JPWO2019058609A1 - エネルギー消費促進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
肥満は、エネルギー摂取量と消費量のバランスが崩れ、消費量よりも摂取量が上回ることで起こるとされている。肥満をはじめとしたメタボリックシンドロームの予防、改善には身体活動量を増やすことにより、エネルギー消費量を増加させることが有効と考えられている。
主にエネルギー消費は、基礎代謝の他、食事に起因する食事誘発性熱産生、身体活動起因する熱産生に分けられる。身体活動に起因する熱産生は、スポーツ等の運動による熱産生と、それ以外の日常的な身体活動に起因する非運動性活動熱産生(Non Exercise Activity Thermogenesis:NEAT)からなる(非特許文献1)。更に、運動によるエネルギー消費は、運動中に限らず、運動終了後においてもエネルギー消費量の増加が継続することが知られている。
これまでにエネルギー消費を促進させる成分として、交感神経活性化作用を有するカフェイン等が報告されている(非特許文献2)。しかし一方で、カフェインの摂取によって血圧の上昇が引き起こされる可能性が報告されており(非特許文献3)、安全性や刺激性の観点からその実用性が限定される。
また、遊離アミノ酸が50質量%程度のカゼインの加水分解物が、脂質利用量を増加させるものの、エネルギー消費量には影響を与えないことが報告されている(非特許文献4)。
また、カゼイン加水分解物に含まれるMet−Lys−Proのアミノ酸配列からなるトリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害作用及びブラジキニン不活性化抑制作用を有し、血圧降下に有効であることも知られている(特許文献4)。
また、乳清タンパク質を加水分解して得られる乳清タンパク質加水分解物は、消化管ホルモンGLP−2分泌促進作用やシステインプロテアーゼ阻害作用、インターロイキン−18誘導作用等を有することが知られている(特許文献5〜7)。
本発明の一形態においてエネルギー消費促進用組成物は、好ましくは体温上昇用に用いられる。
また、本発明の一形態においてエネルギー消費促進用組成物は、運動後に摂取されることが好ましい。
また、本発明の一形態において、前記乳タンパク質はカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。
また、本発明の好ましい一形態において、前記乳タンパク質分解物は、タンパク質分解酵素による加水分解物である。
また、本発明の一形態において、前記乳タンパク質分解物は、少なくともMet−Lys−Proからなるペプチドを含むことが好ましい。
また、本発明の好ましい一形態において、前記エネルギー消費は、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する。
また、本態様の飲食品組成物は、好ましくは体温上昇用に用いられる。
また、本態様の飲食品組成物は、運動後に摂取されることが好ましい。
また、本態様の飲食品組成物において、前記乳タンパク質はカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。
本態様において好ましくは、前記乳タンパク質分解物は、タンパク質分解酵素による加水分解物である。
また、本態様において、前記乳タンパク質分解物は、少なくともMet−Lys−Proからなるペプチド、又は該配列を含むペプチド(以降「MKPペプチド」とも記す)を含むことが好ましい。なお、前記Met−Lys−Proを含むペプチドとは、Met−Lys−Proの配列を含み、そのC末端及び/又はN末端側に1又は複数個の任意のアミノ酸が付加したものをいう。ここで複数個とは、好ましくは2〜10個をいうが特に限定されない。
本態様において好ましくは、前記エネルギー消費は、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する。
本発明のエネルギー消費促進剤及びエネルギー消費促進用組成物は、平均分子量が220ダルトン以上かつ1000ダルトン以下である、乳タンパク質分解物を有効成分として含有する。
なお、本発明において、カゼインの加水分解物を利用するときには、より好ましくは350〜390Daの平均分子量のものを用いることが好ましく、乳清タンパク質の場合は360〜400Daの平均分子量のものを用いることが好ましい。
なお、非特許文献4のカゼイン加水分解物の平均分子量は、本発明におけるものよりも小さいと推測される。
数平均分子量(Number Average of Molecular Weight)は、例えば文献(社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第116〜119頁、株式会社東京化学同人、1978年)に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量(以下、Mnと略記することがある。)は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖iの分子量がMiであり、その分子数をNiとすると、次の式により定義される。
