:變異核苷酸子序列 818a:變異核苷酸子序列 818b:變異核苷酸子序列 824a:基因產物 824b:基因產物 826a:成員；核酸成員 826b:成員；核酸成員
圖1繪示還原TCR組庫用於庫產生之方法。
圖2繪示還原TCR組庫且鑑別抗原特異性TCRα及TCRβ序列用於癌症療法之方法。
圖3展示用於TCR表現盒之例示性設計。
圖4繪示用於篩選組合TCR庫之一些實施例。
圖5展示用於治療癌症患者之本文所揭示之方法的例示性應用。
圖6展示TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性盒之示意性實例。
圖7展示組裝TCR表現盒之例示性策略。
圖8展示根據本發明之實施例之篩選方法的示意性實例。
圖9展示根據本發明之實施例之篩選方法的流程圖。
圖10A-圖10J描繪自無活性腫瘤樣本中還原TCR組庫以鑑別新抗原特異性TCR序列。
圖10A為篩選方法之一些實施例的示意圖。
圖10B為描繪TCR純系型數目之圖式。
圖10C為描繪10,000個TCRα×β組合中之每一者之機率密度的圖式。
圖10D為描繪在殺稻瘟菌素(blasticidin)選擇之後所得細胞群體之曲線。
圖10E為使用各種所指示標記物之一系列FACS結果。
圖10F為描繪各種PCR產物之凝膠。
圖10G為描繪在存在(x軸)及不存在(y軸)B細胞之TMG表現的情況下篩選之平均經Rlog轉換讀段計數的一系列繪圖，其表示於10B)-10F)中所述之pt1腫瘤樣品以及以相同方式處理之三個額外MMRp-CRC樣品(pt2、pt3及pt4)。新抗原反應性TCR前導描繪為環繞的較大黑點。
圖10H為描繪步驟10H之曲線。
圖10I為描繪如相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)之CD69陽性所量測之活化的圖式。展示了藉由對照(PARVA-P70R)以及AKAP8L-R191W肽進行之活化。
圖10J為描繪如相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)之CD69陽性所量測之活化的圖式。展示藉由對照(ETS1-R70W)以及TP53-R282W肽進行之活化。
圖10K為描繪如相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)之CD69陽性所量測之活化的圖式。展示藉由對照B細胞(不表現TMG)以及藉由表現MG91 (HSPA9-p.K654RfsX42)或TMG3之B細胞的活化。
圖10L為描繪如相對於陽性對照(用PMA/離子黴素處理)之CD69陽性所量測之活化的圖式。展示藉由對照B細胞(不表現TMG)以及藉由表現MG132 (ITPR3-p.L2379M)或TMG4之B細胞的活化。
圖11A為描繪TCR純系型數目之條形圖。
圖11B為TCR表現質體之示意性圖示。
圖11C為描繪每個患者庫之10,000個α×β組合中之每一者之機率密度的圖式。
圖11D提供每TCR之讀段量、平均覆蓋度及處於中值+/-2 log-單位範圍內的TCR之百分比的範圍。
圖12A為表示純系型數目之條形圖
圖12B為描繪每個患者庫之10,000 TCRα×β組合中之每一者之機率密度的圖式。
圖12C為提供10,000 α×β組合中之每一者之覆蓋度的表。
圖13A為提供24種未知抗原特異性TCR當中六種已知抗原特異性TCR之稀釋度的表。
圖13B為展示選擇後TCR+Jurkat報導細胞之頻率的FACS結果。
圖13C為描繪基於CD69活化標記物之頂部及底部T細胞群體之分選策略的FACS圖。
圖13D為描繪各種PCR產物之凝膠。
圖13E為比較已知抗原特異性TCR及未知抗原特異性TCR之富集與頻率的圖式。
圖14A為摻入有經表徵TCR鏈之50×50及100×100個設計之流程圖。
圖14B為描繪基於CD69活化標記物之頂部及底部T細胞群體之分選策略的FACS圖。
圖14C為描繪各種PCR產物之凝膠。
圖14D為比較頂部樣品相對於底部樣品中之TCR表示相對於此等樣品中之平均表現的變化倍數之圖。
圖14E為提供最富集TCR序列之排名次序及此類TCR之基線平均值、Log(2)變化倍數及經調節p值的表。
圖14F為比較在不存在抗原下之TCR反應性與抗原存在下之TCR反應性的圖。
圖14G為呈現富集於篩選中之抗原特異性TCR及未知特異性TCR之機率的圖式。
圖15A為描繪TCR盒之組合組裝的示意圖。
圖15B為描繪TCR庫中TCRα鏈、TCRβ鏈及TCRαβ組合之機率密度的一系列圖式。
圖15C及圖15D為描繪構成較高複雜性TCR庫之替代策略的圖式。
圖15E描繪存在於兩個200×200個TCR庫中之TCR組合的機率密度，該等庫由四個100×100個庫合成且以1:1:1:1等莫耳比率混合而產生。
圖15F描繪使用200×200個庫篩選方法之pt2的TCR鑑別。
圖15G表示100×100及200×200庫篩選中100×100篩選中所鑑別之pt2 TCR的統計行為之表。
圖16A為展示CD69+細胞百分比與用於脈衝APC之CMV肽的量之關係的圖式。
圖16B為描繪CD69+細胞百分比與細胞接種密度之條形圖。
圖16C為描繪CD69+細胞百分比與效應與目標比率及培養容器之關係的條形圖。
圖16D為描繪CD69+細胞百分比與經接種效應細胞之數目及所用抗原肽之量的一系列條形圖。
圖16E為展示富集至各種TCR之程度的條形圖。
圖17a-c.用經CDK4及CMV轉導之Jurkat TCR KO細胞進行肽滴定分析。(17a )用CDK4-8或17 TCR或用CMV-1或2 TCR反轉錄病毒轉導Jurkat TCR KO細胞。經轉導TCR由小鼠恆定區及人類可變區構成。隨後，分選mTCRβ+ CD8+ 群體。前側圖展示分選之前的細胞及後側圖展示分選之後的細胞。(17b ：CDK4，17c ：CMV)在與負載有分級濃度之同源肽的JY細胞(E:T比率為1:1)共培養20小時之後，如藉由CD69上調評定經TCR轉導或未經轉導Jurkat細胞之活化。EC50值描繪於圖式圖例中。將PMA/離子黴素刺激用作陽性對照，且將在不具有負載有最高濃度(1 μg/ml)之不相關肽的JY細胞及具有JY細胞之情況下的培養用作陰性對照(描繪於各圖之右側)。一式三份地進行分析(一式兩份地進行具有CDK4突變型肽之未經轉導的Jurkat細胞)。資料展示為平均值±s.d(誤差條僅展示於肽滴定曲線中)。n=1。NT：未經轉導的。
圖 18a-18e .殺稻瘟菌素選擇具有不同轉導效率之經CMV-1轉導的Jurkat TCR KO細胞。(18a)用不同體積之CMV-1-殺稻瘟菌素反轉錄病毒上清液轉導Jurkat TCR KO細胞，以達成不同轉導效率。對未經轉導及經TCR轉導的Jurkat細胞進行CD8及mTCRβ染色。(18b、18c、18d、18e)以0.25×106 個細胞/毫升之濃度接種具有不同CMV-1轉導效率之Jurkat TCR KO細胞且用不同殺稻瘟菌素濃度選擇。四天後，藉由移除殺稻瘟菌素(稱為「在第4天移除殺稻瘟菌素」)或添加具有相應濃度之新的殺稻瘟菌素(稱為「在第4天添加新的殺稻瘟菌素」)以0.25×106 個細胞/毫升之密度再接種細胞。(18b、18d)在開始殺稻瘟菌素選擇之後六天或七天，總活細胞及mTCRβ+ CD8+ 細胞之擴增倍數。(18c 、 18e )分別在起始殺稻瘟菌素選擇之後六天或七天，mTCRβ+ CD8+ 細胞之百分比。n=1。NT：未經轉導的。
