JPWO2019059171A1 - 検出装置及び検出方法 - Google Patents

検出装置及び検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2019059171A1
JPWO2019059171A1 JP2019543635A JP2019543635A JPWO2019059171A1 JP WO2019059171 A1 JPWO2019059171 A1 JP WO2019059171A1 JP 2019543635 A JP2019543635 A JP 2019543635A JP 2019543635 A JP2019543635 A JP 2019543635A JP WO2019059171 A1 JPWO2019059171 A1 JP WO2019059171A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substance
metal microstructure
vhh antibody
detected
detection device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2019543635A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7266196B2 (ja
Inventor
博人 柳川
博人 柳川
正彦 塩井
正彦 塩井
和晃 西尾
和晃 西尾
江美奈 池内
江美奈 池内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Original Assignee
Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd filed Critical Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Publication of JPWO2019059171A1 publication Critical patent/JPWO2019059171A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7266196B2 publication Critical patent/JP7266196B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

本開示は、低濃度の被検出物質を高感度に検出することができる検出装置を提供する。本開示による検出装置は、被検出物質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体（２０４５）が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体（２０４１）と、被検出物質（２０６２）と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質（２０６４）で標識された第２のＶＨＨ抗体（２０６３）、及び被検出物質（２０６２）を含み得る試料を、金属微細構造体（２０４１）に導入する導入口と、第２のＶＨＨ抗体（２０６３）及び試料が導入された金属微細構造体（２０４１）に、励起光を照射する光源と、励起光の照射により蛍光物質（２０６４）から生じる蛍光に基づき、被検出物質（２０６２）を検出する検出部と、を備える。