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料を6規定の塩酸で110℃、24時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで110℃、22時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ギ酸処理後、6規定の塩酸で110℃、18時間加水分解し、それぞれアミノ酸自動分析機(日立製作所製、835型)により分析し、アミノ酸の質量を測定する。
上記の方法により試料中の各アミノ酸の組成を測定し、これを合計して試料中の全アミノ酸の質量を算出する。次いで、スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、残留する各遊離アミノ酸の質量を上記の方法により測定し、これを合計して試料中の全遊離アミノ酸の質量を算出する。これらの値から、試料中の遊離アミノ酸含有率を次式により算出する。
アミノ酸遊離率(質量%)=(全遊離アミノ酸の質量/全アミノ酸の質量)×100
カゼイン分解物を取得するにあたり出発原料となるカゼインは、例えば、市販品の各種カゼイン;ミセラーカゼイン;乳酸カゼイン、塩酸カゼイン等の酸カゼイン;ナトリウムカゼイネイト、カリウムカゼイネイト、カルシウムカゼイネイト等のカゼイネイト等から選ばれる1種のもの又は2種以上の混合物が挙げられる。当該混合物は任意の割合で混合すればよい。
乳清タンパク質分解物を取得するにあたり出発原料となる乳清タンパク質は、特に限定されないが、市販の各種乳清タンパク質、例えば、乳清タンパク質濃縮物(WPC)、乳清タンパク質単離物(WPI)等が好ましい。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から乳清蛋白質を常法により精製することもできる。
また、前記カゼイン又は乳清タンパク質は、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳等から公知の方法によって単離されたカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。
原料乳タンパク質を水又は温湯に分散し、溶解して乳タンパク質水溶液を調製する。当該乳タンパク質水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、タンパク質濃度として2質量%以上、さらに好ましくは5〜15質量%程度の濃度範囲に設定するのが好適である。
さらに、前記乳タンパク質水溶液を、ナトリウム型又はカリウム型陽イオン交換樹脂(好適には強酸性陽イオン交換樹脂)を用いたイオン交換法、電気透析法、限界濾過膜法、ルーズ逆浸透膜法等で脱塩し、適宜pH調整やカルシウム濃度調整を行うのが好適である。脱塩の際には、カラム式やバッチ式の何れを採用してもよい。また、乳タンパク質水溶液を、脱塩前等に適宜、加熱殺菌をおこなってもよい。
本開示のタンパク質分解酵素は、例えば、植物由来、動物由来、微生物由来等が挙げられ、これらから1種又は2種以上組み合わせて使用できる。当該タンパク質分解酵素としては、エンドプロテアーゼが好適である。
前記エンドプロテア−ゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼが挙げられ、これらを1種又は2種以上選択して用いることができる。このうち、セリンプロテアーゼ及び/又はメタロプロテアーゼを用いるのが好適である。
また、プロテアーゼは、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼに分類される。このうち中性プロテアーゼを用いるのが好適である。
これらのうち、スブチリシン(subtilisin:例えば、ビオプラーゼ)、トリプシン(trypsin:例えばPTN6.0S)、及びバシロシン(bachillolysin:例えばプロテアーゼN)から選ばれる1種又は2種以上の中性プロテアーゼが好ましく、より好ましくはこれら3種を組み合わせて用いる。
前記タンパク質分解酵素による加水分解条件を適宜調整することにより、本発明に係る特定の平均分子量の範囲の乳タンパク質分解物を得ることができる。
前記タンパク質分解酵素の反応保持時間は、前記特定の非タンパク態窒素比率になるように適宜調整すればよく、例えば0.5〜24時間で行うことが可能であり、好ましくは1〜15時間、より好ましくは3〜10時間である。
前記タンパク質分解酵素による加水分解は、当該酵素を加熱して失活させて終了させればよい。例えば、100℃以上(好適には110〜130℃)で失活させる場合には1〜3秒間、100℃未満60℃以上で失活させる場合には3〜40分間で行うことが好適である。
加水分解終了後、必要に応じて分解液のpHを、好ましくは6〜8、より好ましくは7.0±0.5、さらに好ましくは7.0±0.3とするのが好適である。
また、前記乳タンパク質水溶液を、熱処理にて加水分解してもよい。この乳タンパク質水溶液は、pH未調整でもよく、またpH調整(具体的には、酸性(pH5以下)、中性(pH6〜8)、アルカリ性(pH8以上))してもよい。熱処理は、4〜100℃程度で、上記酸アルカリ処理のような条件にて行えばよい。