圖 19a-19d .擴大 Jurkat 細胞與 APC 共培養物。 (a 、 b 、 c 、 d - 左側 )在各實驗中效應Jurkat細胞之CD8及mTCRβ表現。Jurkat細胞用(19a )由16個TCR構成之TCR庫轉導，其中之四個對TMG2.1內所含有之抗原具有特異性，或用(19b 、 19c 、 19d ) CDK4-17 TCR轉導。(19b 、 19c )雙陰性群體為由於其CD20表現較低而不可能圈選出之目標細胞。(19a 、 19b 、 19c 、 19d - 右側 )用表現TMG2.1之EBV LCL進行共培養持續20小時(E:T比率為1:1，2.5×106 個細胞/毫升細胞密度)。將未經轉導的EBV LCL用作陰性對照。繪製總活細胞及CD69+ 效應細胞之百分比。綠色文字指示哪些條件在1100 rpm下短暫離心1分鐘(較短自旋)。所用總細胞數目：0.5×106 個細胞(96W)，≤2×106 個細胞(分別為含1.3/2×106 個細胞之15/50 ml Falcon)，170×106 個細胞(GMP袋)。(19c )一式三份或(19d )一式兩份地進行96W共培養。資料展示為平均值±s.d.。n=1。96W，96孔圓底板。GMP袋，MACS GMP細胞分化袋-500。*來自較低數目個活細胞之資料。
圖 20a-20e .T 細胞活化標記物 CD69 、 CD25 及 CD62L 之縱向分析。 以1:1之E:T比率在存在(CDK4-8：圓圈，CMV-1：三角形)或不存在(CDK4-8：矩形，CMV-1：倒三角形)表現TMG2.1之EBV LCL的情況下培養經CDK4-8或CMV-1 TCR (＞80% mTCRβ+ CD8+ 細胞)轉導的Jurkat TCR KO細胞16、20、24、28及32小時，接著對效應細胞之CD69、CD25及CD62L表現進行多色流式細胞量測分析。使用與EBV LCL TMG2.1共培養之未經轉導的Jurkat TCR KO細胞作為陰性對照(菱形)。各代表性點陣圖來自經CDK4-8轉導的Jurkat細胞與EBV LCL TMG2.1之20小時共培養物。該等效應細胞之(20a ) CD69上調、(20b ) CD25上調及(20d ) CD62L下調。進行CD69與(20c ) CD25或(20e ) CD62L之共表現分析。一式三份地進行共培養(展示為平均值±s.d)，n=1。NT：未經轉導的。
圖 21a-21d .評定在 Jurkat TCR KO 細胞中具有嘌呤黴素抗性基因之基於 NFAT 的報導慢病毒載體之功效。 (21a )具有嘌呤黴素抗性盒之四種基於NFAT的報導慢病毒質體的示意性圖示。(21b )藉由使用PEI作為轉染劑將四種載體轉染至HEK293T細胞中。將額外質體(pmaxGFP)共轉染為轉染效率之量度。點陣圖展示在轉染後三天未經轉染且經轉染HEK293T細胞之GFP表現。(21c )將慢病毒上清液與凝聚烯組合用於轉導Jurkat TCR KO細胞。用PMA/離子黴素刺激Jurkat細胞24小時，且隨後用1 µg/ml嘌呤黴素選擇三天。點陣圖呈現活細胞(DAPI- )及CD69+ 未經轉導及經轉導的Jurkat TCR KO細胞之百分比。(21d )使經轉導及嘌呤黴素選擇之細胞擴增20天，以便進行第二輪PMA/離子黴素刺激持續24小時，接著進行具有不同嘌呤黴素濃度之4天嘌呤黴素選擇。繪製活細胞(DAPI- )及CD69+ 細胞之百分比。應注意，NT細胞不同於(c )中之NT細胞。n=1。NT：未經轉導的。
圖 22a-22c 評定在 Jurkat TCR KO 細胞中 EGFP 基於 NFAT 的報導慢病毒載體之功效。 (22a )具有EGFP基因之四種基於NFAT之報導慢病毒質體的示意性圖示。(22b )使用PEI或FuGENE作為轉染劑將四種NFAT載體轉染至HEK293T細胞中。展示轉染後三天之GFP+ HEK293T細胞之百分比。(22c )藉助於凝聚胺作為轉導劑將來自PEI轉染之慢病毒上清液轉導至Jurkat TCR KO細胞中。用PMA/離子黴素刺激經NFAT轉導的Jurkat TCR KO細胞24小時，且每24小時量測GFP表現(展示為GFP+ 細胞之百分比及MFI)持續三天。藉由CD69上調評定Jurkat細胞之活化。n=1。MFI，平均螢光強度。EGFP，增強型GFP。NT，未經轉導的。
圖 23 .評估初級 T 細胞中之 EGFP 基於 NFAT 之報導慢病毒載體的功效。 初級T細胞經用於圖23中之NFAT4x豆狀病毒載體或含有不同最小啟動子(minP)之NFAT4x豆狀病毒載體(NFAT4x新)轉導。用PMA/離子黴素刺激經NFAT轉導的初級T細胞24小時，且每24小時量測GFP表現(展示為GFP+ 細胞之百分比及MFI)持續三天。藉由CD69表現評定Jurkat細胞之活化。n=2個生物上無關之重複(展示為平均值±s.d)。*P≤0.05，**P≤0.01，ns：不顯著(雙向ANOVA，接著Sidak多重比較測試)。MFI，平均螢光強度。NT，未經轉導的。
圖 24a-24d .在 Jurkat TCR KO 細胞中基於 NFAT 之報導基因質體的非病毒遞送。 (24a )兩個NFAT質體之示意性圖示。NFAT0x不含有任何NFAT結合位點且用於評定單獨minP之背景信號。(b 、 c 、 d )將NFAT0x及NFAT4x電穿孔至經CDK4-17轉導的Jurkat TCR KO細胞(約90% mTCRβ+ CD8+ 細胞)中。(24b )在電穿孔之後20小時、2天及6天評定在存在或不存在質體DNA之情況下未經電穿孔或經電穿孔之Jurkat細胞的細胞存活率。(24c )經NFAT轉染的Jurkat細胞之E2深紅及GFP單及雙陽性群體之百分比的縱向分析。在第6天用0.5 µg/ml嘌呤黴素起始抗生素選擇持續七天。在開始選擇之後四天更新嘌呤黴素。(24d )在嘌呤黴素選擇之後七天，細胞存活率(DAPI- 細胞)及GFP及E2深紅表現之點陣圖。n=1。minP，最小啟動子。EGFP，增強型GFP。
圖 25a 、 25b .未經轉導的 Jurkat TCR KO 細胞之 殺稻瘟菌素選擇。 將未經轉導的Jurkat TCR KO細胞以0.25×106 個細胞/毫升之濃度接種且在不同殺稻瘟菌素濃度下經受選擇持續六天。四天後，藉由移除殺稻瘟菌素(稱為「在第4天移除殺稻瘟菌素」)或添加具有相應濃度之新的殺稻瘟菌素(稱為「在第4天添加新的殺稻瘟菌素」)以0.25×106 個細胞/毫升之濃度再接種細胞。(25a )在殺稻瘟菌素選擇之後總活細胞之擴增倍數。(25b )流式細胞測量術圖展示在存在或不存在4 μg/ml殺稻瘟菌素下培養之未經轉導的細胞之FSC-A/SSC-A及CD8/mTCRβ表現。n=1。NT：未經轉導的。