Description

本開示は、試料に含有される被検出物質（例えばウイルス）を検出するための検出装置及び検出方法に関する。
特許文献１は、試料に含有される被検出物質を検出する周知技術として用いられる蛍光法を開示している。特許文献１では、まず、蛍光物質で標識された抗体（以下、標識化抗体という）が結合された被検出物質を、金属層を含むセンサ部上に固定化された抗体（以下、固定化抗体という）を介してセンサ部上に結合させる。そして、センサ部に励起光を照射することにより、金属層にプラズモンを励起し、プラズモンにより増強した光電場を生じさせる。増強した光電場内において標識化抗体の蛍光物質から生じる蛍光の量を測定することにより、被検出物質の量が検出される。
特許文献１では、固定化抗体として、断片化された抗体（以下、断片化抗体という）が用いられている。これにより、通常の抗体を用いる場合よりも蛍光物質と金属層との距離が短くなり、増強された光電場を効率よく利用して、高感度に光信号を検出することが可能となる。
特開２０１０−０４３９３４号公報 特開２０１５−１７８９９３号公報 特開２０１７−０３６２５８号公報
しかしながら、上述した断片化抗体を用いる従来技術では、低濃度の被検出物質を検出することが難しい。
そこで、本開示は、低濃度の被検出物質を高感度に検出することができる検出装置及び検出方法を提供する。
本開示の一態様に係る検出装置は、被検出物質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記被検出物質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体、及び前記被検出物質を含み得る試料を、前記金属微細構造体に導入する導入口と、前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備える。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
本開示によれば、低濃度の被検出物質を高感度に検出することができる。
第１実施形態に係る検出システムの概略図 第１実施形態に係る検出装置の概略図 第１実施形態におけるセンサセルの検出領域の斜視図 第１実施形態における金属微細構造体の拡大断面図 第１実施形態における金属微細構造体上に形成されたＳＡＭを示す図 第１実施形態に係る検出装置の動作を示すフローチャート 第２実施形態における金属微細構造体の拡大断面図 第２実施形態における金属微細構造体の吸収特性を示すグラフ 第３実施形態における金属微細構造体に形成されたＳＡＭを示す図
（本開示の基礎となった知見）
上述したように、断片化抗体を用いる従来技術では、低濃度の被検出物質を検出することが難しい。本発明者は、この原因が抗体の断片化による抗原捕捉能の低下にあることを発見した。断片化抗体では、通常の抗体よりも抗原捕捉能が低下してしまうため、固定化抗体が低濃度の被検出物質と結合することが難しく検出感度の低下を招く。
そこで、本開示の一態様に係る検出装置は、被検出物質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記被検出物質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体、及び前記被検出物質を含み得る試料を、前記金属微細構造体に導入する導入口と、前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備える。
この構成によれば、被検出物質に基づく蛍光を表面プラズモンによって増強して検出する表面増強蛍光法において、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることができる。ＶＨＨ抗体とは、ラクダ科動物（ラマ、アルパカ等）が有する重鎖抗体の可変領域である。つまり、ＶＨＨ抗体は、天然起源のシングルドメイン抗体であり、通常のＩｇＧ抗体よりも小さい。さらに、ＶＨＨ抗体は、ＩｇＧ抗体を断片化して得られる断片化抗体よりも抗原捕捉能が高い。したがって、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることで、抗原捕捉能の低下がなく、蛍光増強効果を向上させることができ、低濃度の被検出物質を高感度に検出することが可能となる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体の表面の算術平均粗さ（Ｒａ）は、前記第２のＶＨＨ抗体の大きさの５０％以下であってもよい。
この構成によれば、金属微細構造体の表面の算術平均粗さを第２のＶＨＨ抗体の大きさの５０％以下にすることができる。したがって、金属微細構造体の表面に付着した第２のＶＨＨ抗体の半分以上の部分を露出させることができる。その結果、金属微細構造体の表面を洗浄するときに、金属微細構造体の表面に付着した第２のＶＨＨ抗体（標識化抗体）を比較的容易に取り除くことができ、非特異吸着を低減することができる。
ＶＨＨ抗体の大きさは、当該ＶＨＨ抗体の三次元構造モデルを内包する最小の直方体の最も長い辺の長さによって規定される。ＶＨＨ抗体の三次元構造モデルは、ＶＨＨ抗体のアミノ酸の一次構造に基づき、公知のタンパク質構造予測技術を利用して構築される。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体は、基板平面上に配置された複数の突起部を含み、前記複数の突起部において隣接する突起部の間の隙間の長さは、前記第１のＶＨＨ抗体と前記被検出物質と前記第２のＶＨＨ抗体とからなる複合体の大きさの１００％〜２００％の長さであってもよい。
この構成によれば、金属微細構造体の隣接する突起部の間の隙間の長さを第１のＶＨＨ抗体と被検出物質と第２のＶＨＨ抗体とからなる複合体の大きさの１００％〜２００％の長さにすることができる。これにより、被検出物質の捕捉能力と表面プラズモンによる蛍光増強効果とのバランスを図ることができる。第１のＶＨＨ抗体、第２のＶＨＨ抗体及び被検出物質の複合体を突起部の間の隙間で捕捉するためには、複合体の大きさの１００％以上の隙間が必要となる。また、電場増強の観点では隙間が狭い方がよく、隣接する突起部の両方に複合体を捕捉できる２００％以上の隙間は捕捉能力の観点から過剰である。つまり、突起部の間の隙間の長さを複合体の大きさの１００％〜２００％の長さとすることで、被検出物質の捕捉能力と表面プラズモンによる蛍光増強能力とのバランスを図ることができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体の表面には、リンカー分子及び非リンカー分子を含む自己組織化単分子膜が形成されており、前記第１のＶＨＨ抗体は、前記リンカー分子を介して前記金属微細構造体に固定されていてもよい。
この構成によれば、金属微細構造体の表面に、リンカー分子及び非リンカー分子を含むＳＡＭが形成される。したがって、第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質がＳＡＭに付着することを非リンカー分子によって抑制しつつ、リンカー分子によって第１のＶＨＨ抗体を固定することができる。つまり、第１のＶＨＨ抗体の固定化量を維持しつつ、非特異吸着を低減することが可能となる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にカルボキシル基を有し、かつ、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含み、前記非リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にヒドロキシル基を有し、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含んでもよい。
この構成によれば、ＳＡＭは、炭素数が１０以上のアルキル鎖を含むことができる。これにより、緻密なＳＡＭを実現することができ、第１のＶＨＨ抗体を固定する能力の向上と非特異吸着の低減との両立を図ることができる。さらに、ＳＡＭは、エチレングリコール鎖を含むことができる。これにより、リンカー分子の末端に位置するカルボキシル基に可動性を付与することができ、カルボキシル基に結合した第１のＶＨＨ抗体と被検出物質との結合性を向上しつつ、立体障害により第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質の非特異吸着を低減することができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体は、吸収スペクトルを測定した際に、前記励起光の波長と前記蛍光の波長とに対応する波長域に吸収領域を有し、当該吸収領域のピーク幅は５００ｎｍ以下であってもよい。
この構成によれば、吸収領域のピーク幅を５００ｎｍ以下にすることができる。このように励起光の波長と蛍光の波長とに対応する波長域に存在する吸収領域のピーク幅を従来よりも小さくすることで、より単一モードに近い表面プラズモンを生じさせることができる。その結果、より効果的に蛍光を増強することができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記励起光の波長、及び前記蛍光の波長は、６００ｎｍ〜８５０ｎｍであってもよい。
この構成によれば、励起光の波長及び蛍光の波長として、６００ｎｍ〜８５０ｎｍの波長を用いることができる。これにより、ＶＨＨ抗体の自家蛍光を抑制して検出感度を高めることができ、さらに半導体レーザを光源として利用することができる。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
以下、実施の形態に関して図面を参照しながら具体的に説明する。
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する。