分子量分画として、例えば、限外濾過、ゲル濾過等の方法が採用でき、これにより不要な分子量のペプチドや遊離アミノ酸の除去率を高めることができる。
限外濾過の場合には、所望の限外濾過膜を使用すればよく、ゲル濾過の場合には、所望のサイズ排除クロマトグラフィーに用いるゲルろ過剤を使用すればよい。
さらに、脱塩や不純物を除去したり、純度を高めたりするために、公知の分離精製方法(例えば、イオン交換樹脂等)を用いてもよい。
本発明においてMKPペプチドは、大豆、卵、小麦、大麦、米、じゃが芋、さつま芋、えんどう豆、トウモロコシ、畜肉、魚肉、魚介などに由来するタンパク質を分解処理して取得したものであってもよいし、該分解処理物からMKPペプチドをさらに単離・精製したものであってもよいし、化学合成又は生合成によりMKPペプチドを取得したものであってもよい。
なお、本明細書において有効成分として「乳タンパク質分解物」というときは、上記の如く乳以外に由来するタンパク質を分解処理して得たMKPペプチドや、化学合成又は生合成により得たMKPペプチドをも含む概念とする。
(a)試料粉末を、1.0mg/mLとなるように、0.2%ギ酸水溶液に希釈溶解し、10分間超音波破砕したのち、0.22μm口径のPVDFフィルター(Millipore社製)でろ過して粉末溶液を調製し、下記測定条件によるLC/MS分析を実施する。一方、MKPペプチドの化学合成標準ペプチド(ペプチド研究所社製)の溶解液を濃度別に数点調製し、下記測定条件によるLC/MS分析を実施し、検量線を作成する。
前記粉末溶液の分析におけるピークのうち、標準ペプチドと分子量及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定する。標準ペプチドのピーク面積と資料粉末のピーク面積を対比することにより、前記粉末溶液中にMKPペプチドの含有量を求める。
MKP含有量(mg/カゼイン加水分解物1g)=〔得られたカゼイン加水分解物中のMKPペプチド測定値(mg)〕/〔得られたカゼイン加水分解物の質量(g)〕
〔得られたカゼイン加水分解物中のMKPペプチド測定値(mg)〕は、下記「LC/MS」による、試料中のMKPペプチドの測定値である。
質量分析計:TSQ Quantum Discovery MAX(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)。
高速液体クロマトグラフ:Prominence (島津製作所社製)、カラム:XBridge BEH300 C18 φ2.1 mm×250 mm,3.5 μm(Waters社製)。
移動相A:0.2重量% ギ酸−水溶液
移動相B:0.2重量% ギ酸−アセトニトリル溶液
タイムプログラム:2%B(0.0分)−25%B(5.0分)−65%B(5.1分)−65%B(10分)−85%B(10.1分)−85%B(13.0%)−2%B(13.1分)−STOP(30.0分)。
試料注入量:10μL、カラム温度:40℃、液体流量:200μL/min
分析モード:SRM測定。
Product Mass:m/z=260.10(Parent m/z = 375.21)
エネルギー消費量は、間接熱量測定法によりエネルギー消費量を求めることができる。エネルギー消費量の算出にはTadaishi et al. PLoS One. 2011 6(12) e28290.(文献名等)2011ら の方法に従って、以下の式を用いることにより求めることができる。
エネルギー消費量(cal/min)=3.91 VO2(ml/min)+1.10 VCO2(ml/min)
なお、本明細書において運動とは、健康のため、体を鍛えるため、楽しみのために計画的・意図的に実施するスポーツ、ウォーキング、ジョギング等の活動であり、身体活動とは、労働、家事、通勤・通学、趣味等の運動を除く日常の生活における身体活動を指す。
また、本発明において、エネルギー消費の促進とは、通常のエネルギー消費レベルから増強させてエネルギー消費量を増大させること、諸々の原因により低下したエネルギー消費レベルを回復させてエネルギー消費量を通常又はそれ以上にまで増大させること、及び/又は、運動後に増加するエネルギー消費をさらに促進させることを含む。
したがって本発明に係る乳タンパク質分解物は、エネルギー消費の促進用途や、エネルギー消費機能低下の治療、改善及び/又は予防用途のために用いることができる。さらに、エネルギー消費機能の向上、エネルギー消費機能低下に関わる様々な状態や疾患の制御、例えば免疫力向上、体力向上、血流改善、疲労改善、肥満の予防及び/又は改善、ダイエット、メタボリックシンドロームの予防及び/又は改善、糖尿病等の生活習慣病の予防及び/又は改善について効果を期待できる。
本発明に係る乳タンパク質分解物は、体温の上昇作用を有するので、生体の体温を正常な状態に戻す、またはより高めることによる体温低下の予防や改善、末梢血流の改善、発汗作用の亢進、体感作用が期待される。また、持続する低体温状態を原因とする低血圧、内臓機能低下(便秘・下痢)、免疫力低下、血行不良(冷え・肩こり・腰痛・関節痛)、睡眠障害、新陳代謝低下(肥満)疾患等の治療や改善や予防に用いることができる。