圖 26a 、 26b .具有不同轉導效率之 4 µg/ml 殺稻瘟菌素選擇經 CMV-1 轉導的 Jurkat TCR KO 細胞的 mTCRβ MFI 。 (26a 、 26b )以0.25×106 個細胞/毫升之濃度接種具有不同CMV-1轉導效率之Jurkat TCR KO細胞且用4 µg/ml殺稻瘟菌素選擇。四天後，藉由移除殺稻瘟菌素(稱為：在第4天移除殺稻瘟菌素)或添加新4 µg/ml殺稻瘟菌素(稱為：在第4天添加新的殺稻瘟菌素)以0.25×106 個細胞/毫升之濃度再接種該等細胞。(26a )用殺稻瘟菌素選擇mTCRβ+ CD8+ 細胞之mTCRβ MFI持續六天/七天。(26b )代表性點陣圖展示CD8及mTCRβ染色在開始殺稻瘟菌素選擇之後七天。n=1。MFI，平均螢光強度。
圖 27 .使用兩種不同抗人類 CD69 單株抗體 ， 純系 FN50 及純系 CH/4 量測 T 細胞活化。 實驗設置描述於圖19b之圖例中。對該等細胞進行CD69單獨FN50 (APC)及CD69單獨CH/4 (PE)染色。n=1。96W，96孔圓底板。*來自少量活細胞之資料。
圖28描繪新抗原特異性TCR分離平台之一些實施例。
圖29：藉由實現較大細胞數目個更高效處理同時仍維持TCR覆蓋度來達成TCR分離平台之可擴展性。
圖30：測試殺稻瘟菌素之效率及毒性之方法。
圖31描繪TCR平台分離平台之各種實施例，其可包括所有步驟，或裝箱步驟(例如，1及/或2及/或3及/或4)中之每一者，或線性編號步驟(例如，1至7)中之更多者中的任一者。
圖32描繪SEQ ID NO: 1：表現為TCRβ-P2A-TCRα-T2A-嘌呤黴素抗性表現盒之TCR基因的胺基酸序列；及SEQ ID NO: 4：表現為TCRβ-P2A-TCRα-T2A-殺稻瘟菌素抗性表現盒之TCR基因的胺基酸序列。
圖33：SEQ ID NO: 2：CD8α-P2A-CD8β轉殖基因之胺基酸序列。
圖34：SEQ ID NO 3：HLA-A*02:01-IRES-FusionRed之實例核苷酸序列。
圖35A展示篩選設計之示意圖。使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及95個未經表徵TCR產生100×100個設計之組合TCR庫。
圖35B展示使用CD69標記物，藉由FACS進行T細胞活化的細胞分選結果。
圖35C展示所得PCR產物(其中PCR具有有限數目個週期以擴增來自經分選經TCR轉導的Jurkat T細胞的TCRβ-P2A-TCRα盒之一部分)，其大小為約1.5 kb。
圖35D展示來自圖35C之篩選資料的TCR富集分析。
圖35E展示五個經表徵抗原反應性TCR之特徵。
圖36A展示篩選設計之示意圖。使用來自卵巢癌(OVC)或結腸直腸癌(CRC)樣品之五個經表徵TCR及95個未經表徵TCR創建100×100個設計之組合TCR庫。
圖36B展示用於篩選之分選策略。
圖36C展示TCR表現盒之檢索。
圖36D展示來自圖36C之篩選資料的TCR富集分析。
圖36E展示圖36D中前7種最顯著富集TCR之特徵。
圖37A展示6×6組合TMG編碼設計之示意圖。
圖37B展示所有TCRα×β組合之排名次序隨pt2 TCR庫篩選之重複數目而變的分析。
圖37C展示基於CRC TCR庫篩選之2次或3次重複之統計分析的概述表。
圖37D展示用於成對TCR富集分析之pt4樣品之表。
圖37E展示成對TCR富集分析結果。
圖38展示TCR活化與TCR背景活化在篩選與驗證資料之間的相關性。
圖39表示TCR表示之量度。該圖展示經其同源抗原刺激之五個經表徵TCR富集於頂部樣品中(最淺灰色陰影)。源自與表現TMG之B細胞的共培養物之底部樣品顯示出較低的rlog值。
圖40描繪SEQ ID NO: 1，表現為TCRβ-P2ATCRα-T2A-嘌呤黴素抗性表現盒之TCR基因的圖。
圖41描繪SEQ ID NO: 2，CD8α-P2A-CD8β轉殖基因之圖。
圖42描繪SEQ ID NO 3：K562-HLA-A*02:01-IRESFusionRed之圖。
圖43描繪SEQ ID NO: 4，表現為TCRβ-P2A-TCRα-T2AB殺稻瘟菌素抗性表現盒之TCR基因的圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Claims (145)

  1. 一種自不同T細胞群體中還原T細胞受體(TCR)之組庫的方法，該方法包含： 確定個體之樣品內TCR-α及β核苷酸或胺基酸序列； 自總組庫中選擇TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集； 藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫；及 自所創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對。
  2. 如請求項1之方法，其中基於以下至少一個準則選擇來自該總組庫之該TCRα鏈及β鏈序列之一或多個子集： 該T細胞群體內之頻率， 與第二T細胞群體相比之相對富集， 給定TCR鏈之DNA與RNA複本數之相對差異， 該TCR鏈之生物特性，其中該等特性選自以下中之至少一者：(預測的)抗原特異性、(預測的) HLA限制性、抗原親和力、輔受體依賴性、親本T細胞譜系(例如CD4或CD8 T細胞)或TCR序列模體， 基因表現之空間模式，其中空間基因表現模式源自以下中之至少一者：組織中之起始區域或其他基因之共表現模式， 共同出現或以類似頻率出現在多個樣品中，例如出現在多個腫瘤病變中， 分配至多個組中以分別還原該TCR組庫之特定部分， 如不同實施例所定義之多個準則的組合。
  3. 如請求項2之方法，其中基於該T細胞群體內之頻率的選擇係基於TCR序列之頻率的資料，該資料用於創建針對TCRα鏈及β鏈之單獨排名次序或針對TCRα鏈與β鏈之組合排名次序。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含確定頻率臨限值，該頻率臨限值係基於針對TCR組庫還原之所需深度定義的且用於基於頻率選擇TCRα鏈及β鏈之集合。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中藉由以下中之至少一者確定TCR-α及β序列： 多重PCR； 藉由目標富集之TCR序列還原； 藉由5'RACE及PCR之TCR序列還原； 藉由空間定序之TCR序列還原； 藉由RNA-seq之TCR序列還原； 及使用獨特分子標識符(UMI)。