また、以下の実施の形態では、被検出物質が空気中を浮遊するウイルスを構成する成分（以下、単にウイルスという）である場合について説明するが、本開示において被検出物質はこれに限られない。ウイルスを構成する成分とは、例えばウイルスを構成するたんぱく質又は核酸などである。ウイルスの種類は、特に限定される必要はなく、一般的にウイルスと分類されるものであれば何でもよい。また、被検出物質は、ウイルスでなくてもよい。
（第１実施形態）
［検出システムの概要］
図１は、第１実施形態に係る検出システム１０の概略図である。検出システム１０は、例えば人が出入りする部屋に設置されている。図１に示すように、検出システム１０は、捕集装置１００と、検出装置２００と、コントローラ３００と、を備える。以下に、捕集装置１００、検出装置２００及びコントローラ３００の詳細について説明する。
［捕集装置の詳細］
捕集装置１００は、空気中のウイルスを含み得る微粒子を捕集して捕集液に混合する。図１に示すように、捕集装置１００は、吸引器１０２と、捕集液タンク１０４と、ポンプ１０６と、サイクロン１０８と、空気吸入口１１０と、洗浄液タンク１１２と、ポンプ１１４と、廃液タンク１２０と、液体流路１２２と、を備える。以下に、捕集装置１００の各構成要素について説明する。
吸引器１０２は、空気吸入口１１０から空気を吸入する。空気中を浮遊するウイルスを含み得る微粒子は、空気とともに空気吸入口１１０よりサイクロン１０８に吸入される。
捕集液タンク１０４は、空気中のウイルスを捕集するための捕集液を保持するための容器である。
ポンプ１０６は、捕集液タンク１０４に含有される捕集液をサイクロン１０８に供給する。
サイクロン１０８は、空気吸入口１１０及び捕集液タンク１０４に接続されており、吸引器１０２により空気吸入口１１０から吸入された空気中のウイルスを含み得る微粒子と、ポンプ１０６により捕集液タンク１０４から供給された捕集液とを混合する。サイクロン１０８は、液体流路１２２を介して検出装置２００に接続されている。微粒子が混合された捕集液（以下、試料という）は、サイクロン１０８から液体流路１２２を介して検出装置２００に排出される。
洗浄液タンク１１２は、サイクロン１０８及び液体流路１２２を洗浄するための洗浄液を保持するための容器である。洗浄液タンク１１２は、サイクロン１０８に接続されており、洗浄液タンク１１２内の洗浄液は、ポンプ１１４によってサイクロン１０８に供給される。
廃液タンク１２０は、不要な液体を貯蔵するための容器である。
液体流路１２２は、サイクロン１０８から出力された試料を、検出装置２００に導くための経路である。
［検出装置の詳細］
次に、検出装置２００について、図１及び図２を参照しながら説明する。図２は、第１実施形態に係る検出装置２００の概略図である。
検出装置２００は、捕集装置１００によって微粒子が混合された捕集液からウイルスを検出する。図１及び図２に示すように、検出装置２００は、センサデバイス２０２と、導入口２０６と、光源２０８と、ビームスプリッタ２１０と、レンズ２１２と、検出部２１４と、を備える。以下に、検出装置２００の各構成要素について説明する。
センサデバイス２０２は、センサセル２０４を備える。なお、図１では、センサデバイス２０２は、単一のセンサセル２０４を備えているが、複数のセンサセルを備えてもよい。
本実施の形態では、センサデバイス２０２は、０．１ｐＭ〜１００ｎＭの濃度範囲のウイルスを検出できる。また、本実施の形態では、ウイルス量を光学的に検出するために、表面増強蛍光法が利用される。
センサセル２０４は、励起光が照射されたときに、表面プラズモンを生じさせることにより、ウイルスに結合した蛍光物質からの蛍光を増強する。図２に示すように、センサセル２０４は、流路２０４ａ及び検出領域２０４ｂを備える。
流路２０４ａは、導入口２０６から滴下されたサンプル液体２０６１を検出領域２０４ｂに導くための経路である。
検出領域２０４ｂは、表面プラズモンを利用してウイルスを光学的に検出するための領域である。検出領域２０４ｂには、金属微細構造体が配置されており、光源２０８から励起光が照射されることにより表面プラズモンが生じる。また、金属微細構造体には、第１のＶＨＨ抗体が固定されている。第１のＶＨＨ抗体は、ウイルスに特異的に結合する固定化抗体である。検出領域２０４ｂの詳細については、図３Ａ及び図３Ｂを用いて後述する。
導入口２０６は、第２のＶＨＨ抗体及び試料をセンサセル２０４に導入する。具体的には、導入口２０６は、第２のＶＨＨ抗体と試料とを含むサンプル液体２０６１をセンサセル２０４に滴下する。第２のＶＨＨ抗体は、蛍光物質で標識された標識化抗体である。試料は、ウイルスを含み得る液体であり、本実施の形態ではサイクロン１０８から排出された捕集液である。
試料にウイルスが含まれれば、当該ウイルスは、第１のＶＨＨ抗体を介して金属微細構造体に結合する。このとき、ウイルスは、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体とも結合している。つまり、金属微細構造体に、第１のＶＨＨ抗体、ウイルス、第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質の複合体が結合される。この状態で金属微細構造体に光が照射されると、ウイルスと間接的に結合している蛍光物質から蛍光が発せられ、当該蛍光が表面プラズモンによって増強される。以降において、表面プラズモンによって増強された蛍光を表面増強蛍光と呼ぶ。
光源２０８は、センサセル２０４に励起光を照射する光照射部の一例である。光源２０８としては、公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば半導体レーザ、ガスレーザ等のレーザを光源２０８として利用することができる。なお、光源２０８は、ウイルスに含まれる物質と相互作用が小さい波長（例えば４００ｎｍ〜２０００ｎｍ）の励起光を照射することが好ましい。さらには、励起光の波長は、半導体レーザが利用できる波長６００ｎｍ〜８５０ｎｍであることが好ましい。
ビームスプリッタ２１０は、光源２０８から照射された励起光から検出領域２０４ｂで発生した表面増強蛍光を分離する。具体的には、ビームスプリッタ２１０は、光源２０８からの励起光を通過させ、センサセル２０４で発生した表面増強蛍光を分離して検出部２１４に導く。
レンズ２１２は、ビームスプリッタ２１０を通過した光源２０８からの励起光を検出領域２０４ｂに集光する。
検出部２１４は、ビームスプリッタ２１０により導かれた表面増強蛍光を分光し、特定の波長帯の光を検知することにより、試料中のウイルスの量に相当する電気信号を出力する。検出部２１４は、特定の波長帯の光を検出できる受光素子などの公知の技術を特に限定無く利用することができる。例えば、検出部２１４として、光を分光するために特定の波長帯を透過させる干渉フィルター、回折格子を用いて分光するツェルニー型分光器及びエシェル型分光器等を利用することができる。さらには、検出部２１４は、光源２０８からの励起光を除去するためのノッチフィルター、あるいは、光源２０８からの励起光を遮断し、かつ、センサセル２０４で発生した表面増強蛍光を透過させることができるロングパスフィルターを含んでもよい。
［コントローラの詳細］
コントローラ３００は、検出システム１０全体の動作を制御する。具体的には、コントローラ３００は、捕集装置１００及び検出装置２００を制御する。
より具体的には、コントローラ３００は、測定の開始を制御して、吸引器１０２に周辺の空気の吸引を開始させ、かつ、ポンプ１０６に、捕集液タンク１０４からサイクロン１０８に捕集液を供給させる。これにより、サイクロン１０８において捕集液と微粒子とが混合され、試料がサイクロン１０８から検出装置２００に供給される。さらには、コントローラ３００は、光源２０８に光を照射させ、検出部２１４に表面増強蛍光を検知させる。
例えば、コントローラ３００は、入力パラメータに基づいて、予め設定された条件で、各ポンプを制御して所定体積のサンプル液体２０６１を検出装置２００に供給することができる。さらに、コントローラ３００は、計時機能を有しており、各動作に要した時間の情報を生成し記憶してもよい。また、コントローラ３００は、検出装置２００から計測値を受信して、計測値と時間情報とに基づいて、空気中を浮遊するウイルスの濃度の経時的変化を算出してもよい。
なお、コントローラ３００は、例えば１以上の専用の電子回路によって実現される。１以上の専用の電子回路は、１個のチップ上に集積されてもよいし、複数のチップ上に個別に形成されてもよい。また、コントローラ３００は、１以上の専用の電子回路の代わりに、汎用のプロセッサ（図示せず）と、ソフトウェアプログラム又はインストラクションが格納されたメモリ（図示せず）とによって実現されてもよい。この場合、ソフトウェアプログラム又はインストラクションが実行されたときに、プロセッサは、コントローラ３００として機能する。
［センサセルの検出領域の詳細］
ここで、センサセル２０４の検出領域２０４ｂの詳細な構成について、図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら具体的に説明する。
図３Ａは、第１実施形態におけるセンサセル２０４の検出領域２０４ｂの斜視図である。図３Ｂは、第１実施形態における金属微細構造体２０４１の拡大断面図である。
図３Ａに示すように、検出領域２０４ｂには、表面プラズモンを発生するためのナノスケールの金属微細構造体２０４１が設けられている。本実施の形態では、図３Ｂに示すように、金属微細構造体２０４１は、樹脂基板２０４２及び金属膜２０４３を備える。
樹脂基板２０４２は、ナノインプリント又は射出成形により形成されたナノ構造体を有する。ここでは、ナノ構造体は、複数のピラー２０４２ａを含む。この複数のピラー２０４２ａにおいて、ピラーの高さとピラー間のピッチのサイズの比率は、１：１〜１：３であることが望ましい。本実施の形態では、励起光の波長及び蛍光の波長は、７５０ｎｍ〜８５０ｎｍである。したがって、本実施の形態では、例えばピラー高さは約２００ｎｍ、ピラー直径は約２３０ｎｍ、ピラー間ピッチは約４６０ｎｍであることが望ましい。なお、樹脂基板２０４２のナノ構造体は、これに限定されるものではなく、複数のピラーの代わりに、複数の半球体を含んでもよい。