すなわち、本発明の別の態様は、本発明のエネルギー消費促進剤及び組成物を対象に投与する工程を含む、エネルギー消費を促進する方法である。さらには、エネルギー消費を促進することにより、前述した疾患又は状態を治療、改善及び/又は予防する方法であってもよく、また、対象の体温を上昇させる方法であってもよい。
また、本明細書において、「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、或いは適用対象の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善のために用いられる、乳タンパク質分解物とも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善における、乳タンパク質分解物の使用とも言うことができる。
本発明は、乳タンパク質分解物を、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び/又は改善する方法とも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善のために用いられる、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドとも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善における、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドの使用とも言うことができる。
本発明は、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドを、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び/又は改善する方法とも言うことができる。
本発明のエネルギー消費促進用組成物における乳たんぱく質分解物の含有量は、最終組成物に対し、0.001〜100質量%に設定することができる。
また、本発明のエネルギー消費促進用組成物におけるMKPペプチドの含有量は、最終組成物に対し、0.00001〜1質量%に設定することができる。
なお、本明細書において、最終組成物とは、対象者に投与するとき又は対象者が摂取するときの組成物のことをいう。
本発明では、対象者に対する乳たんぱく質分解物の使用量は、好ましくは、0.0001〜1g/kg体重/日、より好ましくは0.0005〜0.5g/kg体重/日、さらに好ましくは0.0001〜0.1g/kg体重/日である。
本発明のエネルギー消費促進用組成物は、医薬品の態様とすることが好適である。その場合、経口投与剤や非経口投与剤等とすることができる。
本発明のエネルギー消費促進用組成物の一態様である医薬品組成物は、経口投与及び非経口投与の何れでもよいが、経口投与が望ましい。非経口投与として、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。かかる医薬品は、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤;溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤等に製剤化することができる。
製剤化に際しては、本明細書に係る乳タンパク質分解物の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、pH調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、公知の又は将来的に見出される上述のエネルギー消費促進作用等を有する薬、脂質代謝異常改善薬、高脂血症治療薬などを併用することも可能である。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
本発明のエネルギー消費促進剤又は組成物を食品に配合する場合には、上述のエネルギー消費の促進及び/又はエネルギー消費機能低下によって引き起こされる各種疾患等の予防、改善又は治療用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。また、本明細書に係る乳タンパク質分解物は、これら食品等の製造のために使用可能である。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的(インターネット等)方法により提供する行為等が挙げられる。
かかる表示としては、例えば、運動中及び/又はダイエット中である人を対象として、「エネルギー消費を向上させたい方」、「代謝を向上させたい方」、「体脂肪を減らしたい方」等と表示することが挙げられる。
または、高齢者及び/又は免疫力が低下した人、基礎代謝能力が低下した人を対象として、「基礎代謝の低下が気になる方」「体をあたためたい方」「冷え症の方」「疲労を感じている方」等と表示することが挙げられる。
前記小麦粉製品として、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
前記即席食品類として、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