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中所還原TCR鏈序列經定義為CDR3核苷酸序列連同足夠的5'-及3'-核苷酸序列資訊，以基於核苷酸序列比對選擇至少一個TCR V區段及一個TCR J區段家族，從而組裝完整TCR鏈序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中藉由組合配對經選擇TCRα鏈及β鏈序列，創建TCRαβ對之庫，來創建TCR組庫係藉由以下中之至少一者達成： 使用TCR鏈序列來合成TCRα鏈及β鏈DNA或RNA片段之單獨庫，該等片段隨後連接成一個DNA或RNA片段，其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接， 藉由直接合成其中恰好一個TCRα鏈與一個β鏈連接的DNA或RNA片段來產生TCRα鏈與β鏈之組合， 藉由用TCRα基因及β基因之單獨集合修飾細胞池而在胞內創建TCRα鏈與β鏈之組合，其方式為使得細胞將表現至少一個TCRα鏈與一個β鏈，及/或 TCRα鏈與β鏈之組合連接於單鏈TCR構築體中，其中TCRα與TCRβ可變鏈片段兩者融合，且其中該單鏈TCR構築體可融合於(i)單獨跨膜域或(ii)另外含有胞內信號傳導域，包括但不限於單獨或與CD28信號傳導域組合的CD3ε或CD3ζ信號傳導域。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中自該經創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對係藉由以下中之至少一者達成： 經所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種活化標記物分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池用適合於追蹤細胞增殖之螢光染料標記，藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於增殖分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池分成至少兩個樣品；藉由表現至少一種所關注抗原或不表現之抗原呈現細胞刺激樣品；在刺激之後，將兩個報導細胞群體培育一段時間，且隨後藉由TCR分離分析兩個報導細胞群體；比較自兩個樣品得到的TCRαβ對，以鑑別暴露於至少一種抗原之樣品中豐度較高的TCR基因； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於至少一種報導TCR觸發的報導基因，諸如NFAT-GFP或NFAT-YFP，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激，且基於按照選擇性存活對抗原特異性報導細胞的選擇，分離抗原反應性報導細胞用於TCR分離，該選擇性存活包括但不限於在TCR信號傳導時例如藉由使用NFAT嘌呤黴素轉殖基因之獲得性抗生素抗性； 將經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池暴露於一或多個攜帶所關注抗原之MHC複合物；分離結合於MHC複合物之報導細胞用於TCR分離； 經該所產生TCRαβ對之庫修飾的報導細胞池藉由表現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激；隨後，使用基於單細胞之液滴PCR或微流體方法以使TCR分離與至少一種活化標記物之轉錄物含量的偵測組合來鑑別所關注TCRαβ對；藉此在該T細胞池內偵測到單報導細胞，其中TCRαβ轉錄物與增加含量的活化標記物共表現。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該個體之樣品包含無活性起始物質。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中還原經鑑別TCR組庫之經定義部分。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中還原抗原特異性TCR序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中還原I類及/或II類限制型TCR序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中還原以下中之至少一者： 新抗原特異性TCR序列， 病毒特異性TCR序列， 共用腫瘤抗原特異性TCR序列， 自身抗原特異性TCR序列。
  14. 如請求項12之方法，其進一步包含投與表現該等新抗原特異性TCR序列之T細胞作為癌症療法的步驟。
  15. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該方法用於診斷。
  16. 如請求項15之方法，其中該診斷為自感染或自體免疫之病理性部位中還原TCR組庫。
  17. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該方法用於還原BCR/抗體組庫。
  18. 如請求項1至16中任一項之方法，其進一步包含分離來自包含TCR-α及β核苷酸序列之個體的核酸。
  19. 如請求項8之方法，其中該活化標記物選自由以下組成之群：CD25、CD69、CD62L、CD137、IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、OX40。
  20. 如請求項1至18中任一項之方法，其中DNA及RNA分離來自作為不同細胞類型之混合物或組織樣品(諸如血液或腫瘤組織)之一部分的T細胞群體。
  21. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該個體之樣品包含自體液分離之細胞。
  22. 如請求項20之方法，其中該等細胞為腫瘤特異性T細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞。
  23. 如請求項20至21之方法，其中該體液選自由以下組成之群：血液、尿液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、腦脊髓液、唾液、痰、黏膜分泌物、陰道液、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液及腹腔液。
  24. 如請求項1之方法，其進一步包含使用該等TCRαβ鏈序列治療患有癌症、免疫病症、自體免疫疾病或感染性疾病之個體。
  25. 如請求項1至7中任一項之方法，其中自該經創建TCR組庫中鑑別具有所需特徵的至少一個TCRαβ對係藉由以下中之至少一者達成： 基於至少一種活化標記物之鑑別或選擇； 基於回應於抗原之增殖的鑑別或選擇； 基於鑑別與未經刺激細胞相比，經抗原刺激細胞中較高豐度之TCR基因的鑑別或選擇； 基於藉由TCR觸發之報導基因活化之鑑別或選擇； 基於選擇性存活之鑑別或選擇，該選擇性存活包括但不限於TCR信號傳導時之獲得性抗生素抗性； 基於結合至一或多種MHC複合物之鑑別或選擇； 使用基於單細胞之液滴PCR或微流體的鑑別或選擇； 或其任何組合。