金属膜２０４３は、樹脂基板２０４２に金属を成膜することで作製される。金属膜２０４３には、樹脂基板２０４２の複数のピラー２０４２ａに対応する複数の突起部２０４３ａが形成されている。励起光の波長及び蛍光の波長が７５０ｎｍ〜８５０ｎｍである場合は、金属膜２０４３の膜厚は、約４００ｎｍであることが望ましい。また、複数の突起部２０４３ａにおいて隣接する突起部の間の隙間の長さは、第１のＶＨＨ抗体と被検出物質と第２のＶＨＨ抗体とからなる複合体の大きさの１００％〜２００％の長さ（一例としては、１５ｎｍ〜３０ｎｍ）であることが望ましい。
金属膜２０４３の材料は、特に限定される必要はなく、金、銀、銅、若しくはアルミニウム、又はこれらのいずれかの金属を主成分として含む合金であってもよい。また、本実施の形態では、金属膜２０４３の成膜方法として、電子ビーム（ＥＢ）蒸着が用いられている。なお、金属膜２０４３の成膜方法は、特に限定される必要はなく、例えばスパッタリング、又は真空蒸着であってもよい。
金属膜２０４３上には、自己組織化単分子膜（以下、ＳＡＭと呼ぶ）が形成されており、第１のＶＨＨ抗体は、このＳＡＭを介して金属微細構造体２０４１に固定される。図４は、第１実施形態における金属微細構造体２０４１上のＳＡＭ２０４４を示す図である。
図４において、金属微細構造体２０４１上にはＳＡＭ２０４４が形成されている。本実施の形態では、ＳＡＭ２０４４は、例えば炭素数が６程度のアルキル鎖を含む。第１のＶＨＨ抗体２０４５は、ＳＡＭ２０４４を介して金属微細構造体２０４１に固定されている。
サンプル液体２０６１中にウイルス（被検出物質）２０６２が含まれる場合、そのウイルス２０６２は、金属微細構造体２０４１に固定された第１のＶＨＨ抗体２０４５に結合する。ウイルス２０６２には、蛍光物質２０６４で標識された第２のＶＨＨ抗体２０６３も結合されている。
このような金属微細構造体２０４１に励起光が照射されると、蛍光物質２０６４から蛍光が発せられ、金属微細構造体２０４１に生じた表面プラズモンによって当該蛍光が増強される。つまり、ウイルスの量に対応する表面増強蛍光が発せられる。
［検出装置の動作］
以上のように構成された検出装置２００の動作について図５を参照しながら説明する。図５は、第１実施形態に係る検出装置２００の動作を示すフローチャートである。
まず、導入口２０６は、ウイルスを含み得るサンプル液体２０６１を金属微細構造体２０４１に導入する（Ｓ１０２）。続いて、光源２０８は、サンプル液体２０６１が導入された金属微細構造体２０４１に励起光を照射する（Ｓ１０４）。検出部２１４は、励起光の照射により蛍光物質２０６４から生じる蛍光であって表面プラズモンによって増強された蛍光を計測することにより、サンプル液体２０６１中のウイルスを検出する（Ｓ１０６）。
［第１実施形態の要旨］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、被検出物質に基づく蛍光を表面プラズモンによって増強して検出する表面増強蛍光法において、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることができる。ＶＨＨ抗体は、通常のＩｇＧ抗体よりも小さく、かつ、断片化されたＩｇＧ抗体よりも抗原捕捉能が高い。したがって、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることで、効果的にウイルスを捕捉しつつ、表面プラズモンによる蛍光増強効果を向上させることができ、低濃度の被検出物質を高感度に検出することが可能となる。
また、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、金属微細構造体２０４１の隣接する突起部２０４３ａの間の隙間の長さを、第１のＶＨＨ抗体と被検出物質と第２のＶＨＨ抗体とからなる複合体の大きさの１００％〜２００％にすることができる。これにより、被検出物質の捕捉能力と表面プラズモンによる蛍光増強能力とのバランスを図ることができる。第１のＶＨＨ抗体、第２のＶＨＨ抗体及び被検出物質の複合体を突起部の間の隙間で捕捉するためには、複合体の大きさの１００％以上の隙間が必要となる。また、電場増強の観点では隙間が狭い方がよく、隣接する突起部の両方に複合体を捕捉できる２００％以上の隙間は捕捉能力の観点から過剰である。つまり、突起部の間の隙間の長さを複合体の大きさの１００％〜２００％とすることで、被検出物質の捕捉能力と表面プラズモンによる蛍光増強能力とのバランスを図ることができる。
（第２実施形態）
次に、第２実施形態について説明する。上記第１実施形態では、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることで低濃度の被検出物質の検出感度の向上を実現している。しかしながら、ＶＨＨ抗体を用いた場合に、高濃度の被検出物質の量を正確に測定することが難しく、発明者は、その原因が非特異吸着にあることを発見した。
非特異吸着とは、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体又は蛍光物質が、被検出物質を介さずに、直接的に、金属膜、ＳＡＭ、又は、第１のＶＨＨ抗体に付着することを指す。非特異吸着が発生すれば、被検出物質が存在しなくても蛍光を発してしまう。つまり、非特異吸着は、ノイズを増加させ、Ｓ／Ｎ比の低下を招き、被検出物質の量の検出精度を低下させる。
ＶＨＨ抗体は、従来の抗体（例えばＩｇＧ抗体）よりも小さく、従来の抗体以上に非特異吸着が顕著となる。そのため、ＶＨＨ抗体を表面増強蛍光法で用いた際には、従来の抗体に比べて高濃度の被検出物質の検出精度が低下する。したがって、ＶＨＨ抗体を表面増強蛍光法で利用するためには、非特異吸着の低減が求められる。
そこで、本実施の形態では、非特異吸着を低減するために、より滑らかな表面を有する金属微細構造体を利用する。以下に、このような金属微細構造体を有する検出システムについて図面を参照しながら説明する。
なお、本実施の形態に係る捕集装置及びコントローラの構成は、第１実施形態に係る捕集装置及びコントローラの構成と実質的に同一である。また、本実施の形態に係る検出装置の構成は、センサセルの金属微細構造体を除いて、第１実施形態に係る検出装置の構成と実質的に同一である。したがって、本実施の形態に係る検出システムについて、第１実施形態と異なる金属微細構造体を中心に説明する。
［金属微細構造体の構造］
図６は、第２実施形態における金属微細構造体２０４１Ａの拡大断面図である。金属微細構造体２０４１Ａは、樹脂基板２０４２及び金属膜２０４３Ａを備える。本実施の形態では、金属膜２０４３Ａは、樹脂基板２０４２に金をスパッタリングにより成膜することにより作製される。
このようにスパッタリングにより金を成膜することにより、金属微細構造体２０４１Ａの表面の算術平均粗さ（Ｒａ）を２．５ｎｍ以下にすることができる。つまり、金属微細構造体２０４１Ａの表面の算術平均粗さ（Ｒａ）を第２のＶＨＨ抗体の大きさ（約５ｎｍ）の５０％以下にすることができる。なお、ＥＢ蒸着により金膜が作製された場合、金属微細構造体の表面の算術平均粗さは約１０ｎｍとなる。算術平均粗さ（Ｒａ）は、以下の式（１）によって表される。
Figure 2019059171
ここで、ｎはサンプル数であり、ｉは１からｎまでの序数である。ｙｉは、平均線ｍからｉ番目のサンプル点までの垂直距離である。算術平均粗さは、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定できるが、測定方法は特に限定されない。
［金属微細構造体の吸収特性］
次に、本実施の形態に係る金属微細構造体２０４１Ａの吸収特性について図７を参照しながら説明する。図７は、第２実施形態における金属微細構造体２０４１Ａの吸収特性を示すグラフである。
図７において、縦軸は吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔａｎｃｅ）を示し、横軸は波長（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を示す。吸収スペクトル８００は、スパッタリングによって作製された金膜を有する金属微細構造体２０４１Ａの吸収特性を示す。吸収スペクトル８１０は、ＥＢ蒸着によって作製された金膜を有する金属微細構造体２０４１の吸収特性を示す。
本実施の形態では、励起光の波長及び蛍光の波長の各々は、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長帯に含まれる。したがって、スパッタリングによって作製された金属膜を有する金属微細構造体２０４１Ａは、吸収スペクトルを測定した際に、励起光の波長と蛍光の波長とに対応する波長域に吸収領域８０２を有している。つまり、金属微細構造体２０４１Ａの吸収スペクトル８００は、励起光の波長及び蛍光の波長を含む波長域に吸収領域８０２を有する。このとき、吸収領域８０２のピーク幅８０４は、５００ｎｍ以下であり、具体的には図７では２２０ｎｍである。
また、ＥＢ蒸着によって作製された金属膜を有する金属微細構造体２０４１の吸収スペクトル８１０は、励起光の波長及び蛍光の波長に対応する波長域に吸収領域８１２を有する。吸収領域８１２のピーク幅８１４は、５００ｎｍより大きく、具体的には図７では７００ｎｍである。
なお、吸収領域とは、吸収スペクトルの吸収率の極大値と、当該極大値を挟む２つの極小値と、に基づいて定義される領域である。また、吸収領域のピーク幅は、極大値を挟む２つの極小値の波長の差分値によって定められる。
［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００では、スパッタリングで金を成膜することで金属微細構造体２０４１Ａの表面を平滑にすることができる。その結果、金属微細構造体２０４１Ａへの第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４の非特異吸着を低減できる。