前記農産加工品として、 農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル(穀物加工品)等が挙げられる。
前記水産加工品として、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
前記畜産加工品として、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
前記乳・乳製品として、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
前記油脂類として、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
前記基礎調味料として、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられる。
前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。 例えば、前記冷凍食品として、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
前記菓子類として、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
前記飲料類として、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品として、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
本明細書に係る乳タンパク質分解物の摂取量又は投与量は、年齢、症状等により異なるが、通常、0.001g〜0.5g/kg体重/日、好ましくは0.006kg〜0.334g/kgであり、さらに好ましくは0.015g〜0.167g/kg体重であり、特に好ましくは0.03g〜0.1g/kg体重であり、1日1回から3回に分けて投与してもよい。
本明細書に係るMKPペプチドの摂取量又は投与量は、年齢、症状等により異なるが、通常、0.4μg〜200μg/kg体重/日、好ましくは2.4μg〜130μg/kgであり、さらに好ましくは6μg〜66.8μg/kg体重であり、特に好ましくは12μg〜40μg/kg体重であり、1日1回から3回に分けて投与してもよい。
乳タンパク質分解物のマウスへの投与量(タンパク質換算量)は、マウスの体重を22gとして算出すると約11〜22mg/個体であり、接餌量を3.5g/日、餌に対するタンパク質量を20.7%として算出すると、食餌によって摂取するタンパク質の約1.5〜3.0質量%に相当する。これをヒトに換算した場合、一日のタンパク質摂取量を成人男性60g、成人女性50gとして算出すると、成人男性約0.9〜1.8g、成人女性約0.75〜1.5gとなる。
(1)カゼイン分解物の取得
市販のカゼイン(ニュージーランドデーリーボード製)100gに水900gを加え、よく分散させ、水酸化ナトリウムを添加して溶液のpHを7.0に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約10質量%のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を85℃ で10分間加熱殺菌し、50℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してpHを9.5 に調整した後、ビオプラーゼsp−20(長瀬生化学工業社製)100,800活性単位(タンパク質1g当り1,200活性単位)、プロテアーゼN(天野エンザイム社製)168,000活性単位(タンパク質1g当り2,000活性単位)、及びPTN6.0S(ノボザイムズ・ジャパン社製)588,000活性単位(タンパク質1g当り7,000活性単位)を添加して、加水分解反応を開始した。カゼインの分解率が24.1%に達した時点で、80℃で6分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、10℃に冷却した。この加水分解液を分画分子量3,000の限外ろ過膜(旭化成社製)で限外ろ過し、濃縮後凍結乾燥し、凍結乾燥品を得た。
得られた加水分解物の分子量及び遊離アミノ酸量を前述の方法にて測定したところ、平均分子量は360Da、アミノ酸遊離率は10質量%以下、分子量200〜500のペプチドが53質量%含まれているカゼイン加水分解物を得た。
市販の牛乳乳清タンパク質濃縮物2.6kg(ミライ社製。タンパク質当量として2kg)を脱イオン水18kgに溶解し、10%水酸化ナトリウム水溶液を使用して、pHを7.2に調整し、タンパク質濃度約10%の乳清タンパク質水溶液20.6kgを調製した。該乳清タンパク質水溶液をプレート式熱交換器を使用して80℃で6分間加熱殺菌し、液温を53℃に調整し、10%水酸化カリウム水溶液を使用して、pHを9.0に調整し、エンドプロテアーゼであるPTN6.0S(ノボザイムズ社製)、プロテアーゼNアマノ(天野エンザイム社製)、及びアルカラーゼ2.4L(天野エンザイム社製)をそれぞれタンパク質1g当たり5000活性単位、2000活性単位、及び500活性単位の割合で添加し、タンパク質加水分解反応を開始した。10時間経過し、分解率が20%となった時点で、120℃で3秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、10℃に冷却した。