  26. 如請求項8之方法，其中TCR分離藉由自批量抗原反應性T細胞分離DNA或RNA以產生TCRαβ特異性PCR產物來達成，該TCRαβ特異性PCR產物藉由DNA定序或RNA定序分析以確定抗原反應性T細胞之TCRαβ基因序列，或藉由基於單細胞之液滴PCR或微流體方法分析以分析在所分析單T細胞中表現的該等TCRαβ基因序列。
  27. 如請求項8之方法，其中該等報導細胞為T細胞。
  28. 如請求項24之方法，其中使用基於單細胞之液滴PCR或微流體之鑑別或選擇進一步包含確定活化相關基因之共表現。
  29. 一種創建多個T細胞庫之方法，該方法包含：根據如請求項1之方法還原T細胞受體(TCR)之組庫；選擇來自該總組庫之TCRα鏈及β鏈序列分成多個組，以分別還原該TCR組庫之特定部分，其中創建具有較小複雜性或還原該TCR組庫之特定部分的多個T細胞庫。
  30. 如請求項29之方法，其中基於頻率範圍選擇TCRα鏈及β鏈序列。
  31. 一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第一變異核苷酸子序列定義該連續部分之第一末端，且該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之第二變異核苷酸子序列定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端； 將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽； 基於取決於該兩個或更多個變異核苷酸子序列之組合的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於該等核苷酸序列鑑別該兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少一個組合。
  32. 如請求項1之方法，其中該一或多種多肽包含： T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈； 嵌合抗原受體(CAR)； 開關受體；或 抗體或其抗原結合片段之一或多個鏈。
  33. 如請求項31或32之方法，其中該第一變異核苷酸子序列編碼TCRα變異胺基酸序列且該第二變異核苷酸子序列編碼TCRβ變異胺基酸序列。
  34. 如請求項31至33中任一項之方法，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列編碼以下中之一或多者：TCR V區、TCR互補決定區3 (CDR3)、TCR J區段及TCR恆定區。
  35. 如請求項31或32之方法，其中該兩個或更多個變異核苷酸子序列中之每一者編碼CAR之抗原結合域、鉸鏈域、跨膜域或一或多個細胞內信號傳導域。
  36. 如請求項31至35中任一項之方法，其中該等連續部分之長度為600 bp至15,000 bp。
  37. 如請求項31至36中任一項之方法，其中提供包含產生該庫。
  38. 如請求項37之方法，其中產生該庫包含： 鑑別編碼該一或多個多肽之兩組或更多組變異胺基酸序列的兩組或更多組變異核苷酸子序列，其中該至少一種功能特性取決於該兩組或更多組變異胺基酸序列中之每一者的變異胺基酸序列之組合；及 藉由組合來自該兩組或更多組變異核苷酸子序列中之每一者的變異核苷酸子序列來組裝該連續部分，藉此產生該複數個變異核酸之成員。
  39. 如請求項31至38中任一項之方法，其中使該庫中之該複數個變異核酸之連續部分之間的編輯距離最大化。
  40. 如請求項31至39中任一項之方法，其中該庫包含該兩個或更多個變異核苷酸子序列之至少100個不同組合。
  41. 如請求項31至40中任一項之方法，其中引入包含經由病毒轉導、基於轉座子之基因遞送或核酸酶介導之位點特異性整合來引入該庫。
  42. 如請求項41之方法，其中引入包含以5或更低之感染倍率(MOI)病毒轉導該細胞群體。
  43. 如請求項31至42中任一項之方法，其包含基於該庫中之該兩個或更多個變異核苷酸子序列之多個不同組合來調整該細胞群體之大小。
  44. 如請求項31至43中任一項之方法，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級T細胞。
  45. 如請求項44之方法，其中該等永生化T細胞或初級T細胞為人類T細胞。
  46. 如請求項31至45中任一項之方法，其進一步包含使用標記物以選擇或篩選表現該複數個變異核酸中之至少一者的該細胞群體中之細胞。
  47. 如請求項46之方法，其中該標記物為細胞毒素抗性標記物及/或細胞表面標記物。
  48. 如請求項31至47中任一項之方法，其中該細胞群體之細胞經遺傳修飾。
  49. 如請求項31至47中任一項之方法，其中該群體之細胞不包含賦予該等細胞該至少一種功能特性之內源性多肽。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該等細胞經遺傳修飾以消除或減少CD4、CD8及CD28中之一或多者的表現。
  51. 如請求項48或49之方法，其中該等細胞用CD4及/或CD8重建且用於篩選I類及/或II類限制型TCR序列。
  52. 如請求項50或51之方法，其中該等細胞為T細胞。
  53. 如請求項31至52中任一項之方法，其中選擇包含基於可偵測標記物之表現選擇該亞群，其中該表現取決於該一或多個多肽之該至少一種功能特性。
  54. 如請求項53之方法，其中該可偵測標記物包含細胞表面標記物、細胞激素標記物、細胞增殖標記物、轉錄報導子、信號轉導報導子及/或細胞毒性報導子。
  55. 如請求項54之方法，其中 該細胞表面標記物包含以下中之一或多者：CD25、CD69、CD62L、CD137、OX40； 該細胞激素標記物包含以下中之一或多者∶IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-8、GM-CSF； 該轉錄報導子包含以下中之一或多者：NF-κB、NFAT、AP-1； 該信號轉導報導子包含以下中之一或多者：ZAP70、ERK1/2；及 該細胞毒性報導子包含以下中之一或多者：CD107A、CD107B。
  56. 如請求項31至55中任一項之方法，其中選擇包含使該細胞群體與以下中之一或多者接觸： 第二細胞群體； 該一或多個多肽之配位體； 該一或多個多肽之促效劑或拮抗劑；及 小分子， 其中藉由該接觸誘導之亞群之變化取決於該一或多個多肽之該至少一種功能特性。
  57. 如請求項56之方法，其中選擇進一步包含： 偵測該變化之存在或不存在，及/或該變化之幅度；及 基於該偵測選擇該亞群。
  58. 如請求項56或57之方法，其中該第二細胞群體包含抗原呈現細胞。
  59. 如請求項58之方法，其中該等抗原呈現細胞包含B細胞及/或樹突狀細胞。