具体的には、本実施の形態では、金属微細構造体２０４１Ａの表面が平滑であるので、第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４が表面に付着しても洗浄により除去することが容易になる。一方、例えばＥＢ蒸着により金が成膜された場合、金属微細構造体の表面は相対的に平滑でなく、微視的には隙間を有する。この隙間に第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４が入り込むと、金属微細構造体の表面を洗浄しても第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４を除去することは困難である。
特に、本実施の形態に係る検出装置２００では、金属微細構造体２０４１Ａの表面の算術平均粗さを第２のＶＨＨ抗体の大きさの５０％以下にすることができる。したがって、金属微細構造体２０４１Ａの表面に付着した第２のＶＨＨ抗体の半分以上の部分を露出させることができる。したがって、金属微細構造体２０４１Ａの表面を洗浄するときに、金属微細構造体２０４１Ａの表面に付着した第２のＶＨＨ抗体２０６３（標識化抗体）を比較的容易に取り除くことができ、非特異吸着を低減することができる。
また、本実施の形態では、金属微細構造体２０４１Ａの表面が平滑であるので、より緻密なＳＡＭ２０４４を形成することができる。ＳＡＭ２０４４が緻密であれば、ＳＡＭ２０４４の疎水面をＳＡＭ２０４４中に内包することができる。非特異吸着は、ＳＡＭの疎水面への疎水性相互作用により起こるので、ＳＡＭ２０４４の疎水面をＳＡＭ２０４４中に内包することで、非特異吸着を抑制することができる。一方、金属微細構造体の表面が平滑でなければ、自己組織化単分子はランダムな方向を向いてしまう。そのため、緻密なＳＡＭを形成することができず、ＳＡＭの疎水面が外部に露出し、非特異吸着を抑制することが難しい。
また、本実施の形態では、金属微細構造体２０４１Ａの吸収スペクトルとして、５００ｎｍ以下のピーク幅８０４を持つ吸収領域８０２を含む吸収スペクトル８００を実現することができる。したがって、励起光の波長と蛍光の波長とに対応する波長域に存在する吸収領域のピーク幅を従来よりも小さくすることができ、より単一モードに近い表面プラズモンを生じさせることができる。その結果、より効果的に蛍光を増強することができる。
（第３実施形態）
次に、第３実施形態について説明する。本実施の形態では、上記第２実施形態とＳＡＭの構成が異なる。以下に、上記第２実施形態と異なる点を中心に、本実施の形態に係る検出装置について説明する。
なお、本実施の形態に係る捕集装置及びコントローラの構成は、第２実施形態に係る捕集装置及びコントローラと実質的に同一である。また、本実施の形態に係る検出装置の構成は、ＳＡＭを除いて、第２実施形態に係る検出装置の構成と実質的に同一である。したがって、本実施の形態に係る検出システムについて、第２実施形態と異なるＳＡＭを中心に説明する。
［ＳＡＭの構成］
図８は、第３実施形態における金属微細構造体２０４１Ａ上のＳＡＭ２０４４Ｂを示す図である。図８に示すように、金属微細構造体２０４１Ａの表面には、リンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を含むＳＡＭ２０４４Ｂが形成されている。第１のＶＨＨ抗体２０４５は、リンカー分子２０４６を介して金属微細構造体２０４１Ａに固定される。
リンカー分子２０４６は、一方の末端にチオール基２０４６１を、他方の末端にカルボキシル基２０４６４を有する。チオール基２０４６１は、金属微細構造体２０４１Ａの表面と結合する。カルボキシル基２０４６４は、第１のＶＨＨ抗体２０４５と結合する。
さらに、リンカー分子２０４６は、チオール基２０４６１とカルボキシル基２０４６４との間に、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４６２と、エチレングリコール鎖２０４６３とを含む。具体的には、アルキル鎖２０４６２は、チオール基２０４６１及びエチレングリコール鎖２０４６３に接続されており、エチレングリコール鎖２０４６３は、アルキル鎖２０４６２及びカルボキシル基２０４６４に接続されている。
非リンカー分子２０４７は、一方の末端にチオール基２０４７１を、他方の末端にヒドロキシル基２０４７４を有する。チオール基２０４７１は、金属微細構造体２０４１Ａの表面と結合する。ヒドロキシル基２０４７４は、親水性であるため、第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４の非特異吸着を抑制する。
さらに、非リンカー分子２０４７は、チオール基２０４７１とヒドロキシル基２０４７４との間に、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４７２と、エチレングリコール鎖２０４７３とを含む。具体的には、アルキル鎖２０４７２は、チオール基２０４７１及びエチレングリコール鎖２０４７３に接続されており、エチレングリコール鎖２０４７３は、アルキル鎖２０４７２及びヒドロキシル基２０４７４に接続されている。
本実施の形態では、ＳＡＭ２０４４Ｂに含まれるリンカー分子２０４６は、非リンカー分子２０４７よりも少ない。
［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、金属微細構造体２０４１Ａの表面に、リンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を含むＳＡＭ２０４４Ｂが形成される。したがって、第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４がＳＡＭ２０４４Ｂに付着することを非リンカー分子２０４７によって抑制しつつ、リンカー分子２０４６によって第１のＶＨＨ抗体２０４５を固定することができる。つまり、第１のＶＨＨ抗体を固定する能力を維持しつつ、非特異吸着を低減することが可能となる。
また、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂは、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４６２、２０４７２を含むことができる。これにより、緻密なＳＡＭ２０４４Ｂを実現することができ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を固定する能力の向上と非特異吸着の低減との両立を図ることができる。
例えば、第１実施形態では、炭素数が５程度のアルキル鎖を含むＳＡＭ２０４４が用いられている。アルキル鎖を短くすることで、蛍光物質２０６４が金属微細構造体２０４１の表面に近づくため、プラズモン共鳴による蛍光増強効果を向上することができる。一方、本実施の形態では、非特異吸着を減少させるために、第１実施形態よりもアルキル鎖を長くしている。このようにアルキル鎖を長くすることにより、隣り合うアルキル鎖同士の分子間力が増加し、より緻密なＳＡＭを形成することができる。これにより、非特異吸着のサイトとなるＳＡＭの疎水面が強固にＳＡＭに内包され、非特異吸着を低減できる。さらに、緻密なＳＡＭにより固定化抗体が結合するサイトが増加するため、固定化抗体に結合するウイルスも増加し、信号強度が増加する。以上より、シグナルが増加し、ノイズが低減するため、ウイルスの検出感度を向上させることが可能となる。
なお、本実施の形態では、アルキル鎖が長くなることにより、蛍光物質と金属微細構造体の表面との間の距離が増加するというデメリットがある。しかしながら、炭素が１つ増加したときのアルキル鎖の長さの増加量は、おおよそ０．１５ｎｍである。つまり、炭素が５つ増加しても、アルキル鎖の長さの増加量は約０．７５ｎｍであるため、蛍光物質と金属微細構造体の表面との間の距離の増加によるデメリットは相対的に小さい。
また、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂは、エチレングリコール鎖２０４６３、２０４７３を含むことができる。これにより、リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４に可動性を付与することができ、カルボキシル基２０４６４に結合した第１のＶＨＨ抗体２０４５と被検出物質との結合性を向上することができる。
具体的には、エチレングリコール鎖２０４６３、２０４７３は、リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４と、非リンカー分子２０４７の末端に位置するヒドロキシル基２０４７４とに可動性を付与する。リンカー分子２０４６のエチレングリコール鎖２０４６３に接続されたカルボキシル基２０４６４に第１のＶＨＨ抗体２０４５が結合することで、第１のＶＨＨ抗体２０４５とウイルス２０６２との結合性が向上する。
もしエチレングリコール鎖がなければ、ＳＡＭに固定された第１のＶＨＨ抗体の可動性が低下する。それにより、第１のＶＨＨ抗体２０４５中のウイルス２０６２との結合部位が露出しない可能性が増加し、ウイルス２０６２と第１のＶＨＨ抗体２０４５とが結合できない可能性も増加する。
本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂにおいてリンカー分子２０４６は非リンカー分子２０４７よりも少ない。これにより、非特異吸着を低減しつつ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を適度に固定化することができ、検出精度を向上することができる。リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４は、第１のＶＨＨ抗体２０４５と結合する。一方、非リンカー分子２０４７の末端に位置するヒドロキシル基２０４７４は、親水性であるため第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４の非特異吸着を抑制する。リンカー分子２０４６と非リンカー分子２０４７との混合比に関して実験を行った結果、リンカー分子２０４６に比べ、非リンカー分子２０４７の割合を多くすることで、非特異吸着を低減しつつ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を適度に固定化でき、ウイルスの検出精度が向上することがわかった。リンカー分子２０４６が１００％の場合に比べて、シグナルが大きく低下しない理由は、第１のＶＨＨ抗体は大きさを持つため、密に多くのカルボキシル基が存在しても、全てのカルボキシル基に第１のＶＨＨ抗体が固定されることはないためである。