この加水分解液を、孔径0.45μmの精密濾過膜(ミリポア社製)により膜分画し、透過画分としてタンパク質加水分解物水溶液約18kgを得た。該タンパク質加水分解物水溶液の液温を55℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼAアマノ(天野エンザイム社製)をタンパク質当量1g当たり500活性単位の割合で添加し、第二のタンパク質加水分解反応を開始した。10時間経過し、分解率を7%増加し、かつ最終的な分解率が27%となった時点で、プレート式熱交換器を使用して120℃で3秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、10℃に冷却した。
得られた乳清加水分解物の分子量及び遊離アミノ酸を前述の方法にて測定したところ、平均分子量は360Da、アミノ酸遊離率は12質量%以下、分子量200〜500のペプチドが45質量%含まれていた。
市販のカゼイン(ニュージーランドデーリーボード製)100gに水900gを加え、よく分散させ、水酸化ナトリウムを添加して溶液のpHを7.0に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約10%のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を85℃で10分間加熱殺菌し、50℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してpHを9.5に調整した後、ビオプラーゼsp−20(長瀬生化学工業社製)100,800活性単位(タンパク質1g当り1,200活性単位)、プロテアーゼN(天野エンザイム社製)168,000活性単位(タンパク質1g当り2,000活性単位)、及びPTN6.0S(ノボザイムズ・ジャパン社製)588,000活性単位(タンパク質1g当り7,000活性単位)を添加して、加水分解反応を開始した。カゼインの分解率が24.1%に達した時点で、80℃で6分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、10℃に冷却した。この加水分解液を分画分子量3,000の限外ろ過膜(旭化成社製)で限外ろ過し、濃縮後凍結乾燥し、凍結乾燥品85gを得た。
[HPLC条件1]
カラム:カプセルパックC18(UG120、5μm)20mmI.D.×250mm(資生堂)
検出:UV215nm
流速:16ml/分
溶離液A:0.05%TFAを含む1%アセトニトリル水溶液
溶離液B:0.05%TFAを含む25%アセトニトリル水溶液
溶離液A100%から、40分後に溶離液B100%になるような直線グラジエント条件で、加水分解物を分離した。
[HPLC条件2]
カラム:カプセルパックC18(UG300、5μm)2.0mmI.D.×250mm(資生堂)
検出:UV215nm
流速:0.2ml/分
溶離液A:0.05%TFAを含む1%アセトニトリル水溶液
溶離液B:0.05%TFAを含む10%アセトニトリル水溶液
溶離液A100%から15分後に溶離液B100%になるような直線グラジエント条件で、リテンションタイム13分のピークに含まれるペプチドを凍結乾燥した。
なお、該凍結乾燥品は、特許文献4に記載される通り、H−Met−Lys−Pro−OHの構造を有するトリペプチド(MKPペプチド)を含むことが確認された。
該凍結乾燥品85g中のMKPペプチド含有量は43.5mgであった。
ペプチドシンセサイザー(Model433A型、アプライドバイオシステムズ社) を使用し、Fmoc−L−Met(アプライドバイオシステムズ社)、Fmoc−Lys(Boc)(アプライドバイオシステムズ社)、Fmoc−Pro−TrtA−PEG Resin( 渡辺化学工業(株))を原料に用いて、固相合成法によりトリペプチドMet−Lys−Proを合成した。操作はアプライドバイオシステムズ社のマニュアルに従って行った後、脱保護した。このペプチドは、前述のHPLC条件1で精製し、精製物について質量分析によりMKPペプチドであることを確認した。
以下の実施例により、乳タンパク質分解物のエネルギー消費促進作用を検討した。
(1)運動後の投与
雄性C57BL/6Jマウスに16時間絶食させた後に、15m/分で60分間のトレッドミル走行を行わせた。その後、3群に分け(各群n=8)、糖質及びカゼイン加水分解物(Glu+Pep、1.5mg+0.5mg/g体重)、糖質及びカゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物(Glu+AA、1.5mg+0.5mg/g体重)、又は糖質のみ(Glu、1.5mg/g体重)を各群に経口投与した。カゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物は、カゼイン加水分解物を全てアミノ酸まで分解した際のアミノ酸組成に合わせて20種の結晶アミノ酸を混合、調製した。なお、糖質としてはグルコースを用い、カゼイン加水分解物は前述の<1>で調製したものを用いた。投与30分後から投与120分まで、呼気ガスを連続的に採取し、呼気中の酸素濃度、二酸化炭素濃度から、間接熱量測定法によりエネルギー消費量を求めた。なお、エネルギー消費量の算出にはTadaishi et al. PLoS One. 2011 6(12) e28290.らの方法に従い、以下の式を用いた。