  60. 如請求項56至59中任一項之方法，其中該第二細胞群體包含初級細胞或永生化細胞。
  61. 如請求項56至60中任一項之方法，其中該庫之變異核苷酸序列源自表現變異多肽的細胞，該變異多肽包含由該等變異核苷酸子序列編碼之胺基酸，其中自個體得到該等細胞，且其中該第二細胞群體源自該個體。
  62. 如請求項31至61中任一項之方法，其中選擇包含基於高於或低於臨限值之該至少一種功能特性的度量選擇該細胞群體之第一亞群。
  63. 如請求項62之方法，其中基於該細胞群體之未經選擇亞群中之該功能特性的度量確定該臨限值。
  64. 如請求項62之方法，其中選擇進一步包含基於高於或低於第二臨限值之該至少一種功能特性的第二度量選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第一亞群與該第二亞群為非重疊的。
  65. 如請求項64之方法，其中鑑別該至少一個組合包含比較該第一亞群與該第二亞群之間的該至少一個組合的豐度。
  66. 如請求項31至64中任一項之方法，其中鑑別該至少一個組合包含相對於對照細胞群體量測該亞群中之該至少一個組合的富集。
  67. 如請求項66之方法，其中該細胞群體包含該對照細胞群體。
  68. 如請求項67之方法，其中該亞群及對照細胞群體為非重疊的，其中非重疊表示兩個群體之細胞具有不同活化狀態，但可攜帶相同變異核酸。
  69. 如請求項66之方法，其中基於不同於該至少一種功能特性之第二功能特性選擇該對照細胞群體。
  70. 如請求項31至69中任一項之方法，其中該亞群包含複數個細胞。
  71. 如請求項31至70中任一項之方法，其中該分離不包含基於該至少一種功能特性分離該亞群之單一純系。
  72. 如請求項31至71中任一項之方法，其中該亞群包含至少1,000個細胞。
  73. 如請求項31至72中任一項之方法，其中確定包含藉由產生該連續部分之至少600 bp的定序讀段來定序該等個別成員。
  74. 如請求項73之方法，其中該等定序讀段之長度在600 bp與15,000 bp之間。
  75. 如請求項31至74中任一項之方法，其中確定包含擴增該等個別成員之至少該連續部分。
  76. 如請求項75之方法，其中擴增包含使用雜交至恆定核苷酸子序列之擴增引子，其中該複數個變異核酸中之每一者包含該恆定核苷酸子序列，且其中該恆定核苷酸子序列編碼該一或多個多肽之恆定胺基酸序列。
  77. 如請求項76之方法，其中該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRα恆定區。
  78. 如請求項76之方法，其中該一或多個多肽包含TCRα鏈及TCRβ鏈，且其中該恆定胺基酸序列包含TCRβ恆定區。
  79. 如請求項31至78中任一項之方法，其中該分離包含使用來自該亞群之基因體DNA的CRISPR/Cas9介導之靶向片段化。
  80. 如請求項31至78中任一項之方法，其中該確定包含在該等個別成員之任何擴增之前或不存在該等個別成員之任何擴增下，得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少10。
  81. 如請求項31至80中任一項之方法，其中該確定包含得到該連續部分之該等核苷酸序列中之每一者的平均覆蓋度為至少25、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少1,000。
  82. 一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含： 編碼TCRα變異胺基酸序列且定義該連續部分之第一末端的第一變異核苷酸子序列，與 編碼TCRβ變異胺基酸序列且定義與該第一末端相對之該連續部分之第二末端的第二變異核苷酸子序列之組合； 將該庫引入永生化T細胞群體中，該永生化T細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈； 基於回應於使該等永生化T細胞與表現抗原之永生化B細胞接觸之高於臨限值含量的T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個T細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一與第二變異核苷酸子序列之至少一種組合。
  83. 如請求項82之方法，其進一步包含： 基於回應於使該等永生化T細胞與該等永生化B細胞接觸之低於第二臨限值含量之T細胞活化標記物之表現，選擇該永生化T細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個T細胞，且其中該亞群與該第二亞群為非重疊的； 分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集； 確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列， 其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。
  84. 一種鑑別來自核酸之組合庫之編碼嵌合抗原受體(CAR)鉸鏈域、跨膜域及/或胞內信號傳導域之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分，其中該連續部分包含以下中之兩者或更多者之組合： 編碼CAR鉸鏈域之第一變異核苷酸子序列； 編碼CAR跨膜域之第二變異核苷酸子序列；及 編碼CAR胞內信號傳導域之第三變異核苷酸子序列， 其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之一者定義該連續部分之第一末端，且其中該等第一、第二或第三變異核苷酸子序列中之另一者定義與該第一末端相對之該連續部分的第二末端； 將該庫引入經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼之CAR的細胞群體中，其中該細胞群體包含永生化T細胞或初級人類T細胞群體； 基於回應於使該等細胞與表現對該CAR之抗原結合域具有特異性之抗原的抗原呈現細胞接觸之高於臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於相對於對照之該子集之該等核苷酸序列中之該至少一種組合的富集，鑑別該第一、第二與第三變異核苷酸子序列之至少一種組合。
  85. 如請求項84之方法，其中存在超過一個CAR胞內信號傳導域。
  86. 如請求項85之方法，其中存在至少兩個CAR胞內信號傳導域。
  87. 如請求項84之方法，其中以下中之至少兩者為該至少兩個CAR胞內信號傳導域：CD3ε、CD3ζ ITAM1、CD3ζ ITAM12、CD3ζ ITAM123；具有CD3δ、CD3ε及CD3γ之任何ITAM的CD3ζ；CD8α、CD28、ICOS、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27及CD2。