（実施例）
以下、実施例を用いてより具体的に説明するが、これら実施例は、本開示を何ら制限するものではない。
（実施例１）
本実施例では、金属微細構造体の樹脂基板として、複数のピラーを有するナノ構造体がナノインプリントにより形成された樹脂基板を用いた。ピラー高さは２００ｎｍ、ピラー直径は２３０ｎｍ、ピラーピッチは４６０ｎｍであった。この樹脂基板に、スパッタリングにより金を４００ｎｍの厚さで成膜することで、金属微細構造体を作製した。光源は、７８５ｎｍの波長を有する励起光を金属微細構造体に照射し、蛍光物質から８００ｎｍの波長を有する蛍光が発せされた。この金属微細構造体では、６５０ｎｍ〜８５０ｎｍの波長帯に急峻なプラズモン共鳴による吸収ピークが見られた。
その金属微細構造体を、４０℃のインキュベータ内でＳＡＭ溶液に一晩浸漬することにより、金属微細構造体上にＳＡＭを形成した。
なお、ＳＡＭ溶液は、以下の手順で作製した。まず、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＥＧ６−ｕｎｄｅｋａｎｅｔｈｉｏｌと、Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＥＧ３−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌをそれぞれエタノールで希釈し混合した。その後、エタノールで希釈することでＳＡＭ溶液を作製した。
第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体として、インフルエンザウイルスの核タンパクと特異的に結合するアルパカ由来のＶＨＨ抗体を準備した。
その後、ＳＡＭの末端に位置するカルボキシル基と、第１のＶＨＨ抗体の末端に位置するアミノ基とを、ＥＤＣ−ＮＨＳ反応によりペプチド結合させ、第１のＶＨＨ抗体をＳＡＭに固定化した。
ここに被検出物質であるインフルエンザウイルスの核タンパク（ＮＰ）を第１のＶＨＨ抗体に結合させ、さらに蛍光物質である有機蛍光色素（発光波長８００ｎｍ）で標識化した第２のＶＨＨ抗体をＮＰと結合させることでサンドイッチＡｓｓａｙを行った。
サンドイッチＡｓｓａｙを行ったサンプルに、７８５ｎｍの波長を有するレーザ光を照射することで有機蛍光色素を励起し、その有機蛍光色素が発する、８００ｎｍの波長を有する蛍光の強度を測定した。
（実施例２）
実施例２では、金の成膜方法として、スパッタリングに代えて電子ビーム蒸着を用いたこと以外は、実施例１と同様に行なわれた。
（実施例３）
実施例３では、ＳＡＭ溶液として、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＥＧ６−ｕｎｄｅｋａｎｅｔｈｉｏｌ及びＨｙｄｒｏｘｙ−ＥＧ３−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌを含む溶液に代えて、Ｃａｒｂｏｘｙ−ｈｅｘａｎｅｔｈｉｏｌを含む溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行なわれた。
（実施例４）
実施例４では、金の成膜方法として、スパッタリングに代えて電子ビーム蒸着を用い、ＳＡＭ溶液として、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＥＧ６−ｕｎｄｅｋａｎｅｔｈｉｏｌ及びＨｙｄｒｏｘｙ−ＥＧ３−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌを含む溶液に代えて、Ｃａｒｂｏｘｙ−ｈｅｘａｎｅｔｈｉｏｌを含む溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様に行われた。
（比較例）
比較例では、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体に代えて、ＩｇＧ抗体を用いたこと以外は、実施例４と同様に行われた。
（低濃度のＮＰに対する表面増強蛍光のピーク強度）
実施例４及び比較例につき、低濃度（１００ｐＭ）のＮＰに対する表面増強蛍光のピーク強度の検出値を表１に示した。表１に示されるように、実施例４では、比較例よりも、低濃度のＮＰに対する表面増強蛍光のピーク強度が増加している。つまり、実施例４の検出装置は、ＩｇＧ抗体を用いた比較例の検出装置よりも、低濃度のＮＰを高感度に検出することができた。
Figure 2019059171
実施例１〜３につき、ＮＰの濃度が０Ｍ（以下、ＮＰ−０Ｍという）であるサンプル液体及び１０ｎＭであるサンプル液体（以下、ＮＰ−１０ｎＭという）に対する表面増強蛍光のピーク強度の検出値及びＳ／Ｎ比（ここではＮＰ−１０ｎＭのＰＬ強度をＮＰ−０ＭのＰＬ強度で除算した結果）を表２に示した。
Figure 2019059171
ＮＰ−１０ｎＭにおいて、実施例１のＰＬ強度（９６４４）は、実施例２のＰＬ強度（２３４７）の約４倍である。スパッタリングでは、金属微細構造体の表面が平滑になるため、より均一な金属ナノ構造が形成され単一モードに近いプラズモン共鳴が発生する。そのため、プラズモン共鳴による発光増強が大きくなり、ＰＬ強度が大きくなる。ＮＰ−０Ｍにおいては、実施例１のＰＬ強度（８２）は、実施例２のＰＬ強度（３０）よりも大きくなっている。これは、プラズモン共鳴による発光増強が大きくなったためであり、非特異吸着が増加しているわけではない。ＮＰ−１０ｎＭでは、実施例１のＰＬ強度（９６４４）と実施例２のＰＬ強度（２３４７）との比較から、実施例１では表面プラズモンによる増強が実施例２の約４倍であると推定される。これに対して、ＮＰ−０Ｍでは、実施例１のＰＬ強度（８２）は、実施例２のＰＬ強度（３０）の約３倍であるので、実施例１では実施例２よりも非特異吸着が低減していることがわかる。以上より、実施例１（スパッタリング）のＳ／Ｎ比は、実施例２（ＥＢ蒸着）のＳ／Ｎ比よりも向上し、実施例１では実施例２よりも高感度検出が可能となっている。
実施例１に係るＳＡＭは、第３実施形態におけるリンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を有するＳＡＭである。実施例３に係るＳＡＭは、第１実施形態、２における炭素数が６程度のアルキル鎖を含むＳＡＭである。ＮＰ−０Ｍにおいて、実施例１のＰＬ強度（８２）は、実施例３のＰＬ強度（３１７）の約１／３に低減しており、非特異吸着が低減していることがわかる。一方、ＮＰ−１０ｎＭにおいて、実施例１のＰＬ強度（９６４４）は、実施例３のＰＬ強度（４９１１）の約１．４倍に増加している。その結果、実施例１のＳ／Ｎ比は、実施例３のＳ／Ｎ比の約５倍に増加しており、実施例１の方が実施例３よりも高感度検出が可能となっている。
以上のように、実施例１では、表面が平滑な金属微細構造体及び炭素数が１０以上のアルキル鎖を含むリンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を有するＳＡＭによって、実施例２及び実施例３よりもウイルスを高感度に検出できた。
（他の実施の形態）
なお、上記各実施の形態では、センサセルは、樹脂基板及び金属膜によって形成されていたが、これに限定されない。例えば、センサセルは、フォトリソグラフィによりガラス基板を用いて金属微細構造体が作製されてもよいし、ＡｕＦＯＮ（Ａｕ ｆｉｌｍ ｏｖｅｒ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）により金属微細構造体が作製されてもよい。
なお、上記各実施の形態では、金属微細構造体上にＳＡＭが形成されていたが、必ずしもＳＡＭが形成される必要はない。つまり、金属膜上にＳＡＭが形成されなくてもよい。
なお、上記各実施の形態では、検出装置２００は、ビームスプリッタ２１０及びレンズ２１２を用いて表面増強蛍光の検出を行っていたが、この構成に限定されない。
なお、上記第２実施形態の図７では、励起光の波長及び蛍光の波長の両方が１つの吸収領域に含まれている例を説明したが、励起光の波長及び蛍光の波長は２つの吸収領域に個別に含まれてもよい。この場合であっても、表面プラズモンを効率的に生じさせ、蛍光を効果的に増強することができる。
本開示に係る検出装置は、部屋に滞在している人へのウイルスの感染リスクを低減するために、部屋の空気中の浮遊するウイルス濃度を高感度に検出する検出システムに利用することができる。
１０ 検出システム
１００ 捕集装置
１０２ 吸引器
１０４ 捕集液タンク
１０６、１１４ ポンプ
１０８ サイクロン
１１０ 空気吸入口
１１２ 洗浄液タンク
１２０ 廃液タンク
１２２ 液体流路
２００ 検出装置
２０２ センサデバイス
２０４ センサセル
２０４ａ 流路
２０４ｂ 検出領域
２０６ 導入口
２０８ 光源
２１０ ビームスプリッタ
２１２ レンズ
２１４ 検出部
２０４１、２０４１Ａ 金属微細構造体
２０４２ 樹脂基板
２０４２ａ ピラー
２０４３、２０４３Ａ 金属膜
２０４３ａ 突起部
２０４４、２０４４Ｂ ＳＡＭ
２０４５ 第１のＶＨＨ抗体
２０４６ リンカー分子
２０４７ 非リンカー分子
２０６１ サンプル液体
２０６２ ウイルス（被検出物質）
２０６３ 第２のＶＨＨ抗体
２０６４ 蛍光物質
２０４６１、２０４７１ チオール基
２０４６２、２０４７２ アルキル鎖
２０４６３、２０４７３ エチレングリコール鎖
２０４６４ カルボキシル基
２０４７４ ヒドロキシル基