エネルギー消費量(cal/min)=3.91 VO2(ml/min)+1.10 VCO2(ml/min)
また、統計処理には、二元配置分散分析およびTukeyのHSD検定を用いた。エネルギー消費量の測定結果を図1に示す。糖質のみを投与した群、並びに糖質及びアミノ酸混合物を投与した群と比較して、糖質及びカゼイン加水分解物を投与した群では、エネルギー消費量が有意に高値を示した(p<0.01)。この結果から、運動後のカゼイン加水分解物の摂取は、同組成のアミノ酸摂取と比較してエネルギー消費量を増大させる効果を有することがわかる。
雄性C57BL/6Jマウスに1時間絶食させた後に、4群に分け(各群n=7)、カゼイン加水分解物(Pep)、カゼイン(Cas)、カゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物(AA)、又は水(Water)を各群に1.0mg/g体重ずつ経口投与した。なお、カゼイン加水分解物は前述の<1>で調製したものを用い、カゼインは<1>で加水分解する前の原料を用いた。投与5分後から投与120分までのエネルギー消費量を前述の(1)と同様に求めた。また、統計処理には(1)と同様に、二元配置分散分析およびTukeyのHSD検定を用いた。
エネルギー消費量の測定結果を図2に示す。水、及びアミノ酸混合物を投与した群と比較し、カゼイン加水分解物の摂取は、エネルギー消費量が有意に高値を示した(p<0.01)。また、カゼインを投与した群との比較においても、カゼイン加水分解物を摂取した群ではエネルギー消費量が高値を示した(p<0.05)。この結果から、カゼインをタンパク質やアミノ酸の状態で摂取することと比較し、カゼインを加水分解したカゼイン加水分解物の状態で摂取することによって、効率的にエネルギー消費を促進させることがわかる。
雄性C57BL/6Jマウスを実験動物に用い、安静、カゼイン加水分解物、MKPペプチド、乳清タンパク質加水分解物投与群の4群に分けた。マウスに1時間の絶食をさせた後に、カゼイン加水分解物及び乳清タンパク質加水分解物はそれぞれ1.0mg/g体重、MKPペプチドは0.4μg/g体重を経口投与し、エネルギー消費量を測定した。実験に用いたマウスは、各群n=12とし、ランダム化クロスオーバー試験にて実施した。
なお、カゼイン加水分解物、乳清タンパク質加水分解物は、前述の<1>(1)〜(2)で調製したものを、MKPペプチドは合成ペプチドをペプチド研究所より購入し用いた。投与から60分間のエネルギー消費量を求めた。
投与後60分間のエネルギー消費量の平均値を図3に示す。安静群と比較し、カゼイン加水分解物、MKPペプチド、および乳清タンパク質加水分解物の全ての群でエネルギー消費量が高値を示した。これらの結果から、乳タンパク質を構成するカゼインおよび乳清タンパク質の加水分解物、またはMKPペプチドを摂取することにより、エネルギー消費量が高まることが分かる。
牛乳又は脱脂乳に、実施例1で製造されたカゼイン加水分解物並びにスクラロース(三栄源エフエフ社製)及び希少単糖(商品名:レアシュガースウィート(松谷化学工業社製))を配合し、(A)乳タンパク質 3.5質量%以上、(B)乳脂肪 3.5質量%以下、(C)炭水化物 5.0質量%以上、及び(D)カルシウム 0.15質量%以上を含むように調乳液を調製する。
当該調乳液と乳酸菌及びビフィズス菌を均一に混合した混合物を発酵させる。これにより、カゼイン加水分解物及び難消化性デキストリンを含むエネルギー消費用組成物(発酵乳)を得る。当該発酵乳には、(E)実施例1のカゼイン加水分解物0.3〜0.8質量%、(F)難消化性デキストリン4〜8質量%、(G)スクラロース0.05〜0.02質量%、(H)D−プシコース及びD−アロース0.05〜0.1質量%、及び(I)ラクチュロース1〜4質量%が含まれる。
カゼイン加水分解物の摂取量が、0.0001〜1g/kg体重/日、になるように、本発明のエネルギー消費用組成物を毎日継続して摂取する。これにより、エネルギー消費 促進効果が期待できる。
表1に示す各成分(粉末)を混合して、エネルギー消費用組成物の粉末を得る。当該粉末は、サプリメントとして使用することができ、また水と混合することで飲料とすることができる。また、当該粉末は、カブセル容器に充填又はカプセル皮膜することで、エネルギー消費用のカプセル剤とすることができる。当該粉末は、圧縮成形することで、エネルギー消費促進用の錠菓とすることができる。当該粉末により、エネルギー消費促進の効果が期待できる。なお、当該粉末の原料のカゼイン分解物として、実施例1のカゼイン加水分解物を使用することができる。
Claims (27)
- 平均分子量が220ダルトン以上かつ1000ダルトン以下である乳タンパク質分解物を有効成分として含有する、エネルギー消費促進用組成物。