  88. 如請求項84之方法，其包含 基於回應於使該等細胞與該等抗原呈現細胞接觸之低於第二臨限值含量之細胞增殖，選擇該細胞群體之第二亞群，其中該第二亞群包含第二複數個細胞，且其中該亞群與第二亞群為非重疊的； 分離來自該第二亞群之該複數個變異核酸的第二子集； 確定該第二子集之個別成員之該連續部分的第二核苷酸序列，及 其中基於該子集中之該至少一種組合相對於該第二子集之該等第二核苷酸序列中之至少一種組合的富集，鑑別該至少一種組合。
  89. 一種鑑別來自核酸之組合庫之核苷酸序列的方法，其包含： 提供包含複數個變異核酸之組合庫，該複數個變異核酸中之每一者包含至少600 bp之連續部分； 將該庫引入細胞群體中，該細胞群體經設計以表現由該複數個變異核酸之成員編碼的一或多個多肽； 基於取決於至少600 bp之該連續部分的至少一種功能特性來選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞； 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集； 確定該子集之個別成員之該連續部分的核苷酸序列；及 基於該核苷酸序列鑑別至少600 bp之該連續部分。
  90. 如請求項89之方法，其中至少600 bp之該連續部分之變化性分佈在600個鹼基對中。
  91. 一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法，其包含： 將庫引入能夠表現由複數個變異核酸之成員編碼的TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中， 基於回應於抗原之高於臨限值含量的標記物之表現選擇該細胞群體之亞群，其中該亞群包含複數個細胞， 分離來自該亞群之該複數個變異核酸之子集， 確定該等變異核酸之核苷酸序列，及 基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。
  92. 如請求項91或90之方法，其進一步包含提供包含編碼TCRα及TCRβ鏈之該複數個變異核酸的該庫。
  93. 一種鑑別來自樣品之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，其包含： 對樣品中之TCR-α及β鏈定序， 選擇及組合配對TCRα鏈與β鏈序列，以創建TCRαβ對之庫， 將該TCRαβ對之庫引入報導細胞池， 用呈現至少一種所關注抗原之抗原呈現細胞刺激經該TCRαβ對之庫修飾之該等報導細胞， 確定對該至少一種所關注抗原具有特異性之TCRαβ對，及 將該等TCRαβ對引入細胞中且選擇含有該等TCRαβ對之細胞。
  94. 如請求項14之方法，其進一步包含投與表現該等抗原特異性TCR序列之T細胞，以診斷或治療感染或自體免疫之步驟。
  95. 如請求項14之方法，其中該等T細胞可為自體或同種異體的。
  96. 如請求項8之方法，其中該活化標記物為CD69，且其中分離出兩種細胞群體，一種細胞群體具有較高表現之CD69及另一種細胞群體具有較低表現之CD69。
  97. 一種核苷酸庫，其包含如請求項1至30及95、96中任一項還原的該T細胞受體之組庫。
  98. 一種核苷酸構築體，其包含如請求項1至96中任一項所鑑別之該核苷酸序列。
  99. 一種細胞，其包含如請求項98之核苷酸構築體。
  100. 一種鑑別來自核酸庫之編碼抗原特異性T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈對之核苷酸序列的方法，該方法包含： 將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫； 基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該細胞庫之第一群體；及 分離來自該庫之該第一群體的變異核酸之第一群體。
  101. 如請求項100之方法，其進一步包含： 確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性；及 基於相對於對照之該子集內之該等核苷酸序列的富集，鑑別至少一個變異核苷酸序列。
  102. 如請求項100或101之方法，其中該臨限值含量基於以下中之至少一者： d)   基於標記物之表現回收細胞之總池的百分比；或 e)   自該細胞之總池中回收最小數目之細胞；或 f)    基於磁性探針與至少一種回應於抗原表現之標記物的結合，回收由磁體保留之細胞。
  103. 如請求項66至69、82、84、91或101之方法，其中該對照為低於第二臨限值之第二細胞群體。
  104. 如請求項66至69、82、84、91或101之方法，其中該對照為以下中之一或多者： 參考細胞群體， 引入該細胞群體中的核酸之該組合庫 基於低於第二臨限值之表現標記物，自與該第一群體相同之細胞群體分選的細胞群體， 自表現相關TCR庫之報導T細胞與未呈現任何外源性抗原之抗原呈現細胞，諸如B細胞之共培養物得到的至少一個細胞群體。
  105. 如請求項104之方法，其中該對照(或底部樣品)自與頂部樣品相同但具有較低活化標記物表現之細胞群體分選，或其中該底部樣品自表現該相關TCR庫之報導T細胞與未經工程改造以表現外源性抗原之B細胞的共培養物得到。
  106. 如請求項100至105中任一項之方法，其進一步包含向該細胞群體添加抗原。
  107. 如請求項100至106中任一項之方法，其中該分離第一群體及/或該對照藉由a)磁性珠粒富集、b)流式細胞測量術分選或c)兩者中之至少一者達成。
  108. 一種鑑別來自核酸庫之編碼T細胞受體α (TCRα)鏈及TCRβ鏈之核苷酸序列的方法，該方法包含： 將該核酸庫引入能夠表現TCRα鏈及TCRβ鏈之細胞群體中，以製備細胞庫；及 基於相對於對照之該子集內之該核苷酸序列的富集，確定變異核酸之該第一群體的至少一個核苷酸序列或核酸一致性。
  109. 如請求項108之方法，其中自第一細胞群體分離該至少一個核酸。
  110. 如請求項109之方法，其中基於回應於抗原之高於第一臨限值含量的標記物之表現，選擇該第一細胞群體。
  111. 一種鑑別來自核酸庫之核苷酸序列的方法，其包含： 將該核酸庫引入細胞群體中，以形成細胞庫； 使該細胞庫與第一細胞群體接觸； 基於藉由磁性珠粒富集的至少一種標記物之表現，選擇該細胞庫之亞群；及 基於相對於對照之該亞群內之該等核苷酸序列的統計學上顯著之富集或耗乏，鑑別至少一個核苷酸序列。
  112. 如請求項111之方法，其中細胞之該亞群中之至少一些經設計以表現由該核酸庫之成員編碼的一或多個多肽。
  113. 如請求項111之方法，其中標記物表現與自該庫引入之核酸關聯，其中關聯表示所引入核酸改變標記物表現。
  114. 如請求項111之方法，其中選擇係基於高於臨限值含量之標記物表現。
  115. 如請求項111之方法，其中選擇係基於高於臨限值含量之至少兩種標記物之表現。