Claims (8)

  1. 被検出物質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、
    前記被検出物質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体、及び前記被検出物質を含み得る試料を、前記金属微細構造体に導入 する導入口と、
    前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、
    前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備える
    検出装置。
  2. 前記金属微細構造体の表面の算術平均粗さ（Ｒａ）は、前記第２のＶＨＨ抗体の大きさの５０％以下である、
    請求項１に記載の検出装置。
  3. 前記金属微細構造体は、基板平面上に配置された複数の突起部を含み、
    前記複数の突起部において隣接する突起部の間の隙間の長さは、前記第１のＶＨＨ抗体と前記被検出物質と前記第２のＶＨＨ抗体とからなる複合体の大きさの１００％〜２００％の長さである、
    請求項１または２に記載の検出装置。
  4. 前記金属微細構造体の表面には、リンカー分子及び非リンカー分子を含む自己組織化単分子膜が形成されており、
    前記第１のＶＨＨ抗体は、前記リンカー分子を介して前記金属微細構造体に固定されている、
    請求項１から３のいずれか１項に記載の検出装置。
  5. 前記リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にカルボキシル基を有し、かつ、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含み、
    前記非リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にヒドロキシル基を有し、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含む、
    請求項４に記載の検出装置。
  6. 前記金属微細構造体は、吸収スペクトルを測定した際に、前記励起光の波長と前記蛍光の波長とに対応する波長域に吸収領域を有し、当該吸収領域のピーク幅は５００ｎｍ以下である、
    請求項１から５のいずれか１項に記載の検出装置。
  7. 前記励起光の波長、及び前記蛍光の波長は、６００ｎｍ〜８５０ｎｍである、
    請求項１から６のいずれか１項に記載の検出装置。
  8. 被検出物質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体に、前記被検出物質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体、及び前記被検出物質を含み得る試料を導入する導入ステップと、
    前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する照射ステップと、
    前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出ステップと、を含む
    検出方法。
JP2019543635A 2017-09-21 2018-09-18 検出装置及び検出方法 Active JP7266196B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017181836 2017-09-21
JP2017181836 2017-09-21
PCT/JP2018/034425 WO2019059171A1 (ja) 2017-09-21 2018-09-18 検出装置及び検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019059171A1 true JPWO2019059171A1 (ja) 2020-09-03
JP7266196B2 JP7266196B2 (ja) 2023-04-28