- 体温上昇のために用いられる、請求項1に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 運動後に摂取される、請求項1又は2に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 前記乳タンパク質が、カゼインである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 前記乳タンパク質が、乳清タンパク質である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 前記乳タンパク質分解物が、タンパク質分解酵素による加水分解物である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 前記乳タンパク質分解物が、少なくともMet−Lys−Proからなるペプチド、または前記アミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- 前記エネルギー消費が、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- エネルギー消費機能低下の治療及び/若しくは予防用、又はエネルギー消費促進用の医薬組成物である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 平均分子量が220ダルトン以上かつ1000ダルトン以下である乳タンパク質分解物を有効成分として含有する、エネルギー消費促進用飲食品組成物。
- 体温上昇のために用いられる、請求項10に記載の飲食品組成物。
- 運動後に摂取される、請求項10又は11に記載の飲食品組成物。
- 前記乳タンパク質が、カゼインである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の飲食品組成物。
- 前記乳タンパク質が、乳清タンパク質である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の飲食品組成物。
- 前記乳タンパク質分解物が、タンパク質分解酵素による加水分解物である、請求項10〜14のいずれか1項に記載の飲食品組成物。
- 前記乳タンパク質分解物が、少なくともMet−Lys−Proからなるペプチド、または前記アミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項10〜15のいずれか1項に記載の飲食品組成物。
- 前記エネルギー消費が、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する、請求項10〜16のいずれか1項に記載の飲食品組成物。
- Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、エネルギー消費促進用組成物。
- 前記エネルギー消費が、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する、請求項18に記載のエネルギー消費促進用組成物。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善用組成物の製造における、乳タンパク質分解物の使用。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善のために用いられる、乳タンパク質分解物。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善における、乳タンパク質分解物の使用。
- 乳タンパク質分解物を、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び/又は改善する方法。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善用組成物の製造における、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドの使用。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善のために用いられる、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチド。
- エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善における、Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドの使用。
- Met−Lys−Proからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドを、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び/又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び/又は改善する方法。
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