  116. 82、91、93或100中任一項之方法，其中鑑別或刺激或提供抗原包含以下中之一或多者： a)  選擇多種抗原； b)  創建抗原池，其中各抗原恰好存在於兩個抗原池中， c)  評估表現至少一種T細胞受體之報導細胞針對該等抗原池中之每一者的反應性；及 d)  藉由評估針對恰好兩個抗原池之反應性，確定該至少一個T細胞受體是否對該等經選擇抗原中之任一者具有反應性。
  117. 如請求項116之方法，其中藉由成對富集分析偵測針對恰好兩個抗原池之反應性。
  118. 如請求項111之方法，其中該庫為TCR庫。
  119. 如請求項111之方法，其中採用活化標記物。
  120. 如請求項111之方法，其中採用頂部-底部比較來評估反應性。
  121. 如涉及反應性之評估或進一步包含反應性之評估的前述請求項中任一項之方法，其中採用頂部-底部比較來評估反應性。
  122. 如涉及庫的前述請求項中任一項之方法，其中該庫中之該複數個變異核酸的該核苷酸序列基於以下中之至少一者最佳化： 引入較佳密碼子使用用於宿主細胞， 最佳化mRNA結構穩定性， 避免重複序列， 避免均聚物之較長延伸，及 避免給定變異核酸序列內局部GC含量之較大差異。
  123. 如請求項91之方法，其中經由抗原呈現細胞呈現該抗原。
  124. 如請求項91之方法，其中該庫為組合庫。
  125. 如前述請求項中任一項之方法，其中該抗原由細胞提供。
  126. 如前述請求項中任一項之方法，其中該方法涉及高度的抗原多樣性及/或複雜性。
  127. 如涉及庫的前述方法中任一項之方法，其中該庫為組合庫。
  128. 如以上方法，其中該組合庫為TCR庫。
  129. 一種細胞集合，該集合包含： 一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ各自來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及 一組至少兩個B細胞，其中該至少兩個B細胞中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。
  130. 如請求項129之組合物，其中該一組至少兩個B細胞包含： 至少第一B細胞，其產生該外源性新抗原(或抗原)；及 至少第二B細胞，其產生第二外源性新抗原(或抗原)。
  131. 一種表現TCR之細胞的庫，該表現TCR之細胞的庫包含：一組至少三個T細胞， 其中該等T細胞中之至少兩者經設計以表現至少兩種TCRα及TCRβ對(至少兩種TCR對)， 其中該至少兩種TCR對來自個體， 其中該至少三個T細胞不表現內源性TCR， 其中該至少三個T細胞經設計用於在結合至由B細胞呈現之抗原(或新抗原)時，活化一或多個T細胞活化標記物， 其中如多個TCR細胞所反映，各TCR對之基因體複本的量使得在該樣品中之每個TCR上得到讀段，及 其中該等TCR中之至少一者不均勻地分佈在整個包含該庫之組合物中。
  132. 如請求項131之表現TCR之細胞的庫，其中藉由結合至由B細胞呈現之抗原而改變至少一種T細胞之分佈。
  133. 如請求項131之表現TCR之細胞的庫，其中至少兩種TCR對大致均勻地存在於該表現TCR之細胞的庫中。
  134. 一種治療個體之方法，該方法包含： 鑑別患有腫瘤之個體； 提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體， 提供一組至少兩個B細胞，其中該一組B細胞經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同； 使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個B細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及 向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。
  135. 如請求項134之方法，其中治療減小該腫瘤之尺寸。
  136. 一種治療個體之方法，該方法包含： 鑑別患有腫瘤之個體； 提供一組至少兩個T細胞，其中之每一者經設計以表現至少一個不同TCRα及TCRβ對，其中該TCRα及該TCRβ中之每一者來自該個體， 提供一組至少兩個抗原呈現細胞，其中該一組抗原呈現細胞源於該個體，經設計以表現至少兩個外源性新抗原，且其中該至少兩個外源性新抗原與該個體中發現的彼等新抗原相同； 使該一組至少兩個T細胞與該一組至少兩個抗原呈現細胞組合，且基於經由該至少兩個外源性新抗原活化該至少兩個T細胞來選擇至少兩種TCR對之組合；及 向該個體投與該至少兩種TCR對之組合，藉此治療該腫瘤。
  137. 一種醫藥組合物，其包含： 第一TCR對，其結合至個體之腫瘤的第一抗原(或新抗原)；及 第二TCR對，其結合至該個體之腫瘤的第二抗原(或新抗原)。
  138. 如請求項137之醫藥組合物，其中該第一TCR對為MHC-I類限制型且其中該第二TCR對為MHC-II類限制型。
  139. 一種醫藥組合物，其包含： 第一TCR對，其結合至第一抗原且為MHC-I類限制型；及 第二TCR對，其結合至第二抗原且為MHC-II類限制型。
  140. 如請求項137至139中任一項之醫藥組合物，其進一步包含第三TCR對。
  141. 如請求項137至140中任一項之醫藥組合物，其中該第一TCR對結合至來自腫瘤之新抗原，其中該第二TCR對結合至來自該腫瘤之新抗原，且其中該第一及第二TCR對均存在於該腫瘤之宿主中。
  142. 一種細胞集合，該集合包含： 一組至少兩個T細胞，其中各自經設計以表現至少一種TCRα及TCRβ對，其中該對來自個體，其中該等T細胞不表現內源性TCR，且其中該組經設計用於活化一或多個T細胞活化標記物；及 一組至少兩個抗原呈現細胞(APC)，其中該至少兩個APC中之每一者經設計以表現至少一個外源性新抗原(或抗原)，使得存在至少兩個能夠得以產生之外源性新抗原(或抗原)，且其中該至少兩個外源性新抗原(或抗原)與該個體中之彼等相同。
  143. 如上文之方法中任一項之方法，其中，藉由結合至抗原(諸如新抗原)選擇或鑑別該等TCR對及/或表現該等TCR對之T細胞，其中該抗原由B細胞或抗原呈現細胞表現。
  144. 如上文之方法中任一項之方法，其中該抗原或新抗原來自個體之腫瘤，且其中該等TCR對之TCRα及TCRβ亦各自來自該個體。
  145. 如上文之方法中任一項之方法，其中存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個TCR對(或包含此等對之細胞)且存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10000、100000或1百萬個抗原。
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