Family

ID=65809823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019543635A Active JP7266196B2 (ja) 2017-09-21 2018-09-18 検出装置及び検出方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11768155B2 (ja)
JP (1) JP7266196B2 (ja)
WO (1) WO2019059171A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020218313A1 (ja) * 2019-04-25 2020-10-29 国立大学法人東海国立大学機構 分離装置および固定相部材およびナノ構造体の分離方法
WO2023243490A1 (ja) * 2022-06-14 2023-12-21 国立大学法人徳島大学 ナノ粒子体、ナノ粒子体を含む複合体、ならびにナノ粒子体に含まれる高分子膜の形成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011158369A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology バイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び抗原抗体反応の検出方法
WO2017053516A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 Trustees Of Boston University Multiplexed phenotyping of nanovesicles

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010043934A (ja) 2008-08-12 2010-02-25 Fujifilm Corp 検出方法、検出用試料セル、検出用キット及び検出装置
JP2015178993A (ja) 2014-03-19 2015-10-08 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 検出装置
EP3130914A4 (en) * 2014-04-08 2017-12-06 Konica Minolta, Inc. Surface plasmon enhanced fluorescence measurement device and surface plasmon enhanced fluorescence measurement method
JP2017036258A (ja) 2015-08-07 2017-02-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 インフルエンザウィルスに結合する抗体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011158369A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology バイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び抗原抗体反応の検出方法
WO2017053516A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 Trustees Of Boston University Multiplexed phenotyping of nanovesicles

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON, G. P. ET AL.: "Single domain antibody-quantum dot conjugates for ricin detection by both fluoroimmunoassay and surf", ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 786, JPN6018050090, 14 May 2013 (2013-05-14), pages 132 - 138, XP028572050, ISSN: 0004887537, DOI: 10.1016/j.aca.2013.05.010 *
GONG, XUE, ET AL.: "Specific determination of influenza H7N2 virus based on biotinylated single-domain antibody from a p", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 500, JPN6018050096, 9 October 2015 (2015-10-09), NL, pages 66 - 72, XP029488674, ISSN: 0005011756, DOI: 10.1016/j.ab.2015.09.020 *
LAHIRI, J. ET AL.: "A Strategy for the Generation of Surfaces Presenting Ligands for Studies of Binding Based on an Acti", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 71, JPN6018050092, 1 August 1999 (1999-08-01), US, pages 777 - 790, XP002229684, ISSN: 0004887538, DOI: 10.1021/ac980959t *
SAERENS, DIRK, ET AL.: "Engineering camel single-domain antibodies and immobilization chemistry for human prostate-specific", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 77, JPN6018050093, 25 October 2005 (2005-10-25), US, pages 7547 - 7555, ISSN: 0005011755 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20200166455A1 (en) 2020-05-28
WO2019059171A1 (ja) 2019-03-28
JP7266196B2 (ja) 2023-04-28
US11768155B2 (en) 2023-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100068824A1 (en) Sensing method, sensing device, inspection chip, and inspection kit
US9494465B2 (en) Raman spectroscopic apparatus, raman spectroscopic method, and electronic apparatus
JP5328915B2 (ja) 高感度蛍光検出デバイス
JP2010145272A (ja) プラズモン励起センサを用いたアッセイ法
CN103913444A (zh) 基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法
US11768155B2 (en) Detection device and detection method
WO2021040021A1 (ja) 被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システム
WO2013080505A1 (ja) センシング装置およびこれを用いたセンシング方法
JP7236664B2 (ja) センサ基板、検出装置及びセンサ基板の製造方法
JP2015178993A (ja) 検出装置
US11567069B2 (en) Metal microscopic structure and detection device
CN106198951B (zh) 一种生物传感标定方法、标定系统及疾病检测系统
US20110195516A1 (en) Wire grid substrate structure and method for manufacturing such a substrate
JP2009014491A (ja) 標的物質検出用素子および標的物質検出装置
JP2020193868A (ja) 検出方法及び検出装置
JP7628009B2 (ja) ナノ粒子体を用いて検体中の抗原を検出するプラズモン増強蛍光分析を行う方法
JP2019203187A (ja) センサ基板の製造方法
US11604188B2 (en) Detection apparatus, detection substrate, and detection method
WO2020262374A1 (ja) エクソソームの測定方法およびエクソソームの測定キット
JP5754309B2 (ja) 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤
CN113396330A (zh) 检测方法以及检测装置
JP6468572B2 (ja) 増強電磁場を用いたアレイ型センサーを使用した測定方法及び測定装置
JP2020153904A (ja) センサ基板の製造方法、センサ基板および検出装置
JP2011128060A (ja) プラズモン励起センサ、並びにこれを用いた核酸検出装置および核酸検出方法
WO2023163099A1 (ja) 被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システム

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210906

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221004

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221117

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230110

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230314

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230405

R151 Written notification of patent or utility model registration

Ref document number: 7266196